CN116426497B - 一种l-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶及其在生产胍基乙酸中的应用 - Google Patents

一种l-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶及其在生产胍基乙酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种L‑精氨酸‑甘氨酸脒基转移酶及其在生产胍基乙酸中的应用。本发明采用了多位点氨基酸组合型突变方式，实现了突变体AkAGATT225Q/A258P/L278K酶活性显著高于野生型菌株的技术效果，为工业上大规模生产胍基乙酸提供了应用价值。将本发明构建的L‑精氨酸‑甘氨酸脒基转移酶突变体用于生产胍基乙酸，通过优化转化条件，在1L转化体系中，反应24h胍基乙酸产量达21.4g/L，转化率为90.4％，较原始酶生产胍基乙酸的产量提高了49.6％。

Description

一种L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶及其在生产胍基乙酸中的 应用
技术领域
本发明涉及一种L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶及其在生产胍基乙酸中的应用，属于酶工程技术领域。
背景技术
胍基乙酸(GAA)是一种天然存在的氨基酸衍生物，其作为肌酸的直接前体，可在需要高能量的组织中充当肌酸源。由于其在水溶液中的成本效益和高稳定性以及与肌酸相比的非特异性转运特性，GAA已被研究为营养添加剂。通过补充GAA，可以恢复以低脑肌酸和肌酸合成功能酶机制为特征的疾病中的细胞生物能量，包括神经退行性疾病、脑肿瘤或脑血管疾病。此外，GAA不具有诱变或基因毒性问题，不会对环境造成风险。鉴于GAA的广泛应用，其工业需求很大。
目前，GAA主要通过甘氨酸或甘氨酸钠与鸟苷酰化剂(如O-烷基异脲或氰胺)反应进行化学合成，生产过程需要高温高压，对环境不友好。此外，其纯化过程非常繁琐，容易被初始的酰化剂或有毒物质污染。因此，依靠生物技术，利用可再生资源生产GAA是非常理想的。
研究发现，在L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶(AGAT，EC：2.1.4.1)的催化作用下，可以精氨酸和甘氨酸为底物生产胍基乙酸和鸟氨酸。由于此酶存在于大多数动物以及极少数原核生物中，因此在微生物中对此研究较少，同时发现该酶在微生物中可溶性表达较少，易受到鸟氨酸的抑制作用。因次，利用酶法产胍基乙酸仍有许多限制，转化率与产量较低，仍需要进一步挖掘探究。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明通过筛选不同来源的L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶(AGAT)，并通过相关性质的测定，筛选得到催化能力较好的L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶AkAGAT。通过对其进行突变改造，提高其酶活，并将其导入宿主菌，得到大肠杆菌工程菌进行胍基乙酸的生产。
本发明的第一个目的是提供一种L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶，所述L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶是将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的酶的第225位苏氨酸突变为谷氨酰胺。
进一步地，所述L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶还包括将第258为丙氨酸突变为脯氨酸。
进一步地，所述L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶还包括将第278位亮氨酸突变为赖氨酸。
本发明的第二个目的是提供编码所述L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶的基因。
本发明的第三个目的是提供一种携带所述基因的重组表达载体。
本发明的第四个目的是提供一种表达所述L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶的重组菌。
进一步地，所述重组菌以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET-28a质粒为表达载体。
本发明的第五个目的是提供一种生产胍基乙酸的方法，是以所述L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶或所述重组菌为催化剂，催化精氨酸和甘氨酸反应生产胍基乙酸。
进一步地，在以重组菌为催化剂的催化反应体系中，以0.08～0.12M Tris-HCl为缓冲液，重组菌的菌体量按照OD600为30～50添加。
进一步地，所述催化反应体系中，精氨酸含量为50～200mM，甘氨酸含量为50～200mM，且精氨酸：甘氨酸＝1:2～2:1。
进一步地，所述催化反应体系中，添加了质量百分比为0.5～2％的曲拉通。
进一步地，催化反应的温度为30～40℃，初始pH 7～8。
本发明的有益效果是：
本发明通过选择不同来源的L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶，经过酶活比较，筛选出较高酶活的AGAT酶。将最优酶活的L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶进行突变，筛选得到酶活提高的突变酶AkAGATT225Q/A258P/L278K，该突变酶可溶性表达量提高，催化活性相较于原始酶提高了45.6％，突破了原来酶法产胍基乙酸效率低下的缺点。
本发明将筛选获得的L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶突变体用于生产胍基乙酸，通过优化全细胞催化条件，在1L体系中，将得到的菌株用于转化生产GAA，反应24h，最终产量可达21.4g/L，较原始酶生产胍基乙酸提高了49.6％。
附图说明：
图1为实施例1中pET-28a-AkAGAT、pET-28a-AcAGAT、pET-28a-CrAGAT构建验证结果电泳图谱；
图2为实施例1中不同来源L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶AGAT的SDS-PAGE图，泳道1，2分别为pET-28a空质的沉淀与粗酶液，泳道3，4分别为pET-28a-AkAGAT的沉淀与粗酶液，泳道5，6分别为pET-28a-AtAGAT的沉淀与粗酶液，泳道7，8分别为pET-28a-CrAGAT的沉淀与粗酶液；
图3为实施例2中温度对AkAGAT酶活性的影响；
图4为实施例2中不同金属离子对AkAGAT酶活性的影响；
图5为实施例2中AkAGAT酶的温度稳定性探究；
图6为实施例2中AkAGAT酶的酸碱稳定性探究；
图7为实施例3中AkAGAT突变体的SDS-PAGE图，泳道1，2，3，4分别为AkAGAT、AkAGATT225Q、AkAGATT225Q/A258P、AkAGATT225Q/A258P/L278K纯酶；
图8为不同AkAGAT突变体全细胞转化产胍基乙酸比较；
图9为转化体系中不同底物浓度对GAA生产的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下列实施例中表达载体的宿主为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，购自贝纳生物，pET-28a质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心。
下述实施例中所涉及的大肠杆菌感受态制备与化学转化法如下：
制备大肠杆菌化转感受态细胞，采用TakaRa公司的感受态细胞制备试剂盒Competent Cell Preparation Kit，详细操作参照说明书。采用42℃热击化转至E.coliBL21，经过抗生素抗性平板筛选获得阳性转化子，提取质粒进行PCR验证及送至金唯智生物科技公司测序验证。
下述实施例中所涉及的相关质粒的提取方法：
大肠杆菌的重组菌株提取质粒时将培养适当浓度的菌液离心后去除上清液，采用捷瑞小型质粒提取试剂盒提取，详细操作参照说明书。
下述实例中所涉及的培养基：
LB液体培养基(g/L)：5酵母粉、10胰蛋白胨、10氯化钠。
LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上，添加1.5～2.0％的琼脂粉。
L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶酶活测定方法：
(1)酶活测定体系：100mM Tris-HCl(pH＝7)，120mM精氨酸，120mM甘氨酸，加入适量酶液。
(2)酶活检测方法：在35℃，200rpm反应1h，加入750μL HClO4终止反应，放置10min，离心去除沉淀。取500μL反应液+500μL乙酸+500μL茚三酮溶液，于100℃反应1h，冷却后在515nm处测吸光值。
酶活定义：在标准反应条件下，每1min催化产生1μmol胍基乙酸所需要的酶量为1个酶活单位。
L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶比酶活测定方法：测定纯化后的L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶(U·mL-1)，并且，采用Bradford法测定纯化后的L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶的蛋白含量(mg·mL-1)，以计算L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶的比酶活；
其中，L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶比酶活的计算公式如下：
L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶比酶活(U·mg-1)＝纯化后的L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶的酶活(U·mL-1)/纯化后的L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶的蛋白含量(mg·mL-1)。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
蛋白浓度的检测：利用Bradford试剂盒测定蛋白浓度，以牛血清蛋白作为标准品。
样品检测方法：胍基乙酸的检测使用安捷伦高效液相色谱(配备紫外吸收器)，色谱柱为Waters XBridge BEH Amide 5μm column(4.6mm×250mm)。流动相为30％乙腈水溶液，检测波长在210nm，流速为0.6mL/min。
精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸的检测使用安捷伦C18，5μm，4.6×250mm色谱柱；流速为1.0mL·min-1；柱温40℃；检测波长338nm；流动相：A相：8.0g乙酸钠(13.3g三水合乙酸钠)溶于1000mL水，加入225μL三乙胺，用5％的乙酸将pH调到7.20±0.05，最后加入5mL四氢呋喃，混合；B相：称取6.0g乙酸钠于200mL水溶解，用5％乙酸将pH调到7.20±0.05，将此溶液加入400mL的HPLC级甲醇和400mL的HPLC级乙腈，混合。
实施例1：高酶活异源AGAT的筛选与表达
具体步骤如下：
1、重组菌BL21/pET-28a-AkAGAT、BL21/pET-28a-AcAGAT、BL/pET-28a-CrAGAT的构建
为了获得较高酶活的AGAT，搜索Brenda数据库和NCBI BLAST，分别获得拟无枝杆菌Amycolatopsis kentuckyensis、土地放线动孢菌Actinokineospora terrae、拟柱孢藻Cylindrospermopsis raciborskii AWT205编码AGAT的基因序列(分别如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3所示)，交由苏州金唯智公司合成。所得的agat基因片段分别与线性化质粒pET-28a(P1/P2扩增)通过同源重组酶ClonExpress II One Step Cloning Kit(诺唯赞)连接，转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到转化子，将转化子涂布于含有浓度为50μg/mL的卡那的LB固体培养基中，37℃培养12h，挑取阳性菌落，以P3/P4为引物通过TaqDNA聚合酶对单菌落进行菌落PCR验证(见图1)；带有目的条带大小的阳性单菌落接种于含有LB液体培养基的小瓶中培养12h后，提质粒，送金唯智公司测序正确，构建成功的重组菌分别命名为BL21/pET-28a-AkAGAT、BL21/pET-28a-AcAGAT、BL21/pET-28a-CrAGAT。所涉及的引物序列如下：
P1：5’-AGCAAATGGGTCGCGGATCC-3’
P2：5’-GTGGTGCTCGAGTGCGGCCG-3’
P3：5’-CATGACTGGTGGACAGCAAAT-3’
P4：5’-GCTTTGTTAGCAGCCGGAT-3’
2、L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶AGAT的表达与纯化
取上述构建成功的重组菌株单菌落接种到10ml的LB液体培养基中，37℃培养12小时，1％接种量接种至50ml的LB液体培养基中，培养到OD600约为0.8，加入IPTG，16℃培养16h。PBS洗细胞洗三次，收集的菌体重新用PBS悬浮，超声破碎仪破碎细胞，大肠杆菌破1s停3s，共破15min。离心10000rpm，20min，取上清液跑蛋白胶，均可溶性表达，见图2。将粗酶液通过蛋白纯化镍柱进行纯化，纯酶跑蛋白胶验证。
将纯酶加入到含有相同浓度的底物反应液中，按照上述酶活检测方法测定不同来源的L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶的活性。
结果显示，来源于Amycolatopsis kentuckyensis的AkAGAT具有更好的催化能力，比酶活为2.23±0.03U/mg，选择该酶用于后续的实验。
表1：不同来源的L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶AGAT比酶活比较
酶 比酶活U/mg
AkAGAT 2.23±0.07
AtAGAT 1.44±0.04
CrAGAT 1.23±0.02
实施例2：AkAGAT纯酶的活性分析
下述实验采用的是实施例1的步骤2得到的16℃条件下诱导菌株表达后经纯化后的AkAGAT纯化酶。
研究该酶在不同反应温度(20-60℃)、pH(3-10)、金属离子(Na+、K+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、EDTA)下的酶活，同时测定其温度稳定性及酸碱稳定性。结果如图3-6所示，其最适反应温度为35℃，最适pH为7，金属离子及对该酶酶活无影响，热稳定性较差，耐酸不耐碱。
实施例3：L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶基因可突变位点的挖掘与选择
根据实施例1和实施例2的研究，AkAGAT的热稳定性较差，酶活有待提高，需要对酶进行改造。
具体步骤如下：
1、AkAGAT酶突变体的制备
本发明以Amycolatopsis kentuckyensis的L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶(AkAGAT)为亲本进行突变改造，本发明提出的突变体与AkAGAT氨基酸序列SEQ ID NO.4相比至少存在第225、258、278位点的多个突变，所述突变体具有下述至少一种突变：T225Q、A258P、L278K。
PCR的扩增体系为：Primer F 1.0μL、Primer R 1.0μL、Template 1.0μL、PhantaRMax(p515)DNA polymerases 25μL、Nuclease-free water 22μL
PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；退火温度一般设置为58～60℃，30～60s；72℃延伸按照每分钟扩增1500bp基因设置时间；变性至延伸程序30个循环；72℃再延伸5min；4℃保存。
以P5和P6为引物，以实施例1中构建的pET-28a-AkAGAT为模板，利用上述PCR扩增体系和PCR扩增反应条件进行反向PCR扩增pET-28a-AkAGAT得到AkAGATT225Q突变体，经1.5％琼脂糖胶电泳分离后使用商业试剂盒回收扩增产物。得到质粒pET-28a-AkAGATT225Q突变体再转化感受态细菌细胞E.coli BL21(DE3)，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶活性的克隆菌落，从克隆菌落中提取质粒pET-28a-AkAGATT225Q突变体的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误即获得突变体重组菌。
以P7和P8为引物，以上述构建的pET-28a-AkAGATT225Q为模板，利用上述PCR扩增体系和PCR扩增反应条件进行反向PCR扩增pET-28a-AkAGATT225Q得到AkAGATT225Q/A258P突变体，经1.5％琼脂糖胶电泳分离后使用商业试剂盒回收扩增产物。得到质粒pET-28a-AkAGATT225Q/A258P突变体再转化感受态细菌细胞E.coli BL21(DE3)，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶活性的克隆菌落，从克隆菌落中提取质粒pET-28a-AkAGATT225Q/A258P突变体的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误即获得突变体重组菌。
以P9和P10为引物，以上述构建的pET-28a-AkAGATT225Q/A258P为模板，利用上述PCR扩增体系和PCR扩增反应条件进行反向PCR扩增pET-28a-AkAGATT225Q/A258P得到AkAGATT225Q/A258P/L278K突变体，经1.5％琼脂糖胶电泳分离后使用商业试剂盒回收扩增产物。得到质粒pET-28a-AkAGATT225Q/A258P/L278K突变体再转化感受态细菌细胞E.coli BL21(DE3)，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶活性的克隆菌落，从克隆菌落中提取质粒pET-28a-AkAGATT225Q/A258P/L278K突变体的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误即获得突变体重组菌。
P5：5’-CTTTGGTTCCAGGTGGCGTTGCA-3’
P6：5’-CGCCACCTGGAACCAAAGG-3’
P7：5’-TCAGGACCAGGCCAGGGC-3’
P8：5’-GGCCTGGTCCTGACCAACCC-3’
P9：5’-GAACTCCCAATCGTTTGCCTTGAA-3’
P10：5’-GCAAACGATTGGGAGTTCGTGA-3’
2、AkAGAT酶突变体的表达与酶活测定
将上述构建的AkAGAT饱和突变株的单菌落接种到10ml的LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素)中，37℃培养12小时，1％接种量接种至50ml的LB液体培养基中，培养到OD600约为0.8，加入IPTG，16℃培养16h。PBS洗细胞洗三次，收集的菌体重新用PBS悬浮，超声破碎仪破碎细胞，将粗酶液通过蛋白纯化镍柱进行纯化，得到AkAGAT的突变纯酶。按照上述酶活测定方法测定AkAGAT酶突变体的活性，结果见表2。
突变体表达的蛋白以可溶性形式表达，并且其表达量与野生型相比增多(见图7)，同时在30℃、35℃、40℃、45℃下测定突变体AkAGATT225Q、AkAGATT225Q/A258P、AkAGATT225Q/A258P/L278K的热稳定性，发现在40和45℃条件下，三个突变体的稳定性均有提高，在6h后，三个突变体的酶活残余30％-35％。
突变体AkAGATT225Q、AkAGATT225Q/A258P、AkAGATT225Q/A258P/L278K的酶活性较野生型分别提高21.1％、32％、36.7％。AkAGATT225Q/A258P/L278K的催化活性提高最明显，比酶活可达3.52±0.21U/mg，将BL21/pET-28a-AkAGATT225Q/A258P/L278K用于后续实验中。
表2不同AkAGAT突变体酶活比较
酶 比酶活U/mg
AkAGAT 2.23±0.07
AkAGATT225Q 2.70±0.08
AkAGATT225Q/A258P 2.94±0.20
AkAGATT225Q/A258P/L278K 3.52±0.21
实施例4：利用突变酶AkAGAT突变体生产胍基乙酸
具体步骤如下：
1、利用不同AkAGAT突变体全细胞催化产胍基乙酸比较
将重组菌E.coli BL21/pET28a-AkAGAT、E.coli BL21/pET28a-AkAGATT225Q、E.coliBL21/pET28a-AkAGATT225Q/A258P、E.coli BL21/pET28a-AkAGATT225Q/A258P/L278K按照实施例1进行诱导表达。用PBS洗细胞洗三次，收集的菌体用100mM PBS悬浮。控制初始反应pH值为7.0，反应温度30℃，200rpm，底物浓度120mM，进行催化反应，期间取样。取样时间为0、6、12、18、24h，对样品12000g/min，10min离心取上清，上清液过0.22μm滤膜，进行HPLC检测胍基乙酸产量。
通过取样检测不同时间段的胍基乙酸的产量发现在大肠杆菌中无降解胍基乙酸的相关酶，随着转化时间的延长，胍基乙酸的产量不断增加，结果见图8所示。反应24h，AkAGATT225Q/A258P/L278K表达的酶参与的反应体系可获得7.06g/L胍基乙酸，转化率为50.28％，分别比AkAGAT、AkAGATT225Q、AkAGATT225Q/A258P高49.6％、29.4％、17％。因此，突变酶AkAGATT225Q/A258P/L278K的添加可以显著提高催化效率，节省反应成本，提高胍基乙酸的产量。
2、利用突变酶AkAGATT225Q/A258P/L278K突变体生产胍基乙酸条件优化
为了能够达到最佳的转化效果，需要对转化的条件进行优化，主要从转化体系缓冲液的类型、菌体浓度、底物浓度、通透剂的添加量方面进行优化。
不同缓冲液对GAA生产的影响：收集细胞后，悬浮细胞浓缩至PBS缓冲液/Tris-HCl缓冲液/MOPS缓冲液中，向50ml三角瓶中加入相同体积的细胞浓缩液，使反应体系中最终菌体浓度分为30。全细胞催化体系：0.1M PBS/Tris-HCl/MOPS(pH＝7.4)，底物浓度120mM，反应温度35℃，220rpm，反应24h，0、6、12、18、24h取样，12000rpm，10min离心取上清，稀释10倍后，过0.22μm滤膜，HPLC测定产物GAA产量。结果显示，0.1M Tris-HCl更适合该转化体系，GAA产量达8.41g/L，相较于0.1M PBS/MOPS分别高19.7％、12％。
不同细胞浓度对GAA生产的影响：收集细胞后，悬浮细胞浓缩至适当体积，检测菌体浓度(OD600)，向50ml三角瓶中加入不同体积的细胞浓缩液，使反应体系中最终菌体浓度分为10、20、30、40、50、60。全细胞催化体系：0.1M Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)，底物浓度120mM，反应温度35℃，220rpm，反应24h，0、6、12、18、24h取样，12000rpm，10min离心取上清，稀释10倍后，过0.22μm滤膜，HPLC测定产物GAA产量。结果显示，在OD600＝40时，GAA产量最高为9.12g/L。
表3不同细胞浓度对GAA生产的影响
细胞浓度(OD600) 10 20 30 40 50 60
GAA浓度(g/L) 6.60 8.30 7.59 9.12 8.60 8.71
底物浓度对合成GAA的影响：在最适菌体浓度的条件下，向体系中加入不同浓度的底物，分别为①Arg 50mM、Gly 50mM②Arg 100mM、Gly 100mM③Arg 150mM、Gly 150mM④Arg200mM、Gly 200mM⑤Arg 50mM、Gly 100mM⑥Arg 100mM、Gly 50mM，反应结束后取样，测定产物GAA产量，计算最大转化率。结果如图9所示，在OD600＝40的条件下，发现当以精氨酸：甘氨酸＝1：1投入底物时，在底物浓度为150mM时产量最高，但是转化率并不是很高，在底物浓度为50mM时，转化率最高，但是产量较低，综合来看在底物浓度为100mM时，产量和转化率都较高，产量为9.31g/L，转化率为80％。此外，当精氨酸：甘氨酸＝1：2，精氨酸：甘氨酸＝2：1加入时，都不如1：1加入时产量高。
综上所述，在后续的实验中选用0.1M Tris-HCl作为缓冲体系，添加细胞OD600＝40，同时以1：1加入精氨酸和甘氨酸，加入的量分别为100mM，进行全细胞转化生产胍基乙酸。
3、胍基乙酸转化放大
为利用重组大肠杆菌E.coli BL21/pET28a-AkAGATT225Q/A258P/L278K高效转化生产胍基乙酸，按照上述优化后全细胞催化条件研究重组菌在大体系中的转化水平。用1L 0.1MTris-HCl缓冲液悬浮菌体，控制反应温度35℃，初始pH 7.4，底物精氨酸和甘氨酸各200mM，曲拉通1％，菌体OD600为40的条件下进行转化，液相检测转化液中各组分含量情况。
结果显示，随着时间的推移，反应也在有序进行中，精氨酸和甘氨酸被消耗生成胍基乙酸。转化体系在经过24h的催化反应后逐渐稳定，200mM底物浓度下，共生成21.4g·L-1胍基乙酸，转化率为90.4％。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶，其特征在于，所述L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶是将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的酶的第225位苏氨酸突变为谷氨酰胺。
2.根据权利要求1所述L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶，其特征在于，所述L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶还包括将第258位丙氨酸突变为脯氨酸。
3.根据权利要求2所述L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶，其特征在于，所述L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶还包括将第278位亮氨酸突变为赖氨酸。
4.编码权利要求1~3任一项所述L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶的基因。
5.一种携带权利要求4所述基因的重组表达载体。
6.一种表达权利要求1~3任一项所述L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶的重组菌。
7.根据权利要求6所述重组菌，其特征在于，所述重组菌以大肠杆菌E.coli BL21（DE3）为宿主，以pET-28a质粒为表达载体。
8.一种生产胍基乙酸的方法，其特征在于，是以权利要求1~3任一项所述L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶或权利要求6~7任一项所述重组菌为催化剂，催化精氨酸和甘氨酸反应生产胍基乙酸。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，在以重组菌为催化剂的催化反应体系中，以0.08~0.12M Tris-HCl为缓冲液，重组菌的菌体量按照OD600为30~50添加。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述催化反应体系中，精氨酸含量为50~200mM，甘氨酸含量为50~200mM，且精氨酸：甘氨酸=1:2~2:1。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111748506A (zh) * 2019-03-29 2020-10-09 中国科学院微生物研究所 产胍基乙酸的工程菌及其构建方法与应用
EP3839051A1 (en) * 2019-12-19 2021-06-23 Evonik Operations GmbH Method for the fermentative production of guanidinoacetic acid

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111748506A (zh) * 2019-03-29 2020-10-09 中国科学院微生物研究所 产胍基乙酸的工程菌及其构建方法与应用
EP3839051A1 (en) * 2019-12-19 2021-06-23 Evonik Operations GmbH Method for the fermentative production of guanidinoacetic acid
CN114867861A (zh) * 2019-12-19 2022-08-05 赢创运营有限公司 用于发酵生产胍基乙酸的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Emre Turer et al..Creatine maintains intestinal homeostasis and protects against colitis.《PNAS》.2017,E1273–E1281. *
Erich et al..Substrate binding and catalysis by L-arginine:glycine amidinotransferase A mutagenesis and crystallographic study.《Eur.J.Biochem.》.1997,第247卷483-490. *
王誉杰等.胍基乙酸及代谢产物肌酸的研究进展.《畜牧兽医学报》.2018,第49卷(第8期),1577-1584. *

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