CN113249364B

CN113249364B - 一种含谷氨酸脱羧酶全细胞的工业化发酵生产方法

Info

Publication number: CN113249364B
Application number: CN202110537348.4A
Authority: CN
Inventors: 袁建国; 张言慧
Original assignee: Shandong National Biotechnology Research Institute; Shandong Guoli Biological Science And Technology Co ltd
Current assignee: Shandong National Biotechnology Research Institute; Shandong Guoli Biological Science And Technology Co ltd
Priority date: 2021-05-17
Filing date: 2021-05-17
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2041-05-17
Also published as: CN113249364A

Abstract

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种含谷氨酸脱羧酶全细胞的工业化发酵生产方法。所述方法包括以下步骤：具有遗传稳定性谷氨酸脱羧酶工程菌的构建或选育；将所得工程菌进行种子液培养；将种子液接种到发酵培养基中，于2000L发酵罐中进行发酵；发酵过程中控制发酵液溶氧量，通气量和pH；流加碳源和氮源。本发明方法通过采用具有遗传稳定性的谷氨酸脱羧酶重组菌，适宜的发酵培养基和高密度发酵工艺，实现了2000 L工业化发酵生产，生产所得γ‑氨基丁酸浓度可以达到539.8g/L，谷氨酸脱羧酶酶活高达661.5U/mL。

Description

一种含谷氨酸脱羧酶全细胞的工业化发酵生产方法

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种含谷氨酸脱羧酶全细胞的工业化发酵生产方法。

背景技术

γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，是中枢神经系统中重要的抑制性神经传导物质，主要存在于脑和骨髓中。γ-氨基丁酸具有多种生理功能，包括镇静、抗惊厥、治疗癫痫病；改善肝脏、肾脏功能；降低血压；调节激素分泌；延缓衰老；增强记忆；提高生殖活性；能促进胰岛细胞中胰岛素的分泌，有效地预防糖尿病。此外，γ-氨基丁酸还具有其它一些生理功能，如预防肥胖，促进酒精代谢，调节心律失常，防止动脉硬化以及防止皮肤老化等作用。γ-氨基丁酸还能够治疗尿毒症以及一氧化碳中毒。

采用谷氨酸脱羧酶或能够生产谷氨酸脱羧酶的微生物全细胞脱去L-谷氨酸的α-羧基可生产得到γ-氨基丁酸。谷氨酸脱羧酶或能够生产谷氨酸脱羧酶的微生物全细胞的工业化生产是实现GABA规模化生产的一个重要途径。目前研究多集中于谷氨酸脱羧酶工程菌的构建或小试发酵方法的研究。如专利申请CN110734904A公开了一种生产谷氨酸脱羧酶的方法以食品级枯草芽孢杆菌为宿主构建得到了可表达谷氨酸脱羧酶的重组枯草芽孢杆菌；利用此重组枯草芽孢杆菌可生产得到食品级谷氨酸脱羧酶以及食品级γ-氨基丁酸。中国发明专利CN104099366B公开了一种谷氨酸脱羧酶重组质粒及其构建方法，所述重组质粒是通过将谷氨酸脱羧酶基因gadB与麦芽糖启动子pamyE拼接后，插入到穿梭表达载体pEKEx2中形成的重组质粒pEKEx2-pamyE-gadB。中国发明专利CN112391372A公开了一种谷氨酸脱羧酶突变体、基因工程菌通过蛋白质工程改造植物乳杆菌源的谷氨酸脱羧酶，拓宽了该蛋白催化pH活性范围；改造后的GadB基因与GadC基因共同连接于pNZ8149载体中，在乳酸乳球菌NZ3900中表达；在发酵罐中培养重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-gadBΔC11C，用于转化谷氨酸钠生产食品级GABA。然而该方法仍处于小试发酵(2L)阶段。

目前尚未有关谷氨酸脱羧酶或能够生产谷氨酸脱羧酶的微生物全细胞工业化发酵生产的报道。

发明内容：

本发明主要目的在于提供一种谷氨酸脱羧酶和/或含谷氨酸脱羧酶全细胞的工业化发酵生产方法。本发明方法通过采用具有遗传稳定性的谷氨酸脱羧酶重组菌，适宜的发酵培养基和高密度发酵工艺，实现了2000L工业化发酵生产，生产所得谷氨酸脱羧酶酶活高达661.5U/mL。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种谷氨酸脱羧酶和/或含谷氨酸脱羧酶全细胞的工业化发酵生产方法，其包括以下步骤：

具有遗传稳定性谷氨酸脱羧酶工程菌的构建或选育；将所得工程菌进行种子液培养；将种子液接种到发酵培养基中，于2000L发酵罐中进行发酵；发酵过程中控制发酵液溶氧量，通气量和pH；流加碳源和氮源。

进一步地，所述工程菌以E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET28a(+)为载体，表达谷氨酸脱羧酶GadB基因，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述工程菌发酵培养基由以下成分及配比组成：玉米浆8～45g/L、蛋白胨5～22g/L、酵母粉4～16g/L、氯化钠2～10g/L、硫酸镁0.2～8g/L、氯化钙0.1～2g/L、硫酸亚铁0.1～2g/L、L-谷氨酸钠1～50g/L、甘油7～15g/L、氯化铵0.1～10g/L、尿素0.5～15g/L、磷酸氢二钾2～30g/L g/L、磷酸二氢钾0.5～25g/L，溶剂为水。

进一步地，所述工程菌在发酵过程中添加IPTG或乳糖进行诱导。

进一步地，发酵过程中控制发酵液溶氧量为15～20％，搅拌转速为150～300rpm，通气量为1～2vvm；发酵液pH值控制在6.5～7.5。

进一步地，待发酵至溶氧开始回升时流加碳源，最大流加速率为15～25mL/(L·h)，所述碳源为甘油或葡萄糖。

进一步地，在发酵2～6h开始流加氮源，最大流加速率为2～5mL/(L·h)。

本发明还提供一种γ-氨基丁酸工业化制备方法，包括以下步骤：

采用以上所述方法制备含谷氨酸脱羧酶的全细胞；

将制备的含谷氨酸脱羧酶的全细胞按照菌体湿重30-60g/L加入到水中，加入1000-1400g/L L-谷氨酸，1-3.0g/L硫酸镁，0.1-0.5g/L磷酸吡哆醛；在35-45℃下反应，控制反应液pH值在4.0-5.0。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

本发明方法实现了谷氨酸脱羧酶和/或含谷氨酸脱羧酶全细胞的工业化发酵生产，生产所得谷氨酸脱羧酶酶活高达661.5U/mL。本发明方法为γ-氨基丁酸的工业化生产奠定了基础。

附图说明

图1：谷氨酸脱羧酶催化反应示意图。

图2：实施例1中构建的重组质粒。

图3：实施例1中酶切鉴定核酸电泳图谱，其中条带1为酶切前重组质粒，条带2为酶切后重组质粒，M为DNA Marker。

图4：实施例3中温度对谷氨酸脱羧酶活性的影响。

图5：实施例3中pH对谷氨酸脱羧酶活性的影响。

图6：实施例5中甘油氨水流加速率曲线。

图7：实施例5中菌体生长与比生长速率变化曲线。

图8：实施例6中转化液中γ-氨基丁酸浓度变化过程曲线。

图9：实施例6中转化液液相检测图谱。

图10：实施例6中γ-氨基丁酸标品液相检测图谱。

图11：实施例6中谷氨酸钠与γ-氨基丁酸混标液相检测图谱。

图12：γ-氨基丁酸生产技术路线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

使用高效液相色谱仪测定转化液中的γ-氨基丁酸浓度，色谱柱为C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长为210nm；流动相为0.1％高氯酸用氢氧化钠调节pH至3.0，抽滤后与色谱级乙腈以9:1的比例混合即得。流速为0.8mL/min，柱温为30℃；进样量为20μL；分析时间12min。

谷氨酸脱羧酶活性检测：配制0.2mol/L醋酸钠溶液，用醋酸调节pH至4.4。用上述醋酸-醋酸钠缓冲液配制100g/L的L-谷氨酸钠、5g/L的七水硫酸镁、1g/L的磷酸吡哆醛混合反应液，并将反应液在40℃水浴锅中预热15min。取1mL发酵液离心留菌体待用，取5mL预热后的反应液悬浮上述菌体，然后于40℃条件下水浴反应5min，最后立即煮沸终止反应，离心取上清用HPLC检测γ-氨基丁酸含量从而计算出酶活。

实施例1：谷氨酸脱羧酶工程菌构建

1.谷氨酸脱羧酶工程菌构建

采用基因合成的方法获得谷氨酸脱羧酶目的基因片段，基因工程菌中谷氨酸脱羧酶的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据重组质粒序列，设计首尾引物如下。

正向引物F：5’-AATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGATAAGAAGCAAGTAACGGATTTAA-3’；

反向引物R：5’-AGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGGTATGTTTAAAGCTGTTCTGTTG-3’。

PCR反应体系和条件如下：

PCR扩增体系：

PCR扩增条件：

(1)预变性：95℃3min；

(2)变性：95℃20s；退火：55℃20s；延伸：72℃20s；循环30次；

(3)延伸：72℃10min；

(4)4℃保存。

将处理好的目的片段与载体连接反应体系为：

PCR产物 5μL

酶切后的载体 5μL

Gibson重组酶 10μL

以上连接液在50℃连接30min得重组质粒，重组质粒构建图谱见图2。

将质粒浓度在100ng/μL左右的质粒吸取1-3μL加入到100μL左右的感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置3min。42℃水浴90s不要摇动。冰浴中放置3min左右。每管中加入500-800μL 37℃预温LB培养基，37℃摇床200rpm振荡40min。

制备含相应抗性的琼脂平板。取100μL菌液，然后平铺在含有相应抗性的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面。倒置平板于37℃培养16h可出现菌落。平板挑菌，在37℃，250rpm条件下摇菌14h，用菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆菌送测序，从而获得正确构建的基因工程菌株。重组质粒酶切电泳图谱如图3所示。

实施例2：摇瓶验证试验

发酵培养基为：蛋白胨10g/L、酵母粉8g/L、氯化钠15g/L、硫酸镁1g/L、氯化钙0.3g/L、硫酸亚铁0.3g/L、L-谷氨酸钠3g/L、甘油10g/L、氯化铵1g/L、磷酸氢二钾10g/L、磷酸二氢钾3g/L、十二水磷酸氢二钠15g/L、柠檬酸2g/L。摇瓶装量是50mL/500mL，温度37℃，pH7.0，摇床转速200rpm。发酵培养6h后加入终浓度为0.3mmol/L IPTG开始诱导，诱导后培养温度调整为30℃，发酵周期24h。发酵结束后离心收集菌体用于转化。转化体系组成为全细胞菌体20g/L，谷氨酸100g/L，硫酸镁4.8g/L，磷酸吡哆醛0.5g/L。于30℃条件下反应3h后转化结束，谷氨酸沉淀完全消失，液相检测γ-氨基丁酸浓度为68.9g/L，转化率为98.5％。

实施例3：发酵培养基优化

为了与工业化大生产接轨，一方面提高谷氨酸脱羧酶酶活，增加γ-氨基丁酸产量；另一方面降低生产成本，特对发酵培养基进行了优化。初始发酵培养基为：甘油10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉8g/L、氯化钠15g/L、硫酸镁1g/L、氯化钙0.3g/L、硫酸亚铁0.3g/L、L-谷氨酸钠3g/L、氯化铵1g/L、柠檬酸2g/L、磷酸氢二钾10g/L、磷酸二氢钾3g/L、十二水磷酸氢二钠15g/L。

优化培养基2为：葡萄糖10g/L、玉米浆15g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉8g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁1g/L、氯化钙0.3g/L、硫酸亚铁0.3g/L、L-谷氨酸钠3g/L、氯化铵1g/L、磷酸氢二钾7g/L、磷酸二氢钾1.4g/L。

优化培养基3为：葡萄糖10g/L、玉米浆15g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉8g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁1g/L、氯化钙0.3g/L、硫酸亚铁0.3g/L、L-谷氨酸钠3g/L、氯化铵1g/L、柠檬酸2g/L、磷酸氢二钾7g/L、磷酸二氢钾1.4g/L。

优化培养基4为：葡萄糖10g/L、甘油10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉8g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁1g/L、氯化钙0.3g/L、硫酸亚铁0.3g/L、L-谷氨酸钠3g/L、氯化铵1g/L、磷酸氢二钾7g/L、磷酸二氢钾1.4g/L。

优化培养基5为：甘油10g/L、玉米浆15g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉8g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁1g/L、氯化钙0.3g/L、硫酸亚铁0.3g/L、L-谷氨酸钠3g/L、氯化铵1g/L、磷酸氢二钾7g/L、磷酸二氢钾1.4g/L。

优化培养基6为：甘油10g/L、玉米浆15g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉8g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁1g/L、氯化钙0.3g/L、硫酸亚铁0.3g/L、L-谷氨酸钠3g/L、氯化铵1g/L、尿素3g/L、磷酸氢二钾7g/L、磷酸二氢钾1.4g/L。

将重组菌种子液以3％的接种量分别接种于上述培养基中进行发酵培养，并加入终浓度为50μg/mL的硫酸卡那霉素抗性筛选，摇瓶装量是50mL/500mL，温度37℃，pH7.0，摇床转速200rpm。发酵培养6h后加入终浓度为0.3mmol/L IPTG开始诱导，诱导后培养温度调整为30℃，发酵周期24h。发酵结束后离心收集菌体细胞转化，分别加入L-谷氨酸100g/L、硫酸镁2.0g/L、磷酸吡哆醛0.5g/L，在30℃、160rpm的摇床中进行反应。实验结果见下表：

实验组	初始培养基	优化2	优化3	优化4	优化5	优化6
							菌体湿重(g/L)	19.5	20.8	22.3	17.8	23.4	26.6
GABA浓度(g/L)	52.6	59.6	64.7	55.2	66.3	69.8

从表中实验结果可以看出，优化培养基6在菌体生物量与γ-氨基丁酸两个考察指标上均是最高的，比初始培养基分别高出36.4％与32.7％。所以培养基最终选择为：甘油10g/L、玉米浆15g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉8g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁1g/L、氯化钙0.3、硫酸亚铁0.3g/L、L-谷氨酸钠3g/L、氯化铵1g/L、尿素3g/L、磷酸氢二钾7g/L、磷酸二氢钾1.4g/L。

实施例4：谷氨酸脱羧酶最适转化条件的优化

为了进一步提高生产效率，特对谷氨酸脱羧酶的最适反应温度与最适反应pH进行了研究。优化实验以检测酶活的方式进行，选取25℃、30℃、35℃、40℃、45℃五种不同的反应温度检测谷氨酸脱羧酶的酶活。从图4可以看出，谷氨酸脱羧酶在40℃条件下活性最高，在摇瓶培养条件下，酶活达到125.6U/mL。温度确定以后，另外选取pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5四种不同的pH检测摇瓶发酵液全细胞催化剂的酶活，实验结果见图5，从图中可以看到在最适温度条件下，pH4.5条件下谷氨酸脱羧酶活性最高，达到了165.2U/mL。

实施例5：15L发酵罐高密度发酵培养

1.谷氨酸脱羧酶工程菌的种子液的培养

取甘油管接种于培养皿平板上活化菌种，培养时间24h；将培养皿平板保存于4℃冰箱；用接种环在无菌条件下挖取一环平板种子接种于种子培养基中(50mL/500mL锥形瓶)。培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH自然，在121℃，0.1Mpa压力下灭菌20min。然后将接种后的种子摇瓶在37℃、180rpm的恒温气浴摇床中培养16h得到小试发酵的种子培养液。

2.谷氨酸脱羧酶工程菌的高密度发酵培养方法

采用15L发酵罐进行了谷氨酸脱羧酶高密度细胞培养小试发酵工艺的研究，装液量为7.5L。

将步骤1培养得到的种子液按3％的接种量接入到发酵培养基中，温度控制在37℃，搅拌转速为200rpm，通气量为1.5vvm，发酵至OD₆₀₀为14.6时加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，开始在30℃下诱导。

所用发酵培养基为：玉米浆15g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉8g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁1g/L、氯化钙0.3g/L、硫酸亚铁0.3g/L、L-谷氨酸钠3g/L、甘油10g/L、氯化铵1g/L、尿素2g/L、磷酸氢二钾7g/L、磷酸二氢钾1.4g/L，溶剂为水。

发酵进行至4.5h时溶氧开始回升，此时开始流加浓度为50％v/v的甘油，整个发酵过程共流加浓度为50％v/v甘油22.5％，最高流加速率为19.8mL/(L·h)。从发酵5.5h开始流加浓度为28％v/v氨水，氨水既做氮源又用来调节pH，整个发酵过程共流加氨水2.5％，氨水流加的最高速率为2.3mL/(L·h)。甘油及氨水流加速率曲线如图6所示。甘油刚开始时加入105mL以使发酵罐初始碳源浓度为7.0g/L，通气量调节至1.2vvm，并提高搅拌转速将溶氧控制在20％，随着菌体的生长，菌体的耗氧速率逐渐增加，需要逐渐提升碳源流加速度。氨水根据碳源的消耗速率自动流加，发酵过程中pH值控制在6.8。

发酵24h结束后，菌体OD₆₀₀最后为105.3，采用50nm陶瓷膜收集含谷氨酸脱羧酶的全细胞菌体，并用去离子水洗涤三遍，所得菌体湿重为135.6g/L，菌体干重(DCW)为36.8g/L，酶活为632.5U/mL。DCW及比生长速率变化曲线如图7所示。

实施例6：15L发酵罐全细胞转化及γ-氨基丁酸提取纯化

1.利用菌体全细胞催化L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸的方法

高密度发酵结束后，将实施例5中所得过膜浓缩液按照菌体湿重30g/L的添加量加入9L纯化水中，然后再加入1400g/L L-谷氨酸(12.6kg)，3.0g/L硫酸镁(27g)，0.5g/L磷酸吡哆醛(4.5g)。温度控制在40℃，pH用磷酸控制在4.4。反应开始后由于谷氨酸脱羧会生成CO₂，从而产生大量的气泡，可加入少量消泡剂进行消泡。中间过程每隔2小时取样检测γ-氨基丁酸浓度，转化液中γ-氨基丁酸变化过程曲线如图8所示。随着反应的进行固体L-谷氨酸转变为γ-氨基丁酸并溶于水中，转化反应结束后，反应液体积为14.5L，检测转化液中γ-氨基丁酸浓度为608.5g/L，转化率接近100％，为99.6％。将转化液过50nm陶瓷膜过滤，收集上清液用于后续的提取纯化，分离所得全细胞酶液可以用于下次继续转化L-谷氨酸生产γ-氨基丁酸。转化液液相检测色谱图如图9所示，γ-氨基丁酸标品液相检测色谱图如图10所示，γ-氨基丁酸与L-谷氨酸钠混标液相检测色谱图如11所示。

2.γ-氨基丁酸转化液的浓缩结晶

将步骤1中收获的转化上清液过5kDa超滤膜，收集穿出液。向穿出液中加入γ-氨基丁酸质量2％的活性炭脱色。取1000mL脱色液用旋转蒸发仪在60℃条件下真空浓缩，使γ-氨基丁酸的浓度浓缩至700g/L左右。然后取浓缩液降温析晶，在2-8℃下滴加200mL乙醇，并以80rpm转速搅拌养晶3h后抽滤，放于40℃真空烘干，得到固体干重为584.8g，计算晶体收率为96.1％。

重结晶：将初次结晶样品在60℃条件下加水440mL，完全溶解后体积约830mL，此时γ-氨基丁酸浓度约700g/L。此溶液首先自然降温，然后冰水浴降温至2-8℃，并低速搅拌析晶。搅拌养晶结束后开始抽滤，将抽滤所得晶体真空烘干，即得成品γ-氨基丁酸530.6g，计算晶体总收率为87.2％。检测晶体含量为99.7％。

实施例7：2000L发酵罐进行高密度发酵培养

1.谷氨酸脱羧酶工程菌的种子液的培养

取甘油管接种于培养皿平板上活化菌种，培养时间26h；将培养皿平板保存于4℃冰箱；用接种环在无菌条件下挖取一环平板种子接种于种子培养基中(1L/3L锥形瓶)。培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH自然，在121℃，0.1Mpa压力下灭菌20min。然后将接种后的种子摇瓶在37℃、180rpm的恒温气浴摇床中培养16h得到一级种子培养液。将摇瓶种子液接种于200L种子罐中，发酵罐装料量100L，接种量3％。培养基组成为：玉米浆10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 12g/L，磷酸二氢钾5g/L，NaCl10g/L，pH 7.0，在121℃，0.1Mpa压力下灭菌20min。通气量为1.2vvm，培养至OD₆₀₀为3.0左右后，种子进入对数生长期，得到二级种子液，可以将其接种于2000L规模的发酵罐。

2.谷氨酸脱羧酶工程菌的高密度发酵培养方法

采用2000L发酵罐进行培养，装液量为1000L。

将步骤1中培养得到的二级种子液按3％的接种量接入到1000L发酵培养基中，温度控制在37℃，搅拌转速为200rpm，通气量为1.5vvm，发酵至OD₆₀₀为12.3时，发酵时间6h加入终浓度为0.45mmol/L的IPTG，开始在30℃下诱导。

发酵培养基为：玉米浆23g/L、蛋白胨15g/L、酵母粉12g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁1g/L、氯化钙0.3g/L、硫酸亚铁0.3g/L、L-谷氨酸钠3g/L、甘油10g/L、氯化铵2g/L、尿素2g/L、磷酸氢二钾7g/L g/L、磷酸二氢钾1.4g/L，pH7.0，在121℃，0.1Mpa压力下灭菌20min。

发酵进行至4.8h时溶氧开始回升，此时开始流加浓度为50％甘油，整个发酵过程共流加18.5％，最大流加速率为24.5mL/(L·h)。从发酵2.5h开始流加浓度为26％的氨水，氨水既做氮源又用来调节pH，整个发酵过程共流加氨水6.5％，最大流加速率为2.5mL/(L·h)。甘油刚开始时加入7L以使发酵罐初始碳源浓度为3.5g/L。发酵过程中pH控制在7.0。

发酵24h结束后，菌体OD₆₀₀最后为106.2。采用碟片式离心机收集含谷氨酸脱羧酶的全细胞菌体，并用去离子水洗涤三遍，所得菌体湿重为146g/L，酶活为661.5U/mL。

实施例8:2000L发酵罐全细胞转化及γ-氨基丁酸提取纯化

1.利用含谷氨酸脱羧酶菌体全细胞催化L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸的方法

高密度发酵结束后，将实施例7中所得全细胞催化剂按照菌体湿重60g/L的添加量加入1000L水中，然后再加入1200g/L的L-谷氨酸(1200kg)，1kg硫酸镁，100g磷酸吡哆醛。温度控制在42℃，pH用磷酸控制在4.8左右。反应结束后总体积为1550L，中间过程每隔2小时取样检测γ-氨基丁酸与L-谷氨酸浓度。转化结束后，将转化液采用碟片式离心机进行离心收集上清液，检测上清液γ-氨基丁酸浓度为539.8g/L，转化率为99.5％。上清液用于后续的浓缩结晶，分离所得全细胞菌体可以用于下次继续转化L-谷氨酸生产γ-氨基丁酸。

2.γ-氨基丁酸转化液的浓缩结晶

将步骤1中收获的转化上清液过5kDa超滤膜，收集穿出液。然后向穿出液中加入γ-氨基丁酸质量2％的活性炭脱色。取1000mL脱色液用旋转蒸发仪在50℃条件下真空浓缩，使γ-氨基丁酸的浓度为750g/L。然后取浓缩液降温析晶，在2-8℃下滴加300mL乙醇，并以80rpm转速搅拌养晶4.5h后抽滤，放于40℃真空烘干，得到固体干重为519.2g，计算晶体收率为96.2％。

重结晶：将初次结晶样品在60℃条件下加水溶解并定容至690mL，此时γ-氨基丁酸浓度为750g/L，然后降温至2-8℃，并低速搅拌析晶。搅拌养晶结束后开始抽滤，将抽滤所得晶体真空烘干，即得成品γ-氨基丁酸466.9g，计算晶体总收率为86.5％。检测晶体含量为99.9％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 山东国力生物科技有限公司山东国力生物技术研究院

<120> 一种含谷氨酸脱羧酶全细胞的工业化发酵生产方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atggataaga agcaagtaac ggatttaagg tcggaactac tcgattcacg ttttggtgcg 60

aagtctattt ccactatcgc agaatcaaaa cgttttccgc tgcacgaaat gcgcgacgat 120

gtcgcattcc agattatcaa tgacgaatta tatcttgatg gcaacgctcg tcagaacctg 180

gccactttct gccagacctg ggacgacgaa aatgtccaca aattgatgga tttatccatt 240

aacaaaaact ggatcgacaa agaagaatat ccgcaatccg cagccatcga cctgcgttgc 300

gtaaatatgg ttgccgatct gtggcatgcg cctgcgccga aaaatggtca ggccgttggc 360

accaacacca ttggttcttc cgaggcctgt atgctcggcg ggatggcgat gaaatggcgt 420

tggcgcaagc gtatggaagc tgcaggcaaa ccaacggata aaccaaacct ggtgtgcggt 480

ccggtacaaa tctgctggca taaattcgcc cgctactggg atgtggagct gcgtgagatc 540

cctatgcgcc ccggtcagtt gtttatggac ccgaaacgca tgattgaagc ctgtgacgaa 600

aacaccatcg gcgtggtgcc gactttcggc gtgacctaca ctggtaacta tgagttccca 660

caaccgctgc acgatgcgct ggataaattc caggccgata ccggtatcga catcgacatg 720

cacatcgacg ctgccagcgg tggcttcctg gcaccgttcg tcgccccgga tatcgtctgg 780

gacttccgcc tgccgcgtgt gaaatcgatc agtgcttcag gccataaatt cggtctggct 840

ccgctgggct gcggctgggt tatctggcgt gacgaagaag cgctgccgca ggaactggtg 900

ttcaacgttg actacctggg tggtcaaatt ggtacttttg ccatcaactt ctcccgcccg 960

gcgggtcagg taattgcaca gtactatgaa ttcctgcgcc tcggtcgtga aggctatacc 1020

aaagtacaga acgcctctta ccaggttgcc gcttatctgg cggatgaaat cgccaaactg 1080

gggccgtatg agttcatctg tacgggtcgc ccggacgaag gcatcccggc ggtttgcttc 1140

aaactgaaag atggtgaaga tccgggatac accctgtatg acctctctga acgtctgcgt 1200

ctgcgcggct ggcaggttcc ggccttcact ctcggcggtg aagccaccga catcgtggtg 1260

atgcgcatta tgtgtcgtcg cggcttcgaa atggactttg ctgaactgtt gctggaagac 1320

tacaaagcct ccctgaaata tctcagcgat cacccgaaac tgcagggtat tgcccaacag 1380

aacagcttta aacatacctg a 1401

<210> 2

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Asp Lys Lys Gln Val Thr Asp Leu Arg Ser Glu Leu Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Phe Gly Ala Lys Ser Ile Ser Thr Ile Ala Glu Ser Lys Arg Phe

20 25 30

Pro Leu His Glu Met Arg Asp Asp Val Ala Phe Gln Ile Ile Asn Asp

35 40 45

Glu Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Ala Arg Gln Asn Leu Ala Thr Phe Cys

50 55 60

Gln Thr Trp Asp Asp Glu Asn Val His Lys Leu Met Asp Leu Ser Ile

65 70 75 80

Asn Lys Asn Trp Ile Asp Lys Glu Glu Tyr Pro Gln Ser Ala Ala Ile

85 90 95

Asp Leu Arg Cys Val Asn Met Val Ala Asp Leu Trp His Ala Pro Ala

100 105 110

Pro Lys Asn Gly Gln Ala Val Gly Thr Asn Thr Ile Gly Ser Ser Glu

115 120 125

Ala Cys Met Leu Gly Gly Met Ala Met Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg

130 135 140

Met Glu Ala Ala Gly Lys Pro Thr Asp Lys Pro Asn Leu Val Cys Gly

145 150 155 160

Pro Val Gln Ile Cys Trp His Lys Phe Ala Arg Tyr Trp Asp Val Glu

165 170 175

Leu Arg Glu Ile Pro Met Arg Pro Gly Gln Leu Phe Met Asp Pro Lys

180 185 190

Arg Met Ile Glu Ala Cys Asp Glu Asn Thr Ile Gly Val Val Pro Thr

195 200 205

Phe Gly Val Thr Tyr Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Pro Gln Pro Leu His

210 215 220

Asp Ala Leu Asp Lys Phe Gln Ala Asp Thr Gly Ile Asp Ile Asp Met

225 230 235 240

His Ile Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Leu Ala Pro Phe Val Ala Pro

245 250 255

Asp Ile Val Trp Asp Phe Arg Leu Pro Arg Val Lys Ser Ile Ser Ala

260 265 270

Ser Gly His Lys Phe Gly Leu Ala Pro Leu Gly Cys Gly Trp Val Ile

275 280 285

Trp Arg Asp Glu Glu Ala Leu Pro Gln Glu Leu Val Phe Asn Val Asp

290 295 300

Tyr Leu Gly Gly Gln Ile Gly Thr Phe Ala Ile Asn Phe Ser Arg Pro

305 310 315 320

Ala Gly Gln Val Ile Ala Gln Tyr Tyr Glu Phe Leu Arg Leu Gly Arg

325 330 335

Glu Gly Tyr Thr Lys Val Gln Asn Ala Ser Tyr Gln Val Ala Ala Tyr

340 345 350

Leu Ala Asp Glu Ile Ala Lys Leu Gly Pro Tyr Glu Phe Ile Cys Thr

355 360 365

Gly Arg Pro Asp Glu Gly Ile Pro Ala Val Cys Phe Lys Leu Lys Asp

370 375 380

Gly Glu Asp Pro Gly Tyr Thr Leu Tyr Asp Leu Ser Glu Arg Leu Arg

385 390 395 400

Leu Arg Gly Trp Gln Val Pro Ala Phe Thr Leu Gly Gly Glu Ala Thr

405 410 415

Asp Ile Val Val Met Arg Ile Met Cys Arg Arg Gly Phe Glu Met Asp

420 425 430

Phe Ala Glu Leu Leu Leu Glu Asp Tyr Lys Ala Ser Leu Lys Tyr Leu

435 440 445

Ser Asp His Pro Lys Leu Gln Gly Ile Ala Gln Gln Asn Ser Phe Lys

450 455 460

His Thr

465

Claims

1.一种含谷氨酸脱羧酶全细胞的工业化发酵生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建或选育遗传稳定性表达谷氨酸脱羧酶的工程菌；将所得工程菌进行种子液培养，获得一级、二级种子液；培养得到的二级种子液按3％的接种量接入到1000L发酵培养基中，温度控制在37℃，搅拌转速为200rpm，通气量为1.5vvm，发酵至OD₆₀₀为12.3时，发酵时间6h加入终浓度为0.45mmol/L的IPTG，开始在30℃下诱导；发酵进行至4.8h时溶氧开始回升，开始流加浓度为50％的甘油，整个发酵过程共流加18.5％v/v的甘油，最大流加速率为24.5mL/(L·h)；从发酵2.5h开始流加浓度为26％的氨水，整个发酵过程共流加氨水6.5％v/v，最大流加速率为2.5mL/(L·h)；

所述发酵培养基为：玉米浆23g/L、蛋白胨15g/L、酵母粉12g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁1g/L、氯化钙0.3g/L、硫酸亚铁0.3g/L、L-谷氨酸钠3g/L、甘油10g/L、氯化铵2g/L、尿素2g/L、磷酸氢二钾7g/L、磷酸二氢钾1.4g/L，pH7.0；

所述工程菌以E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET28a(+)为载体，重组表达谷氨酸脱羧酶GadB基因，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。