KR20220119026A

KR20220119026A - 구아니디노아세트산의 발효 생산 방법

Info

Publication number: KR20220119026A
Application number: KR1020227020423A
Authority: KR
Inventors: 프랑크 슈나이더; 프랑크 얀코비치
Original assignee: 에보닉 오퍼레이션스 게엠베하
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2020-12-14
Publication date: 2022-08-26
Also published as: EP4077695B1; ZA202207792B; MX2022007250A; JP2023507482A; TW202136505A; BR112022010862A2; DK4077695T3; EP3839051A1; EP4077695A1; WO2021122400A1; AR120771A1; IL293952A; CN114867861A; AU2020410242A1

Abstract

본 발명은 구아니디노아세트산 (GAA) 을 생산할 수 있도록 형질전환된 미생물 및 상기 미생물을 이용하는 GAA 의 발효 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 크레아틴의 발효 생산 방법에 관한 것이다.

Description

구아니디노아세트산의 발효 생산 방법

GAA 는 동물 사료 첨가제로서 사용되는 유기 화합물이다 (WO2005120246 A1/ US2011257075 A1). GAA 는 크레아틴의 천연 전구체이다 (예를 들어, Humm et al., Biochem. J. (1997) 322, 771-776). 따라서, GAA 의 보충은 유기체 내의 크레아틴의 최적의 공급을 허용한다.

본 발명은 출발 물질로서 산업용 공급 원료 (예를 들어, 암모니아, 암모늄 염 및 글루코스 또는 당 함유 기질) 를 사용하는 발효 공정에 의해 GAA 를 제조하는 방법에 관한 것이다. 생물학적 시스템에서, GAA 및 오르니틴은 L-아르기닌:글리신-아미디노트랜스퍼라제 (AGAT; EC 2.1.4.1) 의 촉매 작용에 의해 출발 물질로서 아르기닌 및 글리신으로부터 형성되며, 이는 크레아틴 생합성의 제 1 단계이다 (US 20060200870 A1):

L-아르기닌 + 글리신 ^AGAT > L-오르니틴 + GAA

Guthmiller et al. (J Biol Chem. 1994 Jul 1;269(26):17556-60) 은 E. 콜라이 (E. coli) 에서 효소를 클로닝하고 이종적으로 발현시킴으로써 래트 신장 AGAT 를 특징화하였다. Muenchhoff et al. (FEBS Journal 277 (2010) 3844-3860) 은 또한 E. 콜라이에서 효소를 클로닝하고 이종적으로 발현시킴으로써 원핵생물로부터 AGAT 의 제 1 특징화를 보고한다. Sosio et al. (Cell Chemical Biology 25, 540-549, May 17, 2018) 은 스트렙토마이세스 종에서 슈도우리디마이신에 대한 생합성 경로를 설명하였다. 이들은 PumN, L-아르기닌:글리신-아미디노트랜스퍼라제 (AGAT) 에 의해 촉매되는 글리신과 L-아르기닌의 반응에 의한 GAA 및 L-오르니틴의 형성을 중간 반응으로서 기술한다. Humm et al. 은 인간 AGAT 를 인코딩하는 재조합 유전자를 대장균에서 발현시키고, AGAT 의 활성 부위 잔기로서 시스테인-407 을 확인하였다 (Biochem. J. (1997) 322, 771-776).

Mijts et al. (WO 2018079687 A1) 은 미생물 중의 목적 물질, 예를 들어 바닐린 및 바닐산의 생산의 맥락에서 크레아틴이 L-아르기닌 및 글리신으로부터 생산될 수 있음을 개시하고 있다. 저자는 이것이 L-아르기닌 생합성 효소, 글리신 생합성 효소, 및 L-아르기닌 및 글리신의 크레아틴으로의 전환을 촉매하는 효소를 사용함으로써 달성될 수 있음을 추가로 제안한다. L-아르기닌 및 글리신은 AGAT (EC 2.1.4.1) 의 작용에 의해 구아니디노아세테이트 (GAA) 및 오르니틴을 생성하기 위해 조합될 수 있고, GAA 는 메틸 공여체로서 S-아데노실 메티오닌 (SAM) 을 사용하여 구아니디노아세테이트 N-메틸트랜스퍼라제 (GAMT, EC 2.1.1.2) 의 작용에 의해 크레아틴을 생성하기 위해 메틸화될 수 있다. 저자는 L-아르기닌 생합성 효소의 예인 폴리아민의 생산의 맥락에서 또한 공지된 L-오르니틴 생합성 효소뿐만 아니라 소위 L-오르니틴 사이클로부터 잘 공지된 효소, 즉 카르바모일 포스페이트 신타아제 (carAB), 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라제 (argF, argI), 아르기니노숙시네이트 신테타제 (argG), 아르기니노숙시네이트 리아제 (argH) 를 포함할 수 있다 (참조: Marc et al., Eur. J. Biochem. 267, 5217-5226, 200).

그러나, 미생물, 특히 박테리아에서, GAA 합성에서 출발 물질 중 하나, 즉 L-아르기닌의 생산을 증가시키기 위한 몇 가지 더 구체적인 접근법이 또한 문헌으로부터 공지되어 있다. L-아르기닌 생산을 위한 코리네박테리움 글루타미쿰 (C. glutamicum) 의 대사 공학에 대한 개요는 ark et al. (NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/ncomms5618) 에 의해 제공된다. 이들은 이미 L-아르기닌 생산 C. 글루타미쿰 균주의 L-아르기닌 생산자, 예를 들어 ATCC 21831 (Nakayama and Yoshida 1974, US3849250 A) 에 대한 랜덤 돌연변이유발 및 스크리닝을 제안하며, 대사의 시스템-와이드 분석에 기초한 단계적 합리적 대사 공학은 균주 공학 단계 전반에 걸쳐 L-아르기닌 생산의 점진적 증가를 초래한다. Yim et al. (J Ind Microbiol Biotechnol (2011) 38:1911-1920) 은 C. 글루타미쿰에서 염색체 argR 유전자를 파괴함으로써 L-아르기닌 생합성 경로를 제어하는 중심 리프레서 단백질 ArgR 을 코딩하는 유전자인 argR 의 불활성화가 아르기닌-생산 균주를 개선시킨다는 것을 보여줄 수 있었다. Ginesy et al. (Microbial Cell Factories (2015) 14:29) 은 아르기닌 생산 증대를 위한 E. 콜라이의 성공적인 공학을 보고한다. 그 중에서도, 그들은 argR 리프레서 유전자의 결실을 제안하였다.

Kurahashi et al. (EP1057893 A1) 은 재조합 DNA 기술을 이용하여 L-아르기닌 생합성 효소를 증진시킴으로써, 예를 들어 에스케리키아 속에 속하는 미생물로부터 유래된 아세틸오르니틴 데아세틸라제, N-아세틸글루탐산-γ-세미알데히드 데히드로게나제, N-아세틸 글루타모키나제 및 아르기니노숙신아제에 대한 유전자를 함유하는 DNA 단편 및 벡터 DNA 를 포함하는 재조합 DNA 를 갖도록 제조된 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 미생물을 이용함으로써 미생물의 L-아르기닌 생산 능력을 증가시키는 방법에 대한 보고한다. 개선된 L-아르기닌 생산을 위해, 상기 저자는 세포내 글루타메이트 디히드로게나제 (GDH) 의 활성이 향상되고, L-아르기닌 생산 능력이 있는 미생물을 추가로 제안하였다.

아르기닌-생합성 오페론인 argR 의 발현을 저해하는 유전자가 불활성화된 유전자 재조합 균주의 이용 방법이 Suga et al. (US7160705 B2) 에 의해 보고되었다. 특히, 아르기닌 오페론을 조절하는 argR 내 결실은 아르기닌 생산의 중요한 인자로서 여겨져 왔다.

코리네박테리움 미생물에서, 아르기닌 생합성에 관여하는 argCJBDFR 유전자는 오페론 형태로 구성되어 세포내 아르기닌에 의한 피드백 저해를 거침으로써 (Sakanyan et al., Microbiology, 142:9-108, 1996), 이의 높은 L-아르기닌 생산 수율에 대한 제한을 가하였다.

그러나, Bae et al. (EP3153573 A1) 은 C. 글루타미쿰에서 L-아르기닌의 생산 수율을 증가시키려는 시도로, 아르기닌 리프레서 (argR) 에서 어떠한 결실도 없이, 아르기닌 오페론 및 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 (ArgF, ArgF2) 의 활성을 향상시킴으로써, 모체 L-아르기닌-생산 균주에 비해 L-아르기닌을 더 높은 수율로 생산할 수 있음을 발견하였다.

아르기닌 오페론은 L-아르기닌 생합성 기전에 관여하는 효소를 인코딩하는 유전자로 구성된 오페론으로, 특히 아르기닌 오페론은 L-아르기닌 생합성의 순환형 단계를 구성하는 효소를 인코딩하는 유전자로 구성된다. 구체적으로, 아르기닌 오페론은 N-아세틸글루타밀 포스페이트 리덕타제 (ArgC), 글루타메이트 N-아세틸트랜스퍼라제 (ArgJ), N-아세틸글루타메이트 키나제 (ArgB), 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제 (ArgD), 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 (ArgF) 및 아르기닌 리프레서 (ArgR) 로 구성된다. 이들 효소는 L-아르기닌 생합성의 연속 효소 반응에 관여하며, argR 에 의해 인코딩된 아르기닌 리프레서에 의해 조절된다 (WO 2006/057450 A1).

Fan Wenchao 은 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 비병원성 미생물의 발효에 의한 크레아틴의 생산 방법을 개시한다 (CN106065411 A). 미생물은 다음의 바이오전환 기능을 갖는다: 글루코스의 L-글루탐산으로의 전환; L-글루탐산의 N-아세틸-L-글루탐산으로의 전환; N-아세틸-L-글루탐산의 N-아세틸-L-글루탐산 세미알데히드로의 전환; N-아세틸-L-글루탐산 세미알데히드의 N-아세틸-L-오르니틴으로의 전환; N-아세틸-L-오르니틴의 L-오르니틴으로의 전환; L-오르니틴의 L-시트룰린으로의 전환; L-시트룰린의 아르기니노-숙신산으로의 전환; 아르기니노-숙신산의 L-아르기닌으로의 전환; L-아르기닌의 구아니디노아세트산으로의 전환; 및 마지막으로 구아니디노아세트산의 크레아틴으로의 전환. Fan Wenchao 는 미생물이 N-아세틸글루타메이트-신타아제, N-아세틸오르니틴-δ-아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 오르니틴-카르바모일 트랜스퍼라제, 아르기니노숙시네이트 신테타제, 글리신 아미디노-트랜스퍼라제 (EC: 2.1. 4.1), 및 구아니디노아세테이트 N-메틸트랜스퍼라제 (EC: 2.1.1.2) 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 과발현한다고 제안한다. 미생물은 바람직하게는 글리신 아미노트랜스퍼라제 (L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제) 및 구아니디노아세테이트 N-메틸트랜스퍼라제를 과발현한다.

지금까지, 야생형 형태에 비해 증가된 GAA 생산에 적합한 미생물 및 이러한 미생물을 이용한 GAA 생산에 대한 각각의 방법은 보고되지 않았다.

따라서, 본 발명의 근본적인 과제는 구아니디노아세트산 (GAA) 을 생산할 수 있도록 형질전환된 미생물 및 상기 미생물을 이용하는 GAA 의 발효 생산 방법을 제공하는 것이다.

이 과제는 야생형 미생물에서 각각의 효소 활성에 비해 카르바모일포스페이트 신타아제 (EC 6.3.4.16) 의 기능을 갖는 효소의 증가된 활성을 포함하고, L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제 (AGAT) 의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 이종 유전자를 포함하는 미생물에 의해 해결된다.

이종 유전자는 유전자가 자연적으로 이 유전자를 갖지 않는 숙주 유기체 내에 삽입되었음을 의미한다. 숙주 내 이종 유전자의 삽입은 재조합 DNA 기술에 의해 수행된다. 재조합 DNA 기술을 거친 미생물은 형질전환, 유전자 변형 또는 재조합체로 불린다. 따라서, 본 발명에 따른 미생물은 재조합체이다.

카르바모일포스페이트 신타아제의 기능을 갖는 효소의 증가된 활성은 카르바모일포스페이트 신타아제의 기능을 갖는 효소를 코딩하는 유전자의 돌연변이 및/또는 과발현에 의해 달성될 수 있다.

L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제의 활성은 또한 L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자의 돌연변이 및/또는 과발현에 의해 증가될 수 있다.

L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제 (AGAT) 의 기능을 갖는 단백질은 아미디노트랜스퍼라제 패밀리에 속한다. 아미디노트랜스퍼라제 패밀리는 각각 크레아틴 및 스트렙토마이신 생합성에 관여하는 효소인 글리신 (EC:2.1.4.1) 및 이노사민 (EC:2.1.4.2) 을 포함한다. 이 패밀리는 또한 아르기닌 데이미나제, EC:3.5.3.6 을 포함한다. 이들 효소는 반응을 촉매한다: 아르기닌 + H₂O <=> 시트룰린 + NH₃. 또한 이 패밀리에서 발견되는 것은 스트렙토코쿠스 항종양 당단백질이다. L-아르기닌:글리신-아미디노트랜스퍼라제 (AGAT) 활성을 갖는 효소 또는 단백질은 또한, 하기 간행물: Pissowotzki K et al., Mol Gen Genet 1991;231:113-123 (PUBMED:1661369 EPMC:1661369); D'Hooghe I et al., J Bacteriol 1997;179:7403-7409 (PUBMED:9393705 EPMC:9393705); Kanaoka M et al., Jpn J Cancer Res 1987;78:1409-1414 (PUBMED:3123442 EPMC:3123442) 에서 설명되는 바와 같은, PFAM 패밀리: Amidinotransf (PF02274) (: Marchler-Bauer A et al. (2017), "CDD/SPARCLE: functional classification of proteins via subfamily domain architectures.", Nucleic Acids Res. 45(D1):D200-D203.) 에 속하는 보존된 도메인을 갖는 것으로 기술된다. AGAT 의 특정 예는 무레아 프로듀센스 (Moorea producens), 호모 사피엔스 (Homo sapiens), 라투스 노르베지쿠스 (Rattus norvegicus), 갈레옵테루스 바리에가투스 (Galeopterus variegatus), 및 실린드로스페르모프시스 라시보르스키 (Cylindrospermopsis raciborskii) 의 것이다.

본 발명에 따른 미생물은 야생형 미생물의 능력에 비해 L-아르기닌 생산 능력이 이상적으로 개선된다. 이러한 특성은 천연 L-아르기닌 생산자인 미생물의 선별에 의해 달성될 수 있거나 돌연변이에 의해 L-아르기닌을 생산하는 능력을 취득할 수 있다.

본 발명에 따르고 야생형 미생물의 능력에 비해 L-아르기닌 생산 능력이 향상된 미생물은 야생형 미생물에서 각각의 효소 활성에 비해 아르기니노숙시네이트 리아제 (E.C. 4.3.2.1) 의 기능을 갖는 효소의 활성이 증가될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 미생물에서, 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 (EC 2.1.3.3) 의 기능을 갖는 효소의 활성을 야생형 미생물에서의 각각의 효소 활성에 비해 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 미생물에서, 아르기니노숙시네이트 신테타제 (E.C. 6.3.4.5) 의 기능을 갖는 효소의 활성을 야생형 미생물에서의 각각의 효소 활성에 비해 증가시킬 수 있다.

미생물에서 증가된 효소 활성은, 예를 들어, 상응하는 내인성 유전자의 돌연변이에 의해 달성될 수 있다. 효소 활성을 증가시키기 위한 추가 측정은 효소를 코딩하는 mRNA 를 안정화시키는 것일 수 있다.

상기 언급된 효소의 활성 증가는 각 효소를 코딩하는 유전자를 과발현시킴으로써 달성될 수도 있다. 다시 말해, 이 과제는 바람직하게는 야생형 유기체의 능력에 비해 L-아르기닌을 생산하는 능력이 개선된 및/또는 카르바모일포스페이트 신타아제 (EC 6.3.4.16) 의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 적어도 하나 이상의 과발현된 유전자 (예를 들어, carA, carB) 를 갖고, L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제 (AGAT, 예를 들어, EC 2.1.4.1) 의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 미생물에 의해 해결된다.

또한, 본 발명에 따른 미생물은 바람직하게는 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제의 기능 (EC 2.1.3.3) 을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자 (예를 들어, argF/argF2/argI), 아르기니노숙시네이트 신테타제 (E.C. 6.3.4.5) 의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자 (예를 들어, argG), 및 아르기니노숙시네이트 리아제 (E.C. 4.3.2.1) 의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자 (예를 들어, argH) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 과발현된 유전자를 포함한다.

유전자의 과발현은 일반적으로 유전자의 카피수를 증가시킴으로써 및/또는 유전자를 강력한 프로모터와 기능적으로 연결시킴으로써 및/또는 리보솜 결합 부위를 향상시킴으로써 및/또는 개시 코돈 또는 전체 유전자의 코돈 사용 최적화 또는 상기 언급된 모든 방법의 선택을 포함하는 조합에 의해 달성된다.

본 발명의 문맥에서 L-아르기닌을 생산하는 능력이 향상된 미생물은 자신의 필요를 초과하여 L-아르기닌을 생산하는 미생물을 의미한다. 이러한 L-아르기닌 생산 미생물의 예는 예를 들어 C. 글루타미쿰 ATCC 21831 또는 Park et al. (NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/ncomms5618) 또는 Ginesy et al. (Microbial Cell Factories (2015) 14:29) 에 의해 개시된 것들이다.

본 발명에 따른 미생물의 일 구현예에서, 아르기닌 오페론 (argCJBDFR) 은 과발현될 수 있다.

대안적으로는, 본 발명에 따른 미생물에서 아르기닌 반응성 리프레서 단백질 ArgR 을 코딩하는 argR 유전자는 약독화되거나 결실될 수 있다.

본 발명의 추가의 구현예에서, 및 임의로 상기 언급된 변형에 더하여, 글루타메이트 디히드로게나제, 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제, 아세틸글루타메이트 키나제, 아세틸글루타밀포스페이트 리덕타제 및 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제를 각각 코딩하는 gdh, argJ, argB, argC 및/또는 argD 를 포함하는, L-아르기닌의 생합성 경로의 효소를 코딩하는 적어도 하나 이상의 유전자가 본 발명에 따른 미생물에서 과발현된다.

표 1 은 상이한 종, 즉 E. 콜라이, C. 글루타미쿰 및 슈도모나스 푸티다 (P. putida) 에서 아르기닌 생합성에 관여하거나 이에 기여하는 효소의 상이한 명칭을 나타낸다.

본 발명의 미생물에 있어서, L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자가 추가로 과발현될 수 있다. 유전자의 과발현은 일반적으로 유전자의 카피수를 증가시킴으로써 및/또는 유전자를 강력한 프로모터와 기능적으로 연결시킴으로써 및/또는 리보솜 결합 부위를 향상시킴으로써 및/또는 전체 유전자의 개시 코돈의 코돈 사용 최적화 또는 상기 언급된 모든 방법 또는 선택을 포함하는 조합에 의해 달성된다.

표 1: 효소의 명칭

본 발명의 미생물에서 L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제 (AGAT) 의 기능을 갖는 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 에 따른 아미노산 서열 (무레아 프로듀센스 (Moorea producens) 의 "AGAT_Mp") 에 대해 적어도 70% 상동, 바람직하게는 적어도 80% 또는 적어도 90% 상동인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 추가의 구현예에서, L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4 에 따른 아미노산 서열과 동일하다 (참조: Database UniProt, 15 February 2017, "Glycine amidinotransferase", XP055706853, EBI 수탁 번호 UNIPROT: A0A1D8TKD3). 무레아 프로듀센스 AGAT 를 코딩하는 야생형 DNA 의 서열은 SEQ ID NO:1 이고, C. 글루타미쿰에 대해 코돈 최적화된 상응하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:3 이다. P. 푸티다에 대해 코돈 최적화된 무레아 프로듀센스 AGAT 유전자에 대한 상응하는 DNA 서열은 SEQ ID NO: 33 이다.

본 발명의 미생물에서 L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제의 기능을 갖는 단백질은 SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 26 에 따른 아미노산 서열 (실린드로스페르모프시스 라시보르스키 (Cylindrospermopsis raciborskii) ATW205 의 "AGAT_cyrA") 에 대해 적어도 70% 상동, 바람직하게는 적어도 80% 또는 적어도 90% 상동인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 추가의 구현예에서, L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:16 또는 SEQ ID NO:26 에 따른 아미노산 서열과 동일하다. 실린드로스페르모프시스 라시보르스키 (Cylindrospermopsis raciborskii) AGAT 를 코딩하는 야생형 DNA 의 서열은 SEQ ID NO:15 이고, C. 글루타미쿰에 대해 코돈 최적화된 상응하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:25 이다.

본 발명의 미생물에서 L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제의 기능을 갖는 단백질은 SEQ ID NO: 23 (갈레옵테루스 바리에가투스 (Galeopterus variegatus) 의 "AGAT_Gv"), 바람직하게는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO:32 에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 상동, 바람직하게는 적어도 80% 또는 적어도 90% 상동인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 추가의 구현예에서, L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:24 또는 SEQ ID NO:32 에 따른 아미노산 서열과 동일하다. C. 글루타미쿰에 대해 코돈 최적화된 상응하는 갈레옵테루스 바리에가투스 AGAT DNA 의 서열은 SEQ ID NO: 31 이다.

본 발명의 미생물에서 L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제의 기능을 갖는 단백질은 SEQ ID NO:18 (호모 사피엔스 (Homo sapiens) 의 "AGAT_Hs"), 바람직하게는 SEQ ID NO: 20 또는 SEQ ID NO:28 에 따른 아미노산 서열, 예를 들어 SEQ ID NO: 21 또는 SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO:30 (라투스 노르베지쿠스 (Rattus norvegicus) 의 각 "AGAT Rn"; C. 글루타미쿰에 대해 코돈 최적화된, 상응하는 DNA 는 SEQ ID NO: 29 임) 에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 상동, 바람직하게는 적어도 80% 또는 적어도 90% 상동인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 추가의 구현예에서, L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:18 에 따른 아미노산 서열과 동일하다. 호모 사피엔스 AGAT 를 코딩하는 야생형 DNA 의 서열은 SEQ ID NO:17 이고, C. 글루타미쿰에 대해 코돈 최적화된 상응하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:27 이다.

본 발명의 미생물은 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum)), 또는 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae) 속, 바람직하게는 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli (E. coli)), 또는 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 바람직하게는 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida (P. putida)) 에 속할 수 있다.

일반적으로, 미생물에서 증가된 효소 활성은, 예를 들어, 상응하는 내인성 유전자의 돌연변이에 의해 달성될 수 있다. 또한 상응하는 유전자의 과발현에 의해 효소 활성이 향상될 수 있다.

일반적으로, 본 발명에 따른, 유전자의 과발현은 유전자의 카피수를 증가시킴으로써 및/또는 조절 인자의 향상에 의해, 예를 들어, 유전자를 강력한 프로모터와 기능적으로 연결시킴으로써 및/또는 리보솜 결합 부위를 향상시킴으로써 및/또는 개시 코돈 또는 전체 유전자의 코돈 사용 최적화에 의해 달성된다. 유전자 발현에 긍정적인 영향을 미치는 이러한 조절 인자의 향상은, 예를 들어, 프로모터의 유효성을 증가시키기 위해 구조 유전자의 업스트림의 프로모터 서열을 변형함으로써 또는 상기 프로모터를 보다 효과적이거나 소위 강한 프로모터로 완전히 대체함으로써 달성될 수 있다. 프로모터는 유전자의 업스트림에 위치한다. 프로모터는 약 40 내지 50 개의 염기쌍으로 이루어진 DNA 서열로서, RNA 중합효소 할로효소의 결합 부위 및 전사 시작 지점을 구성하며, 이에 의해 조절된 폴리뉴클레오티드 또는 유전자의 발현 강도가 영향을 받을 수 있다. 일반적으로, 강한 프로모터를 선택함으로써, 예를 들어, 본래의 프로모터를 강하고 천연적인 (본래 다른 유전자에 할당된) 프로모터로 대체함으로써, 또는 주어진 천연적인 프로모터의 특정 영역 (예를 들어, 소위 -10 및 -35 영역) 을, 예를 들어, C. 글루타미쿰의 경우 M. Patek et al. (Microbial Biotechnology 6 (2013), 103-117) 에 의해 교시된 바와 같이, 컨센서스 서열을 향해 변형시킴으로써, 박테리아에서 유전자의 과발현 또는 발현의 증가를 달성할 수 있다. "기능적 연결" 은 프로모터와 유전자의 순차적인 배열로, 이는 유전자의 전사를 초래하는 것을 의미하는 것으로 이해된다.

유전자 코드는 퇴보되는데, 이는 특정 아미노산이 다수의 상이한 트리플릿에 의해 인코딩될 수 있다는 것을 의미한다. 용어 코돈 사용은 특정 유기체가 전형적으로 동일한 빈도를 갖는 특정 아미노산에 대해 모든 가능한 코돈을 사용하지 않을 것이라는 관찰을 의미한다. 대신에, 유기체는 전형적으로 특정 코돈에 대한 특정 선호도를 나타낼 것이며, 이는 이들 코돈이 유기체의 전사된 유전자의 코딩 서열에서 더 빈번하게 발견됨을 의미한다. 미래의 숙주에 외래인, 즉 상이한 종으로부터 유래된 특정 유전자가 미래의 숙주 유기체에서 발현되어야 한다면, 상기 유전자의 코딩 서열은 상기 미래의 숙주 유기체의 코돈 사용에 대해 조정되어야 한다 (즉, 코돈 사용 최적화).

상기 언급된 과제는 또한, a) 상기 정의된 본 발명에 따른 미생물을 적합한 배지에서 적합한 조건 하에서 배양하는 단계, 및 b) 배지에 구아니디노 아세트산 (GAA) 을 축적하여 GAA 함유 발효 브로쓰를 형성하는 단계를 포함하는, 구아니디노 아세트산 (GAA) 의 발효 생산 방법에 의해 해결된다.

본 발명에 따른 방법은 배지에 글리신을 첨가하는 단계 및/또는 L-아르기닌을 첨가하는 단계 및/또는 L-오르니틴을 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 배지에 0.1 내지 300 g 글리신/l 배지, 바람직하게는 0.82 g 글리신/l 배지 범위의 농도의 글리신 및/또는 0.1 내지 200 g L-아르기닌/l 배지, 바람직하게는 1.9 g L-아르기닌/l 배지 범위의 농도를 얻도록 L-아르기닌을 보충한다.

본 발명의 방법은 발효 브로쓰로부터 GAA 를 단리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 GAA 함유 발효 브로쓰를 건조 및/또는 과립화하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 구아니디노아세테이트 N-메틸트랜스퍼라제 (EC: 2.1.1.2) 의 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는, 상기 정의된 미생물에 관한 것이다. 바람직하게는, 구아니디노아세테이트 N-메틸트랜스퍼라제의 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자가 과발현된다.

또한, 본 발명은 a) 구아니디노아세테이트 N-메틸트랜스퍼라제의 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 본 발명에 따른 미생물을 적합한 배지에서 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 b) 상기 배지 내에 크레아틴을 축적하여 크레아틴 함유 발효 브로쓰를 형성하는 단계를 포함하는, 크레아틴의 발효 생산 방법에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 방법은 크레아틴 함유 발효 브로쓰로부터 크레아틴을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 크레아틴은 등전점법 및/또는 이온 교환법에 의해 발효 브로쓰로부터 추출될 수 있다. 대안적으로, 크레아틴은 물 중에서 재결정화하는 방법에 의해 추가로 정제될 수 있다.

실험 부문

A) 재료 및 방법

화학물질

스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 (Streptomyces kanamyceticus) 로부터의 카나마이신 용액을 Sigma Aldrich (St. Louis, USA, Cat. no. K0254) 로부터 구입하였다. IPTG (이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드) 를 Carl-Roth (Karlsruhe, Germany, Cat. no. 2316.4.) 로부터 구입하였다. 달리 언급되지 않는다면, 모든 다른 화학물질은 Merck (Darmstadt, Germany), Sigma Aldrich (St. Louis, USA) 또는 Carl-Roth (Karlsruhe, Germany) 로부터 분석적으로 순수하게 구입하였다.

세포 증식을 위한 배양

달리 언급되지 않는다면, 배양/인큐베이션 절차는 다음과 같이 수행하였다:

a. Merck (Darmstadt, Germany; Cat. no. 110285) 사의 LB 브로쓰 (MILLER) 를 액체 배지에서 E. 콜라이 균주를 배양하는데 사용하였다. 액체 배양물 (3 개의 배플이 있는 100 ml Erlenmeyer 플라스크 당 10 ml 액체 배지) 을 Infors GmbH (Bottmingen, Switzerland) 사의 Infors HT Multitron 표준 인큐베이터 진탕기에서 30℃ 및 200 rpm 으로 인큐베이션하였다.

b. Merck (Darmstadt, Germany; Cat. no. 110283) 사의 LB 브로쓰 (MILLER) 를 아가 플레이트 상에서 E. 콜라이 균주를 배양하는데 사용하였다. 아가 플레이트를 VWR (Radnor, USA) 사의 INCU-Line® 미니 인큐베이터에서 30℃ 에서 인큐베이션하였다.

c. Merck (Darmstadt, Germany; Cat. no. 110493) 사의 뇌 심장 인퓨전 브로쓰 (BHI) 를 액체 배지에서 C. 글루타미쿰 균주를 배양하는데 사용하였다. 액체 배양물 (3 개의 배플이 있는 100 ml Erlenmeyer 플라스크 당 10 ml 액체 배지) 을 Infors GmbH (Bottmingen, Switzerland) 사의 Infors HT Multitron 표준 인큐베이터 진탕기에서 30℃ 및 200 rpm 으로 인큐베이션하였다.

d. Merck (Darmstadt, Germany; Cat. no. 113825) 사의 뇌 심장 아가 (BHI-아가) 를 아가 플레이트 상에서 C. 글루타미쿰 균주의 배양에 사용하였다. 아가 플레이트를 Kelvitron® 온도 제어기 (Hanau, Germany) 가 있는 Heraeus Instruments 사의 인큐베이터에서 30℃ 에서 인큐베이션하였다.

e. 전기천공 후 C. 글루타미쿰을 배양하기 위하여, BHI-agar (Merck, Darmstadt, Germany, Cat. no. 113825) 에 134 g/l 소르비톨 (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany), 2.5 g/l 효모 추출물 (Oxoid/ThermoFisher Scientific, Waltham, USA, Cat. no. LP0021) 및 25 mg/l 카나마이신을 보충하였다. 아가 플레이트를 Kelvitron® 온도 제어기 (Hanau, Germany) 가 있는 Heraeus Instruments 사의 인큐베이터에서 30℃ 에서 인큐베이션하였다.

박테리아 현탁액의 광학 밀도 결정

a. 진탕 플라스크 배양물 중의 박테리아 현탁액의 광학 밀도를 Eppendorf AG (Hamburg, Germany) 사의 BioPhotometer 를 사용하여 600 nm (OD600) 에서 측정하였다.

b. Tecan Group AG (Maennedorf, Switzerland) 사의 GENios™ 플레이트 판독기를 사용하여 Wouter Duetz (WDS) 마이크로 발효 시스템 (24-웰 플레이트) 에서 생산된 박테리아 현탁액의 광학 밀도를 660 nm (OD660) 에서 측정하였다.

원심분리

a. 최대 부피가 2 ml 인 박테리아 현탁액을 Eppendorf 5417 R 벤치탑 원심분리 (13.000 rpm 에서 5 분) 를 사용하여 1.5 ml 또는 2 ml 반응 튜브 (예를 들어, Eppendorf Tubes® 3810X) 에서 원심분리하였다.

b. 최대 부피가 50 ml 인 박테리아 현탁액을 4.000 rpm 에서 10 분 동안 Eppendorf 5810 R 벤치탑 원심분리를 사용하여 15 ml 또는 50 ml 반응 튜브 (예를 들어, FalconTM 50 ml Conical Centrifuge Tubes) 에서 원심분리하였다.

DNA 단리

플라스미드 DNA 를 제조사의 지시에 따라 Qiagen (Hilden, Germany, Cat. No. 27106) 사의 QIAprep Spin Miniprep Kit 를 사용하여 E. 콜라이 세포로부터 단리하였다.

중합효소 연쇄 반응 (PCR)

프루프 리딩 (높은 충실도) 폴리머라제를 사용한 PCR 을 사용하여 생어 (Sanger) 서열분석 또는 DNA 어셈블리를 위해 원하는 DNA 분절을 증폭시켰다. 비-프루프-리딩 폴리머라제 키트를 E. 콜라이 또는 C. 글루타미쿰 콜로니로부터 직접 원하는 DNA 단편의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 사용하였다.

a. New England BioLabs Inc. (Ipswich, USA, Cat. No. M0530) 사의 Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase Kit (Phusion Kit) 를 제조자의 지시에 따라 선택된 DNA 영역의 주형-정확한 증폭에 사용하였다 (표 2 참조).

표 2: New England BioLabs Inc. 사의 Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase Kit 를 이용한 PCR 을 위한 열순환 조건.

b. Qiagen (Hilden, Germany, Cat. No.201203) 사의 Taq PCR Core Kit (Taq Kit) 를 DNA 의 원하는 분절을 그의 존재를 확인하기 위해 증폭하는데 사용하였다. 키트는 제조사의 지시에 따라 사용하였다 (표 3 참조).

표 3: Qiagen 사의 Taq PCR Core Kit 를 이용한 PCR 을 위한 열순환 조건.

c. Takara Bio Inc (Takara Bio Europe S.A.S., Saint-Germain-en-Laye, France, Cat. No. RR350A/B) 사의 SapphireAmp® Fast PCR Master Mix (Sapphire Mix) 를 제조자의 지침에 따라 E. 콜라이 또는 C. 글루타미쿰으로부터 취한 세포에서 원하는 DNA 분절의 존재를 확인하기 위한 대안으로서 사용하였다 (표 4 참조).

표 4: Takara Bio Inc. 사의 SapphireAmp® Fast PCR Master Mix (Sapphire Mix) 를 사용한 PCR 을 위한 열순환 조건.

d. 모든 올리고뉴클레오티드 프라이머는 McBride and Caruthers (1983) 에 의해 기술된 포스포라미다이트 방법을 사용하여 Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany) 에 의해 합성되었다.

e. PCR 주형으로서, 단리된 플라스미드 DNA 또는 액체 배양물로부터 단리된 총 DNA 의 적합하게 희석된 용액 또는 박테리아 콜로니에 함유된 총 DNA (콜로니 PCR) 를 사용하였다. 상기 콜로니 PCR 을 위해, 아가 플레이트 상의 콜로니로부터 이쑤시개로 세포 물질을 취하고, 세포 물질을 PCR 반응 튜브 내로 직접 위치시킴으로써 주형을 제조하였다. 세포 물질을 SEVERIN Elektrogeraete GmbH (Sundern, Germany) 사의 전자레인지 오븐 유형 Mikrowave & Grill 에서 800 W 에서 10 초 동안 가열한 다음, PCR 반응 튜브 내의 주형에 PCR 시약을 첨가하였다.

f. 모든 PCR 반응은 Eppendorf AG (Hamburg, Germany) 사의 PCR 사이클러 타입 Mastercycler 또는 Mastercycler nexus 구배에서 수행하였다.

DNA 의 제한효소 분해

제한 효소 분해에 대해서는 New England BioLabs Inc. (Ipswich, USA) 사의 "FastDigest restriction endonucleases (FD)" (ThermoFisher Scientific, Waltham, USA) 또는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하였다. 반응은 제조사의 매뉴얼의 지시에 따라 수행되었다.

DNA 단편의 크기 결정

a. 작은 DNA 단편의 크기 (<1000 bps) 는 일반적으로 Qiagen (Hilden, Germany) 사의 QIAxcel 을 사용하는 자동 모세관 전기영동에 의해 결정되었다.

b. DNA 단편이 단리되어야 하는 경우 또는 DNA 단편이 1000 bps 초과인 경우, DNA 를 TAE 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고, GelRed® Nucleic Acid Gel Stain (Biotium, Inc., Fremont, Canada) 으로 염색하였다. 염색된 DNA 는 302 nm 에서 눈에 보였다.

PCR 증폭물 및 제한 단편의 정제

PCR 증폭물 및 제한 단편을 제조자의 지침에 따라, Qiagen (Hilden, Germany; Cat. No. 28106) 사의 QIAquick PCR Purification Kit 를 사용하여 세정하였다. DNA 를 30 ㎕ 의 10 mM Tris*HCl (pH 8.5) 로 용리시켰다.

DNA 농도 결정

DNA 농도는 PEQLAB Biotechnologie GmbH, 2015 년부터 VWR brand (Erlangen, Germany) 사의 NanoDrop Spectrophotometer ND-1000 을 사용하여 측정하였다.

어셈블리 클로닝

플라스미드 벡터는 New England BioLabs Inc. (Ipswich, USA, Cat. No. E5520) 로부터 구입한 "NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit"를 사용하여 어셈블리하였다. 선형 벡터 및 적어도 하나의 DNA 삽입물을 함유하는 반응 혼합물을 50℃ 에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 어셈블리 혼합물 0.5 ㎕ 를 각 형질전환 실험에 사용하였다.

E. 콜라이 의 화학적 형질전환

플라스미드 클로닝을 위해, 화학적으로 적격인 "NEB® Stable Competent E. coli (High Efficiency)" (New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. C3040) 을 제조사의 프로토콜에 따라 형질전환시켰다. 성공적으로 형질전환된 세포를 25 mg/l 카나마이신이 보충된 LB 아가 상에서 선별하였다.

C. 글루타미쿰 의 형질전환

플라스미드-DNA 로의 C. 글루타미쿰의 형질전환은 Ruan et al. (2015) 에 의해 기술된 바와 같이 "Gene Pulser Xcell" (Bio-Rad Laboratories GmbH, Feldkirchen, Germany) 을 사용하는 전기천공을 통해 수행하였다. 전기천공은 1 mm 전기천공 큐벳 (Bio-Rad Laboratories GmbH, Feldkirchen, Germany) 에서 1.8 kV 및 5 ms 로 설정된 고정된 시간 상수로 수행하였다. 형질전환된 세포를 134 g/l 소르비톨, 2.5 g/l 효모 추출물 및 25 mg/l 카나마이신을 함유하는 BHI-아가 상에서 선별하였다.

뉴클레오티드 서열 결정

DNA 분자의 뉴클레오티드 서열은 Applied Biosystems® (Carlsbad, CA, USA) 3730xl DNA Analyzers 상에서, Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463 - 5467, 1977) 의 디데옥시 사슬 종결 방법을 사용하여, 사이클 서열분석에 의해 Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany) 에 의해 결정하였다. Scientific & Educational Software (Denver, USA) 사의 Clonemanager Professional 9 소프트웨어를 사용하여 서열을 시각화하고 평가하였다.

E.콜라이 및 C. 글루타미쿰 균주의 글리세롤 스톡

E.콜라이 및 C. 글루타미쿰 균주의 장기간 저장을 위해 글리세롤 스톡을 제조하였다. 선별된 E.콜라이 클론을 2 g/l 글루코스로 보충된 10 ml LB 배지에서 배양하였다. 선별된 C. 글루타미쿰 클론을 2 g/l 글루코스로 보충된 10 ml 2 배 농축 BHI 배지에서 배양하였다. 플라스미드 함유 E.콜라이 및 C. 글루타미쿰 균주의 배양물에 25 mg/l 카나마이신을 보충하였다. 3 개의 배플이 있는 100 ml Erlenmeyer 플라스크에 배지를 함유하였다. 이것을 콜로니로부터 취한 세포의 루프로 접종하였다. 배양물을 30℃ 및 200 rpm 에서 18 h 동안 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션 기간 후, 1.2 ml 85% (v/v) 멸균 글리세롤을 배양물에 첨가하였다. 얻어진 글리세롤 함유 세포 현탁액을 2 ml 분량으로 분취하여 -80℃ 에서 보관하였다.

밀리리터-규모 배양에서의 GAA 생산

Duetz (2007) 에 따른 밀리리터-규모 배양 시스템을 사용하여 균주의 GAA-생산을 평가하였다. 이를 위해, 웰 당 2.5 ml 배지로 충전된 EnzyScreen BV (Heemstede, Netherlands, Cat. no. CR1424) 사의 24-딥웰 마이크로플레이트 (24 웰 WDS 플레이트) 를 사용하였다.

균주의 예비배양은 10 ml 종자 배지 (SM) 에서 수행하였다. 3 개의 배플이 있는 100 ml Erlenmeyer 플라스크에 배지를 함유하였다. 이를 100 ㎕ 의 글리세롤 스톡 배양물로 접종하고, 배양물을 30℃ 및 200 rpm 에서 24 h 동안 인큐베이션하였다. 종자 배지 (SM) 의 조성은 표 5 에 제시한다.

표 5: 종자 배지 (SM)

상기 인큐베이션 기간 후, 예비배양물의 광학 밀도 OD₆₀₀ 을 결정하였다. 0.1 의 OD₆₀₀ 에 2.5 ml 의 생산 배지 (PM) 를 접종하는데 필요한 부피를 예비배양물로부터 샘플링하고, 원심분리 (8000 g 에서 1 분) 하고, 상청액을 폐기하였다. 그 후, 세포를 100 ㎕ 의 생산 배지에 재현탁시켰다.

주 배양은 24 웰 WDS-플레이트의 웰의 2.4 ml 생산 배지 (PM) 함유 웰에 예비배양물로부터의 재현탁된 세포 각각 100 ㎕ 를 접종함으로써 시작하였다. 생산 배지 (PM) 의 조성은 표 6 에 제시한다.

표 6: 생산 배지 (PM)

주 배양물을 글루코스의 완전한 소비까지 Infors GmbH (Bottmingen, Switzerland) 사의 Infors HT Multitron 표준 인큐베이터 진탕기에서 30℃ 및 300 rpm 에서 72 h 동안 인큐베이션하였다. 현탁액 중의 글루코오스 농도를 LifeScan (Johnson & Johnson Medical GmbH, Neuss, Germany) 사의 혈당계 OneTouch Vita® 로 분석하였다.

배양 후, 배양 현탁액을 딥 웰 마이크로플레이트로 옮겼다. 배양 현탁액의 일부를 적절히 희석하여 OD600 을 측정하였다. 배양물의 또다른 부분을 원심분리하고, 상층액 중의 GAA 의 농도를 하기 기재된 바와 같이 분석하였다.

효모 펩톤 FM902 중의 L-아르기닌 및 글리신 함량의 측정

효모 추출물 FM902 (Angel Yeast Co.,LTD, Hubei, P.R.China) 는 다양한 펩티드와 아미노산을 함유하므로, L-아르기닌과 글리신의 함량을 다음과 같이 측정하였다.

유리 아미노산을 측정하기 위해, 1 g 의 효모 추출물을 20 ml 의 물에 용해시켜 샘플을 제조하였다. 용액을 25 ml 의 총 부피까지 물로 채우고, 완전히 혼합하고, 0.2 μΜ 나일론 시린지 필터를 사용하여 여과하였다.

총 아미노산 (유리 아미노산 + 펩티드에 결합된 아미노산) 을 측정하기 위해, 1 g 효모 추출물을 10 ml 6M HCl 에 용해시키고, 이들을 110℃ 에서 24 h 동안 인큐베이션함으로써 샘플을 제조하였다. 그 후, 총 부피 25 ml 까지 물을 첨가하였다. 용액을 완전히 혼합하고, 0.2 μΜ 나일론 시린지 필터를 사용하여 여과하였다.

샘플 중의 L-아르기닌 및 글리신의 농도는 SYKAM Vertriebs GmbH (F

rstenfeldbruck, Germany) 사의 SYKAM S433 아미노산 분석기를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 결정하였다. 고체상으로서, SYKAM 사의 구형의, 폴리스티렌-기반 양이온 교환기 (Peek LCA N04/Na, 치수 150 x 4.6 mm) 를 갖는 컬럼을 사용하였다. L-아미노산에 따라, 분리는 용리를 위한 완충액 A 및 B 의 혼합물을 사용하는 등용매 실행에서 또는 상기 완충액을 사용하는 구배 용리에 의해 일어난다. 완충액 A 로서 20 l 에 263 g 트리소듐 시트레이트, 120 g 시트르산, 1100 ml 메탄올, 100 ml 37% HCl 및 2 ml 옥탄산 (최종 pH 3.5) 을 함유하는 수용액을 사용하였다. 완충액 B 로서 20 l 에 392 g 트리소듐 시트레이트, 100 g 붕산 및 2 ml 옥탄산 (최종 pH 10.2) 을 함유하는 수용액을 사용하였다. 유리 아미노산을 포스트-컬럼 유도체화를 통해 닌히드린으로 착색하고 570 nm 에서 광도법으로 검출하였다.

표 7 은 효모 추출물 FM902 (Angel Yeast Co.,LTD, Hubei, P.R.China) 에서 결정된 유리 및 총 L-아르기닌 및 글리신의 함량 및 생성 배지 (PM) 에서의 결과량을 나타낸다.

표 7: 효모 추출물 (YE) FM902 중의 L-아르기닌 및 글리신의 함량 및 1.5 g/l YE 를 함유하는 생산 배지 (PM) 중의 생성된 농도.

GAA 의 정량화

샘플을 질량 분석기 "Triple Quad 6420" (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, USA) 와 커플링된 HPLC "Infinity 1260" 으로 구성된 Agilent 사의 분석 시스템으로 분석하였다. 35℃ 에서 Atlantis HILIC Silica 컬럼, 4,6 X 250mm, 5 μm (Waters Corporation, Milford, USA) 상에서 크로마토그래피 분리를 수행하였다. 이동상 A 는 10 mM 암모늄 포르메이트 및 0.2% 포름산을 갖는 물이었다. 이동상 B 는 90% 아세토니트릴과 10% 물의 혼합물이었고, 10 mM 암모늄 포르메이트를 혼합물에 첨가하였다. HPLC 시스템은 100% B 로 시작한 후, 22 분 동안 선형 구배 및 0,6 mL/분의 일정한 유속으로 66% B 까지 이어졌다. 질량 분석기는 ESI 양성 이온화 모드로 작동되었다. GAA 의 검출을 위해, m/z 값을 MRM 단편화 [M+H] + 118 - 76 을 사용하여 모니터링하였다. GAA 에 대한 정량화 한계 (LOQ) 는 7 ppm 으로 고정되었다.

B) 실험 결과

실시예 1: 다양한 유기체로부터 L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제 (AGAT, EC 2.1.4.1) 를 코딩하는 유전자의 합성

무레아 프로듀센스 (Moorea producens) 는 사상성 시아노박테리아이다. 무레아 프로듀센스 균주 PAL-8-15-08-1 의 게놈은 Leao et al. 에 의해 공개되었다 (Leao T, Castel

o G, Korobeynikov A, Monroe EA, Podell S, Glukhov E, Allen EE, Gerwick WH, Gerwick L, Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Mar 21;114(12):3198-3203. doi: 10.1073/pnas.1618556114; 수탁 번호 CP017599.1). 이는 L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제 (AGAT, EC 2.1.4.1, 수탁 번호 BJP34_00300, SEQ ID NO:1) 를 추정적으로 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 함유한다. SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO: 4 는 AGAT_Mp 로서 지정된 유래된 아미노산 서열 (수탁 번호 WP_070390602) 을 나타낸다.

실린드로스페르몹시스 라시보르스키 (Cylindrospermopsis raciborskii) AWT205 (수탁 번호 EU140798.1) 로부터의 유전자 cyrA 는 L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제를 코딩한다 (Mihali TK, Kellmann R, Muenchhoff J, Barrow KD, Neilan BA (2008) "Characterization of the gene cluster responsible for cylindrospermopsin biosynthesis.", Appl Environ Microbiol., 74(3):716-22, doi: 10.1128/AEM.01988-07; SEQ ID NO:15). SEQ ID NO:16 및 SEQ ID NO: 26 은 AGAT_cyrA 로서 지정된 유래된 아미노산 서열 (수탁 번호 ABX60160) 을 나타낸다.

인간 L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제의 cDNA 서열은 Humm et al., 1994 에 의해 기술되었다 (Humm A, Huber R, Mann K (1994) "The amino acid sequences of human and pig l-arginine:glycine amidinotransferase.", FEBS Letters, Vol. 339 (1-2), 101-107, DOI: 10.1016/0014-5793(94)80394-3; 수탁 번호 NM_001482.3, SEQ ID NO:17). 유래된 아미노산 서열 (수탁번호 NP_001473.1, SEQ ID NO:18) 은 성숙 효소에 부재하는 미토콘드리아 전이 펩티드 (아미노산 1 내지 37) 로 시작한다. 아미노산 56 에서 시작하는, 절단된 효소는 E. 콜라이에서 발현될 때 활성인 것으로 밝혀졌다 (Humm A, Fritsche E, Mann K, Goehl M, Huber R (1997) "Recombinant expression and isolation of human L-arginine : glycine amidinotransferase and identification of its active-site cysteine residue." Biochem. J. 322, 771-776, DOI: 10.1042/bj3220771). 7 개 아미노산 태그 (SEQ ID NO:19) 의 N-말단 융합은 E. 콜라이에서 단백질 발현을 개선시키는 것으로 나타났다 (Hansted JG, Pietikaeinen L, Hoeg F, Sperling-Petersen HU, Mortensen KK (2011) "Expressivity tag: A novel tool for increased expression in Escherichia coli." Journal of Biotechnology 155 (2011) 275- 283, DOI:10.1016/j.jbiotec.2011.07.013). 따라서, 태그 및 절두된 AGAT 로 이루어진 융합 단백질을 설계하고, 이를 AGAT_Hs (SEQ ID NO:20 및 SEQ ID NO:28) 로 지정하였다.

라투스 노르베지쿠스 (Rattus norvegicus) 로부터의 L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제의 아미노산 서열 (수탁 번호 NP_112293.1, SEQ ID NO:21) 은 인간 효소와 매우 유사하다. 인간 효소에 대해 기재된 바와 같이, 상기 서열을 사용하여 N-말단 발현 태그 및 효소의 절단된 서열로 이루어진 융합 단백질을 설계하였다. 생성된 융합 단백질을 AGAT_Rn (SEQ ID NO:22 및 SEQ ID NO:30) 으로 지정하였다.

순다 날개여우원숭이 (sunda flying lemur) 갈레옵테루스 바리에가투스 (Galeopterus variegatus) 는 예측된 L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제 (수탁 번호 NP_112293.1, SEQ ID NO:23) 를 갖는다. 인간 효소에 대해 기재된 바와 같이, 이의 아미노산 서열을 사용하여 N-말단 발현 태그 및 효소의 절단된 서열로 이루어진 융합 단백질을 설계하였다. 생성된 융합 단백질을 AGAT_Gv (SEQ ID NO:24 및 SEQ ID NO:32) 으로 지정하였다.

소프트웨어 툴 "GeneOptimizer" (Geneart/ ThermoFisher Scientific, Waltham, USA) 를 사용하여, AGAT_Mp, AGAT_cyrA, AGAT_Hs, AGAT_Rn 및 AGAT_Gv 의 아미노산 서열을 DNA 서열로 다시 번역하고 C. 글루타미쿰의 코돈 사용에 최적화하였다. 이들의 말단은 어셈블리 클로닝을 위한 서열로 확장되었고, 샤인-달가노-서열 (Shine-Dalgarno-Sequence) 은 오픈 리딩 프레임의 업스트림에 추가되었다. 생성된 DNA 서열은 SEQ ID NO:3 (AGAT_Mp 를 코딩함), SEQ ID NO:25 (AGAT_cyrA 를 코딩함), SEQ ID NO:27 (AGAT_Hs 를 코딩함), SEQ ID NO: 29 (AGAT_Rn 을 코딩함) 및 SEQ ID NO:31 (AGAT_Gv 를 코딩함) 이다. 이들은 Invitrogen/Geneart (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) 로부터 유전자 합성을 위해 주문하였다. 합성 유전자는 pMA-T_AGAT_Mp, pMA-T_AGAT_cyrA, pMA-T_AGAT_Hs, pMA-T_AGAT_Rn 및 pMA-T_AGAT_Gv 로서 지정된 클로닝 플라스미드의 일부로서 전달되었다.

실시예 2: AGAT_Mp 의 발현 플라스미드 pEC-XK99E 내로의 클로닝

E. 콜라이-C. 글루타미쿰 셔틀 플라스미드 pEC-XK99E 를 제한 엔도뉴클레아제 SmaI 를 사용하여 소화시켰다. "FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase" (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) 를 사용하여 말단 포스페이트를 제거하였다. 이후, DNA 를 "QIAquick PCR Purification Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 로 정제하였다.

클로닝 플라스미드 pMA-T_AGAT_Mp 를 MluI + AatII 로 소화시키고, 생성된 단편을 "Fast DNA End Repair Kit" (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) 를 사용하여 블런트화하였다. 이들을 아가로스 겔 전기영동 (TAE 완충액 중 0,8% 아가로스) 으로 분리하고, "AGAT_Mp" (1174 bp) 에 해당하는 밴드를 잘라냈다. 이의 DNA 를 "QIAquick Gel Extraction Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 를 사용하여 정제하였다.

AGAT_Mp 단편 및 선형화된 pEC-XK99E 를 "Ready-To-Go T4 DNA ligase" (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany) 를 사용하여 라이게이션하였다. 라이게이션 생성물을 "NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency)" (New England Biolabs, Ipswich, USA) 내로 형질전환시키고, 세포를 25 mg/l 카나마이신을 함유하는 LB 아가 상에서 성장시켰다. 적절한 클론은 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석에 의해 확인되었다. 생성된 플라스미드를 pEC-XK99E_AGAT_Mp 로 명명하였다.

실시예 2.1: AGAT_Mp 및 AGAT_cyrA 의 발현 플라스미드 pEKEx2 내로의 클로닝

E. 콜라이-C. 글루타미쿰 셔틀 플라스미드 pEKEx2 (Eikmanns, 1991) 를 제한 엔도뉴클레아제 PstI 를 사용하여 소화시켰다. 생성된 단편을 "Fast DNA End Repair Kit" (Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여 블런트화하고, 말단 포스페이트를 "FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase" (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) 로 제거하였다. 이후, DNA 를 "QIAquick PCR Purification Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 로 정제하였다.

클로닝 플라스미드 pMA-T_AGAT_Mp 및 pMA-T_AGAT_cyrA 를 MluI + AatII 로 소화시키고, 생성된 단편을 "Fast DNA End Repair Kit" (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) 를 사용하여 블런트화하였다. 이들을 아가로스 겔 전기영동 (TAE 완충액 중 0,8% 아가로스) 으로 분리하고, AGAT_Mp (1174 bp) 및 AGAT_cyrA (1204 bp) 에 해당하는 밴드를 잘라냈다. DNA 를 "QIAquick Gel Extraction Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 를 사용하여 정제하였다.

각각의 AGAT 단편을 "Ready-To-Go T4 DNA ligase" (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany) 를 사용하여 선형화된 pEKEx2 로 라이게이션하였다. 라이게이션 생성물을 "NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency)" (New England Biolabs, Ipswich, USA) 내로 형질전환시키고, 세포를 25 mg/l 카나마이신을 함유하는 LB 아가 상에서 성장시켰다. 적절한 클론은 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석에 의해 확인되었다. 생성된 플라스미드를 pEKEx2_AGAT_Mp 및 pEKEx2_AGAT_cyrA 로 명명하였다.

실시예 2.2: AGAT_Hs, AGAT_Rn 및 AGAT_Gv 의 발현 플라스미드 pEKEx2 내로의 클로닝

클로닝 플라스미드 pMA-T_AGAT_Hs, pMA-T_AGAT_Rn 및 pMA-T_AGAT_Gv 를 Eco31I 로 소화시키고, 생성물을 "QIAquick Gel Extraction Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 를 사용하여 정제하였다.

E. 콜라이-C. 글루타미쿰 셔틀 플라스미드 pEKEx2 (Eikmanns BJ, Kleinertz E, Liebl W, Sahm H (1991) "A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing.", Gene. 1991 Jun 15;102(1):93-8) 를 제한 엔도뉴클레아제 SbfI 및 BamHI 를 사용하여 소화시켰다. DNA 를 "QIAquick PCR Purification Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 로 정제하였다.

각각의 AGAT 단편은 "NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit" (New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. E5520) 를 사용하여 소화된 pEKEx2 와 어셈블리하였다. 어셈블리 생성물을 "NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency)" (New England Biolabs, Ipswich, USA) 내로 형질전환시키고, 세포를 25 mg/l 카나마이신을 함유하는 LB 아가 상에서 성장시켰다. 적절한 클론은 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석에 의해 확인되었다. 생성된 플라스미드를 각각 pEKEx2_AGAT_Hs, pEKEx2_AGAT_Rn 및 pEKEx2_AGAT_Gv 로 명명하였다.

실시예 3: 유전자 argF 의 플라스미드 pCR-Blunt II-TOPO 내로의 클로닝

argF 유전자를 C. 글루타미쿰 ATCC13032 의 게놈 DNA 와 올리고뉴클레오타이드 프라이머 argF_1.p (SEQ ID NO:5) 및 argF_2.p (SEQ ID NO:6) 를 사용하여 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Kit (New England BioLabs Inc., Ipswich, USA) 로 PCR 증폭하였다. 생성된 PCR 생성물을 플라스미드 pCR-Blunt II-TOPO (Thermo Fisher Scientific/Invitrogen, Waltham, USA) 내에 클로닝하고, 적절한 플라스미드 클론을 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 이 플라스미드를 pCRII-argF 로 명명하였다.

실시예 4: 유전자 argG 및 argH 의 플라스미드 pCR-Blunt II-TOPO 내로의 클로닝

유전자 argG 및 argH 를 C. 글루타미쿰 ATCC13032 의 게놈 DNA 와 올리고뉴클레오타이드 프라이머 argG_1.p (SEQ ID NO:7) 및 argH_2.p (SEQ ID NO:8) 를 사용하여 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Kit (New England BioLabs Inc., Ipswich, USA) 로 PCR 증폭하였다. 생성된 PCR 생성물을 플라스미드 pCR-Blunt II-TOPO (Thermo Fisher Scientific/Invitrogen, Waltham, USA) 내에 클로닝하고, 적절한 플라스미드 클론을 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 플라스미드를 pCRII-argGH 로 명명하였다.

실시예 5: 유전자 argG 및 argH 의 플라스미드 pCRII-argF 내로의 클로닝

pCRII-argGH 를 HpaI + AvrII 를 사용하여 절단하고, 2773 bps 의 제한 단편을 아가로스 겔로부터 단리하였다. pCRII-argF 를 SspI + AvrII 를 사용하여 절단하고, 4526 bps 의 제한 단편을 아가로스 겔로부터 단리하였다. 두 단편을 라이게이션한 후 E. 콜라이로 형질전환하였다. 적절한 플라스미드 클론은 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석에 의해 확인되었다. 생성된 플라스미드를 pCRII-argFGH 로 명명하였다.

실시예 6: 유전자 argF , argG 및 argH 의 발현 플라스미드 pEC-XK99E 내로의 클로닝

pCRII-argFGH 를 HpaI + AvrII 를 사용하여 절단하고, 2773 bps 의 제한 단편을 아가로스 겔로부터 단리하였다. 플라스미드 pEC-XK99E 를 Ecl136II + XbaI 를 사용하여 절단하였다. 6999 bps 의 제한 단편을 아가로스 겔로부터 단리하였다. 두 단편을 라이게이션한 후 E. 콜라이로 형질전환하였다. 적절한 플라스미드 클론은 제한 소화 및 DNA 서열분석에 의해 확인되었다. 생성된 플라스미드 pEC-XK99E_argFGH 는 C. 글루타미쿰으로부터의 유전자 argF, argG 및 argH 를 함유한다.

실시예 7: 유전자 argF , argG 및 argH 의 발현 플라스미드 pEC-XK99E_AGAT_Mp 내로의 클로닝

pCRII-argFGH 를 XbaI + SpeI 를 사용하여 절단하고, 3868 bps 의 제한 단편을 아가로스 겔로부터 단리하였다. 플라스미드 pEC-XK99E_AGAT_Mp 를 XbaI 를 사용하여 절단하였다. 8188 bps 의 제한 단편을 아가로스 겔로부터 단리하였다. 두 단편을 라이게이션한 후 E. 콜라이로 형질전환하였다. 적절한 플라스미드 클론은 제한 소화 및 DNA 서열분석에 의해 확인되었다. 생성된 플라스미드 pEC-XK99E_AGAT_Mp_argFGH 는 AGAT_Mp 와 조합으로 C. 글루타미쿰으로부터의 유전자 argF, argG 및 argH 를 함유한다.

실시예 8: 유전자 argF 의 발현 플라스미드 pEC-XK99E_AGAT_Mp 내로의 클로닝

pCRII-argF 를 KpnI + XbaI + AseI 를 사용하여 절단하고, DNA 를 "QIAquick PCR Purification Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 로 정제하였다. 플라스미드 pEC-XK99E_AGAT_Mp 를 KpnI + XbaI 를 사용하여 절단하고, DNA 를 "QIAquick PCR Purification Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 로 정제하였다. 두 용리액을 혼합하고, DNA 단편을 라이게이션하고, 생성물을 사용하여 E. 콜라이를 형질전환시켰다. 적절한 플라스미드 클론은 제한 소화 및 DNA 서열분석에 의해 확인되었다. 생성된 플라스미드 pEC-XK99E_AGAT_Mp_argF 는 AGAT_Mp 와 조합으로 C. 글루타미쿰으로부터의 유전자 argF 를 함유한다.

실시예 9: 유전자 argG 의 발현 플라스미드 pEC-XK99E_AGAT_Mp 내로의 클로닝

pCRII-argGH 를 XbaI + SalI 를 사용하여 절단하고, 1798 bps 의 제한 단편을 아가로스 겔로부터 단리하였다. 플라스미드 pEC-XK99E_AGAT_Mp 를 XbaI + SalI 를 사용하여 절단하고, DNA 를 "QIAquick PCR Purification Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 로 정제하였다. DNA 단편을 라이게이션하고, 생성물을 사용하여 E. 콜라이를 형질전환시켰다. 적절한 플라스미드 클론은 제한 소화 및 DNA 서열분석에 의해 확인되었다. 생성된 플라스미드 pEC-XK99E_AGAT_Mp_argG 는 AGAT_Mp 와 조합으로 C. 글루타미쿰으로부터의 유전자 argG 를 함유한다.

실시예 10: ATCC13032 내 carAB 오페론의 업스트림 sod 프로모터의 염색체 삽입

카르바모일 포스페이트 신테타제의 효소 활성은 ATCC13032 내 carAB 오페론의 업스트림 강한 sod-프로모터의 게놈 삽입에 의해 증가되었다. 따라서, 플라스미드 pK18mobsacB_Psod-carAB 는 다음과 같이 구성되었다. 플라스미드 pK18mobsacB 를 EcoRI + HindIII 를 사용하여 절단하고, 선형화된 벡터 DNA (5670 bps) 를 아가로스 겔로부터 절단하였다. DNA 를 "QIAquick Gel Extraction Kit" (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) 를 사용하여 추출하였다.

삽입체를 구성하기 위해, 3 개의 DNA 단편을 하기 프라이머 쌍 (주형으로서 ATCC13032 의 게놈 DNA) 을 사용하는 PCR 에 의해 생성하였다:

PsodcarAB-LA-F (SEQ ID NO:9) + PsodcarAB-LA-R (SEQ ID NO:10)

= 좌측 상동 암 (arm) (1025 bps)

PsodcarAB-F (SEQ ID NO:11) + PsodcarAB-R (SEQ ID NO:12)

= sod-프로모터 (250 bps)

PsodcarAB-RA-F SEQ ID NO:13) + PsodcarAB-RA-R (SEQ ID NO:14)

= 우측 상동 암 (944 bps)

생성물 DNA 를 "QIAquick PCR Purification Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 를 사용하여 정제하였다. 선형화된 플라스미드 및 PCR 생성물은 이후 "NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit" (New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. E5520) 를 사용하여 어셈블리하였다. 적절한 플라스미드 클론은 제한 소화 및 DNA 서열분석에 의해 확인되었다.

pK18mobsacB_Psod-carAB 를 사용하여 carAB 유전자의 업스트림 강한 sod-프로모터를 C. 글루타미쿰 ATCC13032 의 게놈 내로 통합하였다. 플라스미드를 전기천공에 의해 ATCC13032 내로 형질전환시켰다. 염색체 통합 (제 1 재조합 사건으로부터 초래됨) 을 134 g/l 소르비톨, 2.5 g/l 효모 추출물 및 25 mg/l 카나마이신이 보충된 BHI 아가 상에 플레이팅함으로써 선별하였다. 아가 플레이트를 33℃ 에서 48 시간 동안 인큐베이션한다.

개별 콜로니를 신선한 아가 플레이트 (카나마이신 25 mg/l 함유) 로 옮기고 33℃ 에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 이들 클론의 액체 배양물을 3 개의 배플이 있는 100 ml Erlenmeyer 플라스크에 함유된 10 ml BHI 배지에서 24 시간 동안 33℃ 에서 배양하였다. 제 2 재조합 사건에 직면한 클론을 단리하기 위해, 각각의 액체 배양물로부터 분취물을 취하고, 적합하게 희석하고, 10% 사카로오스가 보충된 BHI 아가 상에 플레이팅하였다 (전형적으로 100 내지 200 ㎕). 이들 아가 플레이트를 33℃ 에서 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 사카로오스 함유 아가 플레이트 상에서 성장하는 콜로니를 카나마이신 민감성에 대해 검사하였다. 이를 위해, 이쑤시개를 사용하여 콜로니로부터 세포 물질을 제거하고, 이를 25 mg/l 카나마이신을 함유하는 BHI 아가 및 10% 사카로오스를 함유하는 BHI 아가 상에 전달하였다. 아가 플레이트를 60 시간 동안 33℃ 에서 인큐베이션하였다. 카나마이신에 민감하고 사카로오스에 내성인 것으로 입증된 클론을 sod 프로모터의 적절한 통합을 위해 PCR 및 DNA 서열분석에 의해 검사하였다. 생성된 균주를 ATCC13032_Psod-carAB 로 명명하였다.

표 8: 균주 목록

표 9: 플라스미드 목록

실시예 11: 다양한 발현 플라스미드로의 C. 글루타미쿰 균주의 형질전환

하기 C. 글루타미쿰 균주를 다양한 플라스미드로 형질전환시켰다:

· C. 글루타미쿰 ATCC13032 ATCC13032 (Kinoshita et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 1957; 3(3): 193-205) 가 통상 사용되는 야생형 균주이다.

· C. 글루타미쿰 균주 ATCC21831 (Park et al., Nat Commun. 2014 Aug 5; 5:4618) 는 암모니아 및 글루코스와 같은 일차 기질로부터 L-아르기닌을 합성한다.

· ATCC13032__Psod-carAB 는 carAB 유전자의 업스트림 강한 sod 프로모터를 갖는 ATCC13032 의 변이체이다.

균주를 다양한 플라스미드 (표 10 에 나타낸 바와 같음) 로 전기천공함으로써 형질전환시켰다. 플라스미드 함유 세포를 25 mg/l 카나마이신으로 선별하였다.

표 10: 플라스미드-함유 C. 글루타미쿰 균주 목록

실시예 12: GAA 생산에 대한 AGAT 및 기질 이용능의 영향

균주 ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp (무레아 프로듀센스로부터의 AGAT 효소에 대한 유전자를 보유함) 및 ATCC13032/pEC-XK99E (대조군을 위한 빈 벡터) 를 Wouter Duetz 의 시스템 (상기 기재됨) 을 사용하여 배치 배양에서 GAA 를 생산하는 능력에 대해 분석하였다. 생산 배지 (PM) 는 40 g/l D-글루코스를 주 탄소원으로 함유하였다. 일부 배치에는 지시된 바와 같이 L-아르기닌 및/또는 글리신을 보충하였다.

표 11: 균주 ATCC13032/pEC-XK99E 및 ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp 에 의한 GAA 생산

표 11 에 나타낸 바와 같이, 대조군 균주 ATCC13032/pEC-XK99E 는 전구체 L-아르기닌 및 글리신을 제공하더라도 GAA 를 생산할 수 없었다. 본 발명자들은 그것이 본질적인 AGAT 활성을 가지지 않는다고 결론지었다. 균주 ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp 는 무레아 프로듀센스로부터의 추정 AGAT 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 이것은 보충되지 않은 PM 에서 25 mg/l GAA 를 생성하였다. 글리신의 보충은 31 mg/l GAA 로의 작은 증가를 초래하였다. 글리신 및 L-아르기닌의 보충은 GAA 생산을 124 mg/l 로 크게 증가시켰다.

실시예 13: 일차 기질로부터 GAA 의 생산

산업적 GAA 생산 공정에서, L-아르기닌의 보충은 암모니아, 우레아 및 글루코스와 같은 일차 기질과 비교할 때 오히려 비용이 많이 들 것이다. 따라서, 이러한 일차 기질로부터 직접 GAA 를 생성하는 것이 바람직할 것이다.

이를 위해, L-아르기닌 생산자 C. 글루타미쿰 ATCC21831 을:

· pEKEx2 (대조군을 위한 빈 벡터),

· pEKEx2_AGAT_Mp (무레아 프로듀센스 (Moorea producens) 로부터의 AGAT_Mp 유전자 함유),

· pEKEx2_AGAT_Hs (호모 사피엔스 (Homo sapiens) 로부터의 AGAT_Hs 유전자 함유),

· pEKEx2_AGAT_Rn (라투스 노르베지쿠스 (Rattus norvegicus) 로부터의 AGAT_Rn 유전자 함유),

· pEKEx2_AGAT_Gv (갈레옵테루스 바리에가투스 (Galeopterus variegatus), 및 로부터의 AGAT_Gv 유전자 함유) 및

· pEKEx2_AGAT_cyrA (실린드로스페르모프시스 라시보르스키 (Cylindrospermopsis raciborskii) 로부터의 AGAT_cyrA 유전자 함유)

로 형질전환시켰다.

ATCC21831 은 카나바닌 내성 돌연변이체로서 단리되었고, 이는 L-아르기닌을 생산하는 것으로 밝혀졌다. 이의 게놈은 Park et al. 에 의해 서열분석되었고 (Nat Commun. 2014 Aug 5;5:4618. doi: 10.1038/ncomms5618; accession number CP007722), 균주는 LGC 표준 (LGC Standards GmbH, Wesel, Germany) 으로부터 공개적으로 입수가능하다.

모든 형질전환된 ATCC21831 균주를 Wouter Duetz 의 시스템 (상기 기재됨) 을 사용하여 배치 배양에서 GAA 를 생산하는 그들의 능력에 대해 분석하였다. 생산 배지 (PM) 는 40 g/l D-글루코스를 주 탄소원으로 함유하였다. 일부 배치는 글리신 및/또는 L-아르기닌으로 보충되었다.

표 12: 1.5 g/l 효모 추출물을 갖는 CGAF 및 MOPS 배지에서 상이한 종으로부터의 AGAT 를 함유하는 pEKEx2 벡터로 형질전환된 ATCC21831 균주에 의한 GAA 생산

표 12 에 나타낸 바와 같이, ATCC21831/pEKEx2 는 심지어 전구체 L-아르기닌 및 글리신이 존재하는 경우에도, GAA 를 생산하지 않았다. 본 발명자들은 ATCC21831/ pEKEx2 가 본질적인 AGAT 활성을 가지지 않는다고 결론지었다. 형질전환된 균주 ATCC21831/ pEKEx2_AGAT_Mp, ATCC21831/pEKEx2_AGAT_Hs, ATCC21831/pEKEx2_AGAT_Rn, ATCC21831/pEKEx2_AGAT_Gv, 및 ATCC21831/pEKEx2_AGAT_cyrA 는 보충되지 않은 PM 에서 약 1 내지 26 mg/l GAA 를 생산하였다. 본 발명자들은 전구체 L-아르기닌 및 글리신이 일차 기질 D-글루코스, 암모늄 및 우레아로부터 합성되었다고 결론내렸다.

글리신을 첨가하였을 때, ATCC21831/pEKEx2_AGAT_Mp, ATCC21831/pEKEx2_AGAT_Hs, ATCC21831/pEKEx2_AGAT_Rn, ATCC21831/pEKEx2_AGAT_Gv, 및 ATCC21831/pEKEx2_AGAT_cyrA 의 GAA 생산은 보충되지 않은 실험에 비해 상당히 증가하였다. 균주 ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp (표 10 참조) 와 비교할 때, AGAT 유전자를 갖는 L-아르기닌 생산자 ATCC21831 은 글리신이 제한되지 않을 때 훨씬 더 많은 GAA 를 축적한다. 본 발명자들은 L-아르기닌을 내부적으로 제공하는 능력이 GAA 생산을 향상시킨다고 결론지었다.

실시예 14: GAA 생산에 대한 L-아르기닌 재생의 영향

L-아르기닌 생산 균주 (예를 들어, ATCC21831) 에서, 중간체 L-오르니틴을 드 노보로 합성하고, 추가로 L-아르기닌으로 전환시킨다. 이러한 균주에 AGAT 가 제공되는 경우, 효소는 동일한 몰량의 GAA 및 L-오르니틴을 생성할 것이다. L-오르니틴의 형성은 상당한 양의 일차 C- 및 N-공급원을 소비하고, 따라서 GAA 의 수율을 저하시킨다.

본 발명자들은 L-오르니틴으로부터 L-아르기닌에 이르는 생합성 경로의 향상이, 아마도 L-오르니틴의 L-아르기닌으로의 재순환을 개선함으로써, GAA 생산을 개선한다는 것을 발견하였다.

ATCC13032 로부터 유래된 다양한 균주를 Wouter Duetz 시스템을 사용하여 배양한 다음, GAA 를 생산하는 이들의 능력에 대해 분석하였다 (표 13, 14 및 15).

표 13: 글리신 또는 L-아르기닌 보충 없이 YE 를 포함하는 PM 에서의 GAA 생산에 대한 개선된 L-아르기닌 재생의 영향

표 14: YE 가 없는 PM 에서의 GAA 생산에 대한 개선된 L-아르기닌 재생의 영향 모든 배양물은 0.82 g/l 글리신으로 보충되었다

표 15: YE 를 포함하는 PM 에서의 GAA 생산에 대한 개선된 L-아르기닌 재생의 영향 모든 배양물은 0.82 g/l 글리신 및/또는 1.9 g/l L-아르기닌으로 보충되었다.

표 13 내지 15 에 나타낸 바와 같이, AGAT 유전자가 결여된 균주는 검출가능한 양의 GAA 를 생산하지 않았다.

ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp 에서 AGAT_Mp 의 발현은 124 mg/l GAA 를 생성하였다. argG (균주 ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp_argG), argF (균주 ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp_argF) 또는 argG+argH (균주 ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp_argGH) 의 추가적인 증폭은 GAA 의 생산을 개선시켰다 (표 14 참조).

균주 ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp_argFGH 에서, 유전자 argF (오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제를 코딩함), argG (아르기니노숙시네이트 신테타제를 코딩함) 및 argH (아르기니노숙시네이트 리아제를 코딩함) 의 발현이 향상된다. 이는 GAA 의 생산을 154 mg/l 로 추가로 개선시켰다 (표 14 참조).

오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제에 의해 촉매되는, L-오르니틴의 L-시트룰린으로의 전환은 공동-기질 카르바모일 포스페이트의 이용가능성에 의존한다. 카르바모일 포스페이트는 유전자 carA 및 carB 에 의해 인코딩되는 카르바모일 포스페이트 신타아제에 의해 생성된다. 균주 ATCC13032_Psod-carAB/pEC-XK99E_AGAT_Mp 에서, 강한 sod-프로모터의 게놈 삽입은 carA 및 carB 의 발현을 향상시킨다. ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp 와 비교할 때, 이는 개선된 GAA 생산 (156 mg/l 대 124 mg/l) 을 초래하였다.

균주 ATCC13032_Psod-carAB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_argFGH 에서, 개선된 L-오르니틴 전환 (argF, argG 및 argH 의 과발현) 을 개선된 카르바모일 포스페이트 생합성 (carA 및 carB 의 과발현) 과 조합하였다. 이러한 조합은 GAA 생산을 171 mg/l 로 추가로 개선시켰다.

실시예 15: 무레아 프로듀센스 유전자 AGAT_Mp 를 위한 P. 푸티다 발현 벡터의 구축

P. 푸티다 KT2440 에서 무레아 프로듀센스 (EC 2.1.4.1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:4) 로부터의 AGAT 의 이종 발현을 위해, 플라스미드 pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp)] 를 구축하였다. 코돈 최적화된 AGAT_Mp 유전자를 람노오스 유도성 프로모터 P_rha 의 제어 하에 벡터 pACYATh-5 내로 클로닝하였다. AGAT_Mp 유전자의 다운스트림에 터미네이터 서열이 위치한다. AGAT_Mp 유전자를 Eurofins Genomics Germany GmbH (Ebersberg, Germany) 로부터 유전자 합성을 위해 주문하고, 유전자 단편의 DNA 서열을 P. 푸티다 KT2440 에서의 발현을 위해 코돈-최적화하였다 (SEQ ID NO:33). 오픈 리딩 프레임의 업스트림에는 샤인-달가노 서열이 추가되었다. P_Rha 프로모터 카세트 (SEQ ID NO:34) 및 터미네이터 서열 (SEQ ID NO:35) 을 E. 콜라이 K12 게놈 DNA 로부터 증폭시켰다. 벡터는 pACYC184 (New England BioLabs Inc., Ipswich, USA) 에 기초하며 E. 콜라이에 대한 p15A 복제 기원 및 P. 푸티다 KT2440 에서의 복제를 위한 pVS1 복제 기원을 가지고 있다. pVS1 기원은 슈도모나스 플라스미드 pVS1 (Itoh Y, Watson JM, Haas D, Leisinger T, Plasmid 1984, 11(3), 206-20) 로부터 유래한다. 다음 단계에서, AGAT_Mp 유전자 단편을 프라이머 MW_20_01_fw (SEQ ID NO:36) 및 MW_20_02_rv (SEQ ID NO:37) 를 사용하는 PCR 을 통해 증폭시키고, 제한 부위 ApaI/XhoI 및 NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning Kit (New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. E5520 사제) 를 사용하여 벡터 pACYCATh-5 내로 클로닝하였다. 어셈블리된 생성물을 10-베타 전기적격 E. 콜라이 세포 (New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. C3020K) 내로 형질전환시켰다. PCR 정제, 클로닝 및 형질전환 절차는 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 표적 유전자의 정확한 삽입을 제한 분석에 의해 확인하고, 도입된 DNA 단편의 진위를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 생성된 발현 벡터를 pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp)] (SEQ ID NO:38, 표 17 참조) 로 명명하였다.

P. 푸티다 균주 KT2440 을 플라스미드 pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp)] 로 전기천공에 의해 형질전환하고, 테트라사이클린 (10 mg/l) 이 보충된 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 형질전환체를 플라스미드 제조 및 분석 제한 분석에 의해 정확한 플라스미드의 존재에 대해 체크하였다. 생성된 균주를 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp)] 로 명명하였다 (표 18 참조).

실시예 16: 무레아 프로듀센스 유전자 AGAT_Mp 및 P. 푸티다 유전자 argF, argG 및 argH 에 대한 P. 푸티다 발현 벡터의 구축

무레아 프로듀센스로부터의 AGAT_Mp 및 P. 푸티다 KT2440 로부터의 argF (SEQ ID NO:39), argG (SEQ ID NO:41), argH (SEQ ID NO:43) 의 이종 발현을 위해, 플라스미드 pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp) argFGH_Pp] 를 구축하였다. L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제 (AGAT, EC 2.1.4.1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:4) 를 인코딩하는 AGAT_Mp, 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제를 인코딩하는 argF (ArgF, EC 2.1.3.3, SEQ ID NO:40), 아르기니노숙시네이트 신타아제를 인코딩하는 argG (ArgG, E.C. 6.3.4.5, SEQ ID NO:42) 및 아르기니노숙시네이트 리아제를 인코딩하는 argH (ArgH, E.C. 4.3.2.1, SEQ ID NO:44) 로 각각 이루어진 합성 오페론을 람노오스 유도성 프로모터 P_rha 의 제어 하에 벡터 pACYCATh-5 내로 클로닝하였다. 합성 오페론의 다운스트림에 터미네이터 서열이 위치한다. AGAT_Mp 유전자를 Eurofins Genomics Germany GmbH (Ebersberg, Germany) 로부터 유전자 합성을 위해 주문하고, 유전자 단편의 DNA 서열을 P. 푸티다 KT2440 에서의 발현을 위해 코돈-최적화하였다. 유전자 argFGH 는 또한 유전자 단편 argFGH (SEQ ID NO: 45) 로서 합성되었다. P_Rha 프로모터 카세트 (SEQ ID NO:34) 및 터미네이터 서열 (SEQ ID NO:35) 을 E. 콜라이 K12 게놈 DNA 로부터 증폭시켰다. 벡터는 pACYC184 (New England BioLabs Inc., Ipswich, USA) 에 기초하며 E. 콜라이에 대한 p15A 복제 기원 및 P. 푸티다 KT2440 에서의 복제를 위한 pVS1 복제 기원을 가지고 있다. pVS1 기원은 슈도모나스 플라스미드 pVS1 (Itoh Y, Watson JM, Haas D, Leisinger T, Plasmid 1984, 11(3), 206-20) 로부터 유래한다. 클로닝을 위해, AGAT_Mp 및 argFGH 를 PCR 을 통해 증폭시켰다. 클로닝에 사용된 프라이머가 표 16 에 열거되어 있다. 최적화된 오페론을 생성하기 위해 제한 부위 ApaI/XhoI 및 NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning Kit (New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. E5520 사제) 를 사용하여 PCR 생성물을 벡터 pACYCATh-5 내에 클로닝하였다. 증폭을 위해 New England Biolabs (Ipswich, USA ) 로부터의 Phusion^TM High-Fidelity Master Mix 를 제조자의 매뉴얼에 따라 사용하였다. 어셈블리된 생성물을 10-베타 전기적격 E. 콜라이 세포 (New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. C3020K) 내로 형질전환시켰다. PCR 정제, 클로닝 및 형질전환 절차는 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 표적 유전자의 정확한 삽입을 제한 분석에 의해 확인하고, 도입된 DNA 단편의 진위를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 생성된 발현 벡터를 pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp) argFGH_Pp] (SEQ ID NO:49, 표 17 참조) 로 명명하였다.

P. 푸티다 균주 KT2440 을 플라스미드 pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp) argFGH_Pp] 로 전기천공에 의해 형질전환하고, 테트라사이클린 (10 mg/l) 이 보충된 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 형질전환체를 플라스미드 제조 및 분석 제한 분석에 의해 정확한 플라스미드의 존재에 대해 체크하였다. 생성된 균주를 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp) argFGH_Pp] 로 명명하였다 (표 18 참조).

표 16: AGAT_Mp 및 argFGH 의 pACYCATh-5 내로의 클로닝을 위해 사용된 프라이머.

실시예 17: P. 푸티다 KT2440 으로부터 유전자 carAB 의 발현 벡터 pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp) argFGH_Pp] 내로의 클로닝

무레아 프로듀센스로부터의 AGAT_Mp, P. 푸티다 KT2440 로부터의 argF (SEQ ID NO:39), argG (SEQ ID NO:41), argH (SEQ ID NO:43), carA (SEQ ID NO:50) 및 carB (SEQ ID NO:52) 의 이종 발현을 위해, 플라스미드 pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp) argFGH_Pp]{carAB_Pp}[carAB_Pp][ter] 를 구축하였다. 카르바모일-포스페이트 신타아제 (CarAB, EC 6.3.5.5, SEQ ID NO:51 및 SEQ ID NO:53) 를 인코딩하는 carA (SEQ ID NO:50) 및 carB 유전자 (SEQ ID NO:52) 를 프라이머 MW_20_35_fw (SEQ ID NO:54) 및 MW_20_36_rv (SEQ ID NO:55) 를 사용하여 PCR 을 통해 carAB 오페론의 고유의 프로모터를 포함하는 P. 푸티다 KT2440 의 게놈 DNA 로부터 증폭시켰다. 증폭을 위해 New England Biolabs (Ipswich, USA ) 로부터의 Phusion^TM High-Fidelity Master Mix 를 제조자의 매뉴얼에 따라 사용하였다. PCR 생성물 (SEQ ID NO:56) 을 NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning Kit (New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. E5520 사제) 를 사용하여 Bsu36I 로 절단된 pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp) argFGH_Pp] 내에 클로닝하였다. 어셈블리된 생성물을 10-베타 전기적격 E. 콜라이 세포 (New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. C3020K) 내로 형질전환시켰다. PCR 정제, 클로닝 및 형질전환 절차는 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 표적 유전자의 정확한 삽입을 제한 분석에 의해 확인하고, 도입된 DNA 단편의 진위를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 생성된 발현 벡터를 pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp) argFGH_Pp]{carAB_Pp}[carAB_Pp][ter] (SEQ ID NO:57, 표 17 참조) 로 명명하였다.

P. 푸티다 균주 KT2440 을 플라스미드 pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp) argFGH_Pp]{carAB_Pp}[carAB_Pp][ter] 로 전기천공에 의해 형질전환하고, 테트라사이클린 (10 mg/l) 이 보충된 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 형질전환체를 플라스미드 제조 및 분석 제한 분석에 의해 정확한 플라스미드의 존재에 대해 체크하였다. 생성된 균주를 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp) argFGH_Pp]{carAB_Pp}[carAB_Pp][ter] 로 명명하였다 (표 18 참조).

표 17: P. 푸티다 발현 플라스미드 목록

표 18: 플라스미드-함유 P. 푸티다 균주 목록

실시예 18: P. 푸티다 KT2440 에서의 GAA 생산에 대한 AGAT 의 영향

M. 프로듀센스로부터의 AGAT 효소에 대한 유전자를 운반하는 균주 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp)] 및 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5 (빈 벡터 대조군) 를 진탕 플라스크를 사용하여 배치 배양에서 GAA 를 생산하는 능력에 대해 분석하였다. 10 mg/l 테트라사이클린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서, 상응하는 균주의 글리세롤 동결배양물의 접종 루프를 스트리킹하였다. 아가 플레이트를 30℃ 에서 24 시간 동안 인큐베이션한다. 10 mg/l 테트라사이클린이 있는, 15 ml 의 종자 배지 (오토클레이브됨: 4.4 g/L Na₂HPO₄ x 2 H₂O, 1.5 g/L KH₂PO₄, 1 g/L NH₄Cl, 10 g/L 효모 추출물, 각각 멸균됨: 20 g/L 글루코스, 0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O, 0.006 g/L FeCl₃, 0.015 g/L CaCl₂, 1 ml/L 미량 원소 용액 SL6 (멸균-여과됨: 0.3 g/L H₃BO₃, 0.2 g/L CoCl₂ x 6 H₂O, 0.1 g/L ZnSO₄ x 7 H₂O, 0.03 g/L MnCl₂ x 4H₂O, 0.01 g/L CuCl₂ x 2 H₂O, 0.03 g/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 0.02 g/L NiCl₂ x 6 H₂O), pH　7) 를 함유하는 배플을 가진 100 ml 플라스크에 아가 플레이트의 단일 콜로니를 접종하고, 진탕 인큐베이터에서 18 시간 동안 30℃ 및 200 rpm 에서 인큐베이션하여, 예비배양물을 생산하였다. 예비배양물을 사용하여 10 mg/l 테트라사이클린, 3.48 g/l 아르기닌 및 1.5 g/l 글리신이 있는, 40 ml 의 M12 배지 (조성: (2.2 g/L (NH₄)₂SO₄, 0.02 g/L NaCl, 0.4 g/L MgSO₄ x 7H₂O, 0.04 g/L CaCl₂ x 2H₂O, 각각 멸균됨: 2 g/L KH₂PO₄, 8.51 g/L Na₂HPO₄, 20 g/L 그루코스, 10 ml/l 미량 원소 용액 M12 (멸균-여과됨: 0.2 g/L ZnSO₄ x 7 H₂O, 0.1 g/L MnCl₂ x 4H₂O, 1.5 g/L Na₃-시트레이트 x 2 H₂O, 0.1 g/L CuSO₄ x 5 H₂O, 0.002 g/L NiCl₂ x 6 H₂O, 0.003 g/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 0.03 g/L H₃BO₃, 1 g/L FeSO₄ x 7 H₂O), pH　7.4) 에 접종하고 0.1 의 OD₆₀₀ 을 시작하였다. 균주를 48 시간 동안 배양하였다. 대략 0.5-0.8 의 OD₆₀₀ 에서, 0.2% (w/v) 람노스를 첨가함으로써 유전자 발현을 유도하였다. 유도 9 시간 및 24 시간 후 1.74 g/l 아르기닌 및 0.75 g/l 글리신이 스파이킹되었다. 배양 종료시, 생성된 GAA 의 농도를 결정하기 위해 샘플을 취하였다.

결과는 표 19 에 제시된다.

표 19: 균주 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5 및 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp)] 에 의한 GAA 생산

표 19 에서 알 수 있는 바와 같이, M. 프로듀센스로부터의 AGAT_Mp 유전자가 장착된 균주 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp)] 는 약 81.5 mg/l GAA 를 생산할 수 있었다. 대조군 균주 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5 는 어떠한 GAA 도 전혀 생산할 수 없었다.

실시예 19: P. 푸티다 KT2440 에서 GAA 생산에 대한 AGAT 및 증가된 L-아르기닌 공급의 영향

M. 프로듀센스로부터의 AGAT 효소에 대한 유전자를 운반하는 균주 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp)] 및 아르기닌 생합성 유전자 argFGH 를 부가적으로 운반하는 균주 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp) argFGH_Pp] 를 진탕 플라스크를 사용하여 배치 배양에서 GAA 를 생산하는 능력에 대해 분석하였다. 10　mg/l 테트라사이클린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서, 상응하는 균주의 글리세롤 동결배양물의 접종 루프를 스트리킹하였다. 아가 플레이트를 30℃ 에서 24 시간 동안 인큐베이션한다. 10 mg/l 테트라사이클린이 있는, 15 ml 의 종자 배지 (오토클레이브됨: 4.4 g/L Na₂HPO₄ x 2 H₂O, 1.5 g/L KH₂PO₄, 1 g/L NH₄Cl, 10 g/L 효모 추출물, 각각 멸균됨: 20 g/L 글루코스, 0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O, 0.006 g/L FeCl₃, 0.015 g/L CaCl₂, 1 ml/L 미량 원소 용액 SL6 (멸균-여과됨: 0.3 g/L H₃BO₃, 0.2 g/L CoCl₂ x 6 H₂O, 0.1 g/L ZnSO₄ x 7 H₂O, 0.03 g/L MnCl₂ x 4H₂O, 0.01 g/L CuCl₂ x 2 H₂O, 0.03 g/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 0.02 g/L NiCl₂ x 6 H₂O), pH　7) 를 함유하는 배플을 가진 100 ml 플라스크에 아가 플레이트의 단일 콜로니를 접종하고, 진탕 인큐베이터에서 18 시간 동안 30℃ 및 200 rpm 에서 인큐베이션하여, 예비배양물을 생산하였다. 예비배양물을 사용하여 10 mg/l 테트라사이클린, 3.48 g/l 아르기닌 및 1.5 g/l 글리신이 있는, 40 ml 의 M12 배지 (조성: (2.2 g/L (NH₄)₂SO₄, 0.02 g/L NaCl, 0.4 g/L MgSO₄ x 7H₂O, 0.04 g/L CaCl₂ x 2H₂O, 각각 멸균됨: 2 g/L KH₂PO₄, 8.51 g/L Na₂HPO₄, 20 g/L 그루코스, 10 ml/l 미량 원소 용액 M12 (멸균-여과됨: 0.2 g/L ZnSO₄ x 7 H₂O, 0.1 g/L MnCl₂ x 4H₂O, 1.5 g/L Na₃-시트레이트 x 2 H₂O, 0.1 g/L CuSO₄ x 5 H₂O, 0.002 g/L NiCl₂ x 6 H₂O, 0.003 g/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 0.03 g/L H₃BO₃, 1 g/L FeSO₄ x 7 H₂O), pH　7.4) 에 접종하고 0.1 의 OD₆₀₀ 을 시작하였다. 균주를 48 시간 동안 배양하였다. 대략 0.5-0.8 의 OD₆₀₀ 에서, 0.2% (w/v) 람노스를 첨가함으로써 유전자 발현을 유도하였다. 유도 9 시간 및 24 시간 후 1.74 g/l 아르기닌 및 0.75 g/l 글리신이 스파이킹되었다. 배양 종료시, 생성된 GAA 의 농도를 결정하기 위해 샘플을 취하였다.

결과는 표 20 에 제시된다.

표 20: 균주 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp)] 및 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp) argFGH_Pp] 에 의한 GAA 생산

표 20 에서 알 수 있는 바와 같이, M. 프로듀센스로부터의 AGAT_Mp 유전자가 장착된 균주 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp)] 는 약 81.5 mg/l GAA 를 생산할 수 있었다. 부가적으로 균주 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp) argFGH_Pp] 에서 argF, argG 및 argH 의 구현은 GAA 생산을 169.5 mg/l 로 개선시켰다.

실시예 20: P. 푸티다 KT2440 에서 GAA 생산에 대한 AGAT 및 L-아르기닌 재생의 영향

M. 프로듀센스로부터의 AGAT 효소에 대한 유전자를 운반하는 균주 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp)], 아르기닌 생합성 유전자 argFGH 를 부가적으로 운반하는 균주 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp argFGH_Pp] 및 카르바모일-포스페이트 신타아제 유전자 carAB 를 부가적으로 운반하는 균주 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp) argFGH_Pp]{carAB_Pp}[carAB_Pp][ter] 를 진탕 플라스크를 사용하여 배치 배양에서 GAA 를 생산하는 능력에 대해 분석하였다. 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제에 의해 촉매되는, L-오르니틴의 L-시트룰린으로의 전환은 공동-기질 카르바모일 포스페이트의 이용가능성에 의존한다. 카르바모일 포스페이트는 유전자 carA 및 carB 에 의해 인코딩되는 카르바모일 포스페이트 신타아제에 의해 생성된다. 10 mg/l 테트라사이클린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서, 상응하는 균주의 글리세롤 동결배양물의 접종 루프를 스트리킹하였다. 아가 플레이트를 30℃ 에서 24 시간 동안 인큐베이션한다. 10 mg/l 테트라사이클린이 있는, 15 ml 의 종자 배지 (오토클레이브됨: 4.4 g/L Na₂HPO₄ x 2 H₂O, 1.5 g/L KH₂PO₄, 1 g/L NH₄Cl, 10 g/L 효모 추출물, 각각 멸균됨: 20 g/L 글루코스, 0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O, 0.006 g/L FeCl₃, 0.015 g/L CaCl₂, 1 ml/L 미량 원소 용액 SL6 (멸균-여과됨: 0.3 g/L H₃BO₃, 0.2 g/L CoCl₂ x 6 H₂O, 0.1 g/L ZnSO₄ x 7 H₂O, 0.03 g/L MnCl₂ x 4H₂O, 0.01 g/L CuCl₂ x 2 H₂O, 0.03 g/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 0.02 g/L NiCl₂ x 6 H₂O), pH　7) 를 함유하는 배플을 가진 100 ml 플라스크에 아가 플레이트의 단일 콜로니를 접종하고, 진탕 인큐베이터에서 18 시간 동안 30℃ 및 200 rpm 에서 인큐베이션하여, 예비배양물을 생산하였다. 예비배양물을 사용하여 10 mg/l 테트라사이클린, 3.48 g/l 아르기닌 및 1.5 g/l 글리신이 있는, 40 ml 의 M12 배지 (조성: (2.2 g/L (NH₄)₂SO₄, 0.02 g/L NaCl, 0.4 g/L MgSO₄ x 7H₂O, 0.04 g/L CaCl₂ x 2H₂O, 각각 멸균됨: 2 g/L KH₂PO₄, 8.51 g/L Na₂HPO₄, 20 g/L 그루코스, 10 ml/l 미량 원소 용액 M12 (멸균-여과됨: 0.2 g/L ZnSO₄ x 7 H₂O, 0.1 g/L MnCl₂ x 4H₂O, 1.5 g/L Na₃-시트레이트 x 2 H₂O, 0.1 g/L CuSO₄ x 5 H₂O, 0.002 g/L NiCl₂ x 6 H₂O, 0.003 g/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 0.03 g/L H₃BO₃, 1 g/L FeSO₄ x 7 H₂O), pH　7.4) 에 접종하고 0.1 의 OD₆₀₀ 을 시작하였다. 균주를 48 시간 동안 배양하였다. 대략 0.5-0.8 의 OD₆₀₀ 에서, 0.2% (w/v) 람노스를 첨가함으로써 유전자 발현을 유도하였다. 유도 후 4 시간 / 18 시간 / 23 시간에, 6.97 g/l Arg/1.5 g/l Gly, 2.34 g/L Arg/0.75 g/L Gly 및 6.97 g/l Arg/1.5 g/l Gly 가 스파이킹되었다. 배양 종료시, 생성된 GAA 의 농도를 결정하기 위해 샘플을 취하였다.

결과는 표 21 에 제시된다.

표 21: 균주 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp)], P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp) argFGH_Pp] 및 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp) argFGH_Pp]{carAB_Pp}[carAB_Pp][ter] 에 의한 GAA 생산

표 21 에서 알 수 있는 바와 같이, M. 프로듀센스로부터의 AGAT_Mp 유전자 및 P. 푸티다로부터의 argFGH 유전자가 장착된 균주는 589 mg/l GAA 를 생산할 수 있었다. 부가적으로 균주 P. 푸티다 KT2440/pACYCATh-5{PRha}[agat_Mp(coPp) argFGH_Pp]{carAB_Pp}[carAB_Pp][ter] 에서 carAB 의 구현은 GAA 생산을 693 mg/l 로 개선시켰다.

SEQUENCE LISTING <110> Evonik Operations GmbH <120> Method for the fermentative production of guanidinoacetic acid <130> 000 <160> 57 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1146 <212> DNA <213> Moorea producens strain PAL-8-15-08-1 <220> <221> CDS <222> (1)..(1143) <223> Genbank accession Number WP_070390602 <400> 1 atg tcg gaa aaa att gtt aat tcc tgg aat gaa tgg gat gaa ttg gaa 48 Met Ser Glu Lys Ile Val Asn Ser Trp Asn Glu Trp Asp Glu Leu Glu 1 5 10 15 gaa atg gtg gta gga att gca gac tat gct agc ttt gaa cca aaa gaa 96 Glu Met Val Val Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Ser Phe Glu Pro Lys Glu 20 25 30 cca ggg aat cat ccg aaa tta aga aat caa aat tta gcg gaa atc att 144 Pro Gly Asn His Pro Lys Leu Arg Asn Gln Asn Leu Ala Glu Ile Ile 35 40 45 cct ttc ccc agt gga cct aaa gac cct aaa gtc ctt gaa aaa gct aat 192 Pro Phe Pro Ser Gly Pro Lys Asp Pro Lys Val Leu Glu Lys Ala Asn 50 55 60 gaa gaa tta aat gga ctg gct tat tta tta aaa gac cac gat gtg ata 240 Glu Glu Leu Asn Gly Leu Ala Tyr Leu Leu Lys Asp His Asp Val Ile 65 70 75 80 gta aga aga ccc gaa aaa att gat ttt act aaa tct cta aaa aca cct 288 Val Arg Arg Pro Glu Lys Ile Asp Phe Thr Lys Ser Leu Lys Thr Pro 85 90 95 tac ttt gaa gtt gca aat caa tac tgt gga gtc tgt cct cgg gat gtc 336 Tyr Phe Glu Val Ala Asn Gln Tyr Cys Gly Val Cys Pro Arg Asp Val 100 105 110 atg att acc ttt ggg aat gaa atc atg gaa gcg act atg tcg aag aga 384 Met Ile Thr Phe Gly Asn Glu Ile Met Glu Ala Thr Met Ser Lys Arg 115 120 125 gct aga ttt ttt gaa tac tta cct tac cgg aaa ttg gtc tat gaa tat 432 Ala Arg Phe Phe Glu Tyr Leu Pro Tyr Arg Lys Leu Val Tyr Glu Tyr 130 135 140 tgg aat aaa gac gag cat atg att tgg aat gct gcg cct aaa ccg act 480 Trp Asn Lys Asp Glu His Met Ile Trp Asn Ala Ala Pro Lys Pro Thr 145 150 155 160 atg cag gat agt atg tat cta gag aat ttc tgg gag ctg tct tta gaa 528 Met Gln Asp Ser Met Tyr Leu Glu Asn Phe Trp Glu Leu Ser Leu Glu 165 170 175 gaa cga ttt aag cgt atg cat gat ttt gaa ttt tgt att aca caa gat 576 Glu Arg Phe Lys Arg Met His Asp Phe Glu Phe Cys Ile Thr Gln Asp 180 185 190 gaa gta att ttt gat gcg gct gac tgt agc aga tta gga aag gat ata 624 Glu Val Ile Phe Asp Ala Ala Asp Cys Ser Arg Leu Gly Lys Asp Ile 195 200 205 tta gtt cag gaa tcg atg aca aca aat aga aca gga att cgg tgg tta 672 Leu Val Gln Glu Ser Met Thr Thr Asn Arg Thr Gly Ile Arg Trp Leu 210 215 220 aaa aag cac cta gaa cca aga gga ttt cgg gtt cac cct gtt cat ttt 720 Lys Lys His Leu Glu Pro Arg Gly Phe Arg Val His Pro Val His Phe 225 230 235 240 ccc ctt gat ttt ttc ccc tca cac att gac tgt acg ttt gtt cct ttg 768 Pro Leu Asp Phe Phe Pro Ser His Ile Asp Cys Thr Phe Val Pro Leu 245 250 255 cga cca ggt ctt att ttg aca aac cct gaa aga cct ata cgg gaa gag 816 Arg Pro Gly Leu Ile Leu Thr Asn Pro Glu Arg Pro Ile Arg Glu Glu 260 265 270 gag gag aag att ttt aaa gag aat ggc tgg gag ttg atc aca gtt cct 864 Glu Glu Lys Ile Phe Lys Glu Asn Gly Trp Glu Leu Ile Thr Val Pro 275 280 285 caa ccg act tgc tcg aat gat gaa atg cca atg ttt tgc cag tcc agt 912 Gln Pro Thr Cys Ser Asn Asp Glu Met Pro Met Phe Cys Gln Ser Ser 290 295 300 aag tgg ttg tca atg aat gtt ctg agt ata tca ccg aca aag gtt atc 960 Lys Trp Leu Ser Met Asn Val Leu Ser Ile Ser Pro Thr Lys Val Ile 305 310 315 320 tgt gag gaa aga gaa aaa cct ctc caa gaa ttg ttg gat aag cat gga 1008 Cys Glu Glu Arg Glu Lys Pro Leu Gln Glu Leu Leu Asp Lys His Gly 325 330 335 ttt gag gtt ttt cct tta ccc ttt aga cat gtc ttt gaa ttt ggg ggg 1056 Phe Glu Val Phe Pro Leu Pro Phe Arg His Val Phe Glu Phe Gly Gly 340 345 350 tct ttt cat tgt gca act tgg gat att cgc cga aaa ggt gag tgt gaa 1104 Ser Phe His Cys Ala Thr Trp Asp Ile Arg Arg Lys Gly Glu Cys Glu 355 360 365 gat tat tta cca aat tta aac tat caa ccg att tgt ggt taa 1146 Asp Tyr Leu Pro Asn Leu Asn Tyr Gln Pro Ile Cys Gly 370 375 380 <210> 2 <211> 381 <212> PRT <213> Moorea producens strain PAL-8-15-08-1 <400> 2 Met Ser Glu Lys Ile Val Asn Ser Trp Asn Glu Trp Asp Glu Leu Glu 1 5 10 15 Glu Met Val Val Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Ser Phe Glu Pro Lys Glu 20 25 30 Pro Gly Asn His Pro Lys Leu Arg Asn Gln Asn Leu Ala Glu Ile Ile 35 40 45 Pro Phe Pro Ser Gly Pro Lys Asp Pro Lys Val Leu Glu Lys Ala Asn 50 55 60 Glu Glu Leu Asn Gly Leu Ala Tyr Leu Leu Lys Asp His Asp Val Ile 65 70 75 80 Val Arg Arg Pro Glu Lys Ile Asp Phe Thr Lys Ser Leu Lys Thr Pro 85 90 95 Tyr Phe Glu Val Ala Asn Gln Tyr Cys Gly Val Cys Pro Arg Asp Val 100 105 110 Met Ile Thr Phe Gly Asn Glu Ile Met Glu Ala Thr Met Ser Lys Arg 115 120 125 Ala Arg Phe Phe Glu Tyr Leu Pro Tyr Arg Lys Leu Val Tyr Glu Tyr 130 135 140 Trp Asn Lys Asp Glu His Met Ile Trp Asn Ala Ala Pro Lys Pro Thr 145 150 155 160 Met Gln Asp Ser Met Tyr Leu Glu Asn Phe Trp Glu Leu Ser Leu Glu 165 170 175 Glu Arg Phe Lys Arg Met His Asp Phe Glu Phe Cys Ile Thr Gln Asp 180 185 190 Glu Val Ile Phe Asp Ala Ala Asp Cys Ser Arg Leu Gly Lys Asp Ile 195 200 205 Leu Val Gln Glu Ser Met Thr Thr Asn Arg Thr Gly Ile Arg Trp Leu 210 215 220 Lys Lys His Leu Glu Pro Arg Gly Phe Arg Val His Pro Val His Phe 225 230 235 240 Pro Leu Asp Phe Phe Pro Ser His Ile Asp Cys Thr Phe Val Pro Leu 245 250 255 Arg Pro Gly Leu Ile Leu Thr Asn Pro Glu Arg Pro Ile Arg Glu Glu 260 265 270 Glu Glu Lys Ile Phe Lys Glu Asn Gly Trp Glu Leu Ile Thr Val Pro 275 280 285 Gln Pro Thr Cys Ser Asn Asp Glu Met Pro Met Phe Cys Gln Ser Ser 290 295 300 Lys Trp Leu Ser Met Asn Val Leu Ser Ile Ser Pro Thr Lys Val Ile 305 310 315 320 Cys Glu Glu Arg Glu Lys Pro Leu Gln Glu Leu Leu Asp Lys His Gly 325 330 335 Phe Glu Val Phe Pro Leu Pro Phe Arg His Val Phe Glu Phe Gly Gly 340 345 350 Ser Phe His Cys Ala Thr Trp Asp Ile Arg Arg Lys Gly Glu Cys Glu 355 360 365 Asp Tyr Leu Pro Asn Leu Asn Tyr Gln Pro Ile Cys Gly 370 375 380 <210> 3 <211> 1248 <212> DNA <213> synthetic DNA <220> <221> RBS <222> (49)..(52) <223> Shine-Dalgarno Sequence AGGA <220> <221> CDS <222> (58)..(1200) <223> open reading frame of optimized AGAT_Mp; protein is identical to genbank accession number WP_070390602 <400> 3 cgtctctgtg gataactgag cggataagtt cctagtacgc gtgcgagcag gaagaac 57 atg agc gag aaa att gtg aac agc tgg aat gaa tgg gat gaa ctg gaa 105 Met Ser Glu Lys Ile Val Asn Ser Trp Asn Glu Trp Asp Glu Leu Glu 1 5 10 15 gaa atg gtt gtt ggt att gca gat tat gca agc ttt gaa ccg aaa gaa 153 Glu Met Val Val Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Ser Phe Glu Pro Lys Glu 20 25 30 ccg ggt aat cat ccg aaa ctg cgt aat cag aat ctg gca gaa att att 201 Pro Gly Asn His Pro Lys Leu Arg Asn Gln Asn Leu Ala Glu Ile Ile 35 40 45 ccg ttt ccg agc ggt ccg aaa gat ccg aaa gtt ctg gaa aaa gca aat 249 Pro Phe Pro Ser Gly Pro Lys Asp Pro Lys Val Leu Glu Lys Ala Asn 50 55 60 gaa gaa ctg aat ggt ctg gcc tat ctg ctg aaa gat cat gat gtt att 297 Glu Glu Leu Asn Gly Leu Ala Tyr Leu Leu Lys Asp His Asp Val Ile 65 70 75 80 gtt cgc cgt ccg gaa aaa atc gac ttt acc aaa agc ctg aaa acc ccg 345 Val Arg Arg Pro Glu Lys Ile Asp Phe Thr Lys Ser Leu Lys Thr Pro 85 90 95 tat ttc gaa gtt gcc aat cag tat tgt ggt gtt tgt ccg cgt gat gtt 393 Tyr Phe Glu Val Ala Asn Gln Tyr Cys Gly Val Cys Pro Arg Asp Val 100 105 110 atg att acc ttt ggc aac gaa att atg gaa gcc acc atg agc aaa cgt 441 Met Ile Thr Phe Gly Asn Glu Ile Met Glu Ala Thr Met Ser Lys Arg 115 120 125 gcc cgt ttt ttt gaa tat ctg ccg tat cgt aaa ctg gtg tat gag tat 489 Ala Arg Phe Phe Glu Tyr Leu Pro Tyr Arg Lys Leu Val Tyr Glu Tyr 130 135 140 tgg aac aaa gat gag cat atg atc tgg aat gca gca ccg aaa ccg acc 537 Trp Asn Lys Asp Glu His Met Ile Trp Asn Ala Ala Pro Lys Pro Thr 145 150 155 160 atg cag gat agc atg tat ctg gaa aac ttt tgg gaa ctg agc ctg gaa 585 Met Gln Asp Ser Met Tyr Leu Glu Asn Phe Trp Glu Leu Ser Leu Glu 165 170 175 gaa cgt ttt aaa cgt atg cac gat ttt gag ttt tgc atc acc cag gat 633 Glu Arg Phe Lys Arg Met His Asp Phe Glu Phe Cys Ile Thr Gln Asp 180 185 190 gaa gtg att ttt gat gca gca gat tgt agc cgt ctg ggt aaa gat att 681 Glu Val Ile Phe Asp Ala Ala Asp Cys Ser Arg Leu Gly Lys Asp Ile 195 200 205 ctg gtt caa gaa agc atg acc acc aat cgt acc ggt att cgt tgg ctg 729 Leu Val Gln Glu Ser Met Thr Thr Asn Arg Thr Gly Ile Arg Trp Leu 210 215 220 aaa aaa cat ctg gaa ccg cgt ggt ttt cgt gtt cat ccg gtt cat ttt 777 Lys Lys His Leu Glu Pro Arg Gly Phe Arg Val His Pro Val His Phe 225 230 235 240 ccg ctg gat ttt ttt ccg agc cat att gat tgt acc ttt gtt ccg ctg 825 Pro Leu Asp Phe Phe Pro Ser His Ile Asp Cys Thr Phe Val Pro Leu 245 250 255 cgt ccg ggt ctg att ctg acc aat ccg gaa cgt ccg att cgt gaa gaa 873 Arg Pro Gly Leu Ile Leu Thr Asn Pro Glu Arg Pro Ile Arg Glu Glu 260 265 270 gaa gag aaa atc ttc aaa gag aat ggc tgg gag ctg att acc gtt ccg 921 Glu Glu Lys Ile Phe Lys Glu Asn Gly Trp Glu Leu Ile Thr Val Pro 275 280 285 cag ccg acc tgt agc aat gat gaa atg ccg atg ttt tgt cag agc agc 969 Gln Pro Thr Cys Ser Asn Asp Glu Met Pro Met Phe Cys Gln Ser Ser 290 295 300 aaa tgg ctg agc atg aat gtt ctg agc att agc ccg acc aaa gtt att 1017 Lys Trp Leu Ser Met Asn Val Leu Ser Ile Ser Pro Thr Lys Val Ile 305 310 315 320 tgt gaa gaa cgt gaa aaa ccg ctg caa gaa ctg ctg gat aaa cat ggt 1065 Cys Glu Glu Arg Glu Lys Pro Leu Gln Glu Leu Leu Asp Lys His Gly 325 330 335 ttt gaa gtg ttt ccg ctg ccg ttt cgt cat gtt ttt gaa ttt ggt ggt 1113 Phe Glu Val Phe Pro Leu Pro Phe Arg His Val Phe Glu Phe Gly Gly 340 345 350 agc ttt cat tgt gcc acc tgg gat att cgt cgt aaa ggt gaa tgt gaa 1161 Ser Phe His Cys Ala Thr Trp Asp Ile Arg Arg Lys Gly Glu Cys Glu 355 360 365 gat tat ctg ccg aat ctg aat tat cag ccg att tgt ggt taataagacg 1210 Asp Tyr Leu Pro Asn Leu Asn Tyr Gln Pro Ile Cys Gly 370 375 380 tccgcgaggg ccgtgttgcc ggtttcttca gagagacg 1248 <210> 4 <211> 381 <212> PRT <213> synthetic DNA <400> 4 Met Ser Glu Lys Ile Val Asn Ser Trp Asn Glu Trp Asp Glu Leu Glu 1 5 10 15 Glu Met Val Val Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Ser Phe Glu Pro Lys Glu 20 25 30 Pro Gly Asn His Pro Lys Leu Arg Asn Gln Asn Leu Ala Glu Ile Ile 35 40 45 Pro Phe Pro Ser Gly Pro Lys Asp Pro Lys Val Leu Glu Lys Ala Asn 50 55 60 Glu Glu Leu Asn Gly Leu Ala Tyr Leu Leu Lys Asp His Asp Val Ile 65 70 75 80 Val Arg Arg Pro Glu Lys Ile Asp Phe Thr Lys Ser Leu Lys Thr Pro 85 90 95 Tyr Phe Glu Val Ala Asn Gln Tyr Cys Gly Val Cys Pro Arg Asp Val 100 105 110 Met Ile Thr Phe Gly Asn Glu Ile Met Glu Ala Thr Met Ser Lys Arg 115 120 125 Ala Arg Phe Phe Glu Tyr Leu Pro Tyr Arg Lys Leu Val Tyr Glu Tyr 130 135 140 Trp Asn Lys Asp Glu His Met Ile Trp Asn Ala Ala Pro Lys Pro Thr 145 150 155 160 Met Gln Asp Ser Met Tyr Leu Glu Asn Phe Trp Glu Leu Ser Leu Glu 165 170 175 Glu Arg Phe Lys Arg Met His Asp Phe Glu Phe Cys Ile Thr Gln Asp 180 185 190 Glu Val Ile Phe Asp Ala Ala Asp Cys Ser Arg Leu Gly Lys Asp Ile 195 200 205 Leu Val Gln Glu Ser Met Thr Thr Asn Arg Thr Gly Ile Arg Trp Leu 210 215 220 Lys Lys His Leu Glu Pro Arg Gly Phe Arg Val His Pro Val His Phe 225 230 235 240 Pro Leu Asp Phe Phe Pro Ser His Ile Asp Cys Thr Phe Val Pro Leu 245 250 255 Arg Pro Gly Leu Ile Leu Thr Asn Pro Glu Arg Pro Ile Arg Glu Glu 260 265 270 Glu Glu Lys Ile Phe Lys Glu Asn Gly Trp Glu Leu Ile Thr Val Pro 275 280 285 Gln Pro Thr Cys Ser Asn Asp Glu Met Pro Met Phe Cys Gln Ser Ser 290 295 300 Lys Trp Leu Ser Met Asn Val Leu Ser Ile Ser Pro Thr Lys Val Ile 305 310 315 320 Cys Glu Glu Arg Glu Lys Pro Leu Gln Glu Leu Leu Asp Lys His Gly 325 330 335 Phe Glu Val Phe Pro Leu Pro Phe Arg His Val Phe Glu Phe Gly Gly 340 345 350 Ser Phe His Cys Ala Thr Trp Asp Ile Arg Arg Lys Gly Glu Cys Glu 355 360 365 Asp Tyr Leu Pro Asn Leu Asn Tyr Gln Pro Ile Cys Gly 370 375 380 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide <400> 5 ccgttaactg ccgagacaat cgcataaagg 30 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide <400> 6 ctcctaggct aatattctta cctcggctgg ttgg 34 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide <400> 7 ccgttaacac ggctggcaag gaactta 27 <210> 8 <211> 41 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide <400> 8 gccctaggtc aatattacag gccataaact aatgcttatc g 41 <210> 9 <211> 46 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide <400> 9 ggaaacagct atgacatgat tacgcggtta tcgcggaatc cgtatg 46 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> PsodcarAB-LA-R <400> 10 ttaagcgttt tgtgcaactc cgtct 25 <210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide <400> 11 agacggagtt gcacaaaacg cttaaaccct acttagctgc caattattcc 50 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide <400> 12 ggtaggtggt ggtgtcttta ctcatgggta aaaaatcctt tcgtaggttt 50 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide <400> 13 atgagtaaag acaccaccac ctacc 25 <210> 14 <211> 46 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide <400> 14 gttgtaaaac gacggccagt gccaccggtg atgtggttct tcactg 46 <210> 15 <211> 1176 <212> DNA <213> Cylindrospermopsis raciborskii AWT205 <220> <221> CDS <222> (1)..(1176) <223> genbank accession number EU140798.1 <400> 15 atg caa aca aga att gta aat agc tgg aat gag tgg gat gaa cta aag 48 Met Gln Thr Arg Ile Val Asn Ser Trp Asn Glu Trp Asp Glu Leu Lys 1 5 10 15 gag atg gtt gtc ggg att gca gat ggt gct tat ttt gaa cca act gag 96 Glu Met Val Val Gly Ile Ala Asp Gly Ala Tyr Phe Glu Pro Thr Glu 20 25 30 cca ggt aac cgc cct gct tta cgc gat aag aac att gcc aaa atg ttc 144 Pro Gly Asn Arg Pro Ala Leu Arg Asp Lys Asn Ile Ala Lys Met Phe 35 40 45 tct ttt ccc agg ggt ccg aaa aag caa gag gta aca gag aaa gct aat 192 Ser Phe Pro Arg Gly Pro Lys Lys Gln Glu Val Thr Glu Lys Ala Asn 50 55 60 gag gag ttg aat ggg ctg gta gcg ctt cta gaa tca cag ggc gta act 240 Glu Glu Leu Asn Gly Leu Val Ala Leu Leu Glu Ser Gln Gly Val Thr 65 70 75 80 gta cgc cgc cca gag aaa cat aac ttt ggc ctg tct gtg aag aca cca 288 Val Arg Arg Pro Glu Lys His Asn Phe Gly Leu Ser Val Lys Thr Pro 85 90 95 ttc ttt gag gta gag aat caa tat tgt gcg gtc tgc cca cgt gat gtt 336 Phe Phe Glu Val Glu Asn Gln Tyr Cys Ala Val Cys Pro Arg Asp Val 100 105 110 atg atc acc ttt ggg aac gaa att ctc gaa gca act atg tca cgg cgg 384 Met Ile Thr Phe Gly Asn Glu Ile Leu Glu Ala Thr Met Ser Arg Arg 115 120 125 tca cgc ttc ttt gag tat tta ccc tat cgc aaa cta gtc tat gaa tat 432 Ser Arg Phe Phe Glu Tyr Leu Pro Tyr Arg Lys Leu Val Tyr Glu Tyr 130 135 140 tgg cat aaa gat cca gat atg atc tgg aat gct gcg cct aaa ccg act 480 Trp His Lys Asp Pro Asp Met Ile Trp Asn Ala Ala Pro Lys Pro Thr 145 150 155 160 atg caa aat gcc atg tac cgc gaa gat ttc tgg gag tgt ccg atg gaa 528 Met Gln Asn Ala Met Tyr Arg Glu Asp Phe Trp Glu Cys Pro Met Glu 165 170 175 gat cga ttt gag agt atg cat gat ttt gag ttc tgc gtc acc cag gat 576 Asp Arg Phe Glu Ser Met His Asp Phe Glu Phe Cys Val Thr Gln Asp 180 185 190 gag gtg att ttt gac gca gca gac tgt agc cgc ttt ggc cgt gat att 624 Glu Val Ile Phe Asp Ala Ala Asp Cys Ser Arg Phe Gly Arg Asp Ile 195 200 205 ttt gtg cag gag tca atg acg act aat cgt gca ggg att cgc tgg ctc 672 Phe Val Gln Glu Ser Met Thr Thr Asn Arg Ala Gly Ile Arg Trp Leu 210 215 220 aaa cgg cat tta gag ccg cgt cgc ttc cgc gtg cat gat att cac ttc 720 Lys Arg His Leu Glu Pro Arg Arg Phe Arg Val His Asp Ile His Phe 225 230 235 240 cca cta gat att ttc cca tcc cac att gat tgt act ttt gtc ccc tta 768 Pro Leu Asp Ile Phe Pro Ser His Ile Asp Cys Thr Phe Val Pro Leu 245 250 255 gca cct ggg gtt gtg tta gtg aat cca gat cgc ccc atc aaa gag ggt 816 Ala Pro Gly Val Val Leu Val Asn Pro Asp Arg Pro Ile Lys Glu Gly 260 265 270 gaa gag aaa ctc ttc atg gat aac ggt tgg caa ttc atc gaa gca ccc 864 Glu Glu Lys Leu Phe Met Asp Asn Gly Trp Gln Phe Ile Glu Ala Pro 275 280 285 ctc ccc act tcc acc gac gat gag atg cct atg ttc tgc cag tcc agt 912 Leu Pro Thr Ser Thr Asp Asp Glu Met Pro Met Phe Cys Gln Ser Ser 290 295 300 aag tgg ttg gcg atg aat gtg tta agc att tcc ccc aag aag gtc atc 960 Lys Trp Leu Ala Met Asn Val Leu Ser Ile Ser Pro Lys Lys Val Ile 305 310 315 320 tgt gaa gag caa gag cat ccg ctt cat gag ttg cta gat aaa cac ggc 1008 Cys Glu Glu Gln Glu His Pro Leu His Glu Leu Leu Asp Lys His Gly 325 330 335 ttt gag gtc tat cca att ccc ttt cgc aat gtc ttt gag ttt ggc ggt 1056 Phe Glu Val Tyr Pro Ile Pro Phe Arg Asn Val Phe Glu Phe Gly Gly 340 345 350 tcg ctc cat tgt gcc acc tgg gat atc cat cgc acg gga acc tgt gag 1104 Ser Leu His Cys Ala Thr Trp Asp Ile His Arg Thr Gly Thr Cys Glu 355 360 365 gat tac ttc cct aaa cta aac tat acg ccg gta act gca tca acc aat 1152 Asp Tyr Phe Pro Lys Leu Asn Tyr Thr Pro Val Thr Ala Ser Thr Asn 370 375 380 ggc gtt tct cgc ttc atc att tag 1176 Gly Val Ser Arg Phe Ile Ile 385 390 <210> 16 <211> 391 <212> PRT <213> Cylindrospermopsis raciborskii AWT205 <400> 16 Met Gln Thr Arg Ile Val Asn Ser Trp Asn Glu Trp Asp Glu Leu Lys 1 5 10 15 Glu Met Val Val Gly Ile Ala Asp Gly Ala Tyr Phe Glu Pro Thr Glu 20 25 30 Pro Gly Asn Arg Pro Ala Leu Arg Asp Lys Asn Ile Ala Lys Met Phe 35 40 45 Ser Phe Pro Arg Gly Pro Lys Lys Gln Glu Val Thr Glu Lys Ala Asn 50 55 60 Glu Glu Leu Asn Gly Leu Val Ala Leu Leu Glu Ser Gln Gly Val Thr 65 70 75 80 Val Arg Arg Pro Glu Lys His Asn Phe Gly Leu Ser Val Lys Thr Pro 85 90 95 Phe Phe Glu Val Glu Asn Gln Tyr Cys Ala Val Cys Pro Arg Asp Val 100 105 110 Met Ile Thr Phe Gly Asn Glu Ile Leu Glu Ala Thr Met Ser Arg Arg 115 120 125 Ser Arg Phe Phe Glu Tyr Leu Pro Tyr Arg Lys Leu Val Tyr Glu Tyr 130 135 140 Trp His Lys Asp Pro Asp Met Ile Trp Asn Ala Ala Pro Lys Pro Thr 145 150 155 160 Met Gln Asn Ala Met Tyr Arg Glu Asp Phe Trp Glu Cys Pro Met Glu 165 170 175 Asp Arg Phe Glu Ser Met His Asp Phe Glu Phe Cys Val Thr Gln Asp 180 185 190 Glu Val Ile Phe Asp Ala Ala Asp Cys Ser Arg Phe Gly Arg Asp Ile 195 200 205 Phe Val Gln Glu Ser Met Thr Thr Asn Arg Ala Gly Ile Arg Trp Leu 210 215 220 Lys Arg His Leu Glu Pro Arg Arg Phe Arg Val His Asp Ile His Phe 225 230 235 240 Pro Leu Asp Ile Phe Pro Ser His Ile Asp Cys Thr Phe Val Pro Leu 245 250 255 Ala Pro Gly Val Val Leu Val Asn Pro Asp Arg Pro Ile Lys Glu Gly 260 265 270 Glu Glu Lys Leu Phe Met Asp Asn Gly Trp Gln Phe Ile Glu Ala Pro 275 280 285 Leu Pro Thr Ser Thr Asp Asp Glu Met Pro Met Phe Cys Gln Ser Ser 290 295 300 Lys Trp Leu Ala Met Asn Val Leu Ser Ile Ser Pro Lys Lys Val Ile 305 310 315 320 Cys Glu Glu Gln Glu His Pro Leu His Glu Leu Leu Asp Lys His Gly 325 330 335 Phe Glu Val Tyr Pro Ile Pro Phe Arg Asn Val Phe Glu Phe Gly Gly 340 345 350 Ser Leu His Cys Ala Thr Trp Asp Ile His Arg Thr Gly Thr Cys Glu 355 360 365 Asp Tyr Phe Pro Lys Leu Asn Tyr Thr Pro Val Thr Ala Ser Thr Asn 370 375 380 Gly Val Ser Arg Phe Ile Ile 385 390 <210> 17 <211> 1272 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1272) <223> codes for NP_001473.1 <220> <221> transit_peptide <222> (1)..(111) <223> mitochondrial localisation signal peptide <400> 17 atg ctg cgg gtg cgg tgt ctg cgc ggc ggg agc cgc ggc gcc gag gcg 48 Met Leu Arg Val Arg Cys Leu Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Glu Ala 1 5 10 15 gtg cac tac atc gga tct cgg ctt gga cga acc ttg aca gga tgg gtg 96 Val His Tyr Ile Gly Ser Arg Leu Gly Arg Thr Leu Thr Gly Trp Val 20 25 30 cag cga act ttc cag agc acc cag gca gct acg gct tcc tcc cgg aac 144 Gln Arg Thr Phe Gln Ser Thr Gln Ala Ala Thr Ala Ser Ser Arg Asn 35 40 45 tcc tgt gca gct gac gac aaa gcc act gag cct ctg ccc aag gac tgc 192 Ser Cys Ala Ala Asp Asp Lys Ala Thr Glu Pro Leu Pro Lys Asp Cys 50 55 60 cct gtc tct tct tac aac gaa tgg gac ccc tta gag gaa gtg ata gtg 240 Pro Val Ser Ser Tyr Asn Glu Trp Asp Pro Leu Glu Glu Val Ile Val 65 70 75 80 ggc aga gca gaa aac gcc tgt gtt cca ccg ttc acc atc gag gtg aag 288 Gly Arg Ala Glu Asn Ala Cys Val Pro Pro Phe Thr Ile Glu Val Lys 85 90 95 gcc aac aca tat gaa aag tac tgg cca ttt tac cag aag caa gga ggg 336 Ala Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Trp Pro Phe Tyr Gln Lys Gln Gly Gly 100 105 110 cat tat ttt ccc aaa gat cat ttg aaa aag gct gtt gct gaa att gaa 384 His Tyr Phe Pro Lys Asp His Leu Lys Lys Ala Val Ala Glu Ile Glu 115 120 125 gaa atg tgc aat att tta aaa acg gaa gga gtg aca gta agg agg cct 432 Glu Met Cys Asn Ile Leu Lys Thr Glu Gly Val Thr Val Arg Arg Pro 130 135 140 gac ccc att gac tgg tca ttg aag tat aaa act cct gat ttt gag tct 480 Asp Pro Ile Asp Trp Ser Leu Lys Tyr Lys Thr Pro Asp Phe Glu Ser 145 150 155 160 acg ggt tta tac agt gca atg cct cga gac atc ctg ata gtt gtg ggc 528 Thr Gly Leu Tyr Ser Ala Met Pro Arg Asp Ile Leu Ile Val Val Gly 165 170 175 aat gag att atc gag gct ccc atg gca tgg cgt tca cgc ttc ttt gag 576 Asn Glu Ile Ile Glu Ala Pro Met Ala Trp Arg Ser Arg 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370 375 380 Lys Leu Gly Ile Ser Thr Ile Lys Val Asn Ile Arg Asn Ala Asn Ser 385 390 395 400 Leu Gly Gly Gly Phe His Cys Trp Thr Cys Asp Val Arg Arg Arg Gly 405 410 415 Thr Leu Gln Ser Tyr Phe Asp 420 <210> 22 <211> 375 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 22 Met Thr Asp Val Thr Ile Lys Ala Thr His Pro Leu Pro Lys Asp Cys 1 5 10 15 Pro Val Ser Ser Tyr Asn Glu Trp Asp Pro Leu Glu Glu Val Ile Val 20 25 30 Gly Arg Ala Glu Asn Ala Cys Val Pro Pro Phe Thr Val Glu Val Lys 35 40 45 Ala Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Trp Pro Phe Tyr Gln Lys Asn Gly Gly 50 55 60 Leu Tyr Phe Pro Lys Asp His Leu Lys Lys Ala Val Ala Glu Val Glu 65 70 75 80 Glu Met Cys Asn Ile Leu Ser Met Glu Gly Val Thr Val Lys Arg Pro 85 90 95 Asp Pro Ile Asp Trp Ser Leu Lys Tyr Lys Thr Pro Asp Phe Glu Ser 100 105 110 Thr Gly Leu Tyr Ser Ala Met Pro Arg Asp Ile Leu Met Val Val Gly 115 120 125 Asn Glu Ile Ile Glu Ala Pro Met Ala Trp Arg Ser Arg Phe Phe Glu 130 135 140 Tyr Arg Ala Tyr Arg Ser Ile Ile Lys Asp Tyr Phe His Arg Gly Ala 145 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<213> Cylindrospermopsis raciborskii AWT205 <220> <221> RBS <222> (49)..(52) <223> Shine-Dalgarno-Sequence <220> <221> CDS <222> (58)..(1230) <400> 25 cgtctctgtg gataactgag cggataagtt cctagtacgc gtgcgagcag gaagaac 57 atg cag acc cgt att gtt aat agc tgg aat gaa tgg gat gag ctg aaa 105 Met Gln Thr Arg Ile Val Asn Ser Trp Asn Glu Trp Asp Glu Leu Lys 1 5 10 15 gaa atg gtt gtt ggt att gca gat ggt gcc tat ttt gaa ccg acc gaa 153 Glu Met Val Val Gly Ile Ala Asp Gly Ala Tyr Phe Glu Pro Thr Glu 20 25 30 ccg ggt aat cgt ccg gca ctg cgt gat aaa aac att gca aaa atg ttt 201 Pro Gly Asn Arg Pro Ala Leu Arg Asp Lys Asn Ile Ala Lys Met Phe 35 40 45 agc ttt ccg cgt ggt ccg aaa aaa caa gaa gtt acc gaa aaa gcc aac 249 Ser Phe Pro Arg Gly Pro Lys Lys Gln Glu Val Thr Glu Lys Ala Asn 50 55 60 gaa gaa ctg aat ggt ctg gtt gca ctg ctg gaa agc cag ggt gtt acc 297 Glu Glu Leu Asn Gly Leu Val Ala Leu Leu Glu Ser Gln Gly Val Thr 65 70 75 80 gtt cgt cgt ccg gaa aaa cac aat ttt ggt ctg agc gtt aaa acc ccg 345 Val Arg Arg Pro Glu Lys His Asn Phe Gly Leu Ser Val Lys Thr Pro 85 90 95 ttt ttt gaa gtg gaa aat cag tat tgt gca gtg tgt ccg cgt gat gtt 393 Phe Phe Glu Val Glu Asn Gln Tyr Cys Ala Val Cys Pro Arg Asp Val 100 105 110 atg att acc ttt ggt aac gaa att ctg gaa gca acc atg agc cgt cgt 441 Met Ile Thr Phe Gly Asn Glu Ile Leu Glu Ala Thr Met Ser Arg Arg 115 120 125 agc cgt ttt ttt gaa tat ctg ccg tat cgt aaa ctg gtg tat gag tat 489 Ser Arg Phe Phe Glu Tyr Leu Pro Tyr Arg Lys Leu Val Tyr Glu Tyr 130 135 140 tgg cat aaa gat ccg gat atg att tgg aat gca gca ccg aaa ccg acc 537 Trp His Lys Asp Pro Asp Met Ile Trp Asn Ala Ala Pro Lys Pro Thr 145 150 155 160 atg cag aat gca atg tat cgt gaa gat ttt tgg gaa tgc ccg atg gaa 585 Met Gln Asn Ala Met Tyr Arg Glu Asp Phe Trp Glu Cys Pro Met Glu 165 170 175 gat cgt ttt gaa agc atg cac gat ttt gaa ttt tgc gtg acc cag gat 633 Asp Arg Phe Glu Ser Met His Asp Phe Glu Phe Cys Val Thr Gln Asp 180 185 190 gaa gtg att ttt gat gca gca gat tgc agc cgt ttt ggt cgt gat att 681 Glu Val Ile Phe Asp Ala Ala Asp Cys Ser Arg Phe Gly Arg Asp Ile 195 200 205 ttt gtt caa gaa agc atg acc acc aat cgt gca ggt att cgc tgg ctg 729 Phe Val Gln Glu Ser Met Thr Thr Asn Arg Ala Gly Ile Arg Trp Leu 210 215 220 aaa cgt cat ctg gaa ccg cgt cgt ttt cgt gtt cat gat att cat ttt 777 Lys Arg His Leu Glu Pro Arg Arg Phe Arg Val His Asp Ile His Phe 225 230 235 240 ccg ctg gat att ttt ccg agc cat att gat tgt acc ttt gtt ccg ctg 825 Pro Leu Asp Ile Phe Pro Ser His Ile Asp Cys Thr Phe Val Pro Leu 245 250 255 gca ccg ggt gtt gtt ctg gtt aat ccg gat cgt ccg att aaa gaa ggt 873 Ala Pro Gly Val Val Leu Val Asn Pro Asp Arg Pro Ile Lys Glu Gly 260 265 270 gaa gaa aaa ctg ttt atg gac aac ggc tgg cag ttt att gaa gca ccg 921 Glu Glu Lys Leu Phe Met Asp Asn Gly Trp Gln Phe Ile Glu Ala Pro 275 280 285 ctg ccg acc agc acc gat gat gaa atg ccg atg ttt tgt cag agc agc 969 Leu Pro Thr Ser Thr Asp Asp Glu Met Pro Met Phe Cys Gln Ser Ser 290 295 300 aaa tgg ctg gcc atg aat gtt ctg agc att agc ccg aaa 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gcg acg gag ccg ctg ccg aag gat tgc 109 Met Thr Asp Val Thr Ile Lys Ala Thr Glu Pro Leu Pro Lys Asp Cys 1 5 10 15 ccg gtt agc tct tat aat gag tgg gat ccg ttg gag gag gtt atc gtg 157 Pro Val Ser Ser Tyr Asn Glu Trp Asp Pro Leu Glu Glu Val Ile Val 20 25 30 ggc cgc gcg gag aac gcc tgt gtt cct cca ttc act atc gag gtg aag 205 Gly Arg Ala Glu Asn Ala Cys Val Pro Pro Phe Thr Ile Glu Val Lys 35 40 45 gcc aac act tat gaa aag tac tgg ccg ttc tac cag aag caa gga ggt 253 Ala Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Trp Pro Phe Tyr Gln Lys Gln Gly Gly 50 55 60 cat tac ttc cct aag gat cat ctg aaa aaa gcg gta gcc gaa att gag 301 His Tyr Phe Pro Lys Asp His Leu Lys Lys Ala Val Ala Glu Ile Glu 65 70 75 80 gag atg tgc aac atc ctg aaa acg gaa ggc gtg acc gtc cgt cgc ccg 349 Glu Met Cys Asn Ile Leu Lys Thr Glu Gly Val Thr Val Arg Arg Pro 85 90 95 gat ccc att gac tgg tca ttg aag tat aaa acc ccg gac ttc gaa agc 397 Asp Pro Ile Asp Trp Ser Leu Lys Tyr Lys Thr Pro Asp Phe Glu Ser 100 105 110 acg ggt ctt tat tca gcc atg ccg cgt gat atc ctg atc gtt gtt ggt 445 Thr Gly Leu Tyr Ser Ala Met Pro Arg Asp Ile Leu Ile Val Val Gly 115 120 125 aat gaa att att gaa gcc cct atg gcc tgg cgg agc cgc ttc ttc gag 493 Asn Glu Ile Ile Glu Ala Pro Met Ala Trp Arg Ser Arg Phe Phe Glu 130 135 140 tac cgt gct tat cgg tct att atc aaa gat tac ttc cat cgt ggt gca 541 Tyr Arg Ala Tyr Arg Ser Ile Ile Lys Asp Tyr Phe His Arg Gly Ala 145 150 155 160 aaa tgg acg act gct cct aag cca acc atg gca gac gag ttg tac aac 589 Lys Trp Thr Thr Ala Pro Lys Pro Thr Met Ala Asp Glu Leu Tyr Asn 165 170 175 cag gat tac cct atc cat tca gtc gaa gac cgc cac aag ctg gca gca 637 Gln Asp Tyr Pro Ile His Ser Val Glu Asp Arg His Lys Leu Ala Ala 180 185 190 cag ggt aaa ttt gtc acg act gag ttc gaa ccc tgc ttc gat gct gcc 685 Gln Gly Lys Phe Val Thr Thr Glu Phe Glu Pro Cys Phe Asp Ala Ala 195 200 205 gac ttt att cgt gcc gga cgg gat att ttc gca caa cgc tcg caa gta 733 Asp Phe Ile Arg Ala Gly Arg Asp Ile Phe Ala Gln Arg Ser Gln Val 210 215 220 act aac tac ctc ggc 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gct cca aag cct acg atg gct gac gag ctt tac gat 589 Lys Trp Thr Thr Ala Pro Lys Pro Thr Met Ala Asp Glu Leu Tyr Asp 165 170 175 caa gat tac ccc att cat tcg gtt gaa gac cgt cac aaa ttg gcg gca 637 Gln Asp Tyr Pro Ile His Ser Val Glu Asp Arg His Lys Leu Ala Ala 180 185 190 caa gga aaa ttc gtt acg act gag ttc gag cct tgc ttt gac gcc gcc 685 Gln Gly Lys Phe Val Thr Thr Glu Phe Glu Pro Cys Phe Asp Ala Ala 195 200 205 gat ttt att cgg gct ggc cgc gac atc ttc gca cag cgt tca caa gta 733 Asp Phe Ile Arg Ala Gly Arg Asp Ile Phe Ala Gln Arg Ser Gln Val 210 215 220 acc aac tac ttg gga atc gag tgg atg cgt cgg cac ctt gcc cca gat 781 Thr Asn Tyr Leu Gly Ile Glu Trp Met Arg Arg His Leu Ala Pro Asp 225 230 235 240 tac cgg gtc cat atc att tca ttt aaa gat ccc aac ccg atg cac att 829 Tyr Arg Val His Ile Ile Ser Phe Lys Asp Pro Asn Pro Met His Ile 245 250 255 gac gct acc ttc aat att att gga cca gga ctg gta ctc tca aac cct 877 Asp Ala Thr Phe Asn Ile Ile Gly Pro Gly Leu Val Leu Ser Asn Pro 260 265 270 gat 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Phe Tyr Gln Lys His Gly Gly 50 55 60 His Tyr Phe Pro Lys Asp His Leu Lys Lys Ala Val Ala Glu Ile Glu 65 70 75 80 Glu Met Cys Asn Ile Leu Lys Met Glu Gly Val Thr Val Arg Arg Pro 85 90 95 Asp Pro Ile Asp Trp Ser Leu Lys Tyr Lys Thr Pro Asp Phe Glu Ser 100 105 110 Thr Gly Leu Tyr Gly Ala Met Pro Arg Asp Ile Leu Ile Val Val Gly 115 120 125 Asn Glu Ile Ile Glu Ala Pro Met Ala Trp Arg Ala Arg Phe Phe Glu 130 135 140 Tyr Arg Ala Tyr Arg Ser Ile Ile Lys Asp Tyr Phe His Arg Gly Ala 145 150 155 160 Lys Trp Thr Thr Ala Pro Lys Pro Thr Met Ala Asn Glu Leu Tyr Asp 165 170 175 Gln Asp Tyr Pro Ile Tyr Thr Val Glu Asp Arg His Lys Leu Ala Ala 180 185 190 Gln Gly Lys Phe Val Thr Thr Glu Phe Glu Pro Cys Phe Asp Ala Ala 195 200 205 Asp Phe Ile Arg Ala Gly Arg Asp Ile Phe Ala Gln Arg Ser Gln Val 210 215 220 Thr Asn Tyr Leu Gly Ile Glu Trp Met Arg Arg His Leu Ala Pro Asp 225 230 235 240 Tyr Arg Val His Ile Val Ser Phe Lys Asp Pro Asn Pro Met His Ile 245 250 255 Asp Ala Thr Phe Asn Ile Ile Gly Pro Gly Leu Val Leu Ser Asn Pro 260 265 270 Asp Arg Pro Cys His Gln Ile Asp Leu Phe Lys Lys Ala Gly Trp Thr 275 280 285 Ile Ile Thr Pro Pro Ile Pro Val Ile Pro Asp Asp His Pro Leu Trp 290 295 300 Met Ser Ser Lys Trp Leu Ser Met Asn Val Leu Met Leu Asp Glu Lys 305 310 315 320 Arg Val Met Val Asp Ala Asn Glu Val Pro Ile Gln Lys Met Phe Gly 325 330 335 Lys Leu Gly Ile Ser Thr Ile Lys Val Asn Ile Arg Asn Ala Asn Ser 340 345 350 Leu Gly Gly Gly Phe His Cys Trp Thr Cys Asp Val Arg Arg Arg Gly 355 360 365 Thr Leu Gln Ser Tyr Phe Asp 370 375 <210> 33 <211> 1211 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 33 tctagagatc cgcgggggcc caggaggggg gatctggcat ttttgggagg tgtgaaatga 60 gtgagaagat cgtcaactcg tggaacgaat gggatgagct cgaggagatg gtggtcggca 120 ttgcggacta tgccagcttc gaaccgaaag agccaggcaa ccatcccaaa ctgcgcaacc 180 agaacctggc cgaaatcatc cccttcccaa gcggcccaaa ggacccgaag gtgctggaga 240 aagcgaacga agagctgaat gggctggctt acctgctgaa ggaccacgat gtgatcgtgc 300 gtcgtcccga gaagatcgac ttcaccaaga gcctgaaaac cccgtatttc 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agaagacatg tggcgctgga gtgtctcgcc 13620 tgagaatgcc ccggaccagg ctacctacat cgagctgacc taccgcaatg gtgacatcgt 13680 tgccatcgac ggcgtcgaga aatccccggc caccgtcctg gcagacctga accgtatcgg 13740 tggtgccaac ggcatcggcc gtctggacat cgtcgaaaac cgttacgtcg gcatgaagtc 13800 gcgcggttgc tacgaaacgc ctggcggtac catcatgctc aaggcacacc gtgccatcga 13860 gtcgatcacc ctggaccgcg aagtcgctca cctgaaagat gagctgatgc caaagtatgc 13920 cagcctgatc tacaccggct actggtggag cccggagcgt ctgatgctgc aacagatgat 13980 cgatgcttcg caggtcaacg tgaatggtgt ggtgcgcctg aaactgtaca agggcaacgt 14040 gaccgtggtt ggccgcaagt cggacgattc gctgttcgat gccaacatcg ccacctttga 14100 agaagatggt ggtgcctaca accaggcaga tgctgctggc ttcatcaagc tcaatgcact 14160 gcgtatgcgc attgccgcca acaagggccg ttcgctgctc tgattgctat cgacgccact 14220 ttttcgttca cgcctgcaat gagtgaatcc atgagcaccg agaagaccaa tcagtcctgg 14280 ggcggccgct tcagtgagcc cgtcgacgcc ttcgtcgccc gtttcaccgc ctcggtagat 14340 ttcgacaagc gcctgtaccg tcacgacatc atgggttcga ttgcccatgc caccatgctg 14400 gcgcaggtcg gcgtgctcag tgatgccgag cgcgacacca tcatcgatgg cctgaaaacc 14460 atccagggcg agattgaagc cggcaacttc gactggcgtg tcgacctcga agacgtgcac 14520 atgaacatcg aagcacgcct gaccgaccgc atcggcatca ccggcaagaa gctgcatact 14580 gggcgtagcc gcaacgacca ggtggccacc gacatccgcc tttggctgcg cgacgaaatc 14640 gacctgatcc tgggcgaaat cacccgcctg cagcagggcc tgctggagca ggcagagcgt 14700 gaagccgaaa ccatcatgcc tggtttcacc cacctgcaga cggcgcagcc ggtcaccttt 14760 ggccaccacc tgctggcgtg gttcgaaatg ctcagccgcg actatgagcg cctggtcgac 14820 tgccgcaagc gcaccaaccg catgccactg ggcagcgccg cgctggccgg caccacctac 14880 ccgatcgacc gtgaactgac ctgcaagctg ctgggctttg aagccgtggc cggcaactcg 14940 ctggatggcg tgtcggaccg tgatttcgcc atcgaattct gcgccgctgc cagcgtggcg 15000 atgatgcacc tttcgcgctt ctccgaagag ctggtgctgt ggaccagcgc gcagttccag 15060 ttcatcgacc ttccggaccg cttctgcact ggcagctcga tcatgccgca gaaaaagaac 15120 ccggacgtgc cagagctggt acgtggcaag agcggccgcg tgttcggcgc cctgaccggc 15180 ctgctgaccc tgatgaaagg ccaaccgctg gcctacaaca aggacaacca ggaagacaag 15240 gaaccgctgt 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agacagttat gcacaggcca ggcgggtttt aagagtttta ataagtttta aagagtttta 16140 ggcggaaaaa tcgccttttt tctcttttat atcagtcact tacatgtgtg accggttccc 16200 aatgtacggc tttgggttcc caatgtacgg gttccggttc ccaatgtacg gctttgggtt 16260 cccaatgtac gtgctatcca caggaaagag accttttcga cctttttccc ctgctagggc 16320 aatttgccct agcatctgct ccgtacatta ggaaccggcg gatgcttcgc cctcgatcag 16380 gttgcggtag cgcatgacta ggatcgggcc agcctgcccc gcctcctcct tcaaatcgta 16440 ctccggcagg tcatttgacc cgatcagctt gcgcacggtg aaacagaact tcttgaactc 16500 tccggcgctg ccactgcgtt cgtagatcgt cttgaacaac catctggctt ctgccttgcc 16560 tgcggcgcgg cgtgccaggc ggtagagaaa acggccgatg ccgggatcga tcaaaaagta 16620 atcggggtga accgtcagca cgtccgggtt cttgccttct gtgatctcgc ggtacatcca 16680 atcaactagc tcgatctcga tgtactccgg ccgcccggtt tcgctcttta cgatcttgta 16740 gcggctaatc aaggcttcac cctcggatac cgtcaccagg cggccgttct tggccttctt 16800 cgtacgctgc atggcaacgt gcgtggtgtt taaccgaatg caggtttcta ccaggtcgtc 16860 tttctgcttt ccgccatcgg ctcgccggca gaacttgagt acgtccgcaa cgtgtggacg 16920 gaacacgcgg ccgggcttgt ctcccttccc ttcccggtat cggttcatgg attcggttag 16980 atgggaaacc gccatcagta ccaggtcgta atcccacaca ctggccatgc cggccggccc 17040 tgcggaaacc tctacgtgcc cgtctggaag ctcgtagcgg atcacctcgc cagctcgtcg 17100 gtcacgcttc gacagacgga aaacggccac gtccatgatg ctgcgactat cgcgggtgcc 17160 cacgtcatag agcatcggaa cgaaaaaatc tggttgctcg tcgcccttgg gcggcttcct 17220 aatcgacggc gcaccggctg ccggcggttg ccgggattct ttgcggattc gatcagcggc 17280 cgcttgccac gattcaccgg ggcgtgcttc tgcctcgatg cgttgccgct gggcggcctg 17340 cgcggccttc aacttctcca ccaggtcatc acccagcgcc gcgccgattt gtaccgggcc 17400 ggatggtttg cgaccgctca cgccgattcc tcgggcttgg gggttccagt gccattgcag 17460 ggccggcaga caacccagcc gcttacgcct ggccaaccgc ccgttcctcc acacatgggg 17520 cattccacgg cgtcggtgcc tggttgttct tgattttcca tgccgcctcc tttagccgct 17580 aaaattcatc tactcattta ttcatttgct catttactct ggtagctgcg cgatgtattc 17640 agatagcagc tcggtaatgg tcttgccttg gcgtaccgcg tacatcttca gcttggtgtg 17700 atcctccgcc ggcaactgaa agttgacccg cttcatggct ggcgtgtctg ccaggctggc 17760 caacgttgca gccttgctgc tgcgtgcgct cggacggccg gcacttagcg tgtttgtgct 17820 tttgctcatt ttctctttac ctcattaact caaatgagtt ttgatttaat ttcagcggcc 17880 agcgcctgga cctcgcgggc agcgtcgccc tcgggttctg attcaagaac ggttgtgccg 17940 gcggcggcag tgcctgggta gctcacgcgc tgcgtgatac gggactcaag aatgggcagc 18000 tcgtacccgg ccagcgcctc ggcaacctca ccgccgatgc gcgtgccttt gatcgcccgc 18060 gacacgacaa aggccgcttg tagccttcca tccgtgacct caatgcgctg cttaaccagc 18120 tccaccaggt cggcggtggc ccatatgtcg taagggcttg gctgcaccgg aatcagcacg 18180 aagtcggctg ccttgatcgc ggacacagcc aagtccgccg cctggggcgc tccgtcgatc 18240 actacgaagt cgcgccggcc gatggccttc acgtcgcggt caatcgtcgg gcggtcgatg 18300 ccgacaacgg ttagcggttg atcttcccgc acggccgccc aatcgcgggc actgccctgg 18360 ggatcggaat cgactaacag aacatcggcc ccggcgagtt gcagggcgcg ggctagatgg 18420 gttgcgatgg tcgtcttgcc tgacccgcct ttctggttaa gtacagcgat aaccttcatg 18480 cgttcccctt gcgtatttgt ttatttactc atcgcatcat atacgcagcg accgcatgac 18540 gcaagctgtt ttactcaaat acacatcacc tttttagacg gcggcgctcg gtttcttcag 18600 cggccaagct ggccggccag gccgccagct tggcatcaga caaaccggcc aggatttcat 18660 gcagccgcac ggttccggat gagcattca 18689

Claims

야생형 미생물에서 각각의 효소 활성에 비해 카르바모일포스페이트 신타아제의 기능을 갖는 효소의 증가된 활성을 포함하고, L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제의 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 이종 유전자를 포함하는 미생물.
제 1 항에 있어서, 카르바모일포스페이트 신타아제의 기능을 갖는 효소의 증가된 활성이 카르바모일포스페이트 신타아제의 기능을 갖는 효소를 코딩하는 유전자의 돌연변이 및/또는 과발현에 의해 달성되는 미생물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제의 활성이 L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자의 돌연변이 및/또는 과발현에 의해 증가되는 미생물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 미생물의 능력에 비해 L-아르기닌 생산 능력이 개선된 미생물.
제 4 항에 있어서, 아르기니노숙시네이트 리아제의 기능을 갖는 효소의 활성이 야생형 미생물에서의 각각의 효소 활성에 비해 증가되는 미생물.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제의 기능을 갖는 효소의 활성이 야생형 미생물에서의 각각의 효소 활성에 비해 증가되는 미생물.
제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 아르기니노숙시네이트 신테타제의 기능을 갖는 효소의 활성이 야생형 미생물에서의 각각의 효소 활성에 비해 증가되는 미생물.
제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 효소의 증가된 활성이 각각의 효소를 코딩하는 유전자의 돌연변이 및/또는 과발현에 의해 달성되는 미생물.
제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 아르기닌 오페론 (argCJBDFR) 이 과발현되는 미생물.
제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 아르기닌 반응성 리프레서 단백질 ArgR 을 코딩하는 argR 유전자가 약독화되거나 결실되는 미생물.
제 4 항 내지 제 8 항 또는 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 글루타메이트 디히드로게나제, 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제, 아세틸글루타메이트 키나제, 아세틸글루타밀포스페이트 리덕타제 및 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제를 각각 코딩하는 gdh, argJ, argB, argC 및/또는 argD 를 포함하는, L-오르니틴 및 L-아르기닌의 생합성 경로의 효소를 코딩하는 유전자 중 적어도 하나 이상이 과발현되는 미생물.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제의 기능을 갖는 단백질이 SEQ ID NO: 2 에 따른 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 미생물.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제의 기능을 갖는 단백질이 SEQ ID NO: 16 에 따른 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 미생물.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제의 기능을 갖는 단백질이 SEQ ID NO: 24 에 따른 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 미생물.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, L-아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라제의 기능을 갖는 단백질이 SEQ ID NO: 20 에 따른 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 미생물.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae) 속 또는 슈도모나스 (Pseudomonas) 속에 속하는 미생물.
제 16 항에 있어서, 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 인 미생물.
제 16 항에 있어서, 미생물이 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) 인 미생물.
제 16 항에 있어서, 미생물이 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) 인 미생물.
a) 발효 배지에서 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에서 정의된 미생물을 배양하는 단계, 및 b) 배지에 구아니디노 아세트산 (GAA) 을 축적하여 GAA 함유 발효 브로쓰를 형성하는 단계를 포함하는, 구아니디노 아세트산 (GAA) 의 발효 생산 방법.
제 20 항에 있어서, GAA 함유 발효 브로쓰로부터 GAA 를 단리하는 단계를 추가로 포함하는 구아니디노 아세트산 (GAA) 의 발효 생산 방법.
제 20 항에 있어서, GAA 함유 발효 브로쓰를 건조 및/또는 과립화하는 단계를 추가로 포함하는 구아니디노 아세트산 (GAA) 의 발효 생산 방법.
제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 구아니디노아세테이트 N-메틸트랜스퍼라제의 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 미생물.
제 23 항에 있어서, 구아니디노아세테이트 N-메틸트랜스퍼라제의 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자가 과발현되는 미생물.
a) 발효 배지에서 제 22 항 또는 제 24 항에서 정의된 미생물을 배양하는 단계, 및 b) 배지에 크레아틴을 축적하여 크레아틴 함유 발효 브로쓰를 형성하는 단계를 포함하는, 크레아틴의 발효 생산 방법.
제 25 항에 있어서, 크레아틴 함유 발효 브로쓰로부터 크레아틴을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 크레아틴의 발효 생산 방법.