CN109722402A - 一种全细胞转化生产γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种全细胞转化法生产γ‑氨基丁酸的方法。以谷氨酸棒杆菌为生产菌株，异源表达巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶，通过高密度发酵培养，获得蛋白过表达的谷氨酸棒杆菌菌体细胞。以L‑谷氨酸或L‑谷氨酸盐为底物，利用谷氨酸棒杆菌全细胞催化生产γ‑氨基丁酸。本发明使用了催化活性高的谷氨酸脱羧酶和食品安全级的生产菌株谷氨酸棒杆菌来生产γ‑氨基丁酸，具有γ‑氨基丁酸产量高，转化液成分单一，生产周期短，操作简单、生产成本低及无安全隐患等优点。

Description

一种全细胞转化生产γ-氨基丁酸的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及以谷氨酸棒杆菌为生产菌株，通过全细胞转化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐高效生产γ-氨基丁酸。

背景技术

γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然存在的功能性非蛋白质氨基酸，具有增进脑活力、降血压、抗焦虑、调节激素分泌、治疗癫痫和保肝护肾等生理功能，在食品、医药保健、饮料加工^[1]、化妆品等领域具有广泛的应用前景和市场需求^[2]。γ-氨基丁酸的制备方法主要有化学合成、植物富集、微生物发酵和生物转化。化学合成法条件苛刻、能耗大、成本高、得率低且安全性差，不能用于食品、药品等领域。植物富集GABA含量低，不适于规模化生产。微生物发酵法生产周期长、生产得率较低且后续分离提取较为困难，使其工业化应用受到限制。生物转化法即全细胞转化法由于具有操作简便、条件温和、原料利用率高、转化率高且分离纯化成本低等优势，越来越受到青睐。

全细胞转化法生产γ-氨基丁酸需要谷氨酸脱羧酶(GAD)的催化作用，目前，通过表达外源谷氨酸脱羧酶实现γ-氨基丁酸生产的微生物有大肠杆菌、乳酸菌、谷氨酸棒杆菌和枯草芽孢杆菌。Plokhov利用重组大肠杆菌E.coli DADK10全细胞转化L-谷氨酸生产γ-氨基丁酸，产量可达280～300g/L^[3]。本实验室程海娇等利用来源于巨大芽孢杆菌中的GAD，构建大肠杆菌重组菌株，通过全细胞转化反应12h可将500g/L的L-谷氨酸生成347.9g/L的γ-氨基丁酸，摩尔转化率可达99.4％^[4]。张六六等在枯草芽孢杆菌中优化了GAD的表达及辅因子磷酸吡哆醛再生，通过全细胞催化底物L-谷氨酸24h，γ-氨基丁酸的产量可达327g/L^[5]。Kim等从韩国泡菜中分离到了短乳杆菌γ-氨基丁酸生产菌株，可催化50g/L的谷氨酸钠生成20g/L的γ-氨基丁酸，转化率约73％^[6]。Shi等利用来源于短乳杆菌中的GAD在谷氨酸棒杆菌中异源表达，γ-氨基丁酸产量达30.18g/L^[7]。由以上结果可知，大肠杆菌作为生产菌株生产γ-氨基丁酸具有较大优势，但在食品领域大肠杆菌生产γ-氨基丁酸存在食品安全隐患。因此利用食品安全级菌株生产γ-氨基丁酸是理想的选择。然而，目前报道的食品安全级菌株如乳酸菌或谷氨酸棒杆菌生产γ-氨基丁酸产量较低，无法满足工业化生产需求。

发明内容

本发明目的之一是提供一株基因工程菌，其特征在于，是表达了来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的谷氨酸脱羧酶的谷氨酸棒状杆菌，所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列是与SEQ ID NO.1具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上，最优选100％同源性的序列；所述谷氨酸棒杆菌优选为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(C.glutamicumATCC13032)，或谷氨酸棒状杆菌ATCC14020(C.glutamicum ATCC14020)，或谷氨酸棒状杆菌ATCC15990(C.glutamicum ATCC15990)，或谷氨酸棒状杆菌ATCC13032D-5(C.glutamicumATCC13032D-5)，或谷氨酸棒状杆菌ATCC14067(C.glutamicum ATCC14067)。

在优选的实施方式中，所述的基因工程菌，其特征在于，谷氨酸脱羧酶编码基因插入表达载体进行表达，所述表达载体能在宿主中表达目的基因，所述宿主为谷氨酸棒状杆菌，优选的所述表达载体为载体pDXW-6，或载体pDXW-7，或载体pDXW-8，或载体pDXW-9，或载体pDXW-10，或载体pJL23，或载体pJC1，或载体pEC-XK99E，或载体pCRA1，或载体pBKGEXm2，或载体pZ8-1，或载体pVWEx1，或载体pSL360，或载体pEC901，或载体pTRCmob，或载体pAPE12，或载体pXMJ19，更优选的载体pXMJ19。

本发明目的之二是提供一种γ-氨基丁酸的生产方法，包括如下步骤；

(a)培养本发明目的之一任一的基因工程菌；

(b)向步骤(a)得到的菌液加入诱导剂并培养；

(c)将步骤(b)得到的菌液离心获得菌泥；

(d)以L-谷氨酸或L-谷氨酸盐为原料，利用步骤(c)培养得到菌泥催化生成γ-氨基丁酸。

在优选的实施方式中，所述的生产方法，其特征在于，步骤(a)的培养温度为25～35摄氏度，步骤(a)培养直至菌液OD₆₀₀达到5～10。

在优选的实施方式中，本发明目的之二的上述的生产方法，其特征在于，所述的诱导剂为IPTG或乳糖，步骤(b)的培养温度为16～20摄氏度，步骤(b)培养时间3～6小时。

在更优选的实施方式中，本发明目的之二的上述的生产方法，所述诱导剂为IPTG，所述IPTG添加量为0.01～0.05mM。

在优选的实施方式中，本发明目的之二的上述的生产方法，其特征在于，步骤(d)中催化中菌泥的添加量为5～10g/L。

在优选的实施方式中，本发明目的之二的上述的的生产方法，其特征在于，催化体系中L-谷氨酸或L-谷氨酸盐的初始浓度为100～900g/L，优选的L-谷氨酸为600～800g/L，或优选的L-谷氨酸盐为680～900g/L；催化温度为20～25摄氏度；催化时间为5～24小时。

在优选的实施方式中，所述的生产方法，其特征在于，步骤(a)的培养温度为30摄氏度，步骤(a)培养直至菌液OD₆₀₀达到5～10；所述诱导剂为IPTG，所述IPTG添加量为0.01～0.05mM；步骤(d)中催化中菌泥的添加量为5～10g/L；催化体系中谷氨酸或谷氨酸盐的初始浓度分别为600～800g/L或680～900g/L，催化温度为20～25摄氏度，催化时间为5～24小时。

在更优选的实施方式中，所述的生产方法，其特征在于，γ-氨基丁酸产量420～600g/L，优选的为500g/L。

本发明的另一目的在于提供一种可降低成本且操作方便的谷氨酸棒杆菌高产γ-氨基丁酸的制备方法。

本发明的思路是：γ-氨基丁酸可通过L～谷氨酸脱羧反应获得，参与该脱羧反应的谷氨酸脱羧酶是一种5’-磷酸吡哆醛(PLP)依赖型酶。微生物细胞可为酶提供一个稳定的催化环境，利用微生物细胞直接作为酶源进行催化反应能够更高效，且可以避免酶从微生物细胞提取出来的步骤。因此，本发明构建了全细胞转化法用于生产γ-氨基丁酸。影响γ-氨基丁酸产量的因素可包括谷氨酸脱羧酶催化活力、酶的稳定性、酶最适反应条件(pH、催化温度、辅因子等)和酶的表达量等。γ-氨基丁酸作为功能性非天然氨基酸，用于食品、医药及饲料添加等，通过食品安全级微生物来生产γ-氨基丁酸是工业化生产的关键。已报到的谷氨酸脱羧酶一般活性较低且最适pH小于5.0，当pH大于6.0时酶活会急剧下降。本发明使用了一种新型的谷氨酸脱羧酶(BmGAD)，该酶催化活性高且在pH＝7时酶活仍非常稳定；并使用了公认的食品安全级菌株谷氨酸棒杆菌作为生产菌株，构建了携带有BmGAD的谷氨酸棒杆菌重组菌株。该重组菌株经发酵培养及添加一定浓度的诱导剂，可在细胞内大量合成目的蛋白BmGAD。然后利用表达蛋白后的重组菌株菌悬液，添加底物L-谷氨酸，经过全细胞催化反应，最终实现γ-氨基丁酸的高效生产。获得的转化液成分单一，只包括目标产物γ-氨基丁酸和菌体细胞且产物γ-氨基丁酸浓度可达500g/L以上，因此后期目标产物的分离提取相对简单，可简化产品除色、除杂、浓缩等步骤，将大大节约生产成本。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

一种全细胞转化法生产γ-氨基丁酸，包括如下步骤：构建谷氨酸脱羧酶表达载体；以谷氨酸棒杆菌为生产菌株并转入谷氨酸脱羧酶表达载体；重组菌株经添加诱导剂使谷氨酸脱羧酶大量表达，回收蛋白表达菌体并用水重悬；加入底物L-谷氨酸进行全细胞催化生产γ-氨基丁酸。

其中，所述的谷氨酸脱羧酶来源于巨大芽孢杆菌的BmGAD。

其中，对表达载体的种类没有特殊要求，可以为能够在谷氨酸棒杆菌中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体，优选的所述表达载体为载体pDXW-6，或载体pDXW-7，或载体pDXW-8，或载体pDXW-9，或载体pDXW-10，或载体pJL23，或载体pJC1，或载体pEC-XK99E，或载体pCRA1，或载体pBKGEXm2，或载体pZ8-1，或载体pVWEx1，或载体pSL360，或载体pEC901，或载体pTRCmob，或载体pAPE12，或载体pXMJ19，更优选的载体pXMJ19。。

其中，所述生产菌株选自于谷氨酸棒杆菌，优选的为C.glutamicum ATCC13032，或C.glutamicum ATCC14020，或C.glutamicum ATCC15990，或C.glutamicum ATCC13032D-5，或C.glutamicum ATCC14067。

重组菌株进行蛋白诱导条件包括诱导温度为16～20摄氏度。

其中，蛋白诱导时间为3～6小时。

所述诱导剂对应于使用的表达载体上启动子的类型，包括为IPTG、阿拉伯糖及四环素。

其中，诱导剂IPTG的浓度为0.01～0.05mM。

其中，全细胞转化使用的菌体量为按湿菌体5～10g/L，即对于总体积为1L的反应液，需加入5～10g/L湿菌体。

其中，底物L-谷氨酸或L-谷氨酸盐的起始反应的浓度为100～850g/L，优选的谷氨酸为600～800g/L。

其中，上述生产菌株的利用形式是经发酵培养及诱导蛋白表达后分离离心得到的细胞。

γ-氨基丁酸的生成反应在水溶液中进行，20～25摄氏度条件下反应5～24小时。

本发明全细胞催化反应生产γ-氨基丁酸如附图1所示。

本发明使用了来源于巨大芽孢杆菌中的谷氨酸脱羧酶BmGAD，该酶催化活性高(Vmax为150～200U/mg，Km为7～9mmol/L)且在pH＝7时酶活仍非常稳定，最适酶活温度为45～60摄氏度能够高效的催化底物L～谷氨酸生成γ～氨基丁酸。

本发明使用的谷氨酸脱氢酶BmGAD，在谷氨酸棒杆菌中可以高效表达，且蛋白全部可溶如附图2所示，因此全细胞转化反应使用菌体量只需5～10g/L，即可将700～850g/L的L-谷氨酸或800～900g/L的L-谷氨酸盐全部转化为γ-氨基丁酸，极大的降低了生产成本。

本发明利用重组谷氨酸棒杆菌全细胞转化生产γ-氨基丁酸，可将700～850g/L的L-谷氨酸或800～900g/L的L-谷氨酸盐全部转化，生成为γ-氨基丁酸420～600g/L，且转化率高，转化液成分单一，转化液γ-氨基丁酸浓度高。因此将极大降低产品γ-氨基丁酸后期分离提取成本。

本发明的术语“L-谷氨酸盐”是指L-谷氨酸钠，或L-谷氨酸钾，或L-谷氨酸钙。

本发明使用的生产菌株为谷氨酸棒杆菌，该菌株是一种传统的工业发酵微生物，用于生产味精已有数十年的历史，是一种公认的食品安全级微生物，因此使用谷氨酸棒杆菌生产γ-氨基丁酸不存在安全隐患。

附图说明

说明书附图1为谷氨酸棒杆菌全细胞转化生产γ-氨基丁酸示意图。

说明书附图2为重组菌株CG-BmGAD全细胞可溶性总蛋白SDS-PAGE图

说明书附图3为转化液纸层析图，其中1为谷氨酸和γ-氨基丁酸的标准品，I为L-谷氨酸，II为γ-氨基丁酸；2为转化液，III为γ-氨基丁酸。

说明书附图4为HPLC法检测转化液中的γ-氨基丁酸。A为L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的标准品，B为转化液；I为L-谷氨酸，II为γ-氨基丁酸，III为γ-氨基丁酸。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

以下实施例中，大肠杆菌DH5α和谷氨酸棒杆菌均可市售获得，大肠杆菌DH5α用于本发明中所有基因的克隆，谷氨酸棒杆菌用于本发明中基因蛋白表达及全细胞转化生产γ-氨基丁酸。

Phusion高保真DNA聚合酶购自Thermo公司。

限制性内切酶购自Takara公司。

大肠杆菌DH5α感受态细胞与谷氨酸棒杆菌感受态细胞按照常规方法制备。

所用引物均由深圳华大基因科技有限公司合成。

下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。

一方面，本发明提供一种谷氨酸棒杆菌表达菌株，其中，所述谷氨酸棒杆菌能够表达BmGAD基因。

根据本发明，当本发明的谷氨酸棒杆菌含有并能够表达BmGAD基因的情况下，能够有效地进行全细胞转化生产γ-氨基丁酸，因此，优选的，所述谷氨酸棒杆菌含有并能够表达BmGAD基因。

本发明中，基因BmGAD为γ-氨基丁酸合成相关基因。

基因BmGAD(GenBank：KT895523.1)为谷氨酸脱羧酶来自巨大芽孢杆菌中。

优选的，为了提高BmGAD的表达量，还可以其进行谷氨酸棒杆菌密码子偏好性优化，优化后的BmGAD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明中，需要说明的是，在发酵培养时，上述基因BmGAD能被翻译为相应的蛋白，并使相应蛋白发挥其作用。

本发明中，对表达载体的种类没有特殊要求，可以为能够在谷氨酸棒杆菌中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体，例如质粒等。本领域技术人员应该理解的是，表达载体的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至载体中，在此不再赘述。

实施例1：

本发明中使用的载体构建优选以下方法：

以引物gad-F(SEQ ID No.3)/gad-R(SEQ ID No.4)为引导，优选以密码子优化的BmGAD基因(SEQ ID No.2)为模板进行PCR扩增反应，扩增片段经HindIII和BamHI酶切后连入经HindIII和BamHI酶切的质粒pXMJ19中，构建得到质粒pXMJ19-BmGAD。

将所述载体pXMJ19-BmGAD转化谷氨酸棒杆菌菌株，得到可全细胞催化生产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌菌株CG-BmGAD。

优选的，本发明中，所述谷氨酸棒杆菌菌株优选为CG-BmGAD。

本领域技术人员应该理解的是，谷氨酸棒杆菌与巨大芽孢杆菌等在表达蛋白质时，都表现有不同程度的密码子偏爱性。将来自巨大芽孢杆菌的谷氨酸脱羧酶基因进行密码子优化，可以使目标蛋白在谷氨酸棒杆菌表达系统中更有效地表达。所述密码子优化的方法为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。

本发明中，在上述步骤中，PCR扩增反应的反应体系可以为常规的PCR扩增反应体系，优选为：5×phusion HF缓冲液10μL，2.5mM dNTP 2.5μL，50μM正向引物0.5μL，50μM反向引物0.5μL，模板0.5μL，Phusion DNA聚合酶0.5μL，水35.5μL。

本发明中，在上述步骤中，PCR扩增反应的反应程序可以为常规的PCR扩增反应程序，例如可以为：95～98摄氏度预变性1～3分钟；95～98摄氏度变性20～30秒，55～60摄氏度退火30～60秒，72摄氏度延伸30～120秒，28～32个循环；72摄氏度延伸8～10分钟。优选为：98摄氏度预变性2分钟；98摄氏度变性20秒，56摄氏度退火45秒，72摄氏度延伸2分钟，30个循环；72摄氏度延伸10分钟。

将质粒pXMJ19-BmGAD用电转化的方法转入谷氨酸棒杆菌，所述转化方法具体为：取100μL谷氨酸棒杆菌感受态细胞于冰上，10分钟后加入2μL质粒pXMJ19-BmGAD，轻轻混匀，冰上放置5分钟后，全部转入预冷的电激杯，于2500v电压电激，取出立即于加入1mLLBHIS液体培养基，置于46摄氏度水浴锅热激6min，30摄氏度，150rpm摇床复苏培养60～120分钟，然后将菌液涂布在含氯霉素的LBHIS平板上。利用氯霉素抗性筛选携带表达载体的转化菌株CG-BmGAD，并通过提取质粒进行酶切验证，得到可全细胞催化生产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌菌株CG-BmGAD。

实施例2：

种子培养基：葡萄糖10～15g/L，玉米浆1～3g/L，硫酸铵10～20g/L，硫酸镁0.5～1g/L，磷酸二氢钾0.5～1g/L，柠檬酸钠0.5～2g/L。

发酵培养基：葡萄糖40～60g/L，玉米浆5～8g/L，硫酸铵10～30g/L，硫酸镁0.5～5g/L，磷酸二氢钾0.5～5g/L，柠檬酸钠0.5～2g/L。

实施例3：

本实施例用于说明重组谷氨酸棒杆菌CG-BmGAD的高密度发酵培养。

本发明中，所述发酵培养的方法可以包括以下步骤：

(1)将如上所述的构建的重组谷氨酸棒杆菌表达菌株CG-BmGAD接种至含有作为筛选标记用氯霉素的种子培养基中，并在30摄氏度下培养16小时，得到重组谷氨酸棒杆菌CG-BmGAD种子液；

(2)将步骤(1)中得到的重组谷氨酸棒杆菌CG-BmGAD种子液接种至含有所述作为筛选标记用氯霉素的发酵培养基中，并在30摄氏度下培养，当OD₆₀₀达到5～10时加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，16～20摄氏度下诱导培养3～6小时。

本领域技术人员应该理解的是，在发酵培养时，种子液体培养基和发酵液体培养基中加入的抗生素为谷氨酸棒杆菌表达菌株中含有的表达载体上的作为筛选标记用的抗生素，例如，氯霉素；所述抗生素的浓度为本领域的常规选择，例如，所述氯霉素的加入量使其终浓度为25mg/L。

另外，所述谷氨酸棒杆菌种子液的接种量也可以为本领域常规的选择，例如，接种量为1～2％体积，也即，每1L的发酵培养基中加入10～20mL所述谷氨酸棒杆菌种子液。

本发明对IPTG的浓度也没有特别的限制，优选地，其加入量可以使其在发酵液体培养基中的终浓度为0.01～0.05mM。

此外，本发明对pH的调解使用的酸碱溶液及浓度没有特别的限制，优选地，酸溶液为50％的醋酸，碱溶液为50％的氨水。

实施例4：

本实施例用于说明菌泥的制备。

上述发酵培养的谷氨酸棒杆菌细胞，经5000×g～8000×g，离心5～10分钟，倒掉上清，回收谷氨酸棒杆菌体，即得到谷氨酸棒杆菌菌泥，放置于4摄氏度冰箱备用。

实施例5：

本实施例用于说明全细胞转化生产γ-氨基丁酸。

上述发酵培养的谷氨酸棒杆菌细胞，经离心回收谷氨酸棒杆菌菌泥，取5～10g菌泥、720g L-谷氨酸或L-谷氨酸盐和水组成的反应液1000mL置于2.5L的摇瓶。于20～25摄氏度条件下低速搅拌反应20小时，反应结束后，转化液用纸层析和HPLC对γ-氨基丁酸定量分析，转化液中含γ-氨基丁酸500g/L。

本发明中使用的菌泥、L-谷氨酸没有特别的限制，优选地，菌泥为5～10g/L，L-谷氨酸为700～850g/L。

检测例

(1)产物纸层析检测：取实施例4中的发酵液1mL，12000×g离心5min后，取上清稀释20倍，进行纸层析检测。展开剂成分为正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶2的混合溶液(含有0.5％茚三酮)，点样量1μL。

标准品和转化液的纸层析检测(分别为1和2)见图3。如图3所示，转化液中只有γ～氨基丁酸。

(2)产物的HPLC检测：取实施例4中的发酵液1mL，12000×g离心5min后，取上清，用0.02μm孔径的滤膜过滤后，进行HPLC分析检测。分析条件如下：仪器为：安捷伦液相色谱仪，测定条件包括：Agilent Zorbax Eclipse AAA柱(4.6×250mm)；检测波长338nm；流动相A＝40mM NaH₂PO₄，B＝乙腈、甲醇和ddH₂O按9∶9∶2的比例混溶混合溶液；流速＝1mL/min；自动柱前衍生，衍生剂为10g/L邻苯二酚溶液。梯度洗脱条件：0-15min 20％体积B；16-25min 20％体积B到100％体积B(6-25min内B的浓度均匀增加)；进样量0.5μL。

标准品和转化液的HPLC检测结果(分别为A和B)见图4。如图4所示，转化液在8.9分钟时出现了一个新峰(峰III)；该峰III的保留时间与γ-氨基丁酸标准品(峰II)一致。在转化液中没有谷氨酸(峰I)的剩余。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种全细胞转化生产γ-氨基丁酸的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 467

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Pro Gln Trp His Pro His Arg Glu Gln Lys Asn Leu Pro Asp Glu

1 5 10 15

Phe Pro Val Asn Pro Leu Phe Ser Arg Gln Gly Glu Val Thr Ile Pro

20 25 30

Arg Leu Arg Ile Gly Asp Gln Gly Met Leu Pro Glu Thr Ala Tyr Gln

35 40 45

Ile Ile His Asp Glu Ile Ala Leu Asp Gly Asn Ala Arg Leu Asn Leu

50 55 60

Ala Thr Phe Val Thr Thr Trp Met Glu Pro Asp Ala Lys Arg Leu Tyr

65 70 75 80

Gly Glu Ser Phe Asp Lys Asn Met Ile Asp Lys Asp Glu Tyr Pro Gln

85 90 95

Thr Ala Ala Ile Glu Glu Arg Cys Val Arg Ile Leu Ala Asp Leu Trp

100 105 110

Asn Ser Pro Asn Pro Asp Thr Thr Met Gly Val Ser Thr Thr Gly Ser

115 120 125

Ser Glu Ala Cys Met Leu Gly Gly Leu Ala Leu Lys Arg Arg Trp Gln

130 135 140

Lys Leu Arg Lys Ser Lys Gly Leu Ser Thr Asp Arg Pro Asn Ile Val

145 150 155 160

Phe Ser Ser Ser Val Gln Val Val Trp Glu Lys Phe Ala Asn Tyr Trp

165 170 175

Asp Val Glu Pro Arg Tyr Val Asn Ile Asn Pro Asp His Pro Tyr Leu

180 185 190

Asp Ala Glu Gly Val Ile Asn Ala Val Asp Glu Asn Thr Ile Gly Val

195 200 205

Val Pro Ile Leu Gly Val Thr Tyr Thr Gly Gly Tyr Glu Pro Ile Ala

210 215 220

Ala Ile Ala Lys Ala Leu Asp Glu Leu Gln Glu Lys Thr Gly Leu Asp

225 230 235 240

Ile Pro Ile His Val Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Ile Ala Pro Phe

245 250 255

Leu Gln Pro Asp Leu Ile Trp Asp Phe Arg Leu Pro Arg Val Lys Ser

260 265 270

Ile Asn Val Ser Gly His Lys Tyr Gly Leu Val Tyr Pro Gly Leu Gly

275 280 285

Trp Val Ile Trp Arg Glu Lys Glu Asp Leu Pro Glu Asp Leu Ile Phe

290 295 300

Arg Val Ser Tyr Leu Gly Gly Asn Met Pro Thr Phe Ala Leu Asn Phe

305 310 315 320

Ser Arg Pro Gly Ala Gln Val Leu Leu Gln Tyr Tyr Asn Phe Leu Arg

325 330 335

Leu Gly Lys Asp Gly Tyr Tyr Ala Val Gln Lys Thr Ser Gln Glu Asn

340 345 350

Ala Leu Phe Leu Ser Lys Glu Ile Gly Glu Met Asp Ala Phe Glu Ile

355 360 365

Leu Ala Asp Gly Ser Asp Ile Pro Val Leu Ala Trp Lys Leu Lys Glu

370 375 380

Asp Tyr Thr Pro Asn Trp Thr Leu Tyr Asp Leu Ser Arg Gln Leu Arg

385 390 395 400

Thr Tyr Gly Trp Gln Val Pro Ala Tyr Pro Leu Pro Ala Asp Met Glu

405 410 415

Glu Ile Thr Ile Met Arg Ile Val Val Arg Asn Gly Phe Ser Arg Asp

420 425 430

Leu Ala His Leu Phe Met Val Asn Phe Lys Gln Ala Val Glu Phe Leu

435 440 445

Asn Ser Leu Asp Arg Pro Val Leu Lys Asp Thr Lys Tyr Asp Asn Gly

450 455 460

Phe His His

465

<210> 2

<211> 1404

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcctcaat ggcatccgca tcgtgaacaa aaaaatttac ctgatgaatt tcctgttaat 60

ccgctttttt ctcgacaagg agaagtgaca attccaagac tgcgtatcgg tgatcaaggt 120

atgcttccgg aaacggctta tcaaatcatt catgacgaaa ttgctttaga cggaaatgcc 180

cgtcttaact tggctacctt cgtgaccacc tggatggaac ctgatgctaa gcgcctttac 240

ggtgaatctt tcgataagaa catgattgat aaggatgaat accctcagac cgctgcaatt 300

gaagaacgtt gcgtccgtat tttggccgat ctgtggaaca gcccaaaccc tgataccact 360

atgggtgtgt ctaccaccgg ctctagcgaa gcctgtatgt tgggtggttt ggcactcaag 420

cgccgctggc agaagctgcg taagtccaag ggcctctcta ccgatcgtcc taacattgtt 480

ttcagctcta gcgtgcaggt cgtgtgggaa aagttcgcaa actactggga tgtcgaacct 540

cgttacgtca acatcaaccc tgatcaccca tacttggatg ctgaaggcgt tattaacgct 600

gtcgatgaaa acaccatcgg cgttgtgcct atcctcggtg tgacctacac cggcggttac 660

gaacctatcg ccgctattgc aaaggcactc gatgaattgc aggaaaagac ggggcttgac 720

ataccaattc acgttgatgc tgcatccggt ggtttcatcg ctccattcct ccagcctgat 780

ctcatttggg atttccgtct gcctcgggtt aagtctatca acgtgagcgg tcacaagtac 840

ggcctcgttt accctggtct tggttgggtc atctggcgcg aaaaggaaga tttgcctgag 900

gatcttattt tccgtgtgag ctacttgggc ggtaacatgc caaccttcgc actcaacttc 960

tcccgcccag gtgcacaggt tctgctacaa tactacaact tcttgcgctt gggtaaggat 1020

ggttactacg cagtccaaaa aacctctcag gaaaacgcac tgttccttag caaggaaatc 1080

ggcgaaatgg atgctttcga aatcctcgcc gatggctccg acattccagt tctggcatgg 1140

aaattaaagg aagattacac ccctaactgg accttgtacg atttgagccg tcagctccgt 1200

acctacggct ggcaggtccc agcataccca ttgccagcag atatggaaga aatcaccatt 1260

atgcgtattg tcgtgcgcaa cggcttcagc cgcgatctcg ctcacttgtt catggttaac 1320

ttcaagcagg cagtcgagtt ccttaactct ctggatcgcc cagtgctcaa ggataccaag 1380

tacgataacg gcttccacca ctag 1404

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aataaagctt atgcctcaat ggcatccgca tcgtg 35

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaataggatc cctagtggtg gaagccgtta tc 32

Claims (10)

1.一株基因工程菌，其特征在于，是表达了来源于巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)的谷氨酸脱羧酶的生产菌株，所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列是与SEQ IDNO.1具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上，最优选100％同源性的序列；所述生产菌株选自棒杆菌属(Corynebacterium)，优选为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，更优选的为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(Corynebacterium glutamicumATCC13032)，或谷氨酸棒状杆菌ATCC14020(C.glutamicum ATCC14020)，或谷氨酸棒状杆菌ATCC15990(C.glutamicum ATCC15990)，或谷氨酸棒状杆菌ATCC13032D-5(C.glutamicumATCC13032D-5)，或谷氨酸棒状杆菌ATCC14067(C.glutamicum ATCC14067)，最优选的为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(C.glutamicum ATCC13032)。

2.权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，谷氨酸脱羧酶编码基因插入表达载体进行表达，所述表达载体能在宿主中表达目的基因，所述宿主为谷氨酸棒状杆菌，优选的所述表达载体为载体pDXW-6，或载体pDXW-7，或载体pDXW-8，或载体pDXW-9，或载体pDXW-10，或载体pJL23，或载体pJC1，或载体pEC-XK99E，或载体pCRA1，或载体pBKGEXm2，或载体pZ8-1，或载体pVWEx1，或载体pSL360，或载体pEC901，或载体pTRCmob，或载体pAPE12，或载体pXMJ19，更优选的载体pXMJ19。

3.一种γ-氨基丁酸的生产方法，包括如下步骤；

(a)培养权利要求1或权利要求2的基因工程菌；

(b)向步骤(a)得到的菌液加入诱导剂并培养；

(c)将步骤(b)得到的菌液离心获得菌泥；

(d)以L-谷氨酸或L-谷氨酸盐为原料，利用步骤(c)培养得到菌泥催化生成γ-氨基丁酸。

4.权利要求3所述的生产方法，其特征在于，步骤(a)的培养温度为25～35摄氏度，步骤(a)中的培养直至菌液OD₆₀₀达到5～10。

5.权利要求3-4任一所述的生产方法，其特征在于，所述的诱导剂为IPTG，步骤(b)的培养温度为16～20摄氏度，步骤(b)培养时间3～6小时。

6.权利要求3-5任一所述的生产方法，所述诱导剂为IPTG，所述IPTG添加量为0.01～0.05mM。

7.权利要求3-6任一所述的生产方法，其特征在于，步骤(d)中催化中菌泥的添加量为5～10g/L。

8.权利要求3-7任一所述的生产方法，其特征在于，催化体系中L-谷氨酸或L-谷氨酸盐的初始浓度为100～900g/L，优选的L-谷氨酸为600～800g/L，或优选的L-谷氨酸盐为680～900g/L；催化温度为20～25摄氏度；催化时间为5～24小时。

9.权利要求3所述的生产方法，其特征在于，步骤(a)的培养温度为30摄氏度，步骤(a)培养直至菌液OD₆₀₀达到5～10；所述诱导剂为IPTG，所述IPTG添加量为0.01～0.05mM；步骤(d)中催化中菌泥的添加量为5～10g/L；催化体系中L-谷氨酸的初始浓度为600～800g/L，或L-谷氨酸盐的初始浓度为680～900g/L；催化温度为20～25摄氏度，催化时间为5～24小时。

10.权利要求9所述的生产方法，其特征在于，γ-氨基丁酸产量420～600g/L，优选的为500g/L。