CN110195088B

CN110195088B - 一种精氨酸水解酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN110195088B
Application number: CN201810163250.5A
Authority: CN
Inventors: 杨琛; 张昊; 刘玉洁; 聂晓群
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2018-02-26
Filing date: 2018-02-26
Publication date: 2022-09-27
Anticipated expiration: 2038-02-26
Also published as: CN110195088A

Abstract

本发明提供了一种新的精氨酸水解酶及其编码基因和应用，具体地，本发明提供了一种生产鸟氨酸的方法，本发明的精氨酸水解酶制备获得鸟氨酸的副产物是氨和二氧化碳，它们可以很容易的从反应体系中分离，方便鸟氨酸的分离纯化。

Description

一种精氨酸水解酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物技术领域，具体地，涉及一种新的精氨酸水解酶及其编码基因和应用。

背景技术

L-鸟氨酸是一种丰富的非蛋白合成的氨基酸，被广泛用于制作食品补充剂和营养产品。药物剂量的鸟氨酸可以诱导脑垂体中生长激素的分泌进而增强代谢防止肥胖、减缓身体疲劳，因此鸟氨酸是健身者和运动员理想的营养添加剂^1,2。研究报道小鼠口服鸟氨酸可以延长睡眠时间³，在人服用鸟氨酸的研究中也发现鸟氨酸具有缓解压力、提高睡眠质量的作用⁴。在人体中鸟氨酸可以帮助伤口愈合并且通过排氨保护肝脏^5,6。鸟氨酸还是一种天然甜味剂被用于减少果汁和其它饮料的苦味⁷。由于鸟氨酸在食品和药物领域广泛的应用价值，因此急需一种简便和节能的方式来生产鸟氨酸。

已知有三种主要的生产方式来生产鸟氨酸：化学合成，发酵和酶法合成。

化学合成是最早使用的一种方法，它的主要缺点在于合成步骤繁琐、得到的是鸟氨酸的消旋体即等摩尔L-鸟氨酸和D-鸟氨酸的混合物不易分离。另外化学法合成鸟氨酸的产率较低不足70％。

当前，鸟氨酸大多通过微生物发酵获得。虽然微生物发酵能够达到很高的产量，但也存在长时间发酵不充分和底物浪费的问题。同时发酵液成分复杂，给分离提纯鸟氨酸增加了难度。相比之下利用酶法将L-精氨酸转化为L-鸟氨酸的方法更加高效，精氨酸的价格只占鸟氨酸价格的三分之一为酶法生产鸟氨酸的方法提供了可能。

然而，当前酶法主要是用精氨酸酶以精氨酸为底物生成鸟氨酸和尿素。精氨酸酶主要从动物的肝脏中提取，它的回收率比较低花费比较高。热熔芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、幽门螺杆菌、苏云金杆菌和短芽孢杆菌中也可以获取精氨酸酶，但是这些物种里的精氨酸酶容易形成包涵体难以纯化。

因此，本领域迫切需要开发一种可以很容易的从反应体系中分离方便鸟氨酸的分离纯化的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以很容易的从反应体系中分离方便鸟氨酸的分离纯化的方法。

本发明第一方面提供了一种生产鸟氨酸的方法，所述方法包括步骤：

(i)在反应体系中，以L-精氨酸(L-arginine)为底物，在精氨酸水解酶的催化下，进行反应式I所示的催化反应，从而形成L-鸟氨酸(L-ornithine)；和

L-arginine+2H₂O＝L-ornithine+2NH₃+CO₂

反应式I

(ii)任选地，从所述步骤(i)的反应后的反应体系中分离出L-鸟氨酸；

其中，所述的精氨酸水解酶来源于蓝细菌集胞藻(Synechocystis sp.)。

在另一优选例中，所述精氨酸水解酶来源于蓝细菌集胞藻属 6803(Synechocystis sp.PCC 6803)。

在另一优选例中，所述精氨酸水解酶为野生型或突变体。

在另一优选例中，所述鸟氨酸和氨的化学计量比e为0.1-10:0.2-20，较佳地，0.5-8：0.5-15，更佳地，0.8-5：1-10，更佳地，0.9-3:1-3。

在另一优选例中，所述反应的转化率≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥98％，更佳地≥99％，最佳地100％。

在另一优选例中，所述精氨酸水解酶选自下组：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.:1、3或5所示的多肽；

(b)将SEQ ID NO.:1、3或5所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(a)或(b)所述多肽功能的由SEQ ID NO.:1、 3或5所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。

在另一优选例中，所述精氨酸水解酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.:1、3或5所示的序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、 98％、99％以上的序列相同性。

在另一优选例中，所述精氨酸水解酶为选自下组的形式：静息细胞、菌体、粗酶液、纯酶、粗酶粉、固定化酶、游离酶、发酵液、或其组合。

在另一优选例中，所述反应体系中，所述精氨酸水解酶的浓度为 0.005-0.2U/ml，较佳地，0.008-0.1U/ml，更佳地，0.01-0.05U/ml。

在另一优选例中，所述反应体系中，所述精氨酸水解酶的浓度为0.5-50ug/ml，较佳地，1-20ug/ml，更佳地，2-10ug/ml。

在另一优选例中，所述反应体系中，所述L-精氨酸的浓度为0.01mM-100mM，较佳地，0.05-80mM，更佳地，0.08-50mM。

在另一优选例中，所述反应体系中还包括：三乙醇胺、2-酮戊二酸、NADH、和 /或谷氨酸脱氢酶。

在另一优选例中，所述三乙醇胺的浓度为5-500mM，较佳地，10-80mM，更佳地， 30-60mM。

在另一优选例中，所述2-酮戊二酸的浓度为0.5-50mM，较佳地，0.8-30mM，更佳地，1-10mM。

在另一优选例中，所述NADH的浓度为0.02-2mM，较佳地，0.08-1.5mM，更佳地，0.1-1mM。

在另一优选例中，所述谷氨酸脱氢酶的浓度为0.5-50U，较佳地，1-20U，更佳地，2-10U。

在另一优选例中，所述反应体系中还包括金属盐。

在另一优选例中，所述金属盐选自下组：MnCl₂、CoCl₂、MgCl₂、NaCl、CaCl₂、 FeCl₃、FeSO₄、ZnSO₄、CuSO₄、或其组合。

在另一优选例中，所述金属盐选自下组：MnCl₂、MgCl₂、NaCl、CaCl₂、FeCl₃、 FeSO₄、或其组合。

在另一优选例中，步骤(i)中，反应体系的pH为6-8，较佳地，7.0。

在另一优选例中，步骤(i)中，反应温度为20-30℃，较佳地，25度。

在另一优选例中，步骤(i)中，反应时间为10-50分钟，较佳地，20-40分钟。

本发明第二方面提供了一种精氨酸水解酶的用途，用于制备一制剂，所述制剂用于催化以下催化反应：

L-arginine+2H₂O＝L-ornithine+2NH₃+CO₂

反应式I

在另一优选例中，所述精氨酸水解酶选自下组：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.:1、3或5所示的多肽；

本发明第三方面提供了一种L-鸟氨酸生产菌株，所述菌株表达多肽，所述多肽为外源的蓝细菌集胞藻属(Synechocystis sp.)的精氨酸水解酶，并用于催化以下催化反应：

L-arginine+2H₂O＝L-ornithine+2NH₃+CO₂

反应式I。

在另一优选例中，所述精氨酸水解酶为野生型或突变体。

在另一优选例中，所述精氨酸水解酶选自下组：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.:1、3或5所示的多肽；

在另一优选例中，所述生产菌株是细菌，优选地，所述生产菌株是大肠杆菌，更优选地，所述生产菌株是E.coli BL21(DE3)。

本发明第四方面提供了一种生产L-鸟氨酸的方法，所述方法包括步骤：

a)在合适的培养条件下，培养本发明第三方面所述的生产菌株，从而得到L- 鸟氨酸；

b)任选地，从a)的培养体系中分离获得L-鸟氨酸。

本发明第五方面提供了一种具有L-鸟氨酸催化活性的精氨酸水解酶，所述精氨酸水解酶选自下组：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.:1、3或5所示的多肽；

在另一优选例中，所述精氨酸水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1、3或5所示。

在另一优选例中，所述精氨酸水解酶为选自下组的形式：菌体、粗酶液、纯酶、粗酶粉、固定化酶、游离酶、发酵液、或其组合。

本发明第六方面提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第五方面所述的精氨酸水解酶。

在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:1、3或5所示多肽的多核苷酸。

(b)序列如SEQ ID NO.:2全长(第1-2118位)、SEQ ID No.:2中第1-807位；或 SEQID No.:2中第1-849位所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与(b)中所示多核苷酸序列的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)，且编码SEQ ID NO.:1、3或5所示多肽的多核苷酸；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1基于Pfam数据库蛋白结构域的分析；

图2ArgZ全长蛋白及ArgZN截短蛋白的表达；

图3ArgZ反应0min、15min、60min后产物的HPLC检测；

图4ArgZ蛋白没有脒基转移酶活性；

图5ArgZ没有精氨酸酶(arginase)活性；

图6ArgZ反应化学计量数的定量；

图7ArgZ催化的反应；

图8金属离子对ArgZ双水解酶活性的影响；

图9ArgZ的底物特异性；

图10ArgZ动力学参数的测定；

图11ArgZ的N端结构域ArgZN负责催化精氨酸的水解反应。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，意外地发现一种可高效获得鸟氨酸，且不生成尿素的来源于蓝细菌集胞藻属(Synechocystis sp.)的精氨酸水解酶(argZ)，本发明的精氨酸水解酶没有氨基转移酶活性，可特异性的将精氨酸水解为鸟氨酸，而不生成其他氨基酸(比如，甘氨酸、赖氨酸)，并且本发明的精氨酸水解酶制备获得鸟氨酸的副产物是氨和二氧化碳，它们可以很容易的从反应体系中分离，方便鸟氨酸的分离纯化。本发明的实验表明，本发明的精氨酸水解酶具有优异的反应速率和代谢动力学参数。本发明进一步的实验表明，ArgZ蛋白N端的269护氨基酸残基ArgZN可以被单独纯化出来，而且N端结构域负责了精氨酸水解的活性，在等摩尔的条件下，ArgZ和ArgZN具有相同的精氨酸水解活性。在此基础上，本发明人完成了本发明。

术语

化学计量比e

如本文所用，术语“化学计量比e”指化学计量系数的比值。在本发明的ArgZ 催化的反应中，鸟氨酸和氨的化学计量系数之比为0.1-10:0.2-20，较佳地，0.5-8： 0.5-15，更佳地，0.8-5：1-10，更佳地，0.9-3:1-3，更佳地，1:2。

PET表达系统

PET表达系统为本领域技术人员熟知的常规技术。Novagen公司的pET蛋白表达系统使用T7噬菌体启动子，是目前应用最广泛的原核表达系统。具体可参考J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆指南，第三版，科学出版社，2002中第15章“在大肠杆菌中表达克隆化基因”，或参考Novagen公司pET系统操作手册。

精氨酸水解酶

如本文所用，术语“精氨酸水解酶”、“ArgZ”、“本发明多肽”、“多肽”、“本发明的精氨酸水解酶”可互换使用，均指来源于蓝细菌集胞藻属 (Synechocystis sp.)，没有氨基转移酶活性，可特异性的将精氨酸水解为鸟氨酸，而不生成其他氨基酸(比如，甘氨酸、赖氨酸)的蛋白。优选的，所述的本发明的多肽指本发明第一方面所定义的酶。

Synechocystis sp.PCC 6803:sll1336在GenBank的注释是hypotheticalprotein，蛋白全长705个氨基酸，基因全长2118个核苷酸。

在本发明中，精氨酸水解酶是由基因sll1336编码的蛋白，全长705个氨基酸。并且本发明首次发现，该蛋白N端的269或283个氨基酸负责了精氨酸水解酶的活性并且可以被截短表达。

在本发明的优选实施方式中，所述精氨酸水解酶的野生型蛋白序列如SEQ IDNO.:1所示:

MADDIRILMCPPDHYDVDYVINPWMEGNIHKSSQERAVEQWKKLHQTIKECAIVDLVKPAKGWPDM VFTANAGLVLGENVVLSRFYHKERQGEEPYFKAWFEENGFTVYELPQDLPFEGAGDALFDREGRWLWAGYG FRSELDSHPYIAKWLDTEVVSLRLIDERFYHLDTCFCPLSGGYLLYYPPAFDAYSNRVIEMRIPPEKRIIV EELDAVNFACNAVNVNDIIIMNLVSRTLKEKLAEAGFKVRETPLTEFLKAGGAAKCLTLRVTEPILPDVHA TVSIESRVIRMEGHLLDAGILNQALDLVVENSGSFRVLNFNLGVERNSTSSAEVRVSAPSHQIMEEIMTEL IDLGAVPPPQELCDINTETVTQGGVAPDDFYVSTIYPTEVRVNCEWVQVTGQRMDAAIVVTSNPPSARCVL LRDLQVGDRVMVGVEGIRTIKKVESHEGGTRKENKEFAFMAAGVSSERRVELLVEQIAWEMRQIRDQGGKI VVTAGPVVIHTGGAQHLSHLVREGYVHALLGGNAIAVHDIEQATMGTSLGVDMQRGIPVRGGHRHHLKIIN SVRRYGGIRQAVEAGFISKGVMYECVKNNIPYCLAGSIRDDGPLPDTEMNLVRAQSRYSELIQGADMILML SSMLHSIGVGNMTPSGVKMVCVDINPAVVTKLSDRGSVESVGVVTDVGLFLSLLVRQLQQLTRPYSLAETL

(SEQ ID NO.:1)

在本发明的优选实施方式中，所述精氨酸水解酶的截短的蛋白序列(N端269个氨基酸)如SEQ ID NO.:3所示。

MADDIRILMCPPDHYDVDYVINPWMEGNIHKSSQERAVEQWKKLHQTIKECAIVDLVKPAKGWPDM VFTANAGLVLGENVVLSRFYHKERQGEEPYFKAWFEENGFTVYELPQDLPFEGAGDALFDREGRWLWAGYG FRSELDSHPYIAKWLDTEVVSLRLIDERFYHLDTCFCPLSGGYLLYYPPAFDAYSNRVIEMRIPPEKRIIV EELDAVNFACNAVNVNDIIIMNLVSRTLKEKLAEAGFKVRETPLTEFLKAGGAAKCLTLRV(SEQ ID NO.:3)

在本发明的优选实施方式中，所述精氨酸水解酶的截短的蛋白序列(N端283个氨基酸)如SEQ ID NO.:5所示。

MADDIRILMCPPDHYDVDYVINPWMEGNIHKSSQERAVEQWKKLHQTIKECAIVDLVKPAKGWPDM VFTANAGLVLGENVVLSRFYHKERQGEEPYFKAWFEENGFTVYELPQDLPFEGAGDALFDREGRWLWAGYG FRSELDSHPYIAKWLDTEVVSLRLIDERFYHLDTCFCPLSGGYLLYYPPAFDAYSNRVIEMRIPPEKRIIV EELDAVNFACNAVNVNDIIIMNLVSRTLKEKLAEAGFKVRETPLTEFLKAGGAAKCLTLRVTEPILPDVHA TVSI(SEQ IDNO.:5)

野生型编码基因序列如SEQ ID NO.:2所示：

atggctgacgatattcgcattttgatgtgcccccccgaccactacgacgtggactatgtaattaat ccttggatggagggcaatatccacaaatcctcccaggagcgggccgtagagcaatggaaaaaactacacca gaccatcaaagaatgcgccatcgtggacttggtgaagccggcaaagggttggcctgatatggtctttaccg ccaatgcggggctggtgctaggggaaaatgtcgtactgagtcgcttctaccacaaagaacgccagggggaa gaaccctatttcaaagcttggtttgaggaaaatggtttcaccgtttacgaactgccccaggatttaccctt tgaaggggccggggatgccctgtttgaccgggaaggccgttggttgtgggccggctatggtttccgttccg aactagattcccatccctacattgccaaatggctagatacagaagtagtctccctgcggttaattgatgag cgcttctatcacctcgatacctgtttttgccccctgagtggtggctatttactctactatccccctgcgtt tgacgcctattccaaccgggtaattgaaatgcggattccgccggaaaaaaggattattgtcgaggaactgg atgcggttaattttgcctgcaatgcggtcaatgttaacgacatcatcattatgaatttggtgagtcgaacc ctgaaggaaaaattagctgaggcgggctttaaggtgcgggaaactcccctgacggaatttttgaaagcggg gggagcggccaaatgtctaaccctgcgggtaacggagcccattttgccagatgtccatgccaccgtttcca ttgaaagtcgggtgattcgcatggagggtcatctactcgatgccggtattctgaaccaagccctggatttg gtggtggaaaacagcggtagtttccgggtgctgaacttcaatttaggggtggagcgcaacagtacttccag cgcagaggtaagggtttcggccccctcccaccaaattatggaagagatcatgaccgagctgattgatctcg gcgcagtgccccctccccaggaactctgtgatatcaacaccgaaacggtgacccaagggggggtagctccc gatgatttctatgtcagcaccatttaccccacagaggtgcgggttaattgcgaatgggtccaggtgacagg acaacggatggatgcggccattgtggtcaccagcaatcccccttcggcccgctgtgtgctcctccgggatc tccaggtcggcgatcgagtcatggtgggagtcgaaggtattcgtaccatcaaaaaagtggaatcccatgaa ggcggaacccgcaaagaaaataaggaatttgccttcatggcagcgggggtttccagcgagcgtcgggtaga acttttggtggaacaaattgcctgggaaatgcgacaaatccgggaccagggaggcaaaattgttgttaccg caggacctgtggtgatccatactggaggagcccaacacctttcccatctggtgcgggagggctatgtccat gccctactggggggcaatgcgatcgccgtccatgacattgaacaggccaccatgggtacttccctgggggt agatatgcaacggggcatcccagtgcggggggggcaccgtcaccatctgaaaattattaacagtgtgcggc gctacggtgggatccgccaggcggtggaagctggatttatcagcaaaggggttatgtacgaatgcgtaaaa aataacatcccctattgcctagctggttccatccgggatgacggccccctgcccgacacggaaatgaacct agttcgggctcagagccgttacagtgagttaattcagggagcagatatgattctgatgctgtccagcatgt tgcactccattggcgtcggcaatatgactccttccggcgtaaaaatggtctgtgtggacattaaccccgct gtggttaccaaactgagcgatcgtggttcagtggaatccgtgggggtggtcaccgatgtggggttattcct cagtcttctggtacgacaactgcaacaactcaccagaccctatagcttggcggaaacactttaa

(SEQ ID NO.:2)

以编码所述精氨酸水解酶的截短的蛋白序列(N端269个氨基酸)的核苷酸序列为例。

在本发明的优选实施方式中，编码所述精氨酸水解酶的截短的蛋白序列(N端 269个氨基酸)的核苷酸序列如SEQ ID NO.:4所示。

atggctgacgatattcgcattttgatgtgcccccccgaccactacgacgtggactatgtaattaat ccttggatggagggcaatatccacaaatcctcccaggagcgggccgtagagcaatggaaaaaactacacca gaccatcaaagaatgcgccatcgtggacttggtgaagccggcaaagggttggcctgatatggtctttaccg ccaatgcggggctggtgctaggggaaaatgtcgtactgagtcgcttctaccacaaagaacgccagggggaa gaaccctatttcaaagcttggtttgaggaaaatggtttcaccgtttacgaactgccccaggatttaccctt tgaaggggccggggatgccctgtttgaccgggaaggccgttggttgtgggccggctatggtttccgttccg aactagattcccatccctacattgccaaatggctagatacagaagtagtctccctgcggttaattgatgag cgcttctatcacctcgatacctgtttttgccccctgagtggtggctatttactctactatccccctgcgtt tgacgcctattccaaccgggtaattgaaatgcggattccgccggaaaaaaggattattgtcgaggaactgg atgcggttaattttgcctgcaatgcggtcaatgttaacgacatcatcattatgaatttggtgagtcgaacc ctgaaggaaaaattagctgaggcgggctttaaggtgcgggaaactcccctgacggaatttttgaaagcggg gggagcggccaaatgtctaaccctgcgggtataa(SEQ IDNO.:4)。

基于现有技术的知识，本领域普通技术人员不难知晓，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224)。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。

在一优选实施方式中，本发明的精氨酸水解酶是野生型或突变体。

在本发明中，所述精氨酸水解酶包括与氨基酸序列SEQ ID NO.:1、3或5所示的多肽相比，有至多20个、较佳地至多10个，又佳地至多8个，再佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的突变体。这些保守性变异的突变体可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生。

表A

本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

在具体的实施方式中，所述同源性或序列相同性可以是80％以上，优选90％以上，更优选95％-98％，最优选99％以上。

本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M. 和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析 (Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987 和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.， 48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、 BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX 程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。

本发明的多肽可以是天然纯化的产物、重组表达的产物或是化学合成的产物。

本发明中N端截短的蛋白可以是N端269个到N端283个中任意长度的多肽。在全长蛋白和N端截短蛋白的基础上，本发明的多肽片段、衍生物或类似物还可以是i 成熟多肽与另一个化合物(如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合形成的多肽，或ii附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

载体和宿主细胞

本发明还提供了一种包含本发明的精氨酸水解酶基因的载体，以及含所述载体的宿主细胞。

在本发明的一个优选例中，所述述载体具有在大肠杆菌(更佳地在大肠杆菌 BL21(DE3)菌株)中表达的能力。

本领域的普通技术人员可以使用的常规方法获得本发明的精氨酸水解酶基因序列，例如全人工合成或PCR法合成。一种优选的合成法为不对称PCR法。不对称PCR法是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(ssDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50-100∶1。在PCR 反应的最初10-15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明的多核苷酸序列可以通过常规的重组DNA技术(如常用的PET蛋白表达系统)，表达或生产目的蛋白，包括步骤：

(1)用编码本发明蛋白的多核苷酸)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞，较佳地大肠杆菌细胞；

(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，优选市售的载体：pET28a。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

本发明还提供的重组载体，其包含本发明的经过优化的MeHNL DNA序列。在优选的实施方式中，所述重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点，从而可操作地连接目的基因与启动子。

在另一优选的实施方式中，所述重组载体在5’到3’方向上包括：启动子，目的基因和终止子。如果需要，所述重组载体还可以包括以下元件：蛋白纯化标签；3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；选择标记(抗生素抗性基因、荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以被采用。

本领域普通技术人员可以采用熟知的方法构建含有本发明启动子和/或目的基因序列的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

本发明的表达载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主转录目的RNA 或表达目的蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl₂法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

术语“可操作连接”是指将准备转录表达的目的基因以一种本领域的常规方式连接到它的控制序列以被表达。

工程菌的培养和目的蛋白发酵生产

在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞，表达本发明的基因序列所编码的蛋白。根据宿主细胞的不同，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在本发明中，可采用常规的发酵条件。代表性的条件包括(但并不限于)：

(a)就温度而言，精氨酸水解酶的发酵及诱导温度保持在25-37℃，具体地，转化pET28a-argZ质粒和pET28a-argZN质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在16 ℃-28℃通过IPTG诱导表达目的蛋白，而精氨酸水解酶的反应温度控制在25-37 ℃；

(b)就诱导期的pH值而言，诱导期pH控制在7-8，具体地，诱导期的pH 维持在大肠杆菌适宜的pH值一般为7.5；

(c)就诱导期IPTG浓度而言，常规诱导浓度都可用于本发明，通常IPTG 浓度控制在0.2-0.5mM；

(f)就诱导时间而言，诱导时间根据诱导温度确定：在16度诱导的条件下为6-20h，较佳地，10-15h(如12个小时)；在28度诱导的条件下为1-8h，较佳地，2-6(如4个小时)。

本发明的目的蛋白精氨酸水解酶存在大肠杆菌细胞胞内，通过离心机收集宿主细胞，然后通过高压、机器力、酶解细胞被或其他细胞破碎方法破碎宿主细胞，释放重组蛋白，优选的是高压法。宿主细胞裂解液可通过絮凝、盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析、超滤等纯化，也可直接进行层析纯化。

层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析等技术。常用的层析方法包括：

1.阴离子交换层析：

阴离子交换层析介质包括(但不限于)：Q-Sepharose、DEAE-Sepharose。如果发酵样品的盐浓度较高，影响与离子交换介质的结合，则在进行离子交换层析前需降低盐浓度。样品可以用稀释、超滤、透析、凝胶过滤层析等手段进行平衡缓冲液的更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似，然后上样，进行盐浓度或pH的梯度洗脱。

2.疏水层析：

疏水层析介质包括(但不限于)：Phenyl-Sepharose、Butyl-Sepharose、 Octyle-Sepharose。样品通过添加NaCl、(NH₄)₂SO₄等方式提高盐浓度，然后上样，通过降低盐浓度方法洗脱。通过疏水层析除去疏水性有较大差异的杂蛋白。

3.凝胶过滤层析

疏水层析介质包括(但不限于)：Sephacryl、Superdex、Sephadex类。通过凝胶过滤层析更换缓冲体系，或进一步精纯。

4.亲和层析

亲和层析介质包括(但不限于)：HiTrap^TM Heparin HP Columns和镍柱亲和层析。

5.膜过滤

超滤介质包括：有机膜如聚砜膜、无机膜如陶瓷膜、金属膜类。通过膜过滤可以达到纯化和浓缩的目的。

在本发明中，最优使用pET表达系统，最优的纯化方式为镍柱亲和层析。

生产L-鸟氨酸的方法

本发明提供一种高效、底物选择性的生产L-鸟氨酸的方法。本发明利用来源于蓝细菌集胞藻属(Synechocystis sp.)的精氨酸水解酶ArgZ或其截短蛋白ArgZN，本发明的精氨酸水解酶没有氨基转移酶活性，可特异性的将精氨酸水解为鸟氨酸，而不生成其他氨基酸(比如，甘氨酸、赖氨酸)，并且本发明的精氨酸水解酶不产生尿素，利用本发明的精氨酸水解酶制备获得的鸟氨酸的副产物是氨和二氧化碳，它们可以很容易的从反应体系中分离，方便鸟氨酸的分离纯化。

在一优选实施方式中，生产L-鸟氨酸的方法包括步骤：

(i)在反应体系中，以L-精氨酸为底物，在精氨酸水解酶的催化下，进行反应式I所示的催化反应，从而形成L-鸟氨酸；

L-arginine+2H₂O＝L-ornithine+2NH₃+CO₂

反应式I

其中，所述的精氨酸水解酶来源于蓝细菌集胞藻属(Synechocystis sp.)。

在另一优选的实施方式中，所述生产L-鸟氨酸的方法包括：

i)采用生产条件培养本发明的L-鸟氨酸的生产菌株，从而得到L-鸟氨酸；

ii)任选地，从i)的培养体系中分离获得L-鸟氨酸。

L-鸟氨酸的生产菌株

本发明人还提供了表达本发明的精氨酸水解酶的工程菌株，所述工程菌株(或其表达的本发明精氨酸水解酶、或其固定化酶)能够将精氨酸高效、特异性的转化为L-鸟氨酸，其转化率≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥98％，又更佳地≥99％，最佳地100％，鸟氨酸和氨的化学计量比e为0.1-10:0.2-20，较佳地，0.5-8：0.5-15，更佳地，0.8-5：1-10，更佳地，0.9-3:1-3，更佳地，1:2。

在另一优选例中，所述生产菌株是细菌。优选地，所述生产菌株是大肠杆菌。更优选地，所述生产菌株是E.coli BL21(DE3)。

精氨酸水解酶的用途

本发明人意外地发现本发明的精氨酸水解酶可用于制备一制剂，所述制剂用于催化以下催化反应：

L-arginine+2H₂O＝L-ornithine+2NH₃+CO₂

反应式I

制备酶制剂组合物

本发明还提供了一种酶制剂组合物，该酶制剂组合物中包含本发明的精氨酸水解酶。

本发明的酶制剂组合物还可以包含但并不限于：水、缓冲液、甘油、乙醇、及其组合。

本发明的主要优点包括：

(i)本发明首次发现一种精氨酸水解酶，可特异性的将精氨酸转化L-鸟氨酸，不产生尿素，副产物为氨和二氧化碳，可以很容易的从反应体系中分离，方便鸟氨酸的分离纯化。

(ii)本发明的精氨酸水解酶可高效的将精氨酸转化为L-鸟氨酸，并且转化率可高达≥95％(如100％)，所述鸟氨酸和氨的化学计量比e为0.1-10:0.2-20，较佳地， 0.5-8：0.5-15，更佳地，0.8-5：1-10，更佳地，0.9-3:1-3，更佳地，1:2。

(iii)本发明的精氨酸水解酶可在工程化的大肠杆菌中大量表达，降低成本。

(iv)本发明的方法转化率高、成本低、收率高、生产周期短、工艺简单、易于放大、适合进行大生产。

(v)本发明的精氨酸水解酶argZ在制备鸟氨酸的实践中有很大的应用价值。

(vi)本发明首次发现，只有269或283个氨基酸的ArgZN，具有更强的单位质量的ArgZN催化能力。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

通用方法

集胞藻PCC6803突变株的通用构建方法

1.确定集胞藻6803基因组上待敲除片段sll1336及其上下游1kbp基因序列 Up\Dn。将上游片段Up、抗性基因盒子、下游片段Dn通过酶切位点 PstI\SacII依次连入pBluescript II KS(+)质粒中，得到质粒 pKS-sll1336(kana)。

2.取OD为0.6-1.0的PCC6803细胞，3000rpm离心8min，浓缩至OD大约为2.0。

3.取100ul浓缩细胞至新离心管中，加入100ng的pKS-sll1336(kana)质粒。

4.30摄氏度暗培养过夜。

5.将混合液涂布在表面含有卡那霉素抗性的平板上，30摄氏度3000勒克斯光照培养，一周左右有单克隆出现。

6.将单克隆划线，在卡那霉素抗性的平板上传代3次，挑克隆接种至BG11 液体培养基，取菌液PCR验证。即得集胞藻6803中sll1336的敲除株。

实施例

在本发明试验中获得了集胞藻6803中sll1336的敲除株，通过喂养野生型和敲除株[C13,N15]标记的精氨酸发现sll1336编码了一个分解精氨酸的蛋白。并意外发现该蛋白的N端存在一个氨基转移酶活性的结构域(图1)。

a)以Synechocystis sp.PCC 6803基因组DNA作为模板，使用

正向引物sll1336-BamHI-F： gtggacagcaaatgggtcgcGGATCCatggctgacgatattcgc(SEQ ID NO.:6)

反向引物sll1336-HindIII-R： ggtgctcgagtgcggccgcAAGCTTttaaagtgtttccgccaagc(SEQ ID NO.:7)

PCR得到argZ(sll1336)基因705个氨基酸的碱基序列，将该PCR片段连接到pET28a质粒载体中，使用该质粒pET28a-argZ表达N端组氨酸标签的 sll1336蛋白，记为ArgZ。使用正向引物pET28a_sll1336N_F gcgcggcagccatatgatggctgacgatattc(SEQ ID NO.:8)和反向引物pET28a_sll1336N269_R gctcgaattcggatccTTAtacccgcagggtta(SEQ ID NO.:9)PCR得到argZ(sll1336)N端269个氨基酸的碱基序列，同样的连入pET28a质粒载体中，使用该质粒pET28a-argZN表达N端组氨酸标签的蛋白记为ArgZN。 (图2a)

b)转化pET28a-argZ质粒和pET28a-argZN质粒的BL21(DE3)细胞分别在LB 培养基中37度培养，待细胞OD600约为0.8时添加IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)使其终浓度为0.2mM，16度条件下培养12个小时。

c)收集并破碎细胞，通过镍柱层析的方法纯化含有组氨酸标签的蛋白。纯化的蛋白通过10％的SDS聚丙烯酰胺凝胶检测蛋白的大小和纯度(图2b)，结果显示， ArgZ和ArgZN都能够在PET系统中表达，通过镍柱亲和层析的方法可以纯化得到纯度大于90％的蛋白。

d)检测反应的产物将纯化的ArgZ蛋白与5mM精氨酸混合，反应得到产物。①检测鸟氨酸和氨反应产物用异硫氰酸苯酯(PITC)衍生后，通过高效液相色谱检测，检测条件为：使用月旭公司Ultimate系列的氨基酸色谱柱(25cm length,4.6 mm diameter；Welch)，柱温40度，流动相93％H₂O+7％ACN(100mM NaAc,pH＝6.5)以 1.0ml min-1的流速进行等度洗脱，并使用紫外检测器检测254nm波长处的吸收峰(图3a，生成的鸟氨酸进一步通过LC-MS验证)。其中(图3b)是标准品。③检测二氧化碳反应产物加入6M的盐酸将溶液中的碳酸氢根转化为二氧化碳，通过气相色谱检测。

e)argZ不生成尿素，没有脒基转移酶活性①在反应体系里添加Urease发现并没有增加氨的生成，结果显示没有尿素生成(图5)。②在反应体系里添加5mM的甘氨酸或赖氨酸，反应甘氨酸或者精氨酸并没有减少，显示ArgZ不是脒基转移酶 (图4)。

f)ArgZ底物消耗和产物生成的定量将反应15分钟和60分钟的样品衍生后通过HPLC定量，有精氨酸的消耗：鸟氨酸的生成：氨的生成的物质的量比值为 1:1:2.(图6)。推测ArgZ催化的反应如图7所示。

g)argZ酶动力学参数的测定反应在50mM三乙醇胺(pH 8.0)的体系中进行：含有5mM L-精氨酸、5mM 2-酮戊二酸、0.2mM NADH、5U谷氨酸脱氢酶。反应以添加1.0ug的argZ启动，通过分光光度计检测340nm处吸收峰的减少。为了测定 argZ蛋白的kcat和Km值，使反应体系中精氨酸的底物浓度在0.1mM到15mM的范围内变化。所得的动力学数据用GraphpadPrism 5.0软件分析即可得到kcat和 Km值(图10)，结果显示ArgZ蛋白的Km值为0.51mM，以鸟氨酸的生成速率表示 ArgZ的反应速率Kcat＝6.4/s。

h)argZ酶反应条件及底物特异性在反应体系中加入1.0mM MnCl₂、CoCl₂、 MgCl₂、NaCl、CaCl₂、FeCl₃、FeSO₄、ZnSO₄或者CuSO₄检测金属离子对酶活性的影响(图8)。将反应体系中的精氨酸替换成瓜氨酸或者其它19种合成蛋白的氨基酸之一，检测酶对底物的特异性(图9)，结果显示，ArgZ不需要金属离子如镁离子、锰离子来维持酶本身的最大活性。ArgZ只以精氨酸为底物，不以瓜氨酸、双甲基精氨酸等为底物。

i)ArgZ蛋白N端269个氨基酸负责催化精氨酸反应的活性。ArgZN和ArgZ 在等物质的量的条件下，具有相同的活性图11a，ArgZN可以精氨酸为底物生成鸟氨酸和氨(图11b)。

用上述方法获得并检测ArgZ蛋白N端283个氨基酸的催化活性，结果表明， ArgZ蛋白N端283氨基酸的活性与ArgZ蛋白N端269个氨基酸的活性相当。

讨论

本发明在蓝细菌集胞藻6803中鉴定出一个以精氨酸为底物的蛋白，通过分析我们鉴定出了一个全新的反应：L-arginine+2H₂O＝L-ornithine+2NH₃+CO₂(图 7)，通过进一步的实验发现N端269或283个氨基酸ArgZN负责了精氨酸水解酶的活性。使用argZ或ArgZN通过酶法制备鸟氨酸的副产物是氨和二氧化碳，它们可以很容易的从反应体系中分离方便鸟氨酸的分离纯化。精氨酸水解酶argZ或其截短蛋白ArgZN在制备鸟氨酸的实践中有很大的应用价值。

参考文献

1.Sugino,T.,Shirai,T.,Kajimoto,Y.&Kajimoto,O.L-ornithinesupplementation attenuates physical fatigue in healthy volunteers bymodulating lipid and amino acid metabolism.Nutr Res 28,738-743,(2008).

2.Zajac,A.,Poprzecki,S.,Zebrowska,A.,Chalimoniuk,M.&Langfort,J.Arginine and ornithine supplementation increases growth hormone andinsulin-like growth factor-1serum levels after heavy-resistance exercise instrength-trained athletes.J Strength Cond Res 24,1082-1090,(2010).

3.Omori,K.et al.Promotion of non–rapid eye movement sleep in miceafter oral administration of ornithine.Sleep and Biological Rhythms 10, 38-45,(2012).

4.Miyake,M.et al.Randomised controlled trial of the effects of L-ornithine on stress markers and sleep quality in healthy workers. Nutritionjournal 13,53,(2014).

5.Dakshayani,K.B.,Velvizhi,S.&Subramanian,P.Effects of ornithinealpha-ketoglutarate on circulatory antioxidants and lipid peroxidationproducts in ammonium acetate treated rats.Ann Nutr Metab 46, 93-96,(2002).

6.Shi,H.P.et al.Effect of supplemental ornithine on wound healing. JSurg Res 106,299-302,(2002).

7.Tokuyama,E.et al.Bitterness suppression of BCAA solutions by L-ornithine.Chem Pharm Bull(Tokyo)54,1288-1292,(2006).

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 一种新的精氨酸水解酶及其编码基因和应用

<130> P2017-2075

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 705

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Met Ala Asp Asp Ile Arg Ile Leu Met Cys Pro Pro Asp His Tyr Asp

1 5 10 15

Val Asp Tyr Val Ile Asn Pro Trp Met Glu Gly Asn Ile His Lys Ser

20 25 30

Ser Gln Glu Arg Ala Val Glu Gln Trp Lys Lys Leu His Gln Thr Ile

35 40 45

Lys Glu Cys Ala Ile Val Asp Leu Val Lys Pro Ala Lys Gly Trp Pro

50 55 60

Asp Met Val Phe Thr Ala Asn Ala Gly Leu Val Leu Gly Glu Asn Val

65 70 75 80

Val Leu Ser Arg Phe Tyr His Lys Glu Arg Gln Gly Glu Glu Pro Tyr

85 90 95

Phe Lys Ala Trp Phe Glu Glu Asn Gly Phe Thr Val Tyr Glu Leu Pro

100 105 110

Gln Asp Leu Pro Phe Glu Gly Ala Gly Asp Ala Leu Phe Asp Arg Glu

115 120 125

Gly Arg Trp Leu Trp Ala Gly Tyr Gly Phe Arg Ser Glu Leu Asp Ser

130 135 140

His Pro Tyr Ile Ala Lys Trp Leu Asp Thr Glu Val Val Ser Leu Arg

145 150 155 160

Leu Ile Asp Glu Arg Phe Tyr His Leu Asp Thr Cys Phe Cys Pro Leu

165 170 175

Ser Gly Gly Tyr Leu Leu Tyr Tyr Pro Pro Ala Phe Asp Ala Tyr Ser

180 185 190

Asn Arg Val Ile Glu Met Arg Ile Pro Pro Glu Lys Arg Ile Ile Val

195 200 205

Glu Glu Leu Asp Ala Val Asn Phe Ala Cys Asn Ala Val Asn Val Asn

210 215 220

Asp Ile Ile Ile Met Asn Leu Val Ser Arg Thr Leu Lys Glu Lys Leu

225 230 235 240

Ala Glu Ala Gly Phe Lys Val Arg Glu Thr Pro Leu Thr Glu Phe Leu

245 250 255

Lys Ala Gly Gly Ala Ala Lys Cys Leu Thr Leu Arg Val Thr Glu Pro

260 265 270

Ile Leu Pro Asp Val His Ala Thr Val Ser Ile Glu Ser Arg Val Ile

275 280 285

Arg Met Glu Gly His Leu Leu Asp Ala Gly Ile Leu Asn Gln Ala Leu

290 295 300

Asp Leu Val Val Glu Asn Ser Gly Ser Phe Arg Val Leu Asn Phe Asn

305 310 315 320

Leu Gly Val Glu Arg Asn Ser Thr Ser Ser Ala Glu Val Arg Val Ser

325 330 335

Ala Pro Ser His Gln Ile Met Glu Glu Ile Met Thr Glu Leu Ile Asp

340 345 350

Leu Gly Ala Val Pro Pro Pro Gln Glu Leu Cys Asp Ile Asn Thr Glu

355 360 365

Thr Val Thr Gln Gly Gly Val Ala Pro Asp Asp Phe Tyr Val Ser Thr

370 375 380

Ile Tyr Pro Thr Glu Val Arg Val Asn Cys Glu Trp Val Gln Val Thr

385 390 395 400

Gly Gln Arg Met Asp Ala Ala Ile Val Val Thr Ser Asn Pro Pro Ser

405 410 415

Ala Arg Cys Val Leu Leu Arg Asp Leu Gln Val Gly Asp Arg Val Met

420 425 430

Val Gly Val Glu Gly Ile Arg Thr Ile Lys Lys Val Glu Ser His Glu

435 440 445

Gly Gly Thr Arg Lys Glu Asn Lys Glu Phe Ala Phe Met Ala Ala Gly

450 455 460

Val Ser Ser Glu Arg Arg Val Glu Leu Leu Val Glu Gln Ile Ala Trp

465 470 475 480

Glu Met Arg Gln Ile Arg Asp Gln Gly Gly Lys Ile Val Val Thr Ala

485 490 495

Gly Pro Val Val Ile His Thr Gly Gly Ala Gln His Leu Ser His Leu

500 505 510

Val Arg Glu Gly Tyr Val His Ala Leu Leu Gly Gly Asn Ala Ile Ala

515 520 525

Val His Asp Ile Glu Gln Ala Thr Met Gly Thr Ser Leu Gly Val Asp

530 535 540

Met Gln Arg Gly Ile Pro Val Arg Gly Gly His Arg His His Leu Lys

545 550 555 560

Ile Ile Asn Ser Val Arg Arg Tyr Gly Gly Ile Arg Gln Ala Val Glu

565 570 575

Ala Gly Phe Ile Ser Lys Gly Val Met Tyr Glu Cys Val Lys Asn Asn

580 585 590

Ile Pro Tyr Cys Leu Ala Gly Ser Ile Arg Asp Asp Gly Pro Leu Pro

595 600 605

Asp Thr Glu Met Asn Leu Val Arg Ala Gln Ser Arg Tyr Ser Glu Leu

610 615 620

Ile Gln Gly Ala Asp Met Ile Leu Met Leu Ser Ser Met Leu His Ser

625 630 635 640

Ile Gly Val Gly Asn Met Thr Pro Ser Gly Val Lys Met Val Cys Val

645 650 655

Asp Ile Asn Pro Ala Val Val Thr Lys Leu Ser Asp Arg Gly Ser Val

660 665 670

Glu Ser Val Gly Val Val Thr Asp Val Gly Leu Phe Leu Ser Leu Leu

675 680 685

Val Arg Gln Leu Gln Gln Leu Thr Arg Pro Tyr Ser Leu Ala Glu Thr

690 695 700

Leu

705

<210> 2

<211> 2118

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

atggctgacg atattcgcat tttgatgtgc ccccccgacc actacgacgt ggactatgta 60

attaatcctt ggatggaggg caatatccac aaatcctccc aggagcgggc cgtagagcaa 120

tggaaaaaac tacaccagac catcaaagaa tgcgccatcg tggacttggt gaagccggca 180

aagggttggc ctgatatggt ctttaccgcc aatgcggggc tggtgctagg ggaaaatgtc 240

gtactgagtc gcttctacca caaagaacgc cagggggaag aaccctattt caaagcttgg 300

tttgaggaaa atggtttcac cgtttacgaa ctgccccagg atttaccctt tgaaggggcc 360

ggggatgccc tgtttgaccg ggaaggccgt tggttgtggg ccggctatgg tttccgttcc 420

gaactagatt cccatcccta cattgccaaa tggctagata cagaagtagt ctccctgcgg 480

ttaattgatg agcgcttcta tcacctcgat acctgttttt gccccctgag tggtggctat 540

ttactctact atccccctgc gtttgacgcc tattccaacc gggtaattga aatgcggatt 600

ccgccggaaa aaaggattat tgtcgaggaa ctggatgcgg ttaattttgc ctgcaatgcg 660

gtcaatgtta acgacatcat cattatgaat ttggtgagtc gaaccctgaa ggaaaaatta 720

gctgaggcgg gctttaaggt gcgggaaact cccctgacgg aatttttgaa agcgggggga 780

gcggccaaat gtctaaccct gcgggtaacg gagcccattt tgccagatgt ccatgccacc 840

gtttccattg aaagtcgggt gattcgcatg gagggtcatc tactcgatgc cggtattctg 900

aaccaagccc tggatttggt ggtggaaaac agcggtagtt tccgggtgct gaacttcaat 960

ttaggggtgg agcgcaacag tacttccagc gcagaggtaa gggtttcggc cccctcccac 1020

caaattatgg aagagatcat gaccgagctg attgatctcg gcgcagtgcc ccctccccag 1080

gaactctgtg atatcaacac cgaaacggtg acccaagggg gggtagctcc cgatgatttc 1140

tatgtcagca ccatttaccc cacagaggtg cgggttaatt gcgaatgggt ccaggtgaca 1200

ggacaacgga tggatgcggc cattgtggtc accagcaatc ccccttcggc ccgctgtgtg 1260

ctcctccggg atctccaggt cggcgatcga gtcatggtgg gagtcgaagg tattcgtacc 1320

atcaaaaaag tggaatccca tgaaggcgga acccgcaaag aaaataagga atttgccttc 1380

atggcagcgg gggtttccag cgagcgtcgg gtagaacttt tggtggaaca aattgcctgg 1440

gaaatgcgac aaatccggga ccagggaggc aaaattgttg ttaccgcagg acctgtggtg 1500

atccatactg gaggagccca acacctttcc catctggtgc gggagggcta tgtccatgcc 1560

ctactggggg gcaatgcgat cgccgtccat gacattgaac aggccaccat gggtacttcc 1620

ctgggggtag atatgcaacg gggcatccca gtgcgggggg ggcaccgtca ccatctgaaa 1680

attattaaca gtgtgcggcg ctacggtggg atccgccagg cggtggaagc tggatttatc 1740

agcaaagggg ttatgtacga atgcgtaaaa aataacatcc cctattgcct agctggttcc 1800

atccgggatg acggccccct gcccgacacg gaaatgaacc tagttcgggc tcagagccgt 1860

tacagtgagt taattcaggg agcagatatg attctgatgc tgtccagcat gttgcactcc 1920

attggcgtcg gcaatatgac tccttccggc gtaaaaatgg tctgtgtgga cattaacccc 1980

gctgtggtta ccaaactgag cgatcgtggt tcagtggaat ccgtgggggt ggtcaccgat 2040

gtggggttat tcctcagtct tctggtacga caactgcaac aactcaccag accctatagc 2100

ttggcggaaa cactttaa 2118

<210> 3

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

Met Ala Asp Asp Ile Arg Ile Leu Met Cys Pro Pro Asp His Tyr Asp

1 5 10 15

Val Asp Tyr Val Ile Asn Pro Trp Met Glu Gly Asn Ile His Lys Ser

20 25 30

Ser Gln Glu Arg Ala Val Glu Gln Trp Lys Lys Leu His Gln Thr Ile

35 40 45

Lys Glu Cys Ala Ile Val Asp Leu Val Lys Pro Ala Lys Gly Trp Pro

50 55 60

Asp Met Val Phe Thr Ala Asn Ala Gly Leu Val Leu Gly Glu Asn Val

65 70 75 80

Val Leu Ser Arg Phe Tyr His Lys Glu Arg Gln Gly Glu Glu Pro Tyr

85 90 95

Phe Lys Ala Trp Phe Glu Glu Asn Gly Phe Thr Val Tyr Glu Leu Pro

100 105 110

Gln Asp Leu Pro Phe Glu Gly Ala Gly Asp Ala Leu Phe Asp Arg Glu

115 120 125

Gly Arg Trp Leu Trp Ala Gly Tyr Gly Phe Arg Ser Glu Leu Asp Ser

130 135 140

His Pro Tyr Ile Ala Lys Trp Leu Asp Thr Glu Val Val Ser Leu Arg

145 150 155 160

Leu Ile Asp Glu Arg Phe Tyr His Leu Asp Thr Cys Phe Cys Pro Leu

165 170 175

Ser Gly Gly Tyr Leu Leu Tyr Tyr Pro Pro Ala Phe Asp Ala Tyr Ser

180 185 190

Asn Arg Val Ile Glu Met Arg Ile Pro Pro Glu Lys Arg Ile Ile Val

195 200 205

Glu Glu Leu Asp Ala Val Asn Phe Ala Cys Asn Ala Val Asn Val Asn

210 215 220

Asp Ile Ile Ile Met Asn Leu Val Ser Arg Thr Leu Lys Glu Lys Leu

225 230 235 240

Ala Glu Ala Gly Phe Lys Val Arg Glu Thr Pro Leu Thr Glu Phe Leu

245 250 255

Lys Ala Gly Gly Ala Ala Lys Cys Leu Thr Leu Arg Val

260 265

<210> 4

<211> 810

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

atggctgacg atattcgcat tttgatgtgc ccccccgacc actacgacgt ggactatgta 60

attaatcctt ggatggaggg caatatccac aaatcctccc aggagcgggc cgtagagcaa 120

tggaaaaaac tacaccagac catcaaagaa tgcgccatcg tggacttggt gaagccggca 180

aagggttggc ctgatatggt ctttaccgcc aatgcggggc tggtgctagg ggaaaatgtc 240

gtactgagtc gcttctacca caaagaacgc cagggggaag aaccctattt caaagcttgg 300

tttgaggaaa atggtttcac cgtttacgaa ctgccccagg atttaccctt tgaaggggcc 360

ggggatgccc tgtttgaccg ggaaggccgt tggttgtggg ccggctatgg tttccgttcc 420

gaactagatt cccatcccta cattgccaaa tggctagata cagaagtagt ctccctgcgg 480

ttaattgatg agcgcttcta tcacctcgat acctgttttt gccccctgag tggtggctat 540

ttactctact atccccctgc gtttgacgcc tattccaacc gggtaattga aatgcggatt 600

ccgccggaaa aaaggattat tgtcgaggaa ctggatgcgg ttaattttgc ctgcaatgcg 660

gtcaatgtta acgacatcat cattatgaat ttggtgagtc gaaccctgaa ggaaaaatta 720

gctgaggcgg gctttaaggt gcgggaaact cccctgacgg aatttttgaa agcgggggga 780

gcggccaaat gtctaaccct gcgggtataa 810

<210> 5

<211> 283

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

Met Ala Asp Asp Ile Arg Ile Leu Met Cys Pro Pro Asp His Tyr Asp

1 5 10 15

Val Asp Tyr Val Ile Asn Pro Trp Met Glu Gly Asn Ile His Lys Ser

20 25 30

Ser Gln Glu Arg Ala Val Glu Gln Trp Lys Lys Leu His Gln Thr Ile

35 40 45

Lys Glu Cys Ala Ile Val Asp Leu Val Lys Pro Ala Lys Gly Trp Pro

50 55 60

Asp Met Val Phe Thr Ala Asn Ala Gly Leu Val Leu Gly Glu Asn Val

65 70 75 80

Val Leu Ser Arg Phe Tyr His Lys Glu Arg Gln Gly Glu Glu Pro Tyr

85 90 95

Phe Lys Ala Trp Phe Glu Glu Asn Gly Phe Thr Val Tyr Glu Leu Pro

100 105 110

Gln Asp Leu Pro Phe Glu Gly Ala Gly Asp Ala Leu Phe Asp Arg Glu

115 120 125

Gly Arg Trp Leu Trp Ala Gly Tyr Gly Phe Arg Ser Glu Leu Asp Ser

130 135 140

His Pro Tyr Ile Ala Lys Trp Leu Asp Thr Glu Val Val Ser Leu Arg

145 150 155 160

Leu Ile Asp Glu Arg Phe Tyr His Leu Asp Thr Cys Phe Cys Pro Leu

165 170 175

Ser Gly Gly Tyr Leu Leu Tyr Tyr Pro Pro Ala Phe Asp Ala Tyr Ser

180 185 190

Asn Arg Val Ile Glu Met Arg Ile Pro Pro Glu Lys Arg Ile Ile Val

195 200 205

Glu Glu Leu Asp Ala Val Asn Phe Ala Cys Asn Ala Val Asn Val Asn

210 215 220

Asp Ile Ile Ile Met Asn Leu Val Ser Arg Thr Leu Lys Glu Lys Leu

225 230 235 240

Ala Glu Ala Gly Phe Lys Val Arg Glu Thr Pro Leu Thr Glu Phe Leu

245 250 255

Lys Ala Gly Gly Ala Ala Lys Cys Leu Thr Leu Arg Val Thr Glu Pro

260 265 270

Ile Leu Pro Asp Val His Ala Thr Val Ser Ile

275 280

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

gtggacagca aatgggtcgc ggatccatgg ctgacgatat tcgc 44

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

ggtgctcgag tgcggccgca agcttttaaa gtgtttccgc caagc 45

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

gcgcggcagc catatgatgg ctgacgatat tc 32

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

gctcgaattc ggatccttat acccgcaggg tta 33

Claims

1.一种生产鸟氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(i)在反应体系中，以L-精氨酸为底物，在精氨酸水解酶的催化下，进行反应式I所示的催化反应，从而形成L-鸟氨酸；和

L-arginine +2H₂O = L-ornithine + 2NH₃+CO₂

反应式I

(ii)从所述步骤(i)的反应后的反应体系中分离出L-鸟氨酸；

其中，所述的精氨酸水解酶来源于蓝细菌集胞藻(Synechocystis sp.)，所述精氨酸水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、3或5所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述精氨酸水解酶来源于蓝细菌集胞藻属6803(Synechocystis sp. PCC 6803)。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，所述精氨酸水解酶的浓度为0.005-0.2U/ml。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，所述精氨酸水解酶的浓度为0.5-50ug/ml。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，所述L-精氨酸的浓度为0.01mM-100mM。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中还包括：三乙醇胺、2-酮戊二酸、NADH、和/或谷氨酸脱氢酶。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中还包括金属盐。

8.一种精氨酸水解酶的用途，其特征在于，用于制备一制剂，所述制剂用于催化以下催化反应：

L-arginine +2H₂O = L-ornithine + 2NH₃+CO₂

反应式I

9.一种L-鸟氨酸生产菌株，其特征在于，所述菌株表达多肽，所述多肽为外源的蓝细菌集胞藻属(Synechocystis sp.)的精氨酸水解酶，并用于催化以下催化反应：

L-arginine +2H₂O = L-ornithine + 2NH₃+CO₂

反应式I；

所述精氨酸水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、3或5所示。

10.如权利要求9所述的菌株，其特征在于，所述精氨酸水解酶来源于蓝细菌集胞藻属6803(Synechocystis sp. PCC 6803)。

11.一种生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

a) 在合适的培养条件下，培养权利要求9所述的生产菌株，从而得到L-鸟氨酸；

b)从a)的培养体系中分离获得L-鸟氨酸。