WO2012086909A2 - 락토바실러스 균주 또는 재조합 락토바실러스 균주를 이용한 글루탐산나트륨으로부터 감마-아미노부틸산의 제조 방법 - Google Patents

락토바실러스 균주 또는 재조합 락토바실러스 균주를 이용한 글루탐산나트륨으로부터 감마-아미노부틸산의 제조 방법 Download PDF

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박시재
이승환
송봉근
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한국화학연구원
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01015—Glutamate decarboxylase (4.1.1.15)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing gamma-aminobutyric acid (GABA) from sodium glutamate using Lactobacillus strain or recombinant Lactobacillus strain.
  • GABA gamma-aminobutyric acid
  • GABA gamma-aminobutyric acid
  • Such GABA can be prepared by glutamate decarboxylase based on glutamate, and various glutamate decarboxylases have been reported to date (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8491-8495, 1990; Protein Expression and Purification 8: 430-438, 1996; Biosci.Biotechnol.Biochem.
  • the present inventors have developed a process for converting GABA to high concentrations using sodium glutamate produced by biomass, and researched to develop an economical manufacturing process technology for GABA, which can be used as a monomer of nylon 4,
  • GABA glycosyl-derived glutamate decarboxylase gene
  • An object of the present invention is to provide a method for producing gamma-aminobutyric acid (GABA) from sodium glutamate using Lactobacillus strain or recombinant Lactobacillus strain.
  • GABA gamma-aminobutyric acid
  • GABA gamma-aminobutyric acid
  • the present invention provides a method for producing gamma-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus sp.
  • GABA gamma-aminobutyric acid
  • step 2 2) preferably, but not limited to, obtaining GABA from the culture solution of step 1).
  • the strain Lactobacillus of step 1) can be applied to all kinds of strains of the genus Lactobacillus , Lactobacillus brevis ( Lactobacillus brevis ) is preferred, Lactobacillus brevis KCTC3102, Lactobacillus brevis IFO12005 or Lactobacillus More preferably, it is brevis ATCC367, but is not limited thereto.
  • Glycine, chloroform and EDTA of step 1) are weakening cell membranes of the strains of the genus Lactobacillus, the glycine is preferably included in the medium at a concentration of 0.1% by weight, chloroform 0.1% by weight, and EDTA 10 mM. One is not limited thereto.
  • the MSG of step 1) can be used as a substrate of glutamate decarboxylase, as well as glutamate itself as well as various inorganic salt forms of glutamate.
  • glutamate or sodium salt of glutamate may be used as the substrate, and among sodium salts, MSG (monosodium glutamate) is most preferred but not limited thereto.
  • MSG monosodium glutamate
  • the MSG can be very advantageous in terms of cost when the method of the present invention is carried out on an industrial scale.
  • the medium of step 1) may be any medium used for culturing Lactobacillus strains, but preferably, deMan Rogosa Sharpe (MRS) medium, All Purpose with Tween (APT) medium or Brain Heart Infusion (BHI) medium. Most preferably, the MRS medium is not limited thereto.
  • MRS deMan Rogosa Sharpe
  • APT All Purpose with Tween
  • BHI Brain Heart Infusion
  • the medium of step 1) is preferably pH 4.0 to 5.0, more preferably maintained at a constant pH of 4.6, but is not limited thereto.
  • the culturing of step 1) may be performed for 48 to 96 hours, but is not limited thereto, and the culture temperature is preferably 20-40 ° C., most preferably 37 ° C., but is not limited thereto.
  • GABA of step 2) can be obtained by various methods. For example, by spray-drying the culture solution to obtain a large concentration of low concentration GABA-containing powder, the concentration of the culture medium using a reduced pressure evaporator and then lyophilized to obtain a high concentration of GABA.
  • concentration of the culture medium using a reduced pressure evaporator and then lyophilized to obtain a high concentration of GABA.
  • in order to obtain a high purity GABA can be carried out using a purification method using an ion exchange resin and then concentrated and dried.
  • the GABA is not significantly affected by changes in temperature and pH, and because of its process stability, there is no limitation in the recovery process.
  • strains of various wild-type Lactobacillus sp. Were cultured in MRS medium to which MSG was added, and then the strains having high GABA production capacity were selected by confirming GABA conversion production capacity. As a result, it was confirmed that Lactobacillus brevis KCTC3102, Lactobacillus brevis IFO12005 and Lactobacillus brevis ATCC367 strains had a high GABA conversion production capacity, and after incubating Lactobacillus brevis ATCC367 strains in MRS medium, each cell growth was different.
  • the present inventors measured the concentration of GABA produced by adding glycine, chloroform or EDTA to the medium in the culture of Lactobacillus brevis in order to confirm the effect of the substance that can weaken the cell membrane of the strain. As a result, it was confirmed that the Lactobacillus brevis strain treated with the above-mentioned substances was faster than GABA production rate, and GABA production increased when 0.1% glycine, 0.1% chloroform or 10 mM EDTA was added. (See Tables 3-5).
  • the present invention provides a method for producing GABA by recombinant Lactobacillus strains.
  • step 4 preferably, but not limited to, obtaining GABA from the culture solution of step 3).
  • the microorganism of step 1) is preferably one selected from the group consisting of Escherichia coli , E. coli, Lactococcus lactis and Lactobacillus brevi s. And, it is more preferably any one selected from the group consisting of Lactobacillus brevis ATCC367, Lactococcus lactis IL1403 and E. coli W3110, most preferably, but not limited to E. coli W3110, glutamate decarboxyla Any microorganism expressing an aze can be used.
  • the glutamate decarboxylase gene of step 1) preferably encodes an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 4, but is not limited thereto.
  • the 465 of glutamate decarboxylase derived from E. coli W3110 may be used. More preferably, the first amino acid histidine encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 substituted with alanine.
  • the expression vector of step 1) is preferably a vector operable in lactic acid bacteria, more preferably pMG36e capable of replicating in lactic acid and E. coli, but is not limited thereto.
  • the strain Lactobacillus of step 2) can be applied to all kinds of strains of the genus Lactobacillus , preferably Lactobacillus brevis ( Lactobacillus brevis ), Lactobacillus brevis KCTC3102, Lactobacillus brevis IFO12005 or Lactobacillus brevis ATCC367 More preferably, Lactobacillus brevis KCTC3102 is most preferred but not limited thereto.
  • Lactobacillus brevis KCTC3102 is most preferred but not limited thereto.
  • the medium of step 3) may be any medium used for culturing Lactobacillus strains, but preferably, deMan Rogosa Sharpe (MRS), All Purpose with Tween (APT) medium or Brain Heart Infusion (BHI) medium. Most preferably, the MRS medium is not limited thereto.
  • MRS deMan Rogosa Sharpe
  • APT All Purpose with Tween
  • BHI Brain Heart Infusion
  • the medium of step 3) may further include glycine, chloroform, or EDTA, which is a substance capable of weakening the cell membrane of the strain.
  • the medium of step 3) is preferably pH 4.0 to 5.0, more preferably maintained at a constant pH of 4.6, but is not limited thereto.
  • the culture of step 3) may be performed for 48 to 96 hours, but is not limited thereto.
  • the culture temperature is preferably 20-40 ° C., and most preferably 37 ° C., but is not limited thereto.
  • a plasmid expressing glutamate decarboxylase was prepared and transformed to produce a recombinant Lactobacillus strain, which was then used to produce GABA from MSG.
  • histidine the 465th amino acid of glutamate decarboxylase derived from E. coli W3110 described in SEQ ID NO: 1, is designated as alanine (SEQ ID NO: 2) or a termination codon in the pMG36e vector which is an E.
  • coli -lactic acid shuttle shuttle vector Site-directed mutagenesis glutamate decarboxylase, glutamate decarboxylase from Lactococcus lactis IL1403 (SEQ ID NO: 3), or glutamate dicarboxyl from Lactobacillus brevis ATCC367 Genes encoding laase (SEQ ID NO: 4) were respectively inserted to prepare expression vectors (pECGadBH465A # 2, pECGadBH465stop # 1, PLLGadB (lactics) # 1, and pLBGadB (367) # 1).
  • Each of the expression vectors prepared above was transformed into Lactobacillus brevis KCTC3102 strain to prepare a recombinant Lactobacillus brevis strain, which was cultured in MRS medium to which MSG was added to measure the concentration of GABA converted from MSG.
  • MRS medium to which MSG was added to measure the concentration of GABA converted from MSG.
  • the GABA preparation method can be useful for mass production of GABA from MSG, which is a substrate of the enzyme, by using a recombinant Lactobacillus brevis strain overexpressing a glutamate decarboxylase enzyme having a very good GABA production ability.
  • Lactobacillus strain according to the present invention when incubated with a substance that weakens the cell membrane (glycine, chloroform or EDTA), the ability to produce GABA conversion from sodium glutamate (monosodium glutamate, MSG), microbial derived glutamate Recombinant Lactobacillus strain transformed with a decarboxylase gene (glutamate decarboxylase) gene is superior to the wild type GABA production, GABA production method using the Lactobacillus strain or recombinant Lactobacillus strain is a mass production of GABA It can be very useful for commercialization technology through.
  • a substance that weakens the cell membrane glycine, chloroform or EDTA
  • Example 1 Sodium Glutamate Monosodium Glutamate , MSG From GABA Production capacity Excellent lactic acid bacteria ( lactic acid bacteria Screening
  • GABA Gamma-Aminobutyric Acid
  • Lactobacillus brevis L. brevis
  • GABA production capacity Table 1
  • GABA production was measured by treating glycine, chloroform, or EDTA, which is a chemical substance that can weaken the cell membrane, in the reaction buffer of Example ⁇ 2-1>.
  • L. brevis ATCC367 strains were cultured in MRS medium to obtain cells when the OD 600 of the culture medium was 8, and then concentrated and suspended in 0.2M Na-acetate (pH 4.6) buffer so that the OD 600 was 80, respectively. MSG was then added to 50 g / l. Thereafter, GABA production was confirmed by incubating at 37 °C. At this time, glycine, chloroform or EDTA was added to the reaction buffer at the concentrations listed in Table 3 below.
  • the pMG36e vector is an expression vector with a promoter that operates in lactic acid bacteria and replicates in Lactic acid bacteria and E. coli .
  • MCS multiple cloning site
  • the vector was named pMG36e-2.
  • MCS multiple cloning site
  • the EcoR I region in front of the promoter and the Pvu II region at the back of the transcription terminator were used.
  • the promoter portion present in pMG36e was amplified by PCR using primers 1, 2, and 3 shown in Table 6 below.
  • the gene fragment obtained by amplification as described above was used as a template to perform PCR using primers 1 and 3 again to obtain a gene fragment.
  • the gene fragment thus obtained had an artificially produced MCS with a promoter present in pMG36e, and had a HindIII recognition site at Mfe I and 3 'at 5'.
  • the gene fragment was treated with MfeI and HindIII and then inserted into the pMG36e vector cut with EcoRI and HindIII to prepare a pMG36e-2 vector.
  • the glutamate decarboxylase gene was then used for L.
  • E. coli W3110 primers 8 and 9
  • SEQ ID NO: 1 amplified by PCR from E. coli W3110 (primers 8 and 9) (SEQ ID NO: 1) and inserted into the pMG36e-2 vector to prepare a glutamate decarboxylase expression vector.
  • E. coli gadB is known to maintain the activity of glutamate dicarboxylase even at high pH when the histidine, 465th amino acid, is changed. Therefore, the 465th amino acid histidine is a termination codon or alanine (SEQ ID NO: 2). Site-directed mutagenesis. After PCR using primers 8 and 10, histidine-modified genes were selected by sequencing.
  • Each expression vector prepared in Example ⁇ 3-1> L. brevis Recombinant by transforming to KCTC3102 strain L. brevis KCTC3102 strains were prepared and seeded in 10 ml MRS medium (DIFCO, USA) and primary cultured for 16 hours under stationary conditions. Thereafter, 1 ml of the culture was inoculated again into 100 ml of MRS medium, followed by OD of the culture. 600 When it became 2, MSG was added at 15 g / L and incubated for 96 hours, and a sample was obtained to measure the concentration of MSG and GABA. As shown in Table 7, the pECGadBH465A plasmid was contained. Recombination L.
  • the recombinant L. brevis KCTC3102 strain containing the pECGadBH465A plasmid and the wild type L were cultured in MRS medium with MSG added at 30, 60 and 100 g / L, respectively. It was confirmed that the GABA production concentration was significantly increased compared to the brevis KCTC3102 strain (Tables 8 to 10).

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 균주 또는 재조합 락토바실러스 균주를 이용한 글루탐산나트륨으로부터 감마-아미노부틸산의 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로 MSG로부터 GABA 전환 생산능이 있는 것으로 확인된 락토바실러스 속 균주, 또는 상기 균주에 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase)를 형질전환하여 제조한 재조합 균주에 의해 MSG로부터 GABA를 생산하는 방법에 관한 것이며, 상기 락토바실러스 속 균주 또는 재조합 락토바실러스 속 균주는 MSG로부터 GABA로의 전환 생산능이 우수하므로, 상기 방법은 GABA 생산기술에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

락토바실러스 균주 또는 재조합 락토바실러스 균주를 이용한 글루탐산나트륨으로부터 감마-아미노부틸산의 제조 방법
본 발명은 락토바실러스(Lactobacillus) 균주 또는 재조합 락토바실러스 균주를 이용한 글루탐산나트륨으로부터 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)의 제조 방법에 관한 것이다.
최근 전세계적인 석유수급 불안과 석유자원 고갈에 대한 위기의식으로 최근에 산업 바이오 기술을 이용하여 바이오매스에서 유래한 대체 생산 방법이나 대체 화합물을 생산하기 위한 전 인류적인 노력이 바이오에너지, 바이오플라스틱, 바이오화합물 등의 다양한 분야에서 가시화되고 있다. 바이오매스를 활용하여 생산되는 바이오 플라스틱 시장의 경우 2002년 Natureworks사에 의해 상업화된 폴리유산 (Poly Lactic acid)이 연 14 만 톤 규모로 생산되어 최근 시장이 급속히 확대되고 있다. PHA계 바이오플라스틱인 폴리-(3-하이드록시부틸레이트-코-3-하이드록시발레레이트{poly-(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalarate)}(P(3HB-co-3HV))도 Metabolix와 ADM의 합작회사인 Telles에 의해 5 만톤 규모의 공장이 2010년 완공되어 제품이 시판되고 있다. 또한, 듀폰사가 생산하고 있는 바이오매스 기반의 1,3-프로판디올을 이용하여 PTT 고분자 제품이 현재 상용화되어 있다. 이외에도 숙신산 기반의 PBS 등도 활발히 개발되고 있다. 상기 예로 든 바이오매스 유래 고분자의 단점 중의 하나는 낮은 내열성을 들 수 있다. 높은 내열성을 보유한 고분자의 대표적인 예는 나일론이다. 나일론 6과 나일론 6,6이 나일론 시장의 대부분을 차지하고 있지만 최근 생분해성 특성과 내열성을 동시에 지닌 나일론 4에 대한 관심이 높아지고 있다. 나일론 4의 원료물질인 2-피롤리돈은 감마 부티로락톤(gamma butyrolactone)으로부터 생산될 수 있으며 4-아미노부틸산의 탈수고리반응에 의해 생산될 수 있다.
4-아미노부틸산의 경우 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)이라고도 하는데, 체내에서는 신경전달물질 억제효과에 의한 저혈압 및 진통효과가 있다고 알려져, 현재 식품 및 의약품 소재로 활용되고 있다(Erlander et al., Neurochem Res. 16: 215-226, 1991). 이러한 GABA는 글루타메이트를 원료로 글루타메이트 디카르복실라아제(Glutamate decarboxylase)에 의해 제조될 수 있는데, 현재까지 다양한 글루타메이트 디카르복실라아제가 보고되어 있으며(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8491-8495, 1990; Protein Expression and Purification 8: 430-438, 1996; Biosci. Biotechnol. Biochem. 66(12): 2600-2605, 2002), 글루타메이트 디카르복실라아제를 이용하여 GABA를 생산하는 공정이 개발된바 있다. 하지만, 효소반응의 경우 고가의 효소를 이용하기 때문에 GABA의 저가의 대량생산공정에는 적합하지 않을 수 있다.
이에, 본 발명자들은 바이오매스에서 생산된 글루탐산나트륨을 이용하여 GABA를 고농도로 전환하는 공정을 개발하여 나일론 4의 모노머로 이용될 수 있는 GABA의 경제적인 제조 공정 기술을 개발하기 위하여 연구한 결과, 락토바실러스 속(Lactobacillus) 균주가 세포막을 약화시키는 물질과 함께 배양할 경우 GABA 생성능이 증가하고, 미생물 유래 글루타메이트 디카르복실라아제 유전자로 형질전환된 락토바실러스 속 균주가 GABA를 생성하는 야생성 락토바실러스 속 균주에 비해 현저하게 향상된 GABA 생성능을 가지고 있음을 확인하여, 상기 균주는 GABA를 저가로 대량 생산하는데 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 락토바실러스(Lactobacillus) 균주 또는 재조합 락토바실러스 균주를 이용하여 글루탐산나트륨으로부터 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주를 MSG(monosodium glutamate)를 포함하고 글리신(glycine), 클로로포름(chloroform) 및 EDTA 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
2) 단계 1)의 배양액으로부터 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)을 수득하는 단계를 포함하는 락토바실러스 속 균주에 의한 GABA의 제조방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 미생물 유래의 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase) 유전자를 발현벡터 내로 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;
2) 단계 1)에서 제조한 재조합 벡터를 락토바실러스 속 균주에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하는 단계;
3) 단계 2)에서 제조한 형질전환체를 MSG가 첨가된 배지에서 배양하는 단계; 및
4) 단계 3)의 배양액으로부터 GABA를 수득하는 단계를 포함하는 재조합 락토바실러스 속 균주에 의한 GABA의 제조 방법을 제공한다.
하기 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주에 의한 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법은,
1) 락토바실러스 속 균주를 MSG(monosodium glutamate)를 포함하고 글리신(glycine), 클로로포름(chloroform) 및 EDTA 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
2) 단계 1)의 배양액으로부터 GABA를 수득하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 락토바실러스 속 균주는 모든 종류의 락토바실러스 속 균주에 적용될 수 있으나, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)인 것이 바람직하고, 락토바실러스 브레비스 KCTC3102, 락토바실러스 브레비스 IFO12005 또는 락토바실러스 브레비스 ATCC367인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 1)의 글리신, 클로로포름 및 EDTA는 락토바실러스 속 균주의 세포막을 약화시키는 물질로서, 상기 글리신은 0.1 중량%, 클로로포름은 0.1 중량%, 및 EDTA는 10 mM의 농도로 배지에 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 1)의 MSG는 글루타메이트 디카르복실라아제의 기질로서, 글루타메이트 그 자체뿐만 아니라 글루타메이트의 다양한 무기염 형태를 사용할 수도 있다. 구체적으로, 상기 기질은 글루타메이트 또는 글루타메이트의 소듐염이 이용될 수 있고, 소듐염 중에서 MSG(monosodium glutamate)가 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 MSG는 본 발명의 방법이 산업적인 스케일로 실시되는 경우에 비용 측면에서 매우 유리할 수 있다.
상기 단계 1)의 배지는 락토바실러스 속 균주의 배양에 이용되는 어떠한 배지도 사용가능하나, 바람직하게는 MRS(deMan Rogosa Sharpe) 배지, APT(All Purpose with Tween) 배지 또는 BHI(Brain Heart Infusion) 배지이며, 가장 바람직하게는 MRS 배지이나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 1)의 배지는 pH 4.0 내지 5.0인 것이 바람직하고, pH 4.6으로 일정하게 유지되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 1)의 배양은 48 내지 96시간 동안 실시될 수 있으나 이에 한정되지 않고, 배양 온도는 20-40℃인 것이 바람직하고, 37℃인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 2)의 GABA는 다양한 방법으로 수득할 수 있다. 예를 들어, 배양액을 분무 건조하여 저농도의 GABA-함유 분말을 대량으로 얻을 수 있고, 배양액을 감압 증발기를 이용하여 농축한 후 동결건조를 진행하면 고농도의 GABA 수득이 가능하다. 또한, 고순도의 GABA를 얻기 위해서는 이온교환수지를 이용한 정제방법을 사용한 후 농축 및 건조 공정을 수행할 수 있다. 상기 GABA는 온도 및 pH의 변화에 크게 영향을 받지 않고, 공정 안정성이 있기 때문에, 회수 공정상의 제한은 없다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 다양한 야생형 락토바실러스 속 균주를 MSG가 첨가된 MRS 배지에서 배양한 후 GABA 전환 생산능을 확인하여 GABA 생산능이 높은 균주들을 선별하였다. 그 결과, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KCTC3102, 락토바실러스 브레비스 IFO12005 및 락토바실러스 브레비스 ATCC367 균주가 높은 GABA 전환 생산능을 갖는 것을 확인하였고, 락토바실러스 브레비스 ATCC367 균주를 MRS 배지에서 배양한 후 각각 다른 세포성장 단계에서 균주를 수득한 후(OD600 = 2 또는 8), MSG로부터 GABA로의 전환 반응을 수행한 결과, OD600=8에서 수득한 락토바실러스 브레비스 ATCC367 균주를 아세테이트(acetate) 버퍼(pH = 4.6)에 OD600가 80이 되도록 현탁한 후 반응할 때 53 g/ℓ의 MSG로부터 36.5 g/ℓ의 GABA가 생산되었음을 확인함으로써, 생산된 GABA 농도가 가장 높은 것으로 나타났다(표 2 참조).
본 발명자들은 균주의 세포막을 약화시킬 수 있는 물질의 첨가 효과를 확인하기 위하여, 글리신, 클로로포름 또는 EDTA를 락토바실러스 브레비스 배양시 배지에 첨가하여 생산된 GABA의 농도를 측정하였다. 그 결과, 상기 물질들을 처리한 락토바실러스 브레비스 균주는 처리하지 않은 것에 비해 GABA 생성 속도가 빠른 것을 확인하였고, 글리신 0.1%, 클로로포름 0.1%, 또는 EDTA 10 mM을 첨가했을 때 GABA 생산이 증가됨을 확인하였다(표 3 내지 5 참조).
따라서, 락토바실러스 속 균주의 세포막을 약화시킴으로써 상기 균주의 GABA 생성능이 매우 향상됨을 확인하였으므로, 상기 GABA 제조방법은 GABA의 대량 생산에 유용하게 사용할 수 있다.
아울러, 본 발명은 재조합 락토바실러스 속 균주에 의한 GABA의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법은,
1) 미생물 유래의 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase) 유전자를 발현벡터 내로 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;
2) 단계 1)에서 제조한 재조합 벡터를 락토바실러스 속 균주에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하는 단계;
3) 단계 2)에서 제조한 형질전환체를 MSG가 첨가된 배지에서 배양하는 단계; 및
4) 단계 3)의 배양액으로부터 GABA를 수득하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 미생물은 대장균(Escherichia coli, E. coli), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 락토바실러스 브레비스 ATCC367, 락토코커스 락티스 IL1403 및 E. coli W3110으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 더욱 바람직하며, E. coli W3110인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않고, 글루타메이트 디카르복실라아제를 발현하는 미생물이라면 무엇이든 사용가능하다.
상기 단계 1)의 글루타메이트 디카르복실라아제 유전자는 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, E. coli W3110로부터 유래한 글루타메이트 디카르복실라아제의 465번째 아미노산인 히스티딘이 알라닌으로 치환된, 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 1)의 발현벡터는 유산균(lactic acid bacteria)에서 작동가능한 벡터인 것이 바람직하고, 유산균과 대장균에서 복제가능한 pMG36e인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 2)의 락토바실러스 속 균주는 모든 종류의 락토바실러스 속 균주에 적용될 수 있으나, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)인 것이 바람직하고, 락토바실러스 브레비스 KCTC3102, 락토바실러스 브레비스 IFO12005 또는 락토바실러스 브레비스 ATCC367인 것이 더욱 바람직하며, 락토바실러스 브레비스 KCTC3102인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 3)의 배지는 락토바실러스 속 균주의 배양에 이용되는 어떠한 배지도 사용가능하나, 바람직하게는 MRS(deMan Rogosa Sharpe) 배지, APT(All Purpose with Tween) 배지 또는 BHI(Brain Heart Infusion) 배지이며, 가장 바람직하게는 MRS 배지이나 이에 한정되지 않는다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 단계 3)의 배지는 균주의 세포막을 약화시킬 수 있는 물질인, 글리신(glycine), 클로로포름(chloroform) 또는 EDTA를 추가적으로 포함될 수 있다.
상기 단계 3)의 배지는 pH 4.0 내지 5.0인 것이 바람직하고, pH 4.6으로 일정하게 유지되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 3)의 배양은 48 내지 96시간 동안 실시될 수 있으나 이에 한정되지 않고, 배양 온도는 20-40℃인 것이 바람직하고, 37℃인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 글루타메이트 디카르복실라아제를 발현하는 플라스미드를 제작하고 이를 형질전환하여 재조합 락토바실러스 균주를 제작한 다음, 상기 균주를 이용하여 MSG로부터 GABA를 생산하였다. 구체적으로, 대장균-유산균 셔틀벡터인 pMG36e 벡터에, 서열번호 1로 기재되는 E. coli W3110 유래의 글루타메이트 디카르복실라아제의 465번째 아미노산인 히스티딘이 알라닌(서열번호 2) 또는 종결코돈으로 특정부위돌연변이화(site-directed mutagenesis)된 글루타메이트 디카르복실라아제, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) IL1403 유래의 글루타메이트 디카르복실라아제(서열번호 3), 또는 락토바실러스 브레비스 ATCC367 유래의 글루타메이트 디카르복실라아제(서열번호 4)를 암호화하는 유전자를 각각 삽입하여 발현벡터(pECGadBH465A #2, pECGadBH465stop #1, PLLGadB(lactics) #1, 및 pLBGadB(367) #1)를 제조하였다. 상기 제조한 각각의 발현벡터를 락토바실러스 브레비스 KCTC3102 균주에 형질전환하여 재조합 락토바실러스 브레비스 균주를 제조하였고, 이를 MSG가 첨가된 MRS 배지에 배양하여 MSG로부터 전환된 GABA의 농도를 측정한 결과, 465번째 아미노산인 히스티딘이 알라닌으로 치환된 E. coli W3110 유래의 글루타메이트 디카르복실라아제로 형질전환된 균주(pECGadBH465A #2)의 GABA 생성능이 가장 뛰어났고(표 7 참조), MSG 30, 60 또는 100 g/ℓ로 첨가된 MRS 배지에서 배양한 결과, 야생형 락토바실러스 브레비스 KCTC3102 균주에 비해, GABA의 생산 농도가 현저히 증가됨을 확인하였다(표 8 내지 10 참조).
따라서, 상기 GABA 제조방법은 GABA 생성능이 매우 우수한 글루타메이트 디카르복실라아제 효소를 과발현하는 재조합 락토바실러스 브레비스 균주를 이용함으로써, 상기 효소의 기질인 MSG로부터 GABA의 대량 생산에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에 따른, 락토바실러스 속(Lactobacillus) 균주는 세포막을 약화시키는 물질(글리신, 클로로포름 또는 EDTA)과 함께 배양할 경우, 글루탐산나트륨(monosodium glutamate, MSG)으로부터 GABA 전환 생산능이 향상되고, 미생물 유래 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase) 유전자를 형질전환시킨 재조합 락토바실러스 속 균주는 야생형에 비해 GABA 생산능이 우수하므로, 상기 락토바실러스 속 균주 또는 재조합 락토바실러스 속 균주를 이용한 GABA의 제조방법은 GABA 대량 생산을 통한 상업화 기술에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 글루탐산나트륨( Monosodium Glutamate , MSG )으로부터 GABA 생산능이 뛰어난 유산균( lactic acid bacteria )의 스크리닝
한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture, KCTC) 또는 미국세포주은행(American Type Culture Collection, ATCC) 등에서 분양받은 유산균 균주들의 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA) 생산능을 측정하여 GABA 생산능이 뛰어난 균주들을 스크리닝하였다. 유산균 균주를 10 ㎖ MRS(deMan Rogosa Sharpe) 배지(DIFCO, USA)에 접종하여 정치배양 조건에서 16시간 동안 1차 종배양하였다. 이후, 상기 배양액 1 ㎖을 다시 100 ㎖ MRS 배지에 접종한 후, 배양액의 OD600이 2가 되었을 때 MSG를 30 g/ℓ로 첨가한 후 140시간까지 배양하고, 각각의 시료를 수득하여 MSG 및 GABA의 농도를 측정하였다.
그 결과, 하기 표 1에 기재한 바와 같이, 다양한 유산균 중에서 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis, L. brevis)가 가장 높은 GABA 생성능을 갖는 것으로 나타났다(표 1).
표 1
균주 배양시간 (시간) MSG (g/ℓ) GABA (g/ℓ)
L. paracasei 13169 120 39.9
L. paracasei 3510 120 42.1
L. paracasei 3498 120 11.3 6.9
Leuconostoc fallax3537 140 35.89
Leuconostoc citreumi 3926 140 32.39
Sporolactobacillus inulinus5032 140 32.74
Leuconostoc mesenteroides3535 140 29.40
L. delbrueckii1047 140 27.91
Leuconostoc carnosum3525 140 31.42
Lueconostoc mesenteroides3530 140 34.08
Lactobacillus brevis3102 140 27.93
Leuconostoc citreum 3721 140 35.35
Lueconostoc mesenteroides3100 140 30.74
Lactobacillus brevis3102 120 0 22.52
Lactobacillus brevis13094 120 0 24.68
Lactobacillus brevis12005 120 18.99 16.16
Lactobacillus brevis3498 96 31.72 4.58
Lactobacillus brevis367 24 3.91 22.59
Lactobacillus brevis367 140 0 18.74
L. paracasei 13090 140 30.46
L. paracasei 3165 140 38.91
L. johnsonii3801 140 41.92
L. johnsonii3801 140 31.45
L. delbrueckii13412 140 44.51 0.634
<실시예 2> 락토바실러스 브레비스 ATCC367 균주를 이용한 GABA 생산
<2-1> 락토바실러스 브레비스 ATCC365 균주의 GABA 생산능 확인
L. brevis ATCC367 균주를 MRS 배지에서 배양하여 배양액의 OD600이 8이 되었을 때, 균주를 수득한 후 0.2M Na-acetate(pH 4.6) 버퍼에 OD600이 각각 30, 50 및 80이 되도록 농축하여 현탁한 후, MSG를 50 g/ℓ가 되게 첨가하였다. 그 후, 37℃에서 배양하면서 GABA 생성을 확인하였다.
그 결과, 하기 표 2에 기재한 바와 같이, OD600이 80이 되도록 농축한 후 반응을 하였을 때, GABA 농도가 가장 높았으며 48시간 후에 약 36.5 g/ℓ의 GABA가 생산되었다(표 2).
표 2
시간 OD30 OD50 OD80
MSG (g/ℓ) GABA (g/ℓ) MSG (g/ℓ) GABA (g/ℓ) MSG (g/ℓ) GABA (g/ℓ)
0 50.8 0 53.9 0 53.3 0
2 55.4 1.5 56.2 2.6 45.7 4.6
4 50.9 2.4 51.9 4.1 42.3 7.7
6 54.4 3.2 47.8 5.1 41.4 10.1
25 26.3 4.7 24.2 9.0 16.2 23.8
48 41.8 10.2 32.4 17.3 11.1 36.5
<2-2> 세포막이 약화된 락토바실러스 브레비스 ATCC365 균주의 GABA 생산능 확인
GABA 생산성을 높이기 위하여 상기 실시예 <2-1>의 반응버퍼에 세포막을 약화시킬 수 있는 화학물질인 글리신(glycine), 클로로포름(chloroform), 또는 EDTA를 처리하여 GABA 생산을 측정하였다. 구체적으로, L. brevis ATCC367 균주를 MRS 배지에서 배양하여 배양액의 OD600이 8이 되었을 때 세포를 수득한 후 0.2M Na-acetate(pH 4.6) 버퍼에 OD600이 각각 80이 되도록 농축하여 현탁한 후 MSG를 50 g/ℓ가 되도록 첨가하였다. 그 후 37℃에서 배양하면서 GABA 생성을 확인하였다. 이때, 글리신, 클로로포름 또는 EDTA는 하기 표 3에 기재한 농도로 반응 버퍼에 첨가하였다.
그 결과, 하기 표 3 내지 표 5에 기재한 바와 같이, 글리신 0.1%, 클로로포름 0.1%, 또는 EDTA 10 mM을 첨가하였을 때 L. brevis ATCC365 균주로부터 생산되는 GABA 농도가 가장 높게 나타났다. 이는 상기 화학물질을 첨가하지 않았을 때의 결과와 유사하였으나, 25시간 동안 반응시킨 후 생산된 GABA 농도를 비교하였을 때, 글리신, 클로로포름 또는 EDTA를 첨가하면 더욱 짧은 시간에 반응이 빨리 진행되는 것으로 나타났다. 또한, 글리신 0.1%의 조건에서 38.3 g/ℓ의 GABA가 생성되어 글리신을 첨가하지 않았을 때보다 높은 GABA 농도를 확인하였다(표 3 내지 표 5).
표 3
시간 글리신 0.1% 글리신 0.5% 글리신 1%
MSG (g/ℓ) GABA (g/ℓ) MSG (g/ℓ) GABA (g/ℓ) MSG (g/ℓ) GABA (g/ℓ)
0 46.7 0 47.9 0 53.7 0
2 34.6 3.7 36.2 3.8 52.6 0
4 44.6 7.9 45.7 7.8 63.2 0.7
6 40.7 9.6 43.6 9.9 64.2 0.9
25 20.0 23.7 17.2 21.8 54.1 1.0
48 16.6 38.3 13.5 35.2 63.2 1.4
표 4
시간 클로로포름 0.1% 클로로포름 0.5% 클로로포름 1%
MSG (g/ℓ) GABA (g/ℓ) MSG (g/ℓ) GABA (g/ℓ) MSG (g/ℓ) GABA (g/ℓ)
0 55.0 0 58.3 0 48.5 0
2 50.2 6.1 34.0 3.1 42.2 6.9
4 41.8 9.0 50.2 6.5 41.3 12.0
6 38.7 11.3 52.9 8.2 38.1 12.6
25 35.8 14.3 40.8 10.6 14.3 29.9
48 7.8 35.1 44.1 12.9 38.5 16.8
표 5
시간 EDTA 10 mM EDTA 20 mM EDTA 30 mM
MSG (g/ℓ) GABA (g/ℓ) MSG (g/ℓ) GABA (g/ℓ) MSG (g/ℓ) GABA (g/ℓ)
0 63.8 0 64.2 0 57.7 0
2 39.0 3.8 38.0 3.8 33.6 3.5
4 41.9 6.8 38.9 7.0 40.7 7.3
6 43.0 9.1 39.2 9.3 38.7 8.9
25 24.4 22.0 22.6 20.2 22.0 20.8
48 18.5 30.4 20.9 28.1 19.9 27.9
<실시예 3> 재조합 L. brevis KCTC3102 균주를 이용한 GABA 생산
<3-1> 글루타메이트 디카르복실라아제( Glutamate decarboxylase )를 발현하는 재조합 발현벡터의 제작
pMG36e 벡터는 유산균(Lactic acid bacteria)와 대장균(E. coli)에서 복제(replication)가 일어나며, 유산균에서 작동하는 프로모터를 가지고 있는 발현벡터이다. 유전자의 클로닝 및 발현을 용이하게 하기 위하여 pMG36e 벡터의 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)를 우선적으로 바꾸었고 그 벡터 이름을 pMG36e-2라 명명하였다. 구체적으로, pMG36e에 존재하는 프로모터, MCS, 전사 종결자(transcription terminator) 부분을 제거하고 원하는 발현 모듈을 삽입하기 위해서 프로모터 앞 부분의 EcoRⅠ 부위, 전사 종결자 뒷부분의 PvuⅡ 부위를 이용하였다. 우선, pMG36e에 존재하는 프로모터 부분을 하기 표 6의 프라이머 1, 2 및 3을 사용하여 PCR을 실시하여 증폭하였다. 또한, 상기와 같이 증폭하여 수득한 유전자조각을 주형으로 하여 다시 프라이머 1 및 3을 사용하여 PCR을 수행하여 유전자조각을 수득하였다. 이렇게 수득한 유전자 조각은 pMG36e에 존재하는 프로모터와 인위적으로 제작된 MCS를 보유하게 되며, 5' 부분에 MfeⅠ, 3' 부분에 HindⅢ 인식 부위를 갖게 제작되었다. 상기 유전자조각을 MfeⅠ 및 HindⅢ로 처리한 후, EcoRⅠ 및 HindⅢ로 자른 pMG36e 벡터에 삽입하여, pMG36e-2 벡터를 제작하였다. 그런 다음, 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase) 유전자를 L. brevis ATCC367 (프라이머 4 및 5 사용)(서열번호 4), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) IL1403 (프라이머 6 및 7 사용)(서열번호 3), E. coli W3110 (프라이머 8 및 9)(서열번호 1)으로부터 PCR을 통해 증폭하여, pMG36e-2 벡터에 삽입하여 글루타메이트 디카르복실라아제 발현벡터를 제작하였다. 이때, E. coli gadB의 경우, 465번째 아미노산인 히스티딘을 변화시켰을 때 높은 pH에서도 글루타메이트 디카르복실라아제의 활성을 유지하는 것으로 알려져 있으므로, 465번째 아미노산 히스티딘은 종결코돈 또는 알라닌(서열번호 2)으로 특정부위돌연변이화(site-directed mutagenesis)를 유도하였다. 프라이머 8 및 10번을 이용하여 PCR을 한 후 히스티딘이 변화된 유전자를 시퀀싱을 통하여 선별하였다.
표 6
프라이머 서열(5'-3') 서열번호
1 caattgagattaatagttttagctatt 5
2 cgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcattcctccgaatatttttttacc 6
3 aagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccg 7
4 gagctcgcatgaataaaaacgatcaggaaac 8
5 cctgcaggttaacttcgaacggtggtcttg 9
6 gaattcatgttatacggaaaagaaaatc 10
7 ggtaccttagtgagtaaatccatatg 11
8 gagctcatggataagaagcaagtaac 12
9 ggatcctcaggtRtgtttaaagctgt 13
10 ggatcctcaggtNgNtttaaagctgttctgttgggc 14
<3-2> 재조합 L. brevis KCTC3102 균주를 이용한 GABA 생산
상기 실시예 <3-1>에서 제조한 각각의 발현벡터를 L. brevis KCTC3102 균주에 형질전환하여 재조합 L. brevis KCTC3102 균주를 제조하였고, 이를 10 ㎖ MRS 배지(DIFCO, USA)에 접종하여 정치배양 조건에서 16시간 동안 1차 종배양하였다. 이후, 상기 배양액 1 ㎖을 다시 100 ㎖의 MRS 배지에 접종한 후, 배양액의 OD600이 2가 되었을 때, MSG를 15 g/ℓ로 첨가한 후 96시간까지 배양하고, 시료를 수득하여 MSG 및 GABA의 농도를 측정한 결과, 하기 표 7에 기재한 바와 같이, pECGadBH465A 플라스미드를 함유하고 있는 재조합 L. brevis의 GABA 생성능이 가장 뛰어난 것으로 확인되었다(표 7). 이에, 상기 재조합 L. brevis를 이용하여 더 높은 농도의 MSG 전환 실험을 수행하였다. 구체적으로, 상기와 같은 방법으로 재조합 L. brevis를 배양하여 배양액의 OD600이 2가 되었을 때, MSG를 30, 60 및 100 g/ℓ로 각각 첨가한 후 72시간까지 배양하였고, 각각의 시표를 수득하여 MSG 및 GABA의 농도를 측정하였다.
그 결과, 하기 도 8 내지 도 10에 기재한 바와 같이, pECGadBH465A 플라스미드를 함유하고 재조합 L. brevis KCTC3102 균주는 MSG가 30, 60 및 100 g/L로 각각 첨가된 MRS 배지에서 배양함에 따라, 야생형 L. brevis KCTC3102 균주에 비해 GABA 생산 농도가 현저히 증가된 것으로 확인되었다(표 8 내지 10).
표 7
시간　 3102 pMG-2 pECGadBH465A #2
OD MSG GABA OD MSG GABA OD MSG GABA
0 2.00 21.72 0.00 2.00 21.73 0.00 2.00 22.31 0.00
24 5.82 5.09 13.80 2.72 22.07 2.35 5.19 8.16 11.56
48 5.18 0.00 14.10 5.76 0.00 14.70 4.50 0.00 16.43
96 3.91 0.00 16.65 4.50 0.00 14.71 3.70 0.00 16.02
시간 pECGadBH465stop #1 pLLGadB(lactics) #1 pLBGadB(367) #1
OD MSG GABA OD MSG GABA OD MSG GABA
0 2.00 22.45 0.00 2.00 23.75 0.00 2.00 21.67 0.00
24 2.53 20.43 0.00 2.24 26.15 0.00 2.61 20.92 0.00
48 4.20 10.29 8.81 2.66 23.03 2.38 5.70 0.00 13.73
96 4.14 0.00 14.64 4.53 0.00 15.02 4.35 0.00 15.61
표 8
시간　 3102 pMG-2 pECGadBH465A #2
OD MSG GABA OD MSG GABA OD MSG GABA
0 2.26 20.77 0 2.06 23.61 0.00 2.24 34.81 0.00
72 5.84 0 22.87 6.32 0 26.68 4.87 0 24.83
MSG 30 g/ℓ를 처리한 경우.
표 9
　 3102 pMG-2 pECGadBH465A #2
　 OD MSG GABA OD MSG GABA OD MSG GABA
0h 2.30 42.26 0 2.08 86.20 0 2.63 77.53 0
72h 5.17 0 35.59 6.12 20.32 33.9 5.04 0 46.88
MSG 60 g/ℓ를 처리한 경우.
표 10
　 3102 pMG-2 pECGadBH465A #2
　 OD MSG GABA OD MSG GABA OD MSG GABA
0 2.20 89.4 0 2.02 91.1 0 2.24 109.38 0
72 5.41 49.1 29.9 4.86 73.1 24.5 3.95 64.49 31.9
MSG 100 g/ℓ를 처리한 경우.

Claims (11)

1) 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주를 MSG(monosodium glutamate)를 포함하고 글리신(glycine), 클로로포름(chloroform) 및 EDTA 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
2) 단계 1)의 배양액으로부터 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)을 수득하는 단계를 포함하는 락토바실러스 속 균주에 의한 GABA의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)인 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 글리신, 클로로포름 및 EDTA의 농도는 각각 0.1 중량%, 0.1 중량% 및 10 mM인 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 배양은 48 내지 96시간 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.
1) 미생물 유래의 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase) 유전자를 발현벡터 내로 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;
2) 단계 1)에서 제조한 재조합 벡터를 락토바실러스 속 균주에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하는 단계;
3) 단계 2)에서 제조한 형질전환체를 MSG(monosodium glutamate)가 첨가된 배지에서 배양하는 단계; 및
4) 단계 3)의 배양액으로부터 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)을 수득하는 단계를 포함하는 재조합 락토바실러스 속 균주에 의한 GABA의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 단계 1)의 미생물은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 및 대장균(Escherichia coli, E. coli)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 글루타메이트 디카르복실라아제는 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 기재되는 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 단계 1)의 발현벡터는 pMG36e인 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)인 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 단계 3)의 배지는 글리신, 클로로포름 및 EDTA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 단계 3)의 배양은 48 내지 96시간 동안 실시되는 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.
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