CN111748506A - 产胍基乙酸的工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了产胍基乙酸的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明提供了一种产胍基乙酸工程菌的构建方法，包括如下步骤：将与胍基乙酸合成相关基因L‑精氨酸：甘氨酸脒基转移酶编码基因导入宿主菌，得到产胍基乙酸工程菌；所述宿主菌为大肠杆菌或突变型大肠杆菌。本发明通过表达外源蛋白的方法，在大肠杆菌中构建了本底不存在的AGAT催化反应。同时，通过质粒过表达蛋白、染色体上替换启动子及基因敲除等方式，增强大肠杆菌鸟氨酸循环代谢通路的流量，解除鸟氨酸对AGAT催化反应的抑制，利用全细胞催化法循环利用精氨酸生产胍基乙酸，具有良好的环境与经济前景。

Description

产胍基乙酸的工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及产胍基乙酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
胍基乙酸(Guanidinoacetate,GAA)为白色或微黄色结晶性粉末，或片状结晶，常温下在水中的溶解度为4g/L。胍基乙酸是人和动物体内合成肌酸的主要内源性物质,对于肌肉和神经组织的能量代谢，其发挥着无可替代的作用。肌酸既可以从日粮中获得,也可以通过生物体自身合成，所以称其为半必需营养物质。肌酸是细胞内能量新陈代谢的重要分子，能量暂时存储的场所。肌酸被磷酸化后形成磷酸肌酸，是动物肌肉组织中主要的能量供应物质，添加胍基乙酸能够加强机体的能量供应。除了合成肌酸，胍基乙酸还有其他生理功能，其中包括刺激激素合成、调节神经、节约精氨酸和调节细胞氧化状态等。一些欧美国家健美者和力量运动员保健品中也添加少量胍基乙酸，以促进肌肉的生长。在饲料中添加胍基乙酸在一定程度上可弥补纯植物日粮造成的动物生产性能下降，提高动物瘦肉率。所以，胍基乙酸作为新一代无毒害，无副作用的饲料添加剂，受到社会上的广泛关注。总体来说，胍基乙酸有可观的市场需求和良好的市场前景。
目前，胍基乙酸的合成方法主要是化学合成方法，合成工艺大多存在路线复杂，收率不高，副产物处理，对环境不友好等问题。目前，胍基乙酸的化学合成法主要有以下几种方法：
1.硫脲与溴乙烷反应生成S-乙基硫脲氢溴酸盐，氢氧化钠中和,再与甘氨酸反应制得胍基乙酸。
2.由盐酸胍与固体氢氧化钠中和反应生成游离胍，然后与氯乙酸反应制得胍基乙酸。
3.异丙醇、甘氨酸和10％氢氧化钠溶液，室温混合后，滴加单氰胺溶液。反应完毕，减压浓缩，蒸出溶剂，得到胍基乙酸粗品。
上述化学合成方法普遍存在工艺复杂、收率低、产品质量差，副产物回收问题与环境污染问题。现在为止，还没有生物合成胍基乙酸的报道，因此，一种绿色高效合成胍基乙酸的方法显得尤为迫切。
研究发现，甘氨酸和精氨酸可以在甘氨酸-精氨酸脒基转移酶(Glycine-ArginineAmidinotransferase，AGAT，EC:2.1.4.1)的催化下能够利用生成胍基乙酸和鸟氨酸，此酶存在于大多数动物以及极少数原核生物中。大肠杆菌由于研究比较详尽，有着成熟的基因操作体系，繁殖迅速培养代谢易于控制等优点，被作为基因工程菌广泛应用。研究发现，AGAT催化精氨酸生成胍基乙酸的反应被副产物鸟氨酸反馈抑制，因此利用酶法一步合成胍基乙酸的转化率与产量比较低，且底物成本高，难以适用于工业化生产。
发明内容
为了适应工业化生产胍基乙酸，本发明提供了如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种产胍基乙酸工程菌的构建方法，包括如下步骤：将与胍基乙酸合成相关基因L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶编码基因导入宿主菌，得到产胍基乙酸工程菌；所述宿主菌为大肠杆菌或突变型大肠杆菌。
上述方法中，所述L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶为如下A1-A6任一种：
A1.Amycolatopsis kentuckyensis来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶；
所述Amycolatopsis kentuckyensis来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶的Genbank protein id:WP_086848752.1(提交日为24-MAY-2017)或将该氨基酸序列中经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的蛋白质；
A2、Homo sapien来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶；
所述Homo sapien来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶的Genbank protein id:AAB29892.1(提交日为23-SEP-1994)或将该氨基酸序列中经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的蛋白质；
A3.Actinokineospora terrae来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶；
所述Actinokineospora terrae来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶的Genbankprotein id:SER40935.1(提交日为29-OCT-2016)或将该氨基酸序列中经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的蛋白质；
A4.Cylindrospermopsis raciborskii来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶；
所述Cylindrospermopsis raciborskii来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶的Genbank protein id:ABX60160.1(提交日为19-FEB-2008)或将该氨基酸序列中经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的蛋白质；
A5.Moorea producens来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶；
所述Moorea producens来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶的Genbank proteinid:WP_071104515.1(提交日为30-OCT-2016)或将该氨基酸序列中经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的蛋白质；
A6.Micromonospora rifamycinica来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶。
所述Micromonospora rifamycinica来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶的Genbank protein id:SCG74071.1(提交日为16-AUG-2016)或将该氨基酸序列中经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的蛋白质；
上述方法中，
所述突变型大肠杆菌为按照如下a1至a7的至少1种的方式制备的重组大肠杆菌：
a1.提高所述大肠杆菌中氨甲酰磷酸合成酶II编码基因的表达或活性(C00)；
a2.提高所述大肠杆菌中鸟氨酸氨甲酰转移酶编码基因的表达或活性；
a1和a2组成突变体为C01。
a3.提高所述大肠杆菌中谷氨酰胺合成酶编码基因的表达或活性；
a1、a2和a3组成突变体为(C11)。
a4.提高所述大肠杆菌中精氨酰琥珀酸合成酶编码基因的表达或活性；
a5.提高所述大肠杆菌中精氨酰琥珀酸裂解酶编码基因的表达或活性；
a1、a2、a3、a4、a5组成突变体为(C13)。
a6.提高所述大肠杆菌中天冬氨酸裂氨酶编码基因的表达或活性；
a1、a2、a3、a4、a5、a6组成突变体为(CG14)。
a7.降低或抑制所述大肠杆菌中甘氨酸脱羧酶编码基因的表达或活性。
a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7组成突变体为(CG24)。
所述谷氨酰胺合成酶的Genbank protein id:WP_003859638.1(提交日为
06-FEB-2016)或将该氨基酸序列中经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的蛋白质；
所述鸟氨酸氨甲酰转移酶包括鸟氨酸氨甲酰转移酶I，其Genbank protein id:AIN34536.1(提交日为30-OCT-2014)或将该氨基酸序列中经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的蛋白质；
所述鸟氨酸氨甲酰转移酶包括鸟氨酸氨甲酰转移酶II，其Genbank protein id:AIN30787.1(提交日为30-OCT-2014)或将该氨基酸序列中经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的蛋白质；
所述氨甲酰磷酸合成酶小亚基的Genbank protein id:AIN30569.1(提交日为30-OCT-2014)或将该氨基酸序列中经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的蛋白质；
所述氨甲酰磷酸合成酶大亚基的Genbank protein id:AIN30570.1(提交日为30-OCT-2014)或将该氨基酸序列中经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的蛋白质；
所述精氨酰琥珀酸合成酶的Genbank protein id:AIN33516.1(提交日为30-OCT-2014)或将该氨基酸序列中经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到具有相同功能的蛋白质；
所述精氨酰琥珀酸裂解酶的Genbank protein id:AIN34258.1(提交日为30-OCT-2014)或将该氨基酸序列中经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到具有相同功能的蛋白质；
所述天冬氨酸裂氨酶的Genbank protein id:AIN34426.1(提交日为30-OCT-2014)或将该氨基酸序列中经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到具有相同功能的蛋白质；
甘氨酸脱羧酶基因(gcvP)(Gene ID:947394,updated on 11-OCT-2018)编码的甘氨酸脱羧酶的氨基酸序列的Genebank号为AAC75941.1(提交日为24-SEP-2018)或将该氨基酸序列中经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到具有相同功能的蛋白质。
上述方法中，
所述突变型大肠杆菌为按照所述a1至a7中全部方式制备的重组大肠杆菌。
上述方法中，
a1中，所述提高所述大肠杆菌中氨甲酰磷酸合成酶II编码基因的表达或活性为将大肠杆菌中氨甲酰磷酸合成酶II编码基因的启动子替换为CPA1启动子；
或，a2-a6中，提高各个编码基因的表达或活性为将各个编码基因导入所述大肠杆菌中；
或，a7中，所述降低或抑制大肠杆菌中甘氨酸脱羧酶编码基因的表达或活性为敲除所述大肠杆菌中甘氨酸脱羧酶编码基因。
上述方法中，
所述将各个编码基因导入所述大肠杆菌中为将表达各个基因的重组载体导入所述大肠杆菌中。
本发明另一个目的是提供一种大肠杆菌突变体。
本发明提供的突变体，为上述中的所述大肠杆菌突变体。
由上述方法制备的产胍基乙酸工程菌也是本发明保护的范围。
上述的产胍基乙酸工程菌在制备胍基乙酸中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述大肠杆菌突变体在制备瓜氨酸或精氨酸或产胍基乙酸中的应用也是本发明保护的范围。
本发明第3个目的是提供一种制备胍基乙酸的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：将上述的产胍基乙酸的基因工程菌经阿拉伯糖诱导培养得到诱导后重组菌，用所述诱导后重组菌催化精氨酸与甘氨酸反应，得到胍基乙酸。
或，本发明还提供了一种制备瓜氨酸和/或精氨酸的方法，包括如下步骤：将上述的大肠杆菌突变体经阿拉伯糖诱导培养得到诱导后重组菌，用所述诱导后重组菌催化鸟氨酸反应，得到瓜氨酸和/或精氨酸。
所述大肠杆菌突变体为如下b1-b6中任一种：
b1、所述突变型大肠杆菌为提高所述大肠杆菌中氨甲酰磷酸合成酶II编码基因的表达或活性得到的重组大肠杆菌(C00)；
b2、所述突变型大肠杆菌为提高所述大肠杆菌中鸟氨酸氨甲酰转移酶编码基因的表达或活性和氨甲酰磷酸合成酶II编码基因的表达或活性(C01)；
b3、所述突变型大肠杆菌为提高所述大肠杆菌中谷氨酰胺合成酶编码基因、氨甲酰磷酸合成酶II编码基因和鸟氨酸氨甲酰转移酶编码基因的表达和活性(C11)；
b4、所述突变型大肠杆菌为提高所述大肠杆菌中谷氨酰胺合成酶编码基因、氨甲酰磷酸合成酶II编码基因、鸟氨酸氨甲酰转移酶编码基因、精氨酰琥珀酸合成酶编码基因和精氨酰琥珀酸裂解酶编码基因的表达和活性(C13)；
b5、所述突变型大肠杆菌为提高所述大肠杆菌中谷氨酰胺合成酶编码基因、氨甲酰磷酸合成酶II编码基因、鸟氨酸氨甲酰转移酶编码基因、精氨酰琥珀酸合成酶编码基因、精氨酰琥珀酸裂解酶编码基因和天冬氨酸裂氨酶编码基因的表达和活性(C14)；
b6、所述突变型大肠杆菌为提高所述大肠杆菌中谷氨酰胺合成酶编码基因、氨甲酰磷酸合成酶II编码基因、鸟氨酸氨甲酰转移酶编码基因、精氨酰琥珀酸合成酶编码基因、精氨酰琥珀酸裂解酶编码基因和天冬氨酸裂氨酶编码基因的表达和活性，且降低或抑制所述大肠杆菌中甘氨酸脱羧酶编码基因的表达或活性(CG24)。
本发明的一个实施例中的重组菌G80为将与胍基乙酸合成相关基因L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶编码基因(Amycolatopsis kentuckyensis来源)导入突变型大肠杆菌，所述突变型大肠杆菌为降低或抑制所述大肠杆菌中甘氨酸脱羧酶编码基因的表达或活性得到的。
本发明的重组菌CG24为将与胍基乙酸合成相关基因L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶编码基因(Amycolatopsis kentuckyensis来源)导入突变型大肠杆菌，所述突变型大肠杆菌为按照所述a1至a7中全部方式制备的重组大肠杆菌。
本发明通过表达外源蛋白的方法，在大肠杆菌中构建了本底不存在的AGAT催化反应。同时，本发明基于理性的代谢工程策略，通过质粒过表达蛋白、染色体上替换启动子及基因敲除等方式，增强大肠杆菌鸟氨酸循环代谢通路的流量，解除鸟氨酸对AGAT催化反应的抑制，利用全细胞催化法循环利用精氨酸生产胍基乙酸。本发明将通过生物合成法绿色高效的合成胍基乙酸，从而避免化学合成法带来的种种问题，具有良好的环境与经济前景。
附图说明
图1为pLB1a质粒物理图谱。
图2为pSB1s质粒物理图谱。
图3为瓜氨酸以及精氨酸标准品HPLC检测图。
图4为产瓜氨酸以及精氨酸菌种反应后样品HPLC检测图。
图5为胍基乙酸标准品HPLC检测图。
图6为产胍基乙酸工程菌反应后样品HPLC检测图。
图7为不同浓度精氨酸下有无增强尿素循环的胍基乙酸产量。
图8为增强尿素循环各酶后胍基乙酸的产量。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中大肠杆菌K12记载于文献“Baba T,Ara T,Hasegawa M,Takai Y,Okumura Y,Baba M,Datsenko KA,Tomita M,Wanner BL,Mori H:Construction ofEscherichia coli K-12 in-frame,single-gene knockout mutants:the Keiocollection.Mol Syst Biol 2006,2:2006.0008.”中，是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短，容易培养且培养基原料低廉。大肠杆菌K12的全基因组序列的GenBankAccession为U00096.3(GI：545778205，update date是AUG 01，2014，version是3)。公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的野生型P1噬菌体菌种记载于文献“Thomason LC,Costantino N,Court DL:E.coli genome manipulation by P1transduction.Curr Protoc Mol Biol2007,Chapter 1:Unit 1.17.”中，公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的供体菌：大肠杆菌K12菌株BW25113、BW25113 gcvP::Kan(国立遗传学研究所(NIG，Japan)，NIG编号为JW2871)记载于文献“Baba T,Ara T,Hasegawa M,Takai Y,Okumura Y,Baba M,Datsenko KA,Tomita M,Wanner BL,Mori H:Constructionof Escherichia coli K-12 in-frame,single-gene knockout mutants:the Keiocollection.Mol Syst Biol 2006,2:2006.0008.”中，公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、构建产胍基乙酸的基因工程菌
一、构建协同表达谷氨酰胺合成酶与L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶重组质粒与协同表达鸟氨酸氨甲酰转移酶、精氨酰琥珀酸合成酶、精氨酰琥珀酸裂解酶、天冬氨酸氨裂解酶重组质粒
1、构建表达谷氨酰胺合成酶重组质粒pL01
根据谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的谷氨酰胺合成酶(GS)的核酸序列GenBank:AF005635.2(氨基酸序列GenBank:WP_003859638.1)，设计引物(P1和P2)，扩增得到谷氨酰胺合成酶的编码基因(glnA)，片段大小约1200bp，与目的片段相符，测序结果表明扩增片段序列正确，片段用于构建重组质粒pL01。
将载体pLB1a(物理图谱见图1，质粒pLB1a是将专利CN104805047A中所述pDB1s质粒的1662bp-2460bp处的复制起始点换成序列1所示的R6K复制起始点，pDB1s质粒的2460bp-3528bp处的链霉素抗性基因换成序列2所示的氨苄抗性基因得到的)与上述扩增的glnA基因均使用NcoI和XhoI双酶切，电泳回收约4300bp片段载体骨架和1200bp的glnA基因。使用T4连接方法，将基因glnA插入pLB1a的NcoI与XhoI位点之间，提取阳性克隆质粒，进行测序验证，结果表明glnA基因正确插入pLB1a的NcoI与XhoI位点间。重组质粒构建正确，将该重组载体命名为pL01。
引物序列如下：
P1:5’-CCATGGCGTTCGAGACCCCG-3’
P2:5’-CACCACTAGTACCAGATCTACCCTCGAG-3’
2、构建表达L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶重组质粒pL02以及pL03至pL08
根据智人(Homo sapien)来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶(HsAGAT)的核酸序列GenBank:S68805.1(氨基酸序列GenBank:AAB29892.1)，设计引物(P3和P4)，扩增得到L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶的编码基因(Hsagat)，片段大小约1400bp，与目的片段相符，测序结果表明扩增片段序列正确，片段用于构建重组质粒pL03。
根据土地放线动孢菌(Actinokineospora terrae)来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶(AtAGAT)的核酸序列GenBank:FOGI01000003.1(氨基酸序列GenBank:SER40935.1)，设计引物(P5和P6)，扩增得到L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶的编码基因(Atagat)，片段大小约1200bp，与目的片段相符，测序结果表明扩增片段序列正确，片段用于构建重组质粒pL04。
根据拟柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskii)来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶(CrAGAT)的核酸序列GenBank:KJ139707.1(氨基酸序列GenBank:ABX60160.1)，设计引物(P7和P8)，扩增得到L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶的编码基因(Cragat)，片段大小约1200bp，与目的片段相符，测序结果表明扩增片段序列正确，片段用于构建重组质粒pL05。
根据Moorea producens(一种海洋蓝细菌)来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶(MpAGAT)的核酸序列GenBank:NZ_CP017708.1(氨基酸序列GenBank:WP_071104515.1)，设计引物(P9和P10)，扩增得到L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶的编码基因(Mpagat)，片段大小约1150bp，与目的片段相符，测序结果表明扩增片段序列正确，片段用于构建重组质粒pL06。
根据利福霉素小单孢菌(Micromonospora rifamycinica)来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶(MrAGAT)的核酸序列GenBank:LT607752.1(氨基酸序列GenBank:SCG74071.1)，设计引物(P11和P12)，扩增得到L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶的编码基因(Mragat)，片段大小约1100bp，与目的片段相符，测序结果表明扩增片段序列正确，片段用于构建重组质粒pL07。
根据肯塔基拟无枝酸菌(Amycolatopsis kentuckyensis)的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶(AkAGAT)的核酸序列NCBI Reference Sequence:NZ_MUMI01000399.1:1315-2445(氨基酸序列WP_086848752.1)，设计引物(P13和P14)，扩增得到L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶的编码基因(Akagat)，片段大小约1200bp，与目的片段相符，测序结果表明扩增片段序列正确，片段用于构建重组质粒pL08。
除将glnA基因分别替换为Hsagat、Atagat、Cragat、Mpagat、Mragat或Akagat基因外，重组质粒pL03至pL08的构建方法与上述重组质粒pL01的构建方法相同。
将质粒pL01使用XhoI单酶切，电泳回收5500bp片段。使用Gibson连接方法，将使用引物P15和P16扩增的Akagat基因插入pL01质粒的XhoI位点。使用氨苄霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，提取阳性克隆质粒，测序结果表明Akagat基因插入了pL01质粒的正确位点。重组质粒构建正确，将该重组载体命名为pL02，表达谷氨酰胺合成酶与L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶。
引物序列如下：
P3：5’-CCATGGTGCGTGTGCGTTG-3’
P4:5’-GATGATGAGAGGTACCTCGAG-3’
P5：5’-CCATGGCCAACCCGTTCCGTAC-3’
P6:5’-CACCACTAGTACCAGATCTACCCTCGAG-3’
P7：5’-CCATGGAGACCCGTATTG-3’
P8:5’-CTCGAGTTAAATGATAAAACGGCTAACG-3’
P9：5’-CCATGGTTAACAGCTTCGACGAG-3’
P10:5’-CACCACTAGTACCAGATCTACCCTCGAG-3’
P11：5’-CCATGGCCACCGCGGTTCCG-3’
P12:5’-CACCACTAGTACCAGATCTACCCTCGAG-3’
P13：5’-CCATGGGTACCGACACCCGTA-3’
P14:5’-CACCACTAGTACCAGATCTACCCTCGAG-3’
P15：5’-AACTGT ATTTTGATTG CTAAAGGAGGAATTAACATGCGTACCGACACCCGTA-3’
P16:5’-CACCACTAGTACCAGATCTACCCTCGAGTTACACGTTCTGGTTCGGAAAG-3’
3、构建重组质粒pS01
大肠杆菌的鸟氨酸氨甲酰转移酶(ArgFI)编码基因有两个，分别为argI与argF。以大肠杆菌(Escherichia coli)K12基因组为模板，设计两对引物(P17、P18和P19、P20)，扩增得到鸟氨酸氨甲酰转移酶(ArgFI)的两个编码基因(argI与argF)，片段大小均约1000bp，与目的片段相符，经测序分析，结果表明扩增的得到的序列分别与NCBI上编号为GenBank:CP009273.1的argI基因序列与NCBI上编号为GenBank:CP009273.1的argF基因序列相同。
将本实验室构建的载体pSB1s(物理图谱见图2，质粒pSB1s是将专利CN104805047A中pDB1s质粒的1662bp-2460bp处的复制起始点换成序列3所示的repA复制起始位点得到的)使用NcoI和XhoI双酶切，电泳回收约4800bp片段。使用Gibson连接方法，将基因argF与argI按顺序(紧挨着)插入至pSB1s的NcoI和XhoI位点之间，测序结果表明argF与argI基因正确插入pSB1s的多克隆位点中。重组质粒构建正确，将该重组载体命名为pS01，表达鸟氨酸氨甲酰转移酶(ArgFI)。
引物序列如下：
P17:5’-GTGCCGCGCGGCAGCCTCGAGAGGAGGAATTAAATGTCCGATTTATACAAAAAACAC-3’
P18:5’-TTAATTCCTCCTGTGGCTGCTGCACTCACTCCCCAAGCGTTGC-3’
P19:5’-GTGCAGCAGCCACAGGAGGAATTAAATGTCCGGGTTTTATCATAAGC-3’
P20:5’-CACTAGTACCAGATCTACCCTCGAGTTATTTACTGAGCGTCGCG-3’
4、构建重组质粒pS02与pS03
以大肠杆菌(Escherichia coli)K12基因组为模板，设计一对引物(P21和P22)，扩增得到精氨酰琥珀酸合成酶(ArgG)的编码基因argG(GenBank:CP009273.1)，片段大小约1200bp，与目的片段相符。经测序分析，结果表明扩增的得到的序列与NCBI上编号为GenBank:CP009273.1的argG基因序列相同。
以大肠杆菌(Escherichia coli)K12基因组为模板，设计一对引物(P23和P24)，扩增得到精氨酰琥珀酸裂解酶(ArgH)的编码基因argH(GenBank:CP009273.1)，片段大小约1200bp，与目的片段相符，经测序分析，结果表明扩增的得到的序列与NCBI上编号为GenBank:CP009273.1的argH基因序列相同。
将质粒pS01使用XhoI单酶切，电泳回收7000bp片段。使用Gibson连接方法，将上述扩增的argG基因片段按顺序插入pS01的XhoI位点中。构建的重组质粒测序结果表明argG基因插入了pS01的正确位点。重组质粒构建正确，将该重组载体命名为pS02。采用上述方法将扩增的argH基因片段插入了pS02重组质粒的XhoI位点，测序正确，将此质粒命名为pS03。
引物序列如下：
P21:5’-CGCGACGCTCAGTAAATAACTCGAAGGAGGAATTAACCATGACGACGATTCTCAAGC-3’
P22:5’-CAGTTCATTACTGGCCTTTGTTTTCCAG-3’
P23:5’-GAAAACAAAGGCCAGTAACTCGAAGGAGGAATTAACCATGGCACTTTGGGGCGGG-3’
P24:5’-CACCACTAGTACCAGATCTACCCTCGAGTTACCCTAACCGAGCCTGCG-3’
5、构建重组质粒pS04
以大肠杆菌(Escherichia coli)K12基因组为模板，设计一对引物(P25和P26)，扩增得到天冬氨酸氨裂解酶(AspA)的编码基因aspA(GenBank:CP009273.1)，片段大小约1200bp，与目的片段相符，经测序分析，结果表明扩增的得到的序列与NCBI上编号为GenBank:CP009273.1的aspA基因序列相同。
采用与构建pS03质粒相同的方法，将上述aspA基因插入pS04的XhoI位点，测序结果表明aspA基因插入了pS04质粒的正确位点。重组质粒构建正确，将该重组载体命名为pS04，该质粒表达鸟氨酸氨甲酰转移酶、精氨酰琥珀酸合成酶、精氨酰琥珀酸裂解酶和天冬氨酸氨裂解酶。
引物序列如下：
P25:5’-CGCAGGCTCGGTTAGGGTAAAGGAGTAAAAGAGCCATGTCAAACAACATTCGTATCG-3’
P26:5’-CCACTAGTACCAGATCTACCCTCGAGTTACTGTTCGCTTTCATCAGT-3’
二、构建增强氨甲酰磷酸合成酶II基因及敲除甘氨酸代谢途径的大肠杆菌K12CG00
1、大肠杆菌突变体C00
对野生型大肠杆菌K12菌株BW25113进行染色体编辑，将野生型大肠杆菌K12菌株BW25113的氨甲酰磷酸合成酶II基因(carAB)的启动子区(基因组28288-28373)替换为CPA1启动子，得到大肠杆菌突变体C00。CPA1启动子核苷酸序列为序列4。
具体本实施例采用Cre-LoxP的方法(Fukiya,S.；Mizoguchi,H.；Mori,H.,Animproved method for deleting large regions of Escherichia coli K-12chromosome using a combination of Cre/loxP and lambda Red.FEMS Microbiol Lett2004,234(2),325-31.))构建大肠杆菌突变体C00。
2、大肠杆菌突变体G00与CG00
敲除大肠杆菌K12BW25113与K12C00的甘氨酸脱羧酶基因(gcvP)，分别得到大肠杆菌突变体G00与CG00。本实施例采用P1噬菌体介导的转染法构建大肠杆菌突变体G00与CG00，具体步骤如下：
(1)获得供体菌的P1：将供体菌BW25113 gcvP::Kan(国立遗传学研究所(NIG，Japan)，NIG编号为JW2871)接种于含10mM MgCl2、5mM CaCl2和0.1g/100ml葡萄糖的LB培养基中，培养1h，分别加入野生型P1噬菌体，培养1-3h。加几滴氯仿再摇几分钟，离心取上清即得噬菌体P1virΔgcvP。
(2)利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌敲除菌A：将大肠杆菌K12 C00(受体菌)过夜培养，取1.5mL菌体6000rpm离心2分钟后，用0.75mL的P1盐溶液(溶剂为水，溶质为10mMCaCl2和5mM MgSO4)重悬受体菌细胞，将100μl噬菌体P1virΔgcvP与100μl大肠杆菌K12C00细胞悬浮液混合，室温孵育30分钟，添加200μl浓度为1M的柠檬酸钠和1mL LB培养基，37℃继续培养1h，离心收集菌体，用100μl LB培养基重悬后，涂布在含卡那霉素的LB平板(卡那霉素浓度为50μg/mL)上，筛选阳性克隆(能在含卡那霉素的平板上生长的克隆)即C00ΔgcvP::Kan。
(3)消除卡那霉素抗性：利用Flp重组酶的质粒pCP20(CIontech)化学转化C00ΔgcvP::Kan，将C00ΔgcvP::Kan的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除。消除C00ΔgcvP::Kan的卡那霉素抗性，得到大肠杆菌突变体C00ΔgcvP(简称CG00)。
(4)以野生型大肠杆菌K12菌株BW25113的基因组DNA为模板，用引物对gcvP-F和gcvP-R进行PCR扩增，扩增得到大小约4000bp的片段。以CG00的基因组DNA为模板，用引物对gcvP-F和gcvP-R进行PCR扩增，扩增得到大小约1200bp的片段，对比野生型片段大小以及测序表明gcvP基因已敲除。引物结合位置分别为大肠杆菌K12的gcvP基因的上下游600bp位点。引物序列如下：
gcvP-F:5’-GAAATGCCGGTTAAAGTGAC-3’
gcvP-R:5’-CGTTGGTGGAAAGTACTCG-3’
结果表明：大肠杆菌突变体CG00是将大肠杆菌BW25113的氨甲酰磷酸合成酶II基因(carAB)的启动子替换为CPA1启动子，且敲除甘氨酸脱羧酶基因(gcvP)的突变体(简称CG00)。CG00的基因型为BW25113 PcarAB::PCPA1ΔgcvP。
G00的构建以K12菌株BW25113为受体菌，构建方法与上述方法一致。
甘氨酸脱羧酶基因(gcvP)(Gene ID:947394,updated on 11-OCT-2018)编码的甘氨酸脱羧酶的氨基酸序列的genebank号为AAC75941.1(提交日为24-SEP-2018)。
三、构建分别高产瓜氨酸、精氨酸与胍基乙酸的基因工程菌
将重组质粒pS01用氯化钙法转化大肠杆菌C00(基因型K12 PcarAB::PCPA1)，在链霉素平板上筛选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子命名为C01(基因型BW25113 PcarAB::PCPA1+argF/argI)；
将重组质粒pL01与pS01用氯化钙法共转化大肠杆菌C00，在氨苄青霉素与链霉素双抗平板上筛选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子命名为C11(基因型BW25113 PcarAB::PCPA1+glnA+argF/argI)。
将重组质粒pL01与pS03用氯化钙法共转化大肠杆菌C00，在氨苄青霉素与链霉素双抗平板上筛选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子命名为C13(基因型BW25113 PcarAB::PCPA1+glnA+argF/argI+argG+argH)；
将重组质粒pL01与pS04用氯化钙法共转化大肠杆菌C00，在氨苄青霉素与链霉素双抗平板上筛选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子命名为C14(基因型BW25113 PcarAB::PCPA1+glnA+argF/argI+argA+argH+AspA)。
将重组质粒pL08用氯化钙法转化大肠杆菌G00，在氨苄青霉素平板上筛选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子命名为G80(基因型BW25113ΔgcvP+Akagat基因)。
将重组质粒pL02和pS04用氯化钙法共同转化大肠杆菌CG00，在氨苄青霉素与链霉素双抗平板上筛选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子命名为CG24(基因型BW25113PcarAB::PCPA1+ΔgcvP+Akagat+glnA+argF/argI+argG+argH+AspA)。
实施例2、利用产胍基乙酸基因工程菌制备胍基乙酸
一、分别产瓜氨酸、精氨酸与胍基乙酸的基因工程菌的诱导
2YT培养基分步诱导：将产胍基乙酸的代谢基因工程菌CG24划线到含有质量百分比浓度为1.5％的琼脂粉，含50μg/mL的氨苄青霉素和50μg/mL的链霉素的LB平板上，37℃过夜振荡培养，转速200rpm；将过夜培养物以体积百分比为1％的接种量接种至2YT培养基中，37℃振荡培养2-3h至OD6000.5-0.8后，添加终浓度质量分数0.02％的L-阿拉伯糖，30℃，200rpm,培养12h。诱导后细胞，根据菌液的生长情况，取一定量菌体，于4℃，8000rpm离心10min，离心收集得到的菌体采用超声波破碎，得到细胞破碎液，对细胞破碎液进行离心分别取上清液和沉淀进行SDS-PAGE分析。
2YT培养基配方：组分浓度1.6％(W/V)蛋白胨，1％(W/V)酵母提取物，0.5％(W/V)氯化钠。
对照菌BW25113,其余产瓜氨酸基因工程菌C00、C01、C11，产精氨酸基因工程菌C13与C14以及产胍基乙酸基因工程菌G80的诱导方法除了将抗生素换成相应抗生素，其余与上述诱导方法相同。
二、全细胞催化法生产瓜氨酸、精氨酸与胍基乙酸
1、全细胞催化法测试瓜氨酸与精氨酸合成能力
以BW25113，C00(基因型BW25113 PcarAB::PCPA1)，C11(基因型BW25113 PcarAB::PCPA1+glnA+argF/argI)，C13(基因型BW25113 PcarAB::PCPA1+glnA+argF/argI+argG+argH)，C14(基因型BW25113 PcarAB::PCPA1+glnA+argF/argI+argG+argH+AspA)这5株菌中的任一菌株单独为工程菌，均同时进行如下实验：
将步骤一工程菌诱导后的细胞，于4℃，8000rpm/min，离心5min，用质量百分浓度为0.85％氯化钠水溶液洗涤2次后以相同的离心条件收集菌体，以OD600nm值为30的浓度重悬于1mL的转化底物液(100mM MOPS，20mM葡萄糖，10mM氯化镁，5mM磷酸氢二钾，0.1％Triton-X100，20mM鸟氨酸，100mM碳酸氢铵，pH7.5)中。将重悬后的菌液置于25×200(mm)(外径×长度)规格的试管中，30℃，200rpm/min，pH 7.5，转化12h，得到转化液。
将得到的转化液于4℃，12000rpm/min，离心5min,取上清，稀释20倍后，取100uL稀释液、100uL 0.5M碳酸氢钠与50uLDNFB(2，4-二硝基苯酚)反应液(1％DNFB溶于乙腈)，60℃反应12h后，加入750uL 0.01M磷酸二氢钾，混匀用0.22μm的滤膜过滤后，用HPLC检测瓜氨酸与精氨酸的产量。HPLC采用Agilent 1200高效液相色谱仪(配四元泵、DAD检测器和工作站)。色谱条件：Agilent C18column(4.6×150mm，5μm)；流动相：10％乙腈，10％50mM乙酸钠；流速：1mL/min，柱温25℃；进样量10μL，检测波长360nm。胍基乙酸标品购自TCI(TOKYOCHEMICAL INDUSTRY)公司。实验设三次重复，结果取平均值。
结果：瓜氨酸、精氨酸与鸟氨酸标准品的HPLC图谱如图3所示，从图中可见，瓜氨酸标准品的保留时间为14.013min，精氨酸标准品的保留时间为20.266min转化产物的HPLC图谱如图4所示，从图中可见，保留时间14.028min处为瓜氨酸的峰，保留时间20.296min为精氨酸的峰。
表1各个工程菌转化液中瓜氨酸的产量
Figure BDA0002011484530000131
从表1可以看出，全细胞催化12h，加强氨甲酰磷酸合成酶、鸟氨酸氨甲酰转移酶的C01菌株的瓜氨酸产量达到0.64g/L，是出发菌株BW25113的4.05倍。全细胞催化12h，加强谷氨酰胺合成酶表达的C11菌株的瓜氨酸产量达到1.49g/L，是未加强谷氨酰胺合成酶的C01菌株的2.3倍。实验表明，加强瓜氨酸合成途径以及加强谷氨酰胺合成酶的表达来提高谷氨酰胺供应都使瓜氨酸的产量有大幅度提升。
表2各个工程菌转化液中精氨酸的产量
Figure BDA0002011484530000141
从表2可以看出，全细胞催化12h，加强瓜氨酸至精氨酸的两个主要酶——精氨酰琥珀酸合成酶和精氨酰琥珀酸裂解酶的C13菌株的精氨酸产量达到0.71g/L。在此基础上，构建了加强天冬氨酸氨裂解酶的C14菌株，全细胞催化12h，C14菌株的精氨酸产量达到1.39g/L，是未加强天冬氨酸氨裂解酶的C13菌株的1.95倍。实验表明，加强精氨酸合成途径中的精氨酰琥珀酸合成酶和精氨酰琥珀酸裂解酶的表达，以及加强天冬氨酸氨裂解酶的表达来提高天冬氨酸供应等方法可以明显提高精氨酸的产量。
2、全细胞催化法测试胍基乙酸的合成能力
表3各个工程菌转化液中胍基乙酸的产量
Figure BDA0002011484530000142
以G80和CG24这2株菌中的任一菌株单独为工程菌，均同时进
行如下实验：
将步骤一工程菌诱导后的细胞，于4℃，8000rpm/min，离心5min，用质量百分浓度为0.85％氯化钠水溶液洗涤2次后以相同的离心条件收集菌体，以OD600nm值为30的浓度重悬于1mL的转化底物液(100mM MOPS，20mM葡萄糖，10mM氯化镁，5mM磷酸氢二钾，0.1％Triton-X100，0-150mM甘氨酸，0-50mM精氨酸，100mM碳酸氢铵，pH7.5)中。将重悬后的菌液置于25×200(mm)(外径×长度)规格的试管中，30℃，200rpm/min，pH 7.5，转化12-24h，得到转化液。
将得到的转化液于4℃，12000rpm/min，离心5min,取上清，用0.22μm的滤膜过滤后，用HPLC检测胍基乙酸的产量。HPLC采用Agilent 1200高效液相色谱仪(配四元泵、DAD检测器和工作站)。色谱条件：Waters NH2column(4.6×150mm,3.5μm)；流动相：75％乙腈，25％水，氨水调pH至10；流速：1mL/min，柱温35℃；进样量10μL，检测波长210nm。胍基乙酸标品购自TCI(TOKYO CHEMICAL INDUSTRY)公司。实验设三次重复，结果取平均值。
结果：胍基乙酸标准品的HPLC图谱如图5所示，从图中可见，胍基乙酸标准品的保留时间为6.371min。转化产物的HPLC图谱如图6所示，从图中可见，保留时间6.351min处为胍基乙酸的峰。
如图7和图8所示，胍基乙酸的产量如下：
全细胞催化12h，初始150mM甘氨酸、50mM精氨酸的条件下，未增强鸟氨酸循环的基因工程菌G80的胍基乙酸产量为12.3mM(1.44g/L)，增强鸟氨酸循环的基因工程菌CG24的胍基乙酸产量为43.5mM(5.09g/L)，生产强度0.42gl-1h-1。
全细胞催化24h，初始60mM甘氨酸、5mM精氨酸的条件下，没有增强鸟氨酸循环的基因工程菌G80的胍基乙酸产量为6.4±0.6mM(0.75±0.07g/L)，增强鸟氨酸循环的基因工程菌CG24的胍基乙酸产量为24.9±1.2mM(2.91±0.14g/L)。针对精氨酸而言，胍基乙酸转化率达到498％，证明鸟氨酸循环充分发挥了作用，精氨酸得到了循环利用。
从上述数据可见，增强鸟氨酸循环中的各个酶能够显著提高瓜氨酸以及精氨酸的产量，进而显著提高胍基乙酸的产量，从而大幅降低生产成本，有利于胍基乙酸的生产。通过上述方法实现利用大肠杆菌高效循环生产胍基乙酸在国内外尚属首次。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院微生物研究所
<120>产胍基乙酸的工程菌及其构建方法与应用
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1570
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
gtcgacctaa ttcccatgtc agccgttaag tgttcctgtg tcactgaaaa ttgctttgag 60
aggctctaag ggcttctcag tgcgttacat ccctggcttg ttgtccacaa ccgttaaacc 120
ttaaaagctt taaaagcctt atatattctt ttttttctta taaaacttaa aaccttagag 180
gctatttaag ttgctgattt atattaattt tattgttcaa acatgagagc ttagtacgtg 240
aaacatgaga gcttagtacg ttagccatga gagcttagta cgttagccat gagggtttag 300
ttcgttaaac atgagagctt agtacgttaa acatgagagc ttagtacgtg aaacatgaga 360
gcttagtacg tactatcaac aggttgaact gcggatcttg atgagtggat agtacgttgc 420
taaaacatga gataaaaatt gactctcatg ttattggcgt taagatatac agaatgatga 480
ggttttttta tgagactcaa ggtcatgatg gacgtgaaca aaaaaacgaa aattcgccac 540
cgaaacgagc taaatcacac cctggctcaa cttcctttgc ccgcaaagcg agtgatgtat 600
atggcgcttg ctcccattga tagcaaggaa cctcttgaac gagggcgagt tttcaaaatt 660
agggctgaag accttgcagc gctcgccaaa atcaccccat cgcttgctta tcgacaatta 720
aaagagggtg gtaagttact tggtgccagc aaaatttcgc taagagggga tgatatcatt 780
gcttcagcta aagagcttaa cctgctcttt actgctaaag actcccctga agagttagat 840
cttaacatta ttgagtggat agcttattca aatgatgaag gatacttgtc tttaaaattc 900
accagaacca tagaaccata tatctctagc cttattggga aaaaaaataa attcacaacg 960
caattgttaa cggcaagctt acgcttaagt agccagtatt catcttctct ttatcaactt 1020
atcaggaagc attactctaa ttttaagaag aaaaattatt ttattatttc cgttgatgag 1080
ttaaaggaag agttaatagc ttatactttt gataaagatg gaagtattga gtacaaatac 1140
cctgactttc ctatttttaa aagggatgta ttaaataaag ccattgctga aattaaaaag 1200
aaaacagaaa tatcgtttgt tggctttact gttcatgaaa aagaaggaag aaaaattagt 1260
aagctgaagt tcgaatttgt cgttgatgaa gatgaatttt ctggcgataa agatgatgaa 1320
gcttttttta tgaatttatc tgaagctaat gcagcttttc tcaaggtatt tgatgaaacc 1380
gtacctccca aaaaagctaa ggggtgatat atggctaaaa tttacgattt ccctcaagga 1440
gccgaacgcc gcaggatgca ccgcaaaatc cagtggaaca acgctgtaaa attatctaaa 1500
aatggctgga gtaagccaga ggttaaacgc tggtcttttt tagcattcat ctcaactggc 1560
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<210> 2
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
gcggccgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 60
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aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc 180
acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt 240
acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt 300
ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtgatac actattatcc cgtattgacg 360
ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 420
caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 480
ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 540
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aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa 660
tgccaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac 720
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cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca 840
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<213> Artificial sequence
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gatggtcgga gacaaaagga atattcagcg atttgcccga gcttgcgagg gtgctactta 240
agcctttagg gttttaaggt ctgttttgta gaggagcaaa cagcgtttgc gacatccttt 300
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aaacacacaa aggtctagcg gaatttacag agggtctagc agaatttaca agttttccag 480
caaaggtcta gcagaattta cagataccca caactcaaag gaaaaggtct agtaattatc 540
attgactagc ccatctcaat tggtatagtg attaaaatca cctagaccaa ttgagatgta 600
tgtctgaatt agttgttttc aaagcaaatg aactagcgat tagtcgctat gacttaacgg 660
agcatgaaac caagctaatt ttatgctgtg tggcactact caaccccacg attgaaaacc 720
ctacaaggaa agaacggacg gtatcgttca cttataacca atacgctcag atgatgaaca 780
tcagtaggga aaatgcttat ggtgtattag ctaaagcaac cagagagctg atgacgagaa 840
ctgtggaaat caggaatcct ttggttaaag gctttgagat tttccagtgg acaaactatg 900
ccaagttctc aagcgaaaaa ttagaattag tttttagtga agagatattg ccttatcttt 960
tccagttaaa aaaattcata aaatataatc tggaacatgt taagtctttt gaaaacaaat 1020
actctatgag gatttatgag tggttattaa aagaactaac acaaaagaaa actcacaagg 1080
caaatataga gattagcctt gatgaattta agttcatgtt aatgcttgaa aataactacc 1140
atgagtttaa aaggcttaac caatgggttt tgaaaccaat aagtaaagat ttaaacactt 1200
acagcaatat gaaattggtg gttgataagc gaggccgccc gactgatacg ttgattttcc 1260
aagttgaact agatagacaa atggatctcg taaccgaact tgagaacaac cagataaaaa 1320
tgaatggtga caaaatacca acaaccatta catcagattc ctacctacgt aacggactaa 1380
gaaaaacact acacgatgct ttaactgcaa aaattcagct caccagtttt gaggcaaaat 1440
ttttgagtga catgcaaagt aagcatgatc tcaatggttc gttctcatgg ctcacgcaaa 1500
aacaacgaac cacactagag aacatactgg ctaaatacgg aaggatctga ggttcttatg 1560
gctcttgtat ctatcagtga agcatcaaga ctaacaaaca aaagtagaac aactgttcac 1620
cgttagatat caaagggaaa actgtcgata tgcacagatg aaaacggtgt aaaaaagata 1680
gatacatcag agcttttacg agtttttggt gcatttaaag ctgttcacca tgaacagatc 1740
gacaatgtaa cagatgaaca gcatgtaaca cctaatagaa caggtgaaac cagtaaaaca 1800
aagcaactag aacatgaaat tgaacacctg agacaacttg ttacagctca acagtcacac 1860
atagacagcc tgaaacaggc gatgctgctt atcgaatcaa agctgccgac aacacgggag 1920
ccagtgacgc ctcccgtggg gaaaaaatca tggcaattct ggaagaaata gcgctttcag 1980
ccggcaaacc tgaagccgga tctgcgattc tgataacaaa ctagcaacac cagaacagcc 2040
cgtttgcggg cagcaaaacc c 2061
<210> 4
<211> 184
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
ttatcaaaaa gagtattgac ataaagtcta acctatagat aattacagcc atcgagaggg 60
acacggcgat ttgctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaagaat tcaaaagatc ttttaagaag gagatataca 180
tatg 184

Claims (10)

1.一种产胍基乙酸工程菌的构建方法，包括如下步骤：将与胍基乙酸合成相关基因L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶编码基因导入宿主菌，得到产胍基乙酸工程菌；所述宿主菌为大肠杆菌或突变型大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶为如下A1-A6任一种：
A1.Amycolatopsis kentuckyensis来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶；
A2、Homo sapien来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶；
A3.Actinokineospora terrae来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶；
A4.Cylindrospermopsis raciborskii来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶；
A5.Moorea producens来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶；
A6.Micromonospora rifamycinica来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述突变型大肠杆菌为按照如下a1至a7的至少1种的方式制备的重组大肠杆菌：
a1.提高所述大肠杆菌中氨甲酰磷酸合成酶II编码基因的表达或活性；
a2.提高所述大肠杆菌中鸟氨酸氨甲酰转移酶编码基因的表达或活性；
a3.提高所述大肠杆菌中谷氨酰胺合成酶编码基因的表达或活性；
a4.提高所述大肠杆菌中精氨酰琥珀酸合成酶编码基因的表达或活性；
a5.提高所述大肠杆菌中精氨酰琥珀酸裂解酶编码基因的表达或活性；
a6.提高所述大肠杆菌中天冬氨酸裂氨酶编码基因的表达或活性；
a7.降低或抑制所述大肠杆菌中甘氨酸脱羧酶编码基因的表达或活性。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述突变型大肠杆菌为按照所述a1至a7中全部方式制备的重组大肠杆菌。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：
a1中，所述提高所述大肠杆菌中氨甲酰磷酸合成酶II编码基因的表达或活性为将大肠杆菌中氨甲酰磷酸合成酶II编码基因的启动子替换为CPA1启动子；
或，a2-a6中，提高各个编码基因的表达或活性为将各个编码基因导入所述大肠杆菌中；
或，a7中，所述降低或抑制大肠杆菌中甘氨酸脱羧酶编码基因的表达或活性为敲除所述大肠杆菌中甘氨酸脱羧酶编码基因。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述将各个编码基因导入所述大肠杆菌中为将表达各个基因的重组载体导入所述大肠杆菌中。
7.一种大肠杆菌突变体，为权利要求3-6任一方法中的所述大肠杆菌突变体。
8.由权利要求1-6任一方法制备的产胍基乙酸工程菌。
9.权利要求8所述的产胍基乙酸工程菌在制备胍基乙酸中的应用；
或，权利要求7所述的大肠杆菌突变体在制备瓜氨酸或精氨酸或产胍基乙酸中的应用。
10.一种制备胍基乙酸的方法，包括如下步骤：
将权利要求1所述的产胍基乙酸的基因工程菌经阿拉伯糖诱导培养得到诱导后重组菌，用所述诱导后重组菌催化精氨酸与甘氨酸反应，得到胍基乙酸。
或，一种制备瓜氨酸和/或精氨酸的方法，包括如下步骤：
将权利要求7所述的大肠杆菌突变体经阿拉伯糖诱导培养得到诱导后重组菌，用所述诱导后重组菌催化鸟氨酸反应，得到瓜氨酸和/或精氨酸。
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