CN110760533A

CN110760533A - 一种编码谷氨酸脱羧酶的基因、重组工程菌及其应用

Info

Publication number: CN110760533A
Application number: CN201911234348.6A
Authority: CN
Inventors: 姚伦广; 阚云超; 唐存多; 史红玲; 董自星; 史鸿飞; 焦铸锦
Original assignee: Nanyang Normal University
Current assignee: Nanyang Normal University
Priority date: 2019-12-05
Filing date: 2019-12-05
Publication date: 2020-02-07
Anticipated expiration: 2039-12-05
Also published as: CN110760533B

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种编码谷氨酸脱羧酶的基因、重组工程菌及其应用。该编码谷氨酸脱羧酶的基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。将含有该基因的重组大肠杆菌用于合成r‑氨基丁酸时，转化率可达95％以上，具有良好的产业化前景。

Description

一种编码谷氨酸脱羧酶的基因、重组工程菌及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种编码谷氨酸脱羧酶的基因、重组工程菌及其应用。

背景技术

γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid，GABA)是一种天然的非蛋白质氨基酸，在哺乳动物体内作为一种重要的抑制性神经递质，介导了40％以上的神经抑制信号，具有重要的生理活性。GABA具有降低血压、镇静安神、增进脑活力、增强记忆、改善睡眠和延缓衰老等功能，在医药、食品保健、化工等行业具有广泛应用前景。目前GABA的制备方法主要有化学合成、植物富集和生物合成法。化学合成反应剧烈、成本高昂、环境污染严重且安全性差，植物富集法产量又较低，而生物合成法具有条件温和、产量高、能耗低等优点，从而成为目前主要的生产方法。谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)在GABA的生物合成中起着关键作用，能专一、不可逆地催化L-谷氨酸裂解为GABA和二氧化碳。谷氨酸脱羧酶也广泛存在于微生物和动植物活体细胞内，尤其是在大部分乳酸菌中均有谷氨酸脱羧酶的存在，报道较多的有干酪乳杆菌、短乳杆菌和乳酸乳球菌等。然而，由于这些野生型的乳酸菌在传统发酵过程表达谷氨酸脱羧酶的水平较低，故利用野生型的乳酸菌进行发酵时，产GABA的水平也较低，不足以体现出GABA的保健功效。此外，随着社会的发展和营养科学研究的进步，人们对自身健康的关注日益加强。消费者对食品的需求不再仅限于解决饥渴，对身体健康的促进、生活质量的提高、身心压力的释放成为人们对食品的新期望。具有特定功效的天然、绿色、健康、环保的功能性食品已成为食品产业中的“新宠儿”。

自然界中蕴藏着丰富的未被发掘的新型酶资源，如何去发掘这些未知的酶类并加以适当的改造以满足工业生产的需求，已渐渐吸引了广大科研工作者的关注。迄今已有2000多个微生物基因组信息被测定和公开，而且这些数据仍在不断增长，这些日益丰富的基因组信息为新酶的发掘提供了丰富的资源。基因组挖矿(Genome mining)这一术语已被用于多种领域，主要是指开发基因组信息以发现一些新的过程、靶点和产物。基因组挖矿技术可以实现从基因组数据库到真实酶数据库的跨越，进一步丰富了可被利用或改造的酶资源。近年来，已有许多成功利用基因组挖矿技术发现新酶的报道。

文献《Enhancing the Activity of Glutamate Decarboxylase fromLactobacillus brevis by Directed Evolution》(Ling Lin等，[J].Chinese Journal ofChemical Engineering，22(2014)，1322-1327)中公开的Lactobacillus senmaizukei的谷氨酸脱羧酶的最适反应温度为50℃，对反应温度的要求较高。

发明内容

发明人借助基因组挖矿技术，以当前研究比较透彻、催化活性较高的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源的谷氨酸脱羧酶LbGAD的蛋白序列为探针，以各种乳酸菌、肠球菌基因组序列为搜索对象进行BLAST分析，从查询的结果中找出一系列基因组信息来源的且未经表达鉴定、假定的谷氨酸脱羧酶蛋白。对这些序列进行进化树的构建和分析，然后选取代表性的基因序列，并进行表达筛选，从Lactobacillus senmaizukei的基因组中挖掘到了一个新型高活性的谷氨酸脱羧酶(LsGAD)；发明人进一步对编码该酶的核苷酸序列进行优化，获取了编码谷氨酸脱羧酶(LsGAD)的基因，并利用该基因成功构建了能够高效表达谷氨酸脱羧酶(LsGAD)的基因工程菌，并进行了全细胞催化L-谷氨酸合成γ-氨基丁酸的研究，从而完成本发明。

本发明通过密码子优化获取的编码谷氨酸脱羧酶的基因经大肠杆菌表达系统表达后，最适温度为40℃，反应条件更温和，更有利于γ-氨基丁酸的产业化生产。

本发明的编码谷氨酸脱羧酶的基因采用如下技术方案：一种编码谷氨酸脱羧酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二目的在于提供一种重组载体，具体技术方案为：所述重组载体包括如上所述的基因。

本发明的第三目的在于提供一种重组工程菌，该重组工程菌采用如下技术方案：所述重组工程菌包括如上所述的基因或如上所述的重组载体。

优选的，所述重组工程菌通过将所述重组载体热激转化至大肠杆菌BL21感受态细胞制备得到，所述重组载体通过将所述基因连接至pET28a质粒制备得到。

本发明的第四目的在于提供给一种谷氨酸脱羧酶，该谷氨酸脱羧酶的具体技术方案为：所述谷氨酸脱羧酶由如权利要求3或4的重组工程菌表达得到，所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的目的还在于提供一种γ-氨基丁酸的生物合成方法，所述γ-氨基丁酸的生物合成方法采用如下技术方案：将L-谷氨酸或L-谷氨酸钠加入到含有如上所述的重组工程菌的发酵液中，使L-谷氨酸或L-谷氨酸钠的终浓度为1～8g/L，维持反应温度为4～50℃，反应2～48h即可制得γ-氨基丁酸。

优选的，所述重组工程菌的发酵液按照下述方法制备得到：(1)将如上所述的重组工程菌单菌落接种于含有50μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基中，在37℃、220rpm下培养过夜；(2)将步骤(1)所得过夜培养的产物按2％的接种量接种到LB液体培养基中，并置于37℃下、200rpm培养2.5h；(3)加入IPTG诱导，使IPTG的终浓度为0.1mmol/L，置于16℃下、220rpm培养20h，得到重组工程菌发酵液。

优选的，反应过程中用HPLC法检测γ-氨基丁酸的生成量，待转化率达到90％以上时，终止反应；反应液经离心分离上清，再经过0.22μm的滤器过滤后，将过滤后的上清使用旋转蒸发仪60℃蒸发去水至溶液成粘稠状；向所述粘稠状溶液中加入3倍体积的无水乙醇，搅拌，室温下自然降温；降至室温后将其放置4℃环境中过夜结晶，抽滤，即得γ-氨基丁酸晶体。

本发明的有益效果是：本发明的编码谷氨酸脱羧酶的基因经大肠杆菌表达系统表达后，制备得到的谷氨酸脱羧酶的最适反应温度为40℃，相对于密码子优化前的最适反应温度为50℃，反应条件更加温和。

本发明的本发明的编码谷氨酸脱羧酶的基因经大肠杆菌表达系统表达后，谷氨酸脱羧酶(LsGAD)的表达水平高达34.17U/mL发酵液，显著高于探针的表达水平。

本发明的谷氨酸脱羧酶的最适反应pH为5.5，相对于文献中公开的4.5，反应条件更温和。

本发明的重组工程菌可以高效地将L-谷氨酸/L-谷氨酸钠进行脱羧反应，基于全细胞催化无需额外添加辅酶，通过本发明的基因工程菌，L-谷氨酸的转化率可以达到95％以上，具有良好的产业化前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明所涉及的假定的谷氨酸脱羧酶的进化树。

图中标记：LlGAD-来源于Lactococcus lactis的谷氨酸脱羧酶，LlGAD2-来源于Lactococcus lactis的谷氨酸脱羧酶2，LlGAD3-来源于Lactococcus lactis的谷氨酸脱羧酶3，LlGAD4-来源于Lactococcus lactis的谷氨酸脱羧酶4，LgGAD-来源于Lactococcusgarvieae M14的谷氨酸脱羧酶，EpGAD-来源于Enterococcus pallens的谷氨酸脱羧酶，LcoGAD-来源于Lactobacillus collinoides 237的谷氨酸脱羧酶，LpGAD-来源于Lactobacillus plantarum RI-191的谷氨酸脱羧酶，LbGAD-来源于Lactobacillus brevis的谷氨酸脱羧酶，LbGAD2-来源于Lactobacillus brevis的谷氨酸脱羧酶2，LbGAD3-来源于Lactobacillus brevis的谷氨酸脱羧酶3，EaGAD-来源于Enterococcus avium的谷氨酸脱羧酶，EmGAD-来源于Enterococcus malodoratus的谷氨酸脱羧酶，LfGAD-来源于Lactobacillus fermentum AF15-40LB的谷氨酸脱羧酶，LrGAD-来源于Lactobacillusreuteri的谷氨酸脱羧酶，EhGAD-来源于Enterococcus hirae strain L30的谷氨酸脱羧酶，EcGAD-来源于Enterococcus casseliflavus的谷氨酸脱羧酶，EgGAD-来源于Enterococcus gallinarum F1213F的谷氨酸脱羧酶，CdGAD-来源于Carnobacteriumdivergens的谷氨酸脱羧酶，LmGAD-来源于Listeria monocytogenes的谷氨酸脱羧酶，EsGAD-来源于Enterococcus sulfureus ATCC 49903的谷氨酸脱羧酶，LflGAD-来源于Listeria fleischmannii的谷氨酸脱羧酶，CnGAD-来源于Clostridium niameyense mt5的谷氨酸脱羧酶，PsGAD-来源于Paeniclostridium sordellii的谷氨酸脱羧酶，PsGAD2-来源于Paeniclostridium sordellii的谷氨酸脱羧酶2，AwGAD-来源于Acetobacterium woodii的谷氨酸脱羧酶，EfGAD-来源于Enterococcus faecalis MTUP9的谷氨酸脱羧酶，EfGAD2-来源于Enterococcus faecalis MTUP9的谷氨酸脱羧酶2，LsGAD-来源于Lactobacillussenmaizukei的谷氨酸脱羧酶，LcGAD-来源于Lactobacillus cerevisiae DSM100836的谷氨酸脱羧酶，方框里的为本发明表达的4个酶。

图2是本发明所涉及的酶的SDS-PAGE图谱。

图2中标记：M、PageRuler预染蛋白分子量标准，1、BL21/pET28a，2、BL21/pET28a-EsGAD裂解上清，3、BL21/pET28a-LbGAD裂解上清，4、BL21/pET28a-LsGAD裂解上清，5、BL21/pET28a-LlGAD裂解上清。

图3是本发明的谷氨酸脱羧酶LsGAD在不同温度下的相对活性。

图4是本发明的谷氨酸脱羧酶在不同pH下的相对活性。

图5是实施例10利用本发明的基因工程菌BL21/pET28a-LsGAD全细胞催化L-谷氨酸合成γ-氨基丁酸的进程曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：谷氨酸脱羧酶编码基因的基因挖掘

以研究比较透彻、催化活性较高的短乳杆菌来源的谷氨酸脱羧酶LbGAD的蛋白序列为探针，以各种乳酸菌、肠球菌基因组序列为搜索对象进行BLAST分析，从查询的结果中找出一系列基因组信息来源的且未经表达鉴定、假定的谷氨酸脱羧酶蛋白。对这些序列进行进化树的构建和分析(如图1所示)，然后选取4个有代表性的基因序列，经过密码子优化后进行全基因合成。经过比较分析选定了Lactococcus lactis CICC20209、Enterococcussulfureus、Lactobacillus senmaizukei和Lactobacillus brevis ATCC 367来源的4个潜在的谷氨酸脱羧酶进行下一步研究，并将其分别命名为LsGAD、LlGAD、EsGAD、和LbGAD。

以E.coli K12菌株密码子使用频率为参照，利用OPTIMIZER服务器对潜在的谷氨酸脱羧酶基因序列进行密码子优化，LsGAD、LlGAD、EsGAD、和LbGAD优化后的序列分别如SEQID NO：2、3、4和5所示。在基因上下游分别加上BamH I和Xho I酶切位点后，委托苏州泓迅生物科技有限公司进行全基因的合成。

实施例2：产谷氨酸脱羧酶基因工程菌的构建

步骤一、构建重组质粒：分别将实施例1中的谷氨酸脱羧酶编码基因连接至pET28a质粒上，获得重组质粒pET28a-LlGAD、pET28a-EsGAD、pET28a-LsGAD和pET28a-LbGAD；

步骤二、重组质粒转化入宿主细胞：分别将重组质粒pET28a-LlGAD、pET28a-EsGAD、pET28a-LsGAD和pET28a-LbGAD利用热激转化至大肠杆菌BL21(购自Invitrogen公司)感受态细胞中，添加0.4mL LB液体培养基，在37℃、220rpm下孵育1h后，涂布于含有50μg/mL卡拉霉素的LB固体平板上，在37℃下培养12～16h，得到单克隆菌落；

步骤三、重组菌的筛选与鉴定：挑取单克隆菌落至4mL含有50μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基中，在37℃、220rpm下培养过夜，提取质粒利用BamH I和Xho I进行双酶切鉴定，根据电泳结果判断含有与目的基因大小一致的基因片段，初步鉴定该克隆为阳性克隆；然后将阳性克隆送至华大基因公司进行序列测定，测序结果进一步表明该克隆菌落即是目的基因工程菌。

实施例3：谷氨酸脱羧酶的诱导表达及分析

3.1诱导表达：挑选实施例2获得的经鉴定的基因工程菌单菌落接种至4mL含有50μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基中，在37℃、220rpm下培养过夜；将过夜培养的产物用移液器按2％的接种量接种到100mL的LB液体培养基中；然后，置于37℃下、200rpm培养2.5h，最后加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG水溶液，置于16℃下、220rpm培养20h，得到经诱导表达的菌液(发酵液)。

将上述经诱导表达的菌液分装入50mL的离心管中，于8000rpm、4℃离心5min，收集菌体，各用50mL去离子水水洗两次，同样条件下收集菌体。将上述每种菌体用10mL裂解缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH 7.9，500mmol/L NaCl，1.2114g Tris、14.61g NaCl，加水400mL，溶解后用盐酸调pH至7.9，定容至500mL)悬浮，50％的占空比，超5s、停5s，冰水浴超声破碎20min。12000rpm、4℃离心15min，收集上清液，SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形态(如图2所示)。

3.2酶性能测定：

3.2.1酶活测定：对裂解液测定谷氨酸脱羧酶的活性，酶活测定的方法如下：反应体系为1mL，包含0.01mM磷酸吡哆醛、20mM L-谷氨酸、200mM的pH 5.0的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液，37℃保温2min后加入100μL稀释适当倍数的酶液，迅速混匀后反应5min，反应结束后迅速放入沸水浴终止反应。取400μL的反应液，依次加入0.2M的pH 9.0的硼酸缓冲液400μL，1.0mL 6％苯酚和1.0mL次氯酸钠溶液(有效氯大于7.5％)，充分振荡后，沸水浴中反应10min迅速在冰浴中冷却显色20min，待出现蓝绿色后加入2.0mL 60％乙醇溶液，最后在643.5nm处测定吸光度，以底物溶液中不加酶液加入等量蒸馏水为对照组。依次来测定反应生成的γ-氨基丁酸的含量，以测定谷氨酸脱羧酶的活力。在测定条件下每分钟生成1μmolγ-氨基丁酸所需的酶定义为1个酶活力单位(U)。

经测定：本发明的基因工程菌发酵产谷氨酸脱羧酶的水平高达34.17U/mL发酵液，表达水平显著高于探针的28.97U/mL发酵液、BL21/pET28a-EsGAD的8.38U/mL发酵液和BL21/pET28a-LlGAD的32.24U/mL发酵液。

3.2.2LsGAD最适反应温度测定：参照上述酶活测定的方法，在不同温度下测定酶的催化活性，温度范围为30～60℃，以5℃为间隔。经测定，所表达的谷氨酸脱羧酶工程酶最适反应温度为40℃(如图3所示)

3.2.3LsGAD最适反应pH测定：参照上述酶活测定的方法，在不同pH下测定酶的催化活性，pH值范围为2～6，以0.5为间隔。经测定，所表达的谷氨酸脱羧酶工程酶最适反应pH为5.5(如图4所示)

综上，本发明筛选得到的来源于Lactobacillus senmaizukei的谷氨酸脱脱羧酶，经密码子优化和大肠杆菌表达得到的LsGAD的酶活高、最适反应温度低、性能明显优于已报道的谷氨酸脱羧酶。

对比例1以编码LsGAD谷氨酸脱羧酶的密码子优化前的基因按照实施例1-3的方法合成该基因，并将该基因构建重组质粒pET28a-LsGAD0、重组工程菌BL21/pET28a-LsGAD0并对上述重组工程菌进行诱导表达，测定其谷氨酸脱羧酶的表达水平为26.47U/mL发酵液，显著低于密码子优化后的重组工程菌的谷氨酸脱羧酶的表达水平。

备注：LsGAD0表示密码子优化前的编码谷氨酸脱羧酶的基因，其核苷酸序列参见SEQ ID NO.6。

实施例4：γ-氨基丁酸的生物合成

将L-谷氨酸加入到实施例3获得的重组工程菌BL21/pET28a-LsGAD发酵液中，使L-谷氨酸的终浓度为1～8g/L，维持反应温度为4～50℃，反应2～48h，反应过程中用HPLC法检测γ-氨基丁酸的生成量，待转化率达到90％以上时(如图5所示)，终止反应，反应液经高速离心分离上清，再经过0.22μm的滤器过滤后，将过滤后的上清使用旋转蒸发仪60℃蒸发去水，待溶液成粘稠状的时候，取出盛在干净无水的烧杯中，加入3倍体积的无水乙醇，边加边用磁力搅拌器搅拌，然后放置室温，缓慢降温，再放置冰箱4℃过夜结晶，再经抽滤获得γ-氨基丁酸晶体。

实施例5：γ-氨基丁酸的生物合成

将L-谷氨酸加入到实施例3获得的重组工程菌BL21/pET28a-LsGAD发酵液(pH＝5.5)中，使L-谷氨酸的终浓度为1g/L，维持反应温度为30℃，反应48h时用HPLC法检测γ-氨基丁酸的生成量，待转化率达到95％以上；终止反应，反应液经高速离心分离上清，再经过0.22μm的滤器过滤后，将过滤后的上清使用旋转蒸发仪60℃蒸发去水，待溶液成粘稠状的时候，取出盛在干净无水的烧杯中，加入3倍体积的无水乙醇，边加边用磁力搅拌器搅拌，然后放置室温，缓慢降温，再放置冰箱4℃过夜结晶，再经抽滤获得γ-氨基丁酸晶体，计算可得γ-氨基丁酸的得率达到95％以上。

实施例6：γ-氨基丁酸的生物合成

将L-谷氨酸加入到实施例3获得的重组工程菌BL21/pET28a-LsGAD发酵液(pH＝5.5)中，使L-谷氨酸的终浓度为：8g/L，维持反应温度为:35℃，反应时间为20h，用HPLC法检测γ-氨基丁酸的生成量，其转化率达到90％以上；终止反应，反应液经高速离心分离上清，再经过0.22μm的滤器过滤后，将过滤后的上清使用旋转蒸发仪60℃蒸发去水，待溶液成粘稠状的时候，取出盛在干净无水的烧杯中，加入3倍体积的无水乙醇，边加边用磁力搅拌器搅拌，然后放置室温，缓慢降温，再放置冰箱4℃过夜结晶，再经抽滤获得γ-氨基丁酸晶体，计算可得γ-氨基丁酸的得率达到95％以上。

实施例7：γ-氨基丁酸的生物合成

将L-谷氨酸加入到实施例3获得的重组工程菌BL21/pET28a-LsGAD发酵液(pH＝5.5)中，使L-谷氨酸的终浓度为：4g/L，维持反应温度为:20℃，反应时间30h时用HPLC法检测γ-氨基丁酸的生成量，其转化率达到90％以上；终止反应，反应液经高速离心分离上清，再经过0.22μm的滤器过滤后，将过滤后的上清使用旋转蒸发仪60℃蒸发去水，待溶液成粘稠状的时候，取出盛在干净无水的烧杯中，加入3倍体积的无水乙醇，边加边用磁力搅拌器搅拌，然后放置室温，缓慢降温，再放置冰箱4℃过夜结晶，再经抽滤获得γ-氨基丁酸晶体，计算可得γ-氨基丁酸的得率达到95％以上。

实施例8：γ-氨基丁酸的生物合成

将L-谷氨酸加入到实施例3获得的重组工程菌BL21/pET28a-LsGAD发酵液(pH＝5.5)中，使L-谷氨酸的终浓度为：5g/L，维持反应温度为40℃，反应时间2h时用HPLC法检测γ-氨基丁酸的生成量，其转化率达到90％以上；终止反应，反应液经高速离心分离上清，再经过0.22μm的滤器过滤后，将过滤后的上清使用旋转蒸发仪60℃蒸发去水，待溶液成粘稠状的时候，取出盛在干净无水的烧杯中，加入3倍体积的无水乙醇，边加边用磁力搅拌器搅拌，然后放置室温，缓慢降温，再放置冰箱4℃过夜结晶，再经抽滤获得γ-氨基丁酸晶体，计算可得γ-氨基丁酸的得率达到95％以上。

实施例9：γ-氨基丁酸的生物合成

将L-谷氨酸加入到实施例3获得的重组工程菌BL21/pET28a-LsGAD发酵液(pH＝5.5)中，使L-谷氨酸的终浓度为：1g/L，维持反应温度为10℃，反应时间35h时用HPLC法检测γ-氨基丁酸的生成量，其转化率达到80％以上；终止反应，反应液经高速离心分离上清，再经过0.22μm的滤器过滤后，将过滤后的上清使用旋转蒸发仪60℃蒸发去水，待溶液成粘稠状的时候，取出盛在干净无水的烧杯中，加入3倍体积的无水乙醇，边加边用磁力搅拌器搅拌，然后放置室温，缓慢降温，再放置冰箱4℃过夜结晶，再经抽滤获得γ-氨基丁酸晶体，计算可得γ-氨基丁酸的得率达到95％以上。

实施例10：γ-氨基丁酸的生物合成

将L-谷氨酸加入到实施例3获得的重组工程菌BL21/pET28a-LsGAD发酵液(pH＝5.5)中，使L-谷氨酸的终浓度为：8g/L，维持反应温度为30℃，反应时间24h时用HPLC法检测γ-氨基丁酸的生成量，其转化率达到90％以上；终止反应，反应液经高速离心分离上清，再经过0.22μm的滤器过滤后，将过滤后的上清使用旋转蒸发仪60℃蒸发去水，待溶液成粘稠状的时候，取出盛在干净无水的烧杯中，加入3倍体积的无水乙醇，边加边用磁力搅拌器搅拌，然后放置室温，缓慢降温，再放置冰箱4℃过夜结晶，再经抽滤获得γ-氨基丁酸晶体，计算可得γ-氨基丁酸的得率达到95％以上(本实施例催化L-谷氨酸合成γ-氨基丁酸的进程曲线参见图5)。

本发明的重组工程菌用于γ-氨基丁酸的生物合成，具有良好的产业化前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南阳师范学院

<120> 一种编码谷氨酸脱羧酶的基因、重组工程菌及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 478

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Lys Asn Asp Gln Glu Thr Gln Gln Met Leu Asp Ala Ala Gln

1 5 10 15

Leu Glu Lys Thr Phe Leu Gly Ser Thr Ala Ala Gly Glu Ser Leu Pro

20 25 30

Lys Asn Thr Met Pro Ala Gly Pro Met Ala Pro Asp Val Ala Val Glu

35 40 45

Met Val Asp His Phe Arg Leu Asn Glu Ala Lys Ala Asn Gln Asn Leu

50 55 60

Ala Thr Phe Cys Thr Thr Glu Met Glu Pro Gln Ala Asp Gln Leu Met

65 70 75 80

Met Arg Thr Leu Asn Thr Asn Ala Ile Asp Lys Ser Glu Tyr Pro Lys

85 90 95

Thr Ser Ala Met Glu Asn Tyr Cys Val Ser Met Ile Ala His Leu Trp

100 105 110

Gly Ile Pro Asp Glu Glu Lys Phe Gly Asp Asp Phe Ile Gly Thr Ser

115 120 125

Thr Val Gly Ser Ser Glu Gly Cys Met Leu Gly Gly Leu Ala Leu Leu

130 135 140

His Thr Trp Lys His Arg Ala Lys Ala Ala Gly Leu Asp Ile Asp Asp

145 150 155 160

Leu His Ala His Lys Pro Asn Leu Val Ile Met Ser Gly Asn Gln Val

165 170 175

Val Trp Glu Lys Phe Cys Thr Tyr Trp Asn Val Asp Phe Arg Gln Val

180 185 190

Pro Ile Asn Gly Asp Gln Val Ser Leu Asp Leu Asp His Val Met Asp

195 200 205

Tyr Val Asp Glu Asn Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ile Glu Gly Ile Thr

210 215 220

Tyr Thr Gly Ser Val Asp Asp Ile Gln Gly Leu Asp Lys Leu Val Thr

225 230 235 240

Glu Tyr Asn Lys Thr Ala Ala Leu Pro Val Arg Ile His Val Asp Ala

245 250 255

Ala Phe Gly Gly Leu Phe Ala Pro Phe Val Asp Gly Phe Lys Pro Trp

260 265 270

Asp Phe Arg Leu Asp Asn Val Val Ser Ile Asn Val Ser Gly His Lys

275 280 285

Tyr Gly Met Val Tyr Pro Gly Leu Gly Trp Ile Val Trp Arg Lys Asn

290 295 300

Ser Tyr Asp Ile Leu Pro Lys Glu Met Arg Phe Ser Val Pro Tyr Leu

305 310 315 320

Gly Ser Ser Val Asp Ser Ile Ala Ile Asn Phe Ser His Ser Gly Ala

325 330 335

His Ile Asn Ala Gln Tyr Tyr Asn Phe Leu Arg Phe Gly Leu Ala Gly

340 345 350

Tyr Lys Ala Ile Met Asn Asn Val Arg Lys Val Ser Leu Lys Leu Thr

355 360 365

Asp Glu Leu Arg Lys Phe Gly Ile Phe Asp Ile Leu Val Asp Gly Lys

370 375 380

Glu Leu Pro Ile Asn Cys Trp Lys Leu Ser Asp Asn Ala Asn Val Ser

385 390 395 400

Trp Ser Leu Tyr Asp Met Glu Asp Ala Leu Ala Lys Tyr Gly Trp Gln

405 410 415

Val Pro Ala Tyr Pro Leu Pro Lys Asn Arg Glu Glu Thr Ile Thr Ser

420 425 430

Arg Ile Val Val Arg Pro Gly Met Thr Met Ala Ile Ala Asp Asp Phe

435 440 445

Ile Asp Asp Leu Lys Leu Ala Ile Ala Asp Leu Asn His Ser Phe Gly

450 455 460

Asp Val Lys Asp Val Asn Asp Lys Asn Lys Thr Thr Val Arg

465 470 475

<210> 2

<211> 1437

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtctaaaa acgaccagga aacccagcag atgctggacg ctgctcagct ggaaaaaacc 60

ttcctgggtt ctaccgctgc tggtgaatct ctgccgaaaa acaccatgcc ggctggtccg 120

atggctccgg acgttgctgt tgaaatggtt gaccacttcc gtctgaacga agctaaagct 180

aaccagaacc tggctacctt ctgcaccacc gaaatggaac cgcaggctga ccagctgatg 240

atgcgtaccc tgaacaccaa cgctatcgac aaatctgaat acccgaaaac ctctgctatg 300

gaaaactact gcgtttctat gatcgctcac ctgtggggta tcccggacga agaaaaattc 360

ggtgacgact tcatcggtac ctctaccgtt ggttcttctg aaggttgcat gctgggtggt 420

ctggctctgc tgcacacctg gaaacaccgt gctaaagctg ctggtctgga catcgacgac 480

ctgcacgctc acaaaccgaa cctggttata atgtctggta accaagttgt atgggaaaag 540

ttctgcacct actggaacgt tgacttccgt caggttccga tcaacggtga ccaggtttct 600

ctggacctgg accacgttat ggactacgtt gacgaaaaca ccatcggtat catcggtatc 660

gaaggtatca cctacaccgg ttctgttgac gacatccagg gtctggacaa actggttacc 720

gaatacaaca aaaccgctgc tctgccggtt cgtatccacg ttgacgctgc tttcggtggt 780

ctgttcgctc cgttcgttga tggcttcaaa ccgtgggact tccgtctgga caacgttgtt 840

tcgataaacg taagcggtca caaatacggt atggtttacc cgggtctggg ttggatcgtt 900

tggcgtaaaa actcttacga catcctgccg aaagaaatgc gtttctctgt tccgtacctg 960

ggttcttctg ttgactctat cgctatcaac ttctctcact ctggtgctca catcaacgct 1020

cagtactaca acttcctgcg tttcggtctg gctggttaca aagctatcat gaacaacgtt 1080

cgtaaagttt ctctgaaact gaccgacgaa ctgcgtaaat tcggtatctt cgacatcctg 1140

gttgacggta aagaactgcc gatcaactgc tggaaactgt ctgacaacgc taacgtttct 1200

tggtctctgt acgacatgga agacgctctg gctaaatacg gttggcaggt tccggcttac 1260

ccgctgccga aaaaccgtga agaaaccatc acctctcgta tcgttgttcg tccgggtatg 1320

accatggcta tcgctgacga cttcatcgac gacctgaaac tggctatcgc tgacctgaac 1380

cactctttcg gtgacgttaa agacgttaac gacaaaaaca aaaccaccgt tcgttaa 1437

<210> 3

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgctgtacg gtaaagaaaa ccgtgacgaa gctgaattcc tggaaccgat cttcggttct 60

gaatctgaac aggttgacct gccgaaatac aaactggctc agcagtctat cgaaccgcgt 120

gttgcttacc agctggttca ggacgaaatg ctggacgaag gtaacgctcg tctgaacctg 180

gctaccttct gccagaccta catggaaccg gaagctgtta aactgatgtc tcagaccctg 240

gaaaaaaacg ctatcgacaa atctgaatac ccgcgtacca ccgaaatcga aaaccgttgc 300

gttaacatga tcgctgacct gtggaacgct tctgaaaaag aaaaattcat gggtacctct 360

accatcggtt cttctgaagc ttgcatgctg ggtggtatgg ctatgaaatt ctcttggcgt 420

aaacgtgctg aaaaactggg tctggacatc aacgctaaaa aaccgaacct ggttatctct 480

agtggctacc aggtatgctg ggagaaattc tgcgtttact gggacatcga aatgcgtgaa 540

gttccgatgg acaaagaaca catgtctatc aacctggaca aagttatgga ctacgttgac 600

gaatacacca tcggtgttgt tggtatcatg ggtatcacct acaccggtcg ttacgacgac 660

atcaaagctc tggacaacct gatcgaagaa tacaacaaac agaccgacta caaagtttac 720

atccacgttg acgctgcttc tggtggtctg tacgctccgt tcgttgaacc ggaactggaa 780

tgggacttcc gtctgaaaaa cgttatctct atcaacacct ctggtcacaa atacggtctg 840

gtttacccgg gtgttggttg ggttctgtgg cgtgacaaaa aatacctgcc ggaagaactc 900

atattcaaag tgagctacct gggtggtgaa ctgccgacca tggctatcaa cttctctcac 960

tctgcttctc agctgatcgg tcagtactac aacttcgttc gttacggttt cgacggttac 1020

aaagctatcc acgaacgtac ccacaaagtt gctatgttcc tggctaaaga aatcgaaaaa 1080

accggtatgt tcgaaatcat gaacgacggt tctcagctcc cgatcgtctg ctacaagctg 1140

aaagaagact ctaaccgtgg ttggaacctg tacgacctgg ctgaccgtct gctgatgaaa 1200

ggttggcagg ttccggctta cccgctgccg aaaaacctgg aaaacgaaat catccagcgt 1260

ctggttatcc gtgctgactt cggtatgaac atggctttca actacgttca ggacatgcag 1320

gaagctatcg aagctctgaa caaagctcac atcctgtacc acgttgaacc ggaaaacaaa 1380

acctacggtt tcacccacta a 1401

<210> 4

<211> 1377

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaaccagg aaaacaccta ccagccgatc ttcggttcta ccgaagcttc tgaaaacgtt 60

atcctgcaca aactgcgtca gcacccggtt gacgctaccc tggcttaccg tctggttaaa 120

gaccagctga tcgacgaagg taacgctcgt cagaacatgg ctaccttctg ccagacctac 180

atggaaccgg aagctcagaa actgatggct gaaaccttcg aaaaaaacgc tatcgacaaa 240

tctgaatacc cgtctaccgc tgctatcgaa gaagcttgcg ttaacatcat cggtgacctg 300

tggaacgttc cggactctaa aaaaatgatc ggtacctcta ccgttggttc ttctgaagct 360

tgcatgctgg gtggtatggc tatgaaattc aaatggcgta aagaagctga agctcgtggt 420

atcgacctga acaaacagaa accgaacctg atcatctcta gtggctacca ggtatgctgg 480

gagaaattct gcgtttactg ggacatcgaa atgcgtaccg ttccgatgga cgacacccac 540

atgtctatcg acgttgaccg tgttatggac tacgttgacg aatacaccat cggtatcgtt 600

ggtatcctgg gtatcaccta caccggtaaa tacgacgaca tcaaagctct gaacgataaa 660

gttgaagcgt tcaaccagga aactggtcgt gaactgggta tccacgttga cggtgcttct 720

ggtgctatgt tcgctccgtt cgttttcccg gacctggaat gggacttccg tctgaaaaac 780

gttgtttcta tcaacacctc tggtcacaaa tacggtctgg tttacccggg tgttggttgg 840

atcttatggc gtgaccgtca cttcctgccg gaagaactca tattcaacgt gagctacctg 900

ggtggtgaaa tgccgaccat ggctatcaac ttctctcgtt ctgcttctca gatcctgggt 960

cagtactaca acttctaccg ttacggtttc gaaggttacc gtgctatcca cctgcgtacc 1020

cagaaagttg ctatgaaaat cgctaaagct atcgaatctt tcggtatctt cgaaatctac 1080

aacgacggtg aaaacctgcc gatcgtttgc taccgtctga aagacaacgt tgacgttaaa 1140

tggaacctgt acgacctggc tgaccgtctg cagatgaaag gttggcaggt tccggcttac 1200

ccgctgccgg aagacctgga caacatcgag atccagcgtt tcgtgtgcag aggtgacttc 1260

ggtatgaaca tggctgacgc tctgatcgaa gacatccgta ccgctatcgg tgaactggac 1320

aaagctaacg tttctatgca cgctaacgaa gctccgcact ctcagggttt cacccac 1377

<210> 5

<211> 1437

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaacaaaa acgaccagga aacccagcag atgatcaaca acgttgacct ggaaaaaacc 60

ttcctgggtt ctgttgaagc tggtcagtct ctgccgacca acaccctgcc ggacgacccg 120

atggctccgg acgttgctgc tcagctggtt gaacactacc gtctgaacga agctaaagct 180

aaccagaacc tggctacctt ctgcaccacc cagatggaac cgcaggctga cgaactgatg 240

aaaaacgctc tgaacaccaa cgctatcgac aaatctgaat acccgaaaac cgctgctatg 300

gaaaactact gcgtttctat gatcgctcac ctgtggggta tcccggacaa cgaaaaaatc 360

tacgacgact tcatcggtac ctctaccgtt ggttcttctg aaggttgcat gctgggtggt 420

ctggctctgc tgcactcttg gaaacaccgt gctaaagctg ctggtttcga catcgaagac 480

ctgcactctc acaaaccgaa cctggttatc atgtctggct accaggttgt atgggaaaag 540

ttctgcacct actggaacgt tgaaatgcgt caggttccga tcaacggtga ccaggtttct 600

ctggacatgg accacgttat ggactacgtt gacgaaaaca ccatcggtat catcggtatc 660

gaaggtatca cctacaccgg ttctgttgac gacatccaga ccctggacaa cctggttacc 720

gaatacaaca aaaccgctac catgccggtt cgtatccacg ttgacgctgc tttcggtggt 780

ctgttcgctc cgttcgttga tggcttcaac ccgtgggact tccgtctgaa aaacgttgtt 840

tcgataaacg taagcggtca caaatacggt atggtttacc cgggtctggg ttggatcgtt 900

tggcgtcaca acaccgctga catcctgccg gctgaaatgc gtttccaggt tccgtacctg 960

ggtaaaaccg ttgactctat cgctatcaac ttctctcact ctggtgctca catctctgct 1020

cagtactaca acttcatccg tttcggtctg tctggttaca aaaccatcat gcagaacgtt 1080

cgtaaagttt ctctgaaact gaccgctgct ctgaaaacct acggtatctt cgacatcctg 1140

gttgacggtt ctcagctgcc gatcaactgc tggaaactgg ctgacgacgc tccggttggt 1200

tggaccctgt acgacctgga atctgaactg gctaaatacg gttggcaggt tccggcttac 1260

ccgctgccga aaaaccgtga cgacgttacc atctctcgta tcgttgttcg tccgtctatg 1320

accatgacca tcgctgacga cttcctggac gacctgaaac tggctatcga cggtctgaac 1380

cacaccttcg gtgttaccac caccgttgac caggacaaca aaaccaccgt tcgttct 1437

<210> 6

<211> 1437

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgagtaaaa acgatcagga aacgcagcag atgttagacg cagcacaatt ggaaaagact 60

ttcttgggta gcaccgcagc cggtgaatca cttcctaaga acactatgcc tgcaggccca 120

atggccccag acgtagccgt agaaatggtt gaccacttcc gtttaaacga agcaaaagct 180

aaccaaaact tggctacttt ctgtaccact gaaatggaac cacaagctga ccaattgatg 240

atgcgtaccc ttaacactaa cgccatcgac aagtccgaat accctaagac ttccgcaatg 300

gaaaactatt gtgtaagtat gattgctcac ctttggggca ttcctgacga agaaaagttc 360

ggtgatgact tcatcggtac ttcaaccgtt ggttcttccg aaggttgcat gttaggtgga 420

cttgcattgt tgcacacctg gaagcaccgt gctaaggctg ctggccttga catcgatgac 480

cttcacgctc acaagcctaa cttagttatc atgtctggta accaagttgt ttgggaaaag 540

ttctgcactt actggaacgt tgacttccgt caagttccaa tcaatggcga ccaagtatct 600

cttgaccttg accatgttat ggactacgtc gatgagaaca ctattggtat cattggtatt 660

gaagggatca cttacactgg ttccgttgat gacatccaag gtcttgacaa gttagttact 720

gaatacaaca agactgctgc tttgccagta cggattcacg tggacgctgc ctttggtggt 780

ttgttcgccc cattcgttga cggcttcaag ccttgggact tccgtcttga caacgttgtt 840

tcaatcaacg tttcaggtca caagtacggc atggtttacc ctggtttagg ctggatcgta 900

tggcgtaaga actcttacga catccttcct aaggaaatgc gtttctcagt tccttacctt 960

ggttcaagtg tcgactcaat cgctatcaac ttctctcact ctggtgcgca catcaacgcc 1020

caatactaca acttcttacg ctttggttta gctggttaca aggctatcat gaacaacgta 1080

cggaaggttt cattgaagtt gactgacgaa ttacgtaagt ttggtatctt tgacatcctt 1140

gttgatggta aagaattacc aatcaactgc tggaagttgt ctgacaacgc caacgtaagt 1200

tggagtttgt acgacatgga agatgctctg gctaagtacg gctggcaagt acctgcttac 1260

ccacttccaa agaaccgtga agaaactatc accagccgga ttgttgttcg tcctggtatg 1320

actatggcca ttgccgacga cttcatcgat gacttgaagt tagctattgc tgacttgaac 1380

cacagcttcg gtgacgttaa ggatgttaac gacaagaaca agacgactgt tcgttag 1437

Claims

1.一种编码谷氨酸脱羧酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括如权利要求1所述的基因。

3.一种重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌包括如权利要求1所述的基因或如权利要求2所述的重组载体。

4.根据权利要求3所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌通过将所述重组载体热激转化至大肠杆菌BL21感受态细胞制备得到，所述重组载体通过将所述基因连接至pET28a质粒制备得到。

5.一种谷氨酸脱羧酶，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶由如权利要求3或4的重组工程菌表达得到，所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.一种γ-氨基丁酸的生物合成方法，其特征在于，将L-谷氨酸或L-谷氨酸钠加入到含有如权利要求3或4所述的重组工程菌的发酵液中，使L-谷氨酸或L-谷氨酸钠的终浓度为1～8g/L，维持反应温度为4～50℃，反应2～48h即可制得γ-氨基丁酸。

7.根据权利要求6所述的γ-氨基丁酸的生物合成方法，其特征在于，所述重组工程菌的发酵液按照下述方法制备得到：(1)将如权利要求3所述的重组工程菌单菌落接种于含有50μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基中，在37℃、220rpm下培养过夜；(2)将步骤(1)所得过夜培养的产物按2％的接种量接种到LB液体培养基中，并置于37℃下、200rpm培养2.5h；(3)加入IPTG诱导，使IPTG的终浓度为0.1mmol/L，置于16℃下、220rpm培养20h，得到重组工程菌发酵液。

8.根据权利要求6或7所述的γ-氨基丁酸的生物合成方法，其特征在于，反应过程中用HPLC法检测γ-氨基丁酸的生成量，待转化率达到90％以上时，终止反应；反应液经离心分离上清，再经过0.22μm的滤器过滤后，将过滤后的上清使用旋转蒸发仪60℃蒸发去水至溶液成粘稠状；向所述粘稠状溶液中加入3倍体积的无水乙醇，搅拌，室温下自然降温；降至室温后将其放置4℃环境中过夜结晶，抽滤，即得γ-氨基丁酸晶体。