CN111118074B - 一种制备苯丙酮酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备苯丙酮酸的方法，首先将转氨酶基因ata插入pET28a质粒构建转氨酶重组大肠杆菌菌体，再进行诱导表达得到表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体，最后将表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体与L‑苯丙氨酸进行催化反应得到α‑苯丙酮酸；所述表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体的浓度为1.5‑2.5g/L，L‑苯丙氨酸浓度为4‑8g/L。本发明方法采用最优诱导条件结合最优催化条件，避免了pH、温度、时间、底物浓度和菌体浓度等多方面对苯丙酮酸的产率的影响，底物转化率达到91％，获得高质量高产量的苯丙酮酸。

Description

一种制备苯丙酮酸的方法
技术领域
本发明涉及生物领域，更具体地，涉及一种制备苯丙酮酸的方法。
背景技术
α-苯丙酮酸(PPA)是双羰基化合物中的一种，是生产L-苯丙氨酸的前体化合物。在医学及有机合成领域，苯丙酮酸是非常重要的中间体，此外苯丙酮酸在食品生产和食品添加剂方面也有重要应用。近来，随着低热值甜味剂天苯二肽的生产在欧、美、日等国实现了规模化，世界年产量已超过1万吨，苯丙酮酸作为其限制性生产原料，市场需求逐年递增，因而刺激了国内外对苯丙酮酸合成工艺的研究，如何大量制备苯丙酮酸成了大家热衷的话题。目前所用的生产方法包括化学合成法、微生物发酵法、酶转化法。
化学合成法包括乙内酰脲与苯甲醛合成法、乙酰氨基肉桂酸水解法和海因法等。但化学合成法，反应步骤繁琐、反应条件较高、产物生成率一般较低、产生的有毒有害产物对环境污染严重。微生物发酵法虽具有原料廉价易得、环境污染较小、产物纯度高等优点，但其缺点是发酵中产物浓度低，生产周期长，工艺管理要求严格，因此也未加入大批量生产PPA的方法行列。
酶转化法是利用微生物中一些酶的高选择性的催化特点，对底物进行高效的催化反应，便可以得到更具有价值并且与底物结构相似的产品。酶转化法的反应类型丰富，流程较简单，条件较温和，具有高效性、高选择性、无毒、环境友好等特点，目前已广泛用于工业生产当中。然而酶转化法也受到众多因素比如pH、抑制剂、温度、底物浓度等多方面的影响，这些因素对于苯丙酮酸的产率均有较大的影响。
发明内容
本发明的目的是针对上述不足，提出一种制备苯丙酮酸的方法。本发明方法采用最优诱导条件结合最优催化条件，避免了pH、温度、时间、底物浓度和菌体浓度等多方面对苯丙酮酸的产率的影响，通过转氨方法获得苯丙酮酸，底物转化率达到91％。
本发明的技术方案是：
本发明提供一种制备苯丙酮酸的方法，首先将转氨酶基因ata插入pET28a质粒构建转氨酶重组大肠杆菌菌体，再进行诱导表达得到表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体，最后将表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体与L-苯丙氨酸进行催化反应得到α-苯丙酮酸；所述表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体的浓度为1.5-2.5g/L，L-苯丙氨酸浓度为4-8g/L。
优选的，表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体的浓度为1.8-2.2g/L，L-苯丙氨酸浓度为5-7g/L。
最优选的，表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体的浓度为2.0g/L，L-苯丙氨酸浓度为6g/L。
所述催化反应的条件为：pH为8.0-10，反应时间为2.5-4.0h，反应温度为35-42℃。
优选的，催化反应的条件为：pH为8.0-9.0，反应时间为2.8-3.5h，反应温度为37-41℃。
最优选的，催化反应的条件为：pH为9.0，反应时间为3h，反应温度为40℃。
所述诱导表达的条件为：OD600为0.5-0.8，诱导剂浓度为0.1-0.8mmol/L，诱导时间为6-12h，诱导温度为22-30℃。
优选的，诱导表达的条件为：OD600为0.7-0.8，诱导剂浓度为0.2-0.4mmol/L，诱导时间为9-11h，诱导温度为27-29℃。
最优选的，诱导表达的条件为：OD600为0.8，诱导剂浓度为0.3mmol/L，诱导时间为10h，诱导温度为28℃。
所述催化反应的过程为：将表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体与L-苯丙氨酸和α-酮戊二酸共同加入PBS缓冲溶液中构成反应液，反应液在摇床中进行催化反应，得到α-苯丙酮酸。
所述α-酮戊二酸浓度为4-8g/L。
优选的，α-酮戊二酸浓度为5-7g/L。
最优选的，α-酮戊二酸浓度为6g/L。
所述诱导表达过程为：将转氨酶重组大肠杆菌菌体在37℃进行摇床培养，当菌体OD600为0.5-0.8时，加入终浓度为0.1-0.8mmol/L诱导剂再在22-30℃温度下诱导反应6-12h，离心并收集菌体，得到表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体。
所述诱导剂为IPTG。
所述摇床培养的速率为100-500rpm/min。优选的，摇床培养的速率为200rpm/min。
所述转氨酶重组大肠杆菌菌株的构建方法为：先PCR扩增转氨酶基因得到扩增产物，再用Nco I和Xho I双酶切PCR扩增产物，并将双酶切后的产物插入pET28a质粒得到连接有转氨酶的pET28a质粒，最后将连接有转氨酶的pET28a质粒转化BL21感受态细胞，得到转氨酶重组大肠杆菌菌体。
转氨酶基因ata由Arthrobacter sp.基因组中提取获得，根据生工生物工程(上海)股份有限公司的细菌基因组DNA快速抽提试剂盒的说明书提取。
本发明的有益效果：
本发明方法采用最优诱导条件(如OD600＝0.8，IPTG为0.3mmol/L，在28℃条件下诱导10h)结合最优催化条件(如反应液的pH为9.0，表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体的浓度为2.0g/L，L-苯丙氨酸浓度为6g/L，α-酮戊二酸浓度为6g/L，催化时间为3h，催化温度为40℃)，避免了pH、温度、时间、底物浓度和菌体浓度等多方面对苯丙酮酸的产率的影响，底物转化率达到91％，获得高质量高产量的苯丙酮酸。
附图说明
图1示出了本发明实施例1中Arthrobacter sp.基因组电泳图。
图2示出了本发明实施例1中转氨酶基因的PCR扩增电泳图。
图3示出了本发明实施例1中双酶切电泳验证图。
图4示出了本发明实施例1中诱导前和诱导后菌体的SDS-PAGE检测图。
图5示出了本发明实施例1中α-苯丙酮酸的标准曲线图。
图6示出了本发明实施例1中α-苯丙酮酸产物的液相色谱图。
图7示出了本发明实施例4中L-苯丙氨酸和α-酮戊二酸底物浓度对催化效率影响的线性图。
图8示出了本发明实施例5中反应液的pH对催化效率的影响的比较图。
图9示出了本发明实施例6中反应温度对催化效率影响的线性图。
图10示出了本发明实施例7中表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体的浓度对催化效率影响的线性图。
图11示出了本发明实施例8中反应时间对催化效率影响的线性图。
具体实施方式
实施例中的Nco I酶、Xho I酶、IPTG和α-酮戊二酸均购自于生工生物工程(上海)股份有限公司。L-苯丙氨酸和α-苯丙酮酸购自于上海晶纯生化科技股份有限公司，其他原料均为普通市售所得。
实施例1
一种制备苯丙酮酸的方法，步骤为：
(1)转氨酶重组大肠杆菌菌株的构建：提取Arthrobacter sp.基因组中的转氨酶基因ata，先PCR扩增转氨酶基因ata得到扩增产物，再用Nco I和Xho I双酶切PCR扩增产物，并将双酶切后的产物插入pET28a质粒得到连接有转氨酶的pET28a质粒，命名为pET28a-ata，最后将pET28a-ata转化BL21感受态细胞，得到转氨酶重组大肠杆菌菌体，命名为BL21(DE3)/pET28a-ata；
从BL21(DE3)/pET28a-ata中提取质粒并进行双酶切后电泳和测序验证，由图1和图2表明，成功提取基因组并PCR扩增到转氨酶基因。从BL21(DE3)/pET28a-ata中提取的质粒经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切，获得996bp和5230bp两条带(如图3所示)，分别为pET28a和目的基因的长度，结果表明重组质粒pET28a-ata已成功导入BL21大肠杆菌中。
(2)诱导表达：将BL21(DE3)/pET28a-ata在37℃进行摇床培养，摇床培养的速率为200rpm/min，当菌体OD600为0.8时，加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG，再在28℃温度下诱导反应10h，8000rpm/min离心3min，并收集菌体，得到表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体。
以诱导前的菌体作为对照组，将诱导前的菌体和诱导后的菌体分别在冰上超声破碎(240W，强度40％，超声2s，间隔5s，直至菌液澄清透明)，取上清液，分别进行SDS-PAGE检测，如图4所示，与诱导前的菌体对照组(第2,3,4泳道)相比，转氨酶重组大肠杆菌菌体在诱导之后(第8，9泳道)上清液中50kDa处有特定条带，如图4所示。核苷酸序列分析该蛋白大约由604个氨基酸组成，分子量大小约为55586Da，由此可确定此条带即目的条带，说明转氨酶基因成功在大肠杆菌中可溶表达。
(3)催化反应：将表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体与L-苯丙氨酸和α-酮戊二酸共同加入PBS缓冲溶液中构成反应液，反应液的pH为9.0，反应液在40℃温度下在摇床中进行3h催化反应，得到催化产物；其中，反应液中：表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体的浓度为2.0g/L，L-苯丙氨酸浓度为6g/L，α-酮戊二酸浓度为6g/L。
首先将α-苯丙酮酸标准品分别配制成浓度为0g/L、0.2g/L、0.4g/L 0.6g/L、0.8g/L和1.0g/L的标准曲线样品，检测后制作出标准曲线，由图5可知，制得的标准曲线方程为y＝3×107X+245374(R2＝0.9971)。将催化产物离心后吸取上清液经过滤膜处理，经高效液相色谱仪在210nm检测，液相检测条件为：C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A为乙腈，B为0.15％磷酸溶液；流量为1.0mL/min；柱温30℃；检测波长210nm；进样量20μL。梯度洗脱条件为：0-6.0min时，A为25％；6.01-10.0min时，A由25％升至50％，并继续保持6min；16.0-16.01min时，A由50％降至25％，并保持4min。如图6所述，催化得到的α-苯丙酮酸的出峰时间为14.622min。重复检测三次，并计算平均值，计算得到α-苯丙酮酸的浓度为5.46g/L，转化率为91％。
实施例2
一种制备苯丙酮酸的方法，步骤为：
(1)转氨酶重组大肠杆菌菌株的构建：提取Arthrobacter sp.基因组中的转氨酶基因ata，先PCR扩增转氨酶基因ata得到扩增产物，再用Nco I和Xho I双酶切PCR扩增产物，并将双酶切后的产物插入pET28a质粒得到连接有转氨酶的pET28a质粒，命名为pET28a-ata，最后将pET28a-ata转化BL21感受态细胞，得到转氨酶重组大肠杆菌菌体，命名为BL21(DE3)/pET28a-ata；
(2)诱导表达：将BL21(DE3)/pET28a-ata在37℃进行摇床培养，摇床培养的速率为100rpm/min，当菌体OD600为0.5时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，再在30℃温度下诱导反应6h，8000rpm/min离心3min，并收集菌体，得到表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体。
(3)催化反应：将表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体与L-苯丙氨酸和α-酮戊二酸共同加入PBS缓冲溶液中构成反应液，反应液的pH为8.0，反应液在35℃温度下在摇床中进行2.5h催化反应，得到催化产物；其中，反应液中：表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体的浓度为1.5g/L，L-苯丙氨酸浓度为4g/L，α-酮戊二酸浓度为4g/L。
首先将α-苯丙酮酸标准品分别配制成浓度为0g/L、0.2g/L、0.4g/L 0.6g/L、0.8g/L和1.0g/L的标准曲线样品，检测后制作出标准曲线，制得的标准曲线方程为y＝3×107X+245374(R2＝0.9971)。将催化产物离心后吸取上清液经过滤膜处理，经高效液相色谱仪在210nm检测，液相检测条件为：C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A为乙腈，B为0.15％磷酸溶液；流量为1.0mL/min；柱温30℃；检测波长210nm；进样量20μL。梯度洗脱条件为：0-6.0min时，A为25％；6.01-10.0min时，A由25％升至50％，并继续保持6min；16.0-16.01min时，A由50％降至25％，并保持4min。重复检测三次，并计算平均值，计算得到α-苯丙酮酸的浓度为3.4g/L，转化率为85％。
实施例3
一种制备苯丙酮酸的方法，步骤为：
(1)转氨酶重组大肠杆菌菌株的构建：提取Arthrobacter sp.基因组中的转氨酶基因ata，先PCR扩增转氨酶基因ata得到扩增产物，再用Nco I和Xho I双酶切PCR扩增产物，并将双酶切后的产物插入pET28a质粒得到连接有转氨酶的pET28a质粒，命名为pET28a-ata，最后将pET28a-ata转化BL21感受态细胞，得到转氨酶重组大肠杆菌菌体，命名为BL21(DE3)/pET28a-ata；
(2)诱导表达：将BL21(DE3)/pET28a-ata在37℃进行摇床培养，摇床培养的速率为500rpm/min，当菌体OD600为0.7时，加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG，再在22℃温度下诱导反应12h，8000rpm/min离心3min，并收集菌体，得到表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体。
(3)催化反应：将表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体与L-苯丙氨酸和α-酮戊二酸共同加入PBS缓冲溶液中构成反应液，反应液的pH为10，反应液在42℃温度下在摇床中进行4h催化反应，得到催化产物；其中，反应液中：表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体的浓度为2.5g/L，L-苯丙氨酸浓度为8g/L，α-酮戊二酸浓度为8g/L。
首先将α-苯丙酮酸标准品分别配制成浓度为0g/L、0.2g/L、0.4g/L 0.6g/L、0.8g/L和1.0g/L的标准曲线样品，检测后制作出标准曲线，制得的标准曲线方程为y＝3×107X+245374(R2＝0.9971)。将催化产物离心后吸取上清液经过滤膜处理，经高效液相色谱仪在210nm检测，液相检测条件为：C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A为乙腈，B为0.15％磷酸溶液；流量为1.0mL/min；柱温30℃；检测波长210nm；进样量20μL。梯度洗脱条件为：0-6.0min时，A为25％；6.01-10.0min时，A由25％升至50％，并继续保持6min；16.0-16.01min时，A由50％降至25％，并保持4min重复检测三次，并计算平均值，计算得到α-苯丙酮酸的浓度为6.6g/L，转化率为82.5％。
实施例4催化反应中催化底物浓度对催化效率的影响
将实施例1中步骤(3)中反应液中的L-苯丙氨酸和α-酮戊二酸的浓度分别同时替换为2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L进行催化反应，其它步骤和条件均同实施例1。经高效液相色谱仪检测，由图7可知，底物L-苯丙氨酸和α-酮戊二酸的浓度为6g/L时，底物转化率最高，达到最大值88％；当L-苯丙氨酸和α-酮戊二酸浓度低于6g/L时，底物转化率随着底物浓度的上升而不断上升；随着L-苯丙氨酸和α-酮戊二酸浓度的继续上升，底物转化率呈不断下降趋势，这是因为较高的底物浓度会影响酶的活性位点的催化作用，抑制α-苯丙酮酸的生成。因此，当物L-苯丙氨酸和α-酮戊二酸的浓度为6g/L时，底物转化率达到最高。
实施例5催化反应中反应液的pH对催化效率的影响
将实施例1中步骤(3)中反应液的pH分别替换为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，进行催化反应，其它步骤和条件均同实施例1。经高效液相色谱仪检测，由图8可知，当反应液pH由5.0上升至10.0时，底物转化率随之提高，当pH 9.0时，底物转化率达到最高，转化率为69.7％，这是因为过酸的环境会影响蛋白活性位点氨基酸的解离从而影响酶的活性降低产物α-苯丙酮酸的生成。因此，当反应液的pH为9.0时，底物转化率达到最高。
实施例6催化反应中反应温度对催化效率的影响
将实施例1中步骤(3)中催化反应的反应温度分别替换为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃五个温度梯度，进行催化反应，其它步骤和条件均同实施例1。经高效液相色谱仪检测，由图9可知，当反应温度由25℃升高至40℃时，底物转化率随之升高，即α-苯丙酮酸的产量随之提高；当反应温度达40℃时，底物转化率最高，转化率为58.8％；当反应温度从40℃提高至45℃，产量逐渐降低，这是因为所用的转氨酶不耐高温，较高的环境温度会影响酶的空间结构从而影响酶的催化活性。因此，当催化反应的反应温度为40℃时，底物转化率达到最高。
实施例7催化反应中表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体的浓度对催化效率的影响
将实施例1中步骤(3)中催化反应中表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体的浓度分别替换为0.8g/L、1.2g/L、1.6g/L、2g/L和2.4g/L，进行催化反应，其它步骤和条件均同实施例1。经高效液相色谱仪检测，由图10可知，当表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体的浓度从0.8g/L增加到2.0g/L时，底物转化率呈不断上升的趋势，当表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体的浓度达到2.0g/L时，底物转化率最高，转化率为83.2％；而当表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体的浓度大于2.0g/L时，产量呈现明显下降的趋势，这是由于当表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体密度过高会造成菌体和底物的接触机会变少，同时增加了反应体系中氧气的消耗，从而降低了α-苯丙酮酸的产量。因此，当催化反应中表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体的浓度为2.0g/L时，底物转化率达到最高。
实施例8催化反应的反应时间对催化效率的影响
将实施例1中步骤(3)中催化反应的反应时间替换为6h，进行催化反应，其它步骤和条件均同实施例1。从1h开始至6h，每隔1h从反应液中取1mL进行α-苯丙酮酸产率的检测，经高效液相色谱仪检测，由图11可知，当反应时间在1h至3h之间，随着反应时间的增长，底物转化率升高，即α-苯丙酮酸的产率逐渐升高；当反应时间为3h时，底物转化率最高(为73.3％)，即α-苯丙酮酸的产率达到最高，当反应时间在3h之后，底物转化率降低，即α-苯丙酮酸的产率逐渐降低，这是因为随着时间的增加，酶催化反应不断进行，但当时间过长，由于其α-苯丙酮酸的浓度达到一定的量，被细胞中其他的酶所利用，导致产物生成量降低。因此，当催化反应的反应时间为3h时，底物转化率达到最高。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。

Claims (8)

1.一种制备苯丙酮酸的方法，其特征在于，首先将转氨酶基因ata插入pET28a质粒构建转氨酶重组大肠杆菌菌体，再进行诱导表达得到表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体，最后将表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体与L-苯丙氨酸进行催化反应得到α-苯丙酮酸；所述表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体的浓度为2.0 g/L，L-苯丙氨酸浓度为6 g/L；其中，催化反应的条件为：pH 为8.0-10，反应时间为2.5-4.0 h，反应温度为35-42℃；诱导表达的条件为：OD600为0.5-0.8，诱导剂浓度为0.1-0.8 mmol/L，诱导时间为6-12 h，诱导温度为22-30℃；转氨酶基因ata由Arthrobacter sp.基因组中提取获得。
2.根据权利要求1所述的制备苯丙酮酸的方法，其特征在于，所述催化反应的过程为：将表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体与L-苯丙氨酸和α-酮戊二酸共同加入PBS缓冲溶液中构成反应液，反应液在摇床中进行催化反应，得到α-苯丙酮酸。
3.根据权利要求2所述的制备苯丙酮酸的方法，其特征在于，α-酮戊二酸浓度为4-8 g/L。
4.根据权利要求3所述的制备苯丙酮酸的方法，其特征在于，α-酮戊二酸浓度为5-7 g/L。
5.根据权利要求1所述的制备苯丙酮酸的方法，其特征在于，所述诱导表达过程为：将转氨酶重组大肠杆菌菌体在37 ℃进行摇床培养，当菌体OD600为0.5-0.8时，加入终浓度为0.1-0.8 mmol/L诱导剂再在22-30℃温度下诱导反应6-12 h，离心并收集菌体，得到表达转氨酶基因的大肠杆菌菌体。
6.根据权利要求5所述的制备苯丙酮酸的方法，其特征在于，所述诱导剂为IPTG。
7.根据权利要求5所述的制备苯丙酮酸的方法，其特征在于，所述摇床培养的速率为100-500 rpm/min。
8.根据权利要求1所述的制备苯丙酮酸的方法，其特征在于，所述转氨酶重组大肠杆菌菌株的构建方法为：先PCR扩增转氨酶基因得到扩增产物，再用NcoI和XhoI双酶切PCR扩增产物，并将双酶切后的产物插入pET28a质粒得到连接有转氨酶的pET28a质粒，最后将连接有转氨酶的pET28a质粒转化BL21感受态细胞，得到转氨酶重组大肠杆菌菌体。
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