CN114107159B - 一种高产β-丙氨酸生产菌、构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高产β‑丙氨酸生产菌、构建方法及应用。所述高产β‑丙氨酸生产菌是以E.coli ALA4为出发菌，将其基因组中的cycA基因敲除，导入整合了Bacillus subtilis来源panD，aspA，Corynebacterium glutamicum来源的aspB和pyc的pTrc99A‑panDaspBaspApyc质粒，并对Bacillus subtilis来源panD进行定点突变所得。本发明构建所得β‑丙氨酸生产菌在补料发酵过程中，β‑丙氨酸产量可达85.18g/L，具有重要的工业应用价值。

Description

一种高产β-丙氨酸生产菌、构建方法及应用
技术领域
本发明涉及一种高产β-丙氨酸生产菌、构建方法及应用，属于代谢工程领域。
背景技术
β-丙氨酸（3-氨基丙酸）是一种非蛋白质氨基酸，存在于所有生物中。β-丙氨酸作为泛酸的重要组成部分，是辅酶A和酰基载体蛋白合成的前体。以往的研究表明，在微生物体内，缺乏β-丙氨酸合成途径是致命的，因为不能合成辅酶A。另外，β-丙氨酸也可作为补品，被体内吸收后，可与组氨酸偶联形成二肽，在人体肌肉和脑组织中起重要作用。因此，β-丙氨酸广泛应用于药物（如帕米膦酸和胍丙酸和巴尔）、饲料和食品添加剂等领域。
目前β-丙氨酸的合成方法主要有化学催化法、酶法和微生物发酵法，其中化学催化法是工业生产β-丙氨酸的主要方法。然而，以丙烯酰胺、丁二酰亚胺或β-氨基丙腈为原料的化学催化法，由于环境和社会的压力，是不可持续的。因此，利用酶法和微生物发酵法生产β-丙氨酸，引起了学者的兴趣。目前，许多生物的ADC被表征，然后被用于酶法生产β-丙氨酸。虽然酶法合成β-丙氨酸取得了很大进展，并初步满足了工业应用的需要，但微生物发酵法仍是一种很有前途的工业生产方法。β-丙氨酸是以草酰乙酸和富马酸为前体合成的天门冬氨酸衍生物。利用三羧酸循环的还原途径合成β-丙氨酸，在理论产量和能量消耗方面具有优势。然而在需氧发酵过程中，完全通过三羧酸循环的还原途径来合成β-丙氨酸是不可能的，所以通过其他路线来合成β-丙氨酸是研究的重点。
发明内容
本发明的目的是通过代谢工程技术，提供一种高产β-丙氨酸生产菌、构建方法及应用，满足β-丙氨酸工业应用的需要。
为实现本发明的上述目的，本发明采用的技术方案：
一种高产β-丙氨酸生产菌，由如下方法构建获得：
（1）以E. coli W3110为出发菌，将其基因组中panD基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株E. coli W3110/Trc-panD，记为ALA1；
（2）将源自Bacillus subtilis的外源基因panD整合入质粒pTrc99A中，得到质粒pTrc99A-panD；将质粒pTrc99A-panD导入步骤ALA1中，增强panD基因的表达，得到重组菌株，记为ALA2；
（3）将ALA2基因组中的ppc基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株ALA2/Trc-ppc，记为ALA3；
（4）将ALA3基因组中的pykA基因敲除，得到重组菌株ALA3/△pykA，记为ALA4；
（5）将ALA4基因组中的cycA基因敲除，得到重组菌株E. coli ALA4/Δ-cycA，记为ALA6；
（6）将外源基因aspB整合入质粒pTrc99A-panD中，得到质粒pTrc99A-panDaspB；将基因aspA整合入质粒pTrc99A-panDaspB，得到质粒pTrc99A-panDaspBaspA；将外源基因pyc整合入质粒pTrc99A-panDaspBaspA，得到质粒pTrc99A-panDaspBaspApyc；
（7）对panD基因进行定点突变，得到突变后质粒pTrc99A-panD K104S aspBaspApyc，将其转入ALA6中，得到菌株ALA11，即为所述β-丙氨酸生产菌。
大肠杆菌中β-丙氨酸生物合成途径及本发明涉及的基因工程改造示意图参见图1。首先，在出发菌E. coli W3110的基础上，用Trc启动子替换基因panD的原始启动子，促进天冬氨酸转化为β-丙氨酸；再将Bacillus subtilis来源的panD整合到质粒pTrc99A质粒中，并导入工程菌中，进一步促进天冬氨酸转化为β-丙氨酸；然后，通过启动子替换，强化基因ppc的表达，增强天冬氨酸合成的前体草酰乙酸的供应；再通过敲除基因pykA，降低碳通量流入TCA循环；再将其基因组上的cycA基因敲除，降低大肠杆菌对β-丙氨酸的摄取；其次依次过表达基因aspB（C. glutamicum来源），aspA和pyc，分别强化草酰乙酸转化为天冬氨酸，富马酸转化为天冬氨酸和丙酮酸转化为草酰乙酸。最后通过对panD基因定点突变，最终得到高产β-丙氨酸生产菌株。
本发明还涉及构建所述β-丙氨酸生产菌的方法，所述方法如下：
（1）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将出发菌E. coli W3110基因组中的panD基因的启动子替换成Trc启动子，得到重组菌株W3110/Trc-panD，记为ALA1；
（2）将源自Bacillus subtilis的外源基因panD整合入质粒pTrc99A中，得到质粒pTrc99A-panD；将质粒pTrc99A-panD导入步骤ALA1中，增强panD基因的表达，得到重组菌株，记为ALA2；
（3）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将ALA2基因组中的ppc基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株ALA2/Trc-ppc，记为ALA3；
（4）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将ALA3基因组中的pykA基因敲除，得到重组菌株ALA3/ΔpykA，记为ALA4；
（5）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将ALA4基因组中的cycA基因敲除，得到重组菌株ALA4/Δ-cycA，记为ALA6；
（6）将外源基因aspB整合入质粒pTrc99A-panD中，得到质粒pTrc99A-panDaspB；将基因aspA整合入质粒pTrc99A-panDaspB，得到质粒pTrc99A-panDaspBaspA；将外源基因pyc整合入质粒pTrc99A-panDaspBaspA，得到质粒pTrc99A-panDaspBaspApyc；
（7）对panD基因进行定点突变（突变位点为K104S，突变体panD K104S核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，编码SEQ ID No.11所示氨基酸），得到突变后质粒pTrc99A-panD K104S aspBaspApyc，将其转入ALA6中，得到菌株ALA11，即为所述β-丙氨酸生产菌。
具体的，步骤（1）Trc启动子核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
具体的，步骤（2）外源基因panD核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
具体的，步骤（6）外源基因aspB核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，aspA基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，外源基因pyc核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。本发明还涉及所述β-丙氨酸生产菌在微生物发酵制备β-丙氨酸中的应用。
具体的，所述应用为：将所述β-丙氨酸生产菌接种至发酵培养基中，于28~32 ℃、400~800 rpm条件下进行发酵培养48~100h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到β-丙氨酸；所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10~30g/L、硫酸铵10~20g/L、酵母浸粉1~5g/L、KH2PO41~5g/L、MgSO4 0.1~2.0g/L、甜菜碱0.1~1.0g/L、微量金属盐溶液0.5~5mL/L，pH 6.5~7.0，溶剂为去离子水；微量金属盐溶液组成为：10 g/L CuCl2、10 g/L FeSO4·7H2O、1 g/LZnSO4·7H2O、0.20 g/L CuSO4、0.02 g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
优选的，所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20 g/L，硫酸铵16 g/L，酵母粉2 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4 0.5 g/L，甜菜碱0.5 g/L，盐溶液 2 mL/L，溶剂为去离子水
通常，所述基因工程菌株发酵前，先接种至LB培养基中，于温度37℃、转速200 rpm的摇床上过夜培养，然后以体积浓度5~15%接种量接种到发酵培养基中培养。
本发明有益效果主要体现在：本发明通过启动子替换过表达基因panD，并引入B. subtilis来源的panD导入到工程菌中，强化天冬氨酸转化为β-丙氨酸。同时通过启动子替换，强化基因ppc的表达，增强天冬氨酸合成的前体草酰乙酸的供应。再通过敲除基因pykA，降低碳通量流入TCA循环；最后，通过敲除cycA基因，降低大肠杆菌对β-丙氨酸的摄取；再通过过表达外源aspB、内源aspA和外源pyc，分别强化草酰乙酸转化为天冬氨酸，富马酸转化为天冬氨酸和丙酮酸转化为草酰乙酸。最后，通过对外源panD进行定点突变，最终得到β-丙氨酸生产菌株，其在补料发酵过程中，β-丙氨酸产量可达85.18g/L，具有重要的工业应用前景。
附图说明
图1为大肠杆菌中β-丙氨酸生物合成途径及本发明涉及的基因工程改造示意图；
图2为质粒pTrc99A-panDaspBaspApyc图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下实施例中，所述卡那霉素（kana）的使用终浓度为50ng/μL，盐酸壮观霉素（SD）的使用终浓度为50ng/μL。实施例中所用大肠杆菌感受态细胞为商用购买的大肠杆菌DH5α，重组反应所用的一步法定向克隆无缝克隆试剂盒购于诺唯赞公司，但不局限于此公司。
实施例1：ALA1菌株的构建
构建β-丙氨酸生产菌株采用的基因编辑方法参照文献（Zhang, B., et al.,Metabolic engineering of Escherichia coli for D-pantothenic acid production.Food Chem, 2019. 294: p. 267-275.），该编辑方法使用的工具质粒为pTarget和pCas，具体进行方法如下：
ALA6菌株的构建是以E. coli W3110为出发菌株
（1）pTarget-gRNA质粒突变
设计定点突变引物，将质粒pTarget上20bp同源序列突变成靶基因panD启动子中PAM位点前的20bp序列。以pTarget质粒为模板，pT-TpanD-F和pT-TpanDR为引物，PCR扩增pTarget突变质粒，扩增体系如下：
组分 体积（20 µL）
2×Phanta buffer 10 µL
dNTP mix 1 µL
Template（pTarget） 0.5 µL
Primer 0.5 µL
Phanta Max 0.5 µL
H2O to 20 µL
PCR扩增结束后，利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，然后向PCR产物中加入0.5μL的DpnI，37℃消化1h，取消化产物10μL加入到100μL的DH5α感受态细胞中进行转化实验，然后将培养液涂布于LB固体培养基（SD抗性），37℃培养过夜。挑取单菌落接种于10mL的LB液体培养基（SD抗性）中，培养18h以上，取菌液送测序并提取突变质粒pTarget-panD-g备用。
（2）PCR扩增donor DNA和线性化pTarget-panD-g质粒片段
以大肠杆菌基因组为模板，分别以TpanD-P1、TpanD-P2和TpanD-P3、TpanD-P4为引物PCR扩增出靶基因上下游各约500bp序列作为同源臂（donor DNA）。以pT+D CF com、pT+DCR com为引物，pTarget-panD-g为模板，PCR扩增pTarget-panD-g线性化质粒片段。扩增体系如下：
组分 体积（50 µL）
2×Phanta buffer 25 µL
dNTP mix 2 µL
Template（pTarget） 1 µL
Primer 1 µL
Phanta Max 1 µL
H2O to 50 µL
PCR扩增结束后，利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，然后向线性化pTarget-panD-g质粒片段中加入1μL的DpnI，37℃消化1h。然后使用DNA清洁试剂盒对DpnI消化产物和PCR扩增产物donor DNA进行clean up，并检测清洁后产物的DNA浓度，-20℃保存备用。
（3）一步克隆连接线性化pTarget-panD-g质粒片段和donor DNA
取（2）中清洁后的产物，根据线性化pTarget-panD-g质粒片段和donor DNA的浓度，利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒进行重组反应。取一步克隆产物10μL加入到100μL的DH5α感受态细胞中进行转化实验，然后将培养液涂布于LB固体培养基（SD抗性）上，37℃培养过夜。待长出单菌落，挑取单菌落接种到10mL的LB液体培养基（SD抗性）中，送测序并提取质粒pTarget-panD-pdg备用。
（4）pTarget-panD-pdg的电击转化
制备含pCas质粒的W3110菌株的电转感受态。取一只电转感受态，冰浴放置，在超净台中加入2μL pTarget-panD-pdg，用移液器轻柔混匀，冰浴1min；用移液器将混匀液转移至预冷的2mm电击杯中（电击杯需提前在超净台风干），冰浴45S。用纸巾擦干电击杯外侧水雾，置于电转仪中，使用Eco 2档电击。在超净台中向电击杯凹槽加入1mL预冷LB培养基，倾斜电击杯，从电击杯口吸取全部菌液，转移至2mL无菌EP管中。30℃，180rpm复苏2.5h以上；取200μL涂布于LB固体培养基（SD+kana抗性）上，30℃培养过夜。
（5）阳性克隆筛选和验证
在各靶标基因上游同源臂外侧100bp处设计正向验证引物TpanD-VF，替换的Trc启动子上设计反向验证引物Trc-VR，并以此为正反引物，挑取克隆子作为模板，进行菌落PCR，同时以原基因组为模板作阴性对照。菌落PCR有条带的视为阳性。
（6）pTarget-pdg与pCas消除与测序验证
将阳性克隆接种于10 mL LB试管（kana抗性），并加入10μL IPTG母液，30℃，180rpm培养12h。取过夜培养菌液划线于LB固体培养基（kana抗性）上，30℃培养过夜。取过夜划线平板，将单菌落编号，并挑取编号的部分单菌落，划线于LB固体培养基（SD抗性）上所对应的区域，37℃培养过夜。在LB固体培养基（SD抗性）所对应的区域不能生长的单菌落为pTarget-panD-pdg成功消除的克隆。
将pTarget-panD-pdg成功消除的克隆接种于10 mL LB试管（无抗性），37℃，180rpm培养12h。取过夜培养菌液，划线于LB固体培养基（无抗性）上，37℃培养过夜。取过夜培养菌液，将单菌落编号，并挑取编号的部分单菌落，划线于LB固体培养基（kana抗性）上所对应的区域，30℃培养过夜。在LB固体培养基（kana抗性）所对应的区域不能生长的单菌落为pCas成功消除的克隆。
（7）阳性克隆测序验证
挑取pTarget-pdg与pCas均成功消除的克隆作为菌落PCR模板，以验证引物进行菌落PCR，菌落PCR产物送测序，验证阳性克隆，得到ALA1。
实施例2：pTrc99A-panD质粒的构建
以pTrc99A质粒（实验室保藏）为模板，pTrc99A-F、pTrc99A-R为引物，PCR扩增线性化质粒片段，同时以panD-F、panD-R为引物，B. subtilis基因组为模板，扩增panD片段（SEQID No.2）。利用DpnI消化扩增的线性化质粒片段，然后使用clean up试剂盒对消化后的线性化pTrc99A载体片段和panD片段进行清洁，再利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒进行重组反应，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞后，涂布在含有卡那霉素的LB平板上。阳性克隆送测序公司测序，确定连接成功的质粒pTrc99A-panD。将构建的质粒pTrc99A-panD转化入ALA1得到菌株ALA2。
实施例3：Trc启动子替换基因ppc的原始启动子构建菌株ALA3
（1）pTarget-gRNA质粒突变
以pTarget为模板，Tppc-pT F和Tppc-pT R为引物，PCR扩增pTarget突变质粒。PCR产物经消化处理后，转化进入DH5α感受态细胞，经测序验证，得到突变质粒pTarget-ppc-g。
（2）构建质粒pTarget-ppc-pdg
以Tppc-P1、Tppc-P2和Tppc-P3、Tppc-P4为引物PCR扩增靶基因上下游donor DNA。同时以p T+D CF com、p T+D CR com为引物，pTarget-ppc-g为模板，PCR扩增线性化pTarget-ppc-g质粒片段。DpnI消化处理PCR扩增的pTarget-ppc-g线性化质粒片段后，使用DNA清洁试剂盒对消化后的线性化pTarget-ppc-g质粒片段和donor DNA进行clean up，再利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒进行重组反应，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞后，经测序验证后得到质粒pTarget-ppc-pdg。
（3）pTarget-ppc-pdg的电击转化
制备含pCas质粒的ALA2菌株的电转感受态。取一只电转感受态，在超净台中加入2μL pTarget-ppc-pdg，冰浴1min后转移至预冷的2mm电击杯中，冰浴45s。置于电转仪中进行电击。电击后立即向杯凹槽中加入1mL预冷LB培养基，倾斜电击杯，从电击杯口吸取全部菌液，转移至2mL无菌EP管中。30℃，180rpm复苏2.5h以上；取200μL涂布于LB固体培养基（SD+kana抗性）上，30℃培养过夜。
后续基因编辑、验证及质粒消除同实施例1（4-7），得到菌株ALA3。
实施例4：敲除基因pykA构建菌株ALA4
（1）pTarget-gRNA质粒突变
以pTarget为模板，ΔpykA-pT F和ΔpykA-pT R为引物，PCR扩增pTarget突变质粒。PCR产物经消化处理后，转化进入DH5α感受态细胞，经测序验证，得到突变质粒pTarget-pykA-g。
（2）构建质粒pTarget-pykA-pdg
以ΔpykA-P1、ΔpykA-P2和ΔpykA-P3、ΔpykA-P4为引物PCR扩增靶基因上下游donor DNA。同时以pT+D CF com、pT+D CR com为引物，pTarget-pykA-pdg为模板，PCR扩增线性化pTarget-pykA-g质粒片段。DpnI消化处理PCR扩增的pTarget-pykA-g线性化质粒片段后，使用DNA清洁试剂盒对消化后的线性化pTarget-pykA-g质粒片段和donor DNA进行clean up，再利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒进行重组反应，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞后，经测序验证后得到质粒pTarget-pykA-pdg。
（3）pTarget-pykA-pdg的电击转化
制备含pCas质粒的ALA3菌株的电转感受态。取一只电转感受态，在超净台中加入2μL pTarget-pykA-pdg，冰浴1min后转移至预冷的2mm电击杯中，冰浴45s。置于电转仪中进行电击。电击后立即向杯凹槽中加入1mL预冷LB培养基，倾斜电击杯，从电击杯口吸取全部菌液，转移至2mL无菌EP管中。30℃，180rpm复苏2.5h以上；取200μL涂布于LB固体培养基（SD+kana抗性）上，30℃培养过夜。
后续基因编辑、验证及质粒消除同实施例1（4-7），得到菌株ALA4。
实施例5：工程菌ALA6菌株的构建
（1）pTarget-gRNA质粒突变
以pTarget为模板，ΔcycA-pT-F和ΔcycA-pT-R为引物，PCR扩增pTarget突变质粒。PCR产物经消化处理后，转化进入DH5α感受态细胞，经测序验证，得到突变质粒pTarget-cycA-g。
（2）构建质粒pTarget-cycA-pdg
以ΔcycA-P1、ΔcycA-P2和ΔcycA-P3、ΔcycA-P4为引物PCR扩增靶基因上下游donor DNA。同时以pT+D CF com、pT+D CR com为引物，pTarget-cycA-pdg为模板，PCR扩增线性化pTarget-cycA-g质粒片段。DpnI消化处理PCR扩增的pTarget-cycA-g线性化质粒片段后，使用DNA清洁试剂盒对消化后的线性化pTarget-cycA-g质粒片段和donor DNA进行clean up，再利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒进行重组反应，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞后，经测序验证后得到质粒pTarget-cycA-pdg。
（3）pTarget-cycA-pdg的电击转化
制备含pCas质粒的ALA4菌株的电转感受态。取一只电转感受态，在超净台中加入2μL pTarget-cycA-pdg，冰浴1min后转移至预冷的2mm电击杯中，冰浴45s。置于电转仪中进行电击。电击后立即向杯凹槽中加入1mL预冷LB培养基，倾斜电击杯，从电击杯口吸取全部菌液，转移至2mL无菌EP管中。30℃，180rpm复苏2.5h以上；取200μL涂布于LB固体培养基（SD+kana抗性）上，30℃培养过夜。
后续基因编辑、验证及质粒消除同实施例1（4-7），得到菌株ALA6。
实施例6：pTrc99A-panDaspBaspApyc质粒的构建
以pTrc99A-panD质粒为模板，pTrc99A-F、pTrc99A-R为引物，PCR扩增线性化质粒片段，同时以aspB-F、aspB-R为引物，C. glutamicum基因组为模板，扩增aspB片段。利用DpnI消化扩增的线性化质粒片段，然后使用clean up试剂盒对消化后的线性化pTrc99A-panD载体片段和aspB片段进行清洁，再利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒进行重组反应，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞后，涂布在含有卡那霉素的LB平板上。阳性克隆送测序公司测序，确定连接成功的质粒pTrc99A-panDaspB。质粒pTrc99A-panDaspBaspA和pTrc99A-panDaspBaspApyc以同样的方法构建得到。最后将构建的质粒pTrc99A-panDaspBaspApyc转化入ALA6得到菌株ALA7。
实施例7：panD基因突变，构建菌株ALA8，ALA9，ALA10和ALA11
设计定点突变引物，以pTrc99A-panDaspBaspApyc质粒为模板，扩增pTrc99A-panD I46V aspBaspApyc质粒。扩增产物首先通过Dpn Ⅰ消化，除去模板。其次，对消化的产物进行clean up，得到的产物通过化学转化转入大肠杆菌DH5α中，然后将菌液涂布于含有卡那霉素的LB平板上，挑取单菌落培养，并提取质粒送测序公司测序，得到pTrc99A-panD I46V aspBaspApyc质粒。质粒pTrc99A-panD V68I aspBaspApyc；pTrc99A-panD I88M aspBaspApyc以及pTrc99A-panD K104S aspBaspApyc以同样的方法获得，外源基因panD突变体panD I46V、突变体panD V68I、突变体panD I88M和突变体panD K104S核苷酸序列分别如SEQ IDNo.7~10所示。然后将上述质粒分别导入ALA6中，得到重组菌株ALA8，ALA9，ALA10和ALA11。
表1：菌株基因型
Strains/Plasmids Genotype
ALA4 E. coli W3110/Trc-panD/Trc-ppc/∆pykA/pTrc99A-panD
ALA6 ALA4/∆cycA
ALA7 ALA6/pTrc99A-panDaspBaspApyc
ALA8 ALA6/pTrc99A-panD I46V aspBaspApyc
ALA9 ALA6/pTrc99A-panD V68I aspBaspApyc
ALA10 ALA6/pTrc99A-panD I88M aspBaspApyc
ALA11 ALA6/pTrc99A-panD K104S aspBaspApyc
pTrc99A-panD pTrc99a（K）, KanR, containing panD gene from B. subtilis with pTrc RBS sequence
pTrc99A-panDaspB pTrc99a（K）, KanR, containing panD gene from B. subtilis and aspB gene from C. glutamicum
pTrc99A-panDaspBaspA pTrc99a（K）, KanR, containing panD gene from B. subtilis, aspBgene from C. glutamicum and native aspAgene
pTrc99A-panDaspBaspApyc pTrc99a（K）, KanR, containing panD gene from B. subtilis, aspBgene from C. glutamicum, native aspAgene andpyc gene from C. glutamicum
pTrc99A-panD I46V aspBaspApyc plasmid pTrc99A-panDaspBaspApyc with a mutant of panD I46V
pTrc99A-panD V68I aspBaspApyc plasmid pTrc99A-panDaspBaspApyc with a mutant of panD V68I
pTrc99A-panD I88M aspBaspApyc plasmid pTrc99A-panDaspBaspApyc with a mutant of panD I88M
pTrc99A-panD K104S aspBaspApyc plasmid pTrc99A-panDaspBaspApyc with a mutant of panD K104S
表2：引物序列表
Primers Sequence
Gene-editing
pT+D CF com CTGCAGAAGCTTAGATCTATTACCC
pT+D CR com TCTAGAGAATTCAAAAAAAGCACCG
ΔcycA-pT-F TAATACTAGTCGATATTAGGTAACAATACGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
ΔcycA-pT-R GCTCTAAAACCGTATTGTTACCTAATATCGACTAGTATTATACCTAGGAC
ΔcycA-P1 CGGTGCTTTTTTTGAATTCTCTAGAAAGGTGTGAATAGCACCGAATC
ΔcycA-P2 TGAGATTGCGAGTGAGTGTCATATCACGGTG
ΔcycA-P3 GACACTCACTCGCAATCTCACAAACCGAC
ΔcycA-P4 GGGTAATAGATCTAAGCTTCTGCAGGACGACAATCAGCGACACAATG
ΔcycA-VF GCTGCTGAAGGTGTGAAATAC
Plasmid construction
pTrc99a-F ATCCTCTAGAGTCGACCTGCAG
pTrc99a-D-R TGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACCTACAAAATTGTACGGGCTG
aspBcg-F GAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGAGTTCAGTTTCGCTGCAG
aspBcg-R CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATTTAGTTAGCGTAATGCTCCGC
pTrc99a-DB-R TGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACTTAGTTAGCGTAATGCTCCGC
aspA-F GAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGTCAAACAACATTCGTATCG
aspA-R CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATTTACTGTTCGCTTTCATCAGTA
pTrc99a-DBA-R CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATTTACTGTTCGCTTTCATCAGTA
pyccg-F GAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGTCGACTCACACATCTTC
pyccg-R GCAGGTCGACTCTAGAGGATTTAGGAAACGACGACGATC
panDbs-I46V-F AAAAGTACAAGTTGTGAATAATAATAATGGAGCACG
PanDbs-I46V-R TATTATTCACAACTTGTACTTTTTCATTAGGAAGCAT
panDbs-V68I-F CGGAAGCGGCATTATCTGCTTAAACGGTGCAGCCG
panDbs-V68I-R TTAAGCAGATTAAGCCGCTTCCGCGTTTACCAG
PanDbs-I88M-F TCATTATTATGTCCTACAAAATGATGTCTGATC
PanDbs-I88M-R TTTTGTAGGACATAATAATGACCTTATCTCCTTCC
PanDbs-K104S-F CCATGAGCCGAGCGTGGCTGTTCTGAATGATCAAAAC
PanDbs-K104S-F GAACAGCCACGCTCGGCTCATGGCTTGCC
实施例8：工程菌株的摇瓶发酵和发酵罐发酵
菌种活化：取-80℃保藏菌种划线接种于活化培养基（固体LB培养基）中，37℃培养过夜；
种子培养：用接种环挑取活化种子接种于装有10mL种子培养基（LB培养基）的试管中，37℃，200rpm培养过夜；
摇瓶发酵：按5％接种量接种种子液到装有20mL发酵培养基的500mL锥形瓶中，37℃，200rpm/min振荡培养，发酵周期48h；
发酵罐发酵：取种子培养基接种于2瓶含100mL LB培养基的500mL锥形瓶中，37℃，200rpm/min振荡培养12h。按10%的接种量将摇瓶种子液接入含2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵温度控制在30℃，转速500rpm/min，通过40%氨水控制发酵pH为6.8。发酵过程采用pH-stat模式控制补料，每4h取样检测生物量、残糖和β-丙氨酸的量。
摇瓶发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，硫酸铵16g/L，酵母粉2g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.2g/L，CaCO3 15g/L，微量金属盐溶液 1mL/L。发酵培养基组成为：葡萄糖20 g/L，硫酸铵16 g/L，酵母粉2 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4 0.5 g/L，甜菜碱0.5 g/L，盐溶液 2 mL/L。（盐溶液：10 g/L CuCl2、10 g/L FeSO4·7H2O、1 g/L ZnSO4·7H2O、0.2 g/L CuSO4、0.02 g/L NiCl2·7H2O）
补料培养基组成如下：葡萄糖500g/L、硫酸铵10g/L、酵母浸粉2g/L、KH2PO4 14g/L、MgSO4 8g/L、甜菜碱 1.0 g/L盐溶液1mL/L。
发酵结束后，使用氨基酸分析仪检测β-丙氨酸的含量。
表3：基因工程菌5L发酵罐补料发酵产β-丙氨酸
结果显示，通过基因工程操作后，基因工程菌ALA11通过摇瓶发酵β-丙氨酸产量达4.71g/L，通过5L发酵罐补料发酵，β-丙氨酸产量达到85.18g/L。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种高产β-丙氨酸生产菌、构建方法及应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 74
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 60
acaggaaaca gacc 74
<210> 2
<211> 384
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 2
atgtatcgaa caatgatgag cggcaagctt cacagggcaa ctgttacgga agcaaatctg 60
aattatgtgg gaagcattac aattgatgaa gatctcattg atgcggtggg aatgcttcct 120
aatgaaaaag tgcaaattgt gaataataat aatggagcac gtctggaaac gtatattatt 180
cctggtaaac gcggaagcgg cgtcatctgc ttaaacggtg cagccgcacg ccttgtacag 240
gaaggagata aggtcattat tatttcctac aaaatgatgt ctgatcaaga agcggcaagc 300
cacgagccga aagtggctgt tttgaatgat caaaacaaaa ttgaacaaat gctggggaac 360
gaaccagccc gtacaatttt gtag 384
<210> 3
<211> 127
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 3
Met Tyr Arg Thr Met Met Ser Gly Lys Leu His Arg Ala Thr Val Thr
1 5 10 15
Glu Ala Asn Leu Asn Tyr Val Gly Ser Ile Thr Ile Asp Glu Asp Leu
20 25 30
Ile Asp Ala Val Gly Met Leu Pro Asn Glu Lys Val Gln Ile Val Asn
35 40 45
Asn Asn Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Ile Ile Pro Gly Lys Arg
50 55 60
Gly Ser Gly Val Ile Cys Leu Asn Gly Ala Ala Ala Arg Leu Val Gln
65 70 75 80
Glu Gly Asp Lys Val Ile Ile Ile Ser Tyr Lys Met Met Ser Asp Gln
85 90 95
Glu Ala Ala Ser His Glu Pro Lys Val Ala Val Leu Asn Asp Gln Asn
100 105 110
Lys Ile Glu Gln Met Leu Gly Asn Glu Pro Ala Arg Thr Ile Leu
115 120 125
<210> 4
<211> 1281
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 4
atgagttcag tttcgctgca ggattttgat gcagagcgaa ttggtttgtt ccacgaggac 60
attaagcgca agtttgatga gctcaagtca aaaaatctga agctggatct tactcgcggt 120
aagccttcgt cggagcagtt ggatttcgct gatgagttgt tggcgttgcc tggtaagggt 180
gatttcaagg ctgcggatgg tactgatgtc cgtaactatg gcgggctgga tggcatcgtt 240
gatattcgcc agatttgggc ggatttgctg ggtgttcctg tggagcaggt cttggcgggg 300
gatgcttcga gcttgaacat catgtttgat gtgatcagct ggtcgtacat tttcggtaac 360
aatgattcgg ttcagccttg gtcgaaggaa gaaaccgtta agtggatttg ccctgttccg 420
ggctatgatc gccatttctc catcacggag cgtttcggct ttgagatgat ttctgtgcca 480
atgaatgaag acggccctga tatggatgct gttgaggaat tggtgaagaa tccgcaggtt 540
aagggcatgt gggttgttcc ggtgttttct aacccgactg gtttcacggt gacagaagac 600
gtcgcaaagc gtctaagcgc aatggaaacc gcagctccgg acttccgcgt tgtgtgggat 660
aatgcctacg ccgttcatac gctgaccgat gaattccctg aggttatcga tatcgtcggg 720
cttggtgagg ccgctggcaa cccgaaccgt ttctgggcgt tcacttctac ttcgaagatc 780
actctcgcgg gtgcgggcgt gtcgttcttc ctcacctctg cggagaaccg caagtggtac 840
accggccatg cgggtatccg tggcattggc cctaacaagg tcaatcagtt ggctcatgcg 900
cgttactttg gcgatgctga gggagtgcgc gcggtgatgc gtaagcatgc tgcgtcgttg 960
gctccgaagt tcaacaaggt tctggagatt ctggattctc gccttgctga gtacggtgtc 1020
gcgcagtgga ctgtccctgc gggcggttac ttcatttccc ttgatgtggt tcctggtacg 1080
gcgtctcgcg tggctgagtt ggctaaggaa gccggcatcg cgttgacggg tgcgggttct 1140
tcttacccgc tgcgtcagga tccggagaac aaaaatctcc gtttggcacc gtcgctgcct 1200
ccagttgagg aacttgaggt tgccatggat ggcgtggcta cctgtgtgct gttggcagca 1260
gcggagcatt acgctaacta a 1281
<210> 5
<211> 1437
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 5
atgtcaaaca acattcgtat cgaagaagat ctgttgggta ccagggaagt tccagctgat 60
gcctactatg gtgttcacac tctgagagcg attgaaaact tctatatcag caacaacaaa 120
atcagtgata ttcctgaatt tgttcgcggt atggtaatgg ttaaaaaagc cgcagctatg 180
gcaaacaaag agctgcaaac cattcctaaa agtgtagcga atgccatcat tgccgcatgt 240
gatgaagtcc tgaacaacgg aaaatgcatg gatcagttcc cggtagacgt ctaccagggc 300
ggcgcaggta cttccgtaaa catgaacacc aacgaagtgc tggccaatat cggtctggaa 360
ctgatgggtc accaaaaagg tgaatatcag tacctgaacc cgaacgacca tgttaacaaa 420
tgtcagtcca ctaacgacgc ctacccgacc ggtttccgta tcgcagttta ctcttccctg 480
attaagctgg tagatgcgat taaccaactg cgtgaaggct ttgaacgtaa agctgtcgaa 540
ttccaggaca tcctgaaaat gggtcgtacc cagctgcagg acgcagtacc gatgaccctc 600
ggtcaggaat tccgcgcttt cagcatcctg ctgaaagaag aagtgaaaaa catccaacgt 660
accgctgaac tgctgctgga agttaacctt ggtgcaacag caatcggtac tggtctgaac 720
acgccgaaag agtactctcc gctggcagtg aaaaaactgg ctgaagttac tggcttccca 780
tgcgtaccgg ctgaagacct gatcgaagcg acctctgact gcggcgctta tgttatggtt 840
cacggcgcgc tgaaacgcct ggctgtgaag atgtccaaaa tctgtaacga cctgcgcttg 900
ctctcttcag gcccacgtgc cggcctgaac gagatcaacc tgccggaact gcaggcgggc 960
tcttccatca tgccagctaa agtaaacccg gttgttccgg aagtggttaa ccaggtatgc 1020
ttcaaagtca tcggtaacga caccactgtt accatggcag cagaagcagg tcagctgcag 1080
ttgaacgtta tggagccggt cattggccag gccatgttcg aatccgttca cattctgacc 1140
aacgcttgct acaacctgct ggaaaaatgc attaacggca tcactgctaa caaagaagtg 1200
tgcgaaggtt acgtttacaa ctctatcggt atcgttactt acctgaaccc gttcatcggt 1260
caccacaacg gtgacatcgt gggtaaaatc tgtgccgaaa ccggtaagag tgtacgtgaa 1320
gtcgttctgg aacgcggtct gttgactgaa gcggaacttg acgatatttt ctccgtacag 1380
aatctgatgc acccggctta caaagcaaaa cgctatactg atgaaagcga acagtaa 1437
<210> 6
<211> 3423
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 6
atgtcgactc acacatcttc aacgcttcca gcattcaaaa agatcttggt agcaaaccgc 60
ggcgaaatcg cggtccgtgc tttccgtgca gcactcgaaa ccggtgcagc cacggtagct 120
atttaccccc gtgaagatcg gggatcattc caccgctctt ttgcttctga agctgtccgc 180
attggtaccg aaggctcacc agtcaaggcg tacctggaca tcgatgaaat tatcggtgca 240
gctaaaaaag ttaaagcaga tgccatttac ccgggatacg gcttcctgtc tgaaaatgcc 300
cagcttgccc gcgagtgtgc ggaaaacggc attactttta ttggcccaac cccagaggtt 360
cttgatctca ccggtgataa gtctcgcgcg gtaaccgccg cgaagaaggc tggtctgcca 420
gttttggcgg aatccacccc gagcaaaaac atcgatgaga tcgttaaaag cgctgaaggc 480
cagacttacc ccatctttgt gaaggcagtt gccggtggtg gcggacgcgg tatgcgtttt 540
gttgcttcac ctgatgagct tcgcaaatta gcaacagaag catctcgtga agctgaagcg 600
gctttcggcg atggcgcggt atatgtcgaa cgtgctgtga ttaaccctca gcatattgaa 660
gtgcagatcc ttggcgatca cactggagaa gttgtacacc tttatgaacg tgactgctca 720
ctgcagcgtc gtcaccaaaa agttgtcgaa attgcgccag cacagcattt ggatccagaa 780
ctgcgtgatc gcatttgtgc ggatgcagta aagttctgcc gctccattgg ttaccagggc 840
gcgggaaccg tggaattctt ggtcgatgaa aagggcaacc acgtcttcat cgaaatgaac 900
ccacgtatcc aggttgagca caccgtgact gaagaagtca ccgaggtgga cctggtgaag 960
gcgcagatgc gcttggctgc tggtgcaacc ttgaaggaat tgggtctgac ccaagataag 1020
atcaagaccc acggtgcagc actgcagtgc cgcatcacca cggaagatcc aaacaacggc 1080
ttccgcccag ataccggaac tatcaccgcg taccgctcac caggcggagc tggcgttcgt 1140
cttgacggtg cagctcagct cggtggcgaa atcaccgcac actttgactc catgctggtg 1200
aaaatgacct gccgtggttc cgactttgaa actgctgttg ctcgtgcaca gcgcgcgttg 1260
gctgagttca ccgtgtctgg tgttgcaacc aacattggtt tcttgcgtgc gttgctgcgg 1320
gaagaggact tcacttccaa gcgcatcgcc accggattca ttgccgatca cccgcacctc 1380
cttcaggctc cacctgctga tgatgagcag ggacgcatcc tggattactt ggcagatgtc 1440
accgtgaaca agcctcatgg tgtgcgtcca aaggatgttg cagctcctat cgataagctg 1500
cctaacatca aggatctgcc actgccacgc ggttcccgtg accgcctgaa gcagcttggc 1560
ccagccgcgt ttgctcgtga tctccgtgag caggacgcac tggcagttac tgataccacc 1620
ttccgcgatg cacaccagtc tttgcttgcg acccgagtcc gctcattcgc actgaagcct 1680
gcggcagagg ccgtcgcaaa gctgactcct gagcttttgt ccgtggaggc ctggggcggc 1740
gcgacctacg atgtggcgat gcgtttcctc tttgaggatc cgtgggacag gctcgacgag 1800
ctgcgcgagg cgatgccgaa tgtaaacatt cagatgctgc ttcgcggccg caacaccgtg 1860
ggatacaccc cgtacccaga ctccgtctgc cgcgcgtttg ttaaggaagc tgccagctcc 1920
ggcgtggaca tcttccgcat cttcgacgcg cttaacgacg tctcccagat gcgtccagca 1980
atcgacgcag tcctggagac caacaccgcg gtagccgagg tggctatggc ttattctggt 2040
gatctctctg atccaaatga aaagctctac accctggatt actacctaaa gatggcagag 2100
gagatcgtca agtctggcgc tcacatcttg gccattaagg atatggctgg tctgcttcgc 2160
ccagctgcgg taaccaagct ggtcaccgca ctgcgccgtg aattcgatct gccagtgcac 2220
gtgcacaccc acgacactgc gggtggccag ctggcaacct actttgctgc agctcaagct 2280
ggtgcagatg ctgttgacgg tgcttccgca ccactgtctg gcaccacctc ccagccatcc 2340
ctgtctgcca ttgttgctgc attcgcgcac acccgtcgcg ataccggttt gagcctcgag 2400
gctgtttctg acctcgagcc gtactgggaa gcagtgcgcg gactgtacct gccatttgag 2460
tctggaaccc caggcccaac cggtcgcgtc taccgccacg aaatcccagg cggacagttg 2520
tccaacctgc gtgcacaggc caccgcactg ggccttgcgg atcgtttcga actcatcgaa 2580
gacaactacg cagccgttaa tgagatgctg ggacgcccaa ccaaggtcac cccatcctcc 2640
aaggttgttg gcgacctcgc actccacctc gttggtgcgg gtgtggatcc agcagacttt 2700
gctgccgatc cacaaaagta cgacatccca gactctgtca tcgcgttcct gcgcggcgag 2760
cttggtaacc ctccaggtgg ctggccagag ccactgcgca cccgcgcact ggaaggccgc 2820
tccgaaggca aggcacctct gacggaagtt cctgaggaag agcaggcgca cctcgacgct 2880
gatgattcca aggaacgtcg caatagcctc aaccgcctgc tgttcccgaa gccaaccgaa 2940
gagttcctcg agcaccgtcg ccgcttcggc aacacctctg cgctggatga tcgtgaattc 3000
ttctacggcc tggtcgaagg ccgcgagact ttgatccgcc tgccagatgt gcgcacccca 3060
ctgcttgttc gcctggatgc gatctctgag ccagacgata agggtatgcg caatgttgtg 3120
gccaacgtca acggccagat ccgcccaatg cgtgtgcgtg accgctccgt tgagtctgtc 3180
accgcaaccg cagaaaaggc agattcctcc aacaagggcc atgttgctgc accattcgct 3240
ggtgttgtca ccgtgactgt tgctgaaggt gatgaggtca aggctggaga tgcagtcgca 3300
atcatcgagg ctatgaagat ggaagcaaca atcactgctt ctgttgacgg caaaatcgat 3360
cgcgttgtgg ttcctgctgc aacgaaggtg gaaggtggcg acttgatcgt cgtcgtttcc 3420
taa 3423
<210> 7
<211> 384
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
atgtatcgaa caatgatgag cggcaagctt cacagggcaa ctgttacgga agcaaatctg 60
aattatgtgg gaagcattac aattgatgaa gatctcattg atgcggtggg aatgcttcct 120
aatgaaaaag tacaagttgt gaataataat aatggagcac gtctggaaac gtatattatt 180
cctggtaaac gcggaagcgg cgtcatctgc ttaaacggtg cagccgcacg ccttgtacag 240
gaaggagata aggtcattat tatttcctac aaaatgatgt ctgatcaaga agcggcaagc 300
cacgagccga aagtggctgt tttgaatgat caaaacaaaa ttgaacaaat gctggggaac 360
gaaccagccc gtacaatttt gtag 384
<210> 8
<211> 384
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 8
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<210> 9
<211> 384
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 9
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cacgagccga aagtggctgt tttgaatgat caaaacaaaa ttgaacaaat gctggggaac 360
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<210> 10
<211> 384
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 10
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gaaggagata aggtcattat tatttcctac aaaatgatgt ctgatcaaga agcggcaagc 300
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gaaccagccc gtacaatttt gtag 384
<210> 11
<211> 127
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 11
Met Tyr Arg Thr Met Met Ser Gly Lys Leu His Arg Ala Thr Val Thr
1 5 10 15
Glu Ala Asn Leu Asn Tyr Val Gly Ser Ile Thr Ile Asp Glu Asp Leu
20 25 30
Ile Asp Ala Val Gly Met Leu Pro Asn Glu Lys Val Gln Ile Val Asn
35 40 45
Asn Asn Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Ile Ile Pro Gly Lys Arg
50 55 60
Gly Ser Gly Val Ile Cys Leu Asn Gly Ala Ala Ala Arg Leu Val Gln
65 70 75 80
Glu Gly Asp Lys Val Ile Ile Ile Ser Tyr Lys Met Met Ser Asp Gln
85 90 95
Glu Ala Ala Ser His Glu Pro Ser Val Ala Val Leu Asn Asp Gln Asn
100 105 110
Lys Ile Glu Gln Met Leu Gly Asn Glu Pro Ala Arg Thr Ile Leu
115 120 125

Claims (5)

1.一种高产β-丙氨酸生产菌，由如下方法构建获得：
（1）以E. coli W3110为出发菌，将其基因组中panD基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株E. coli W3110/Trc-panD，记为ALA1；所述Trc启动子核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；
（2）将源自Bacillus subtilis的外源基因panD整合入质粒pTrc99A中，得到质粒pTrc99A-panD；将质粒pTrc99A-panD导入步骤ALA1中，增强panD基因的表达，得到重组菌株，记为ALA2；所述外源基因panD核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示；
（3）将ALA2基因组中的ppc基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株ALA2/Trc-ppc，记为ALA3；
（4）将ALA3基因组中的pykA基因敲除，得到重组菌株ALA3/△pykA，记为ALA4；
（5）将ALA4基因组中的cycA基因敲除，得到重组菌株E. coli ALA4/Δ-cycA，记为ALA6；
（6）将外源基因aspB整合入质粒pTrc99A-panD中，得到质粒pTrc99A-panDaspB；将基因aspA整合入质粒pTrc99A-panDaspB，得到质粒pTrc99A-panDaspBaspA；将外源基因pyc整合入质粒pTrc99A-panDaspBaspA，得到质粒pTrc99A-panDaspBaspApyc；所述外源基因aspB核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，aspA基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，外源基因pyc核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
（7）对panD基因进行定点突变，得到突变后质粒pTrc99A-panD K104S aspBaspApyc，将其转入ALA6中，得到菌株ALA11，即为所述β-丙氨酸生产菌；所述panD K104S突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。
2.构建权利要求1所述β-丙氨酸生产菌的方法，其特征在于所述方法如下：
（1）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将出发菌E. coli W3110基因组中的panD基因的启动子替换成Trc启动子，得到重组菌株W3110/Trc-panD，记为ALA1；所述Trc启动子核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
（2）将源自Bacillus subtilis的外源基因panD整合入质粒pTrc99A中，得到质粒pTrc99A-panD；将质粒pTrc99A-panD导入步骤ALA1中，增强panD基因的表达，得到重组菌株，记为ALA2；所述外源基因panD核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示；
（3）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将ALA2基因组中的ppc基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株ALA2/Trc-ppc，记为ALA3；
（4）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将ALA3基因组中的pykA基因敲除，得到重组菌株ALA3/△pykA，记为ALA4；
（5）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将ALA4基因组中的cycA基因敲除，得到重组菌株E. coli ALA4/Δ-cycA，记为ALA6；
（6）将外源基因aspB整合入质粒pTrc99A-panD中，得到质粒pTrc99A-panDaspB；将基因aspA整合入质粒pTrc99A-panDaspB，得到质粒pTrc99A-panDaspBaspA；将外源基因pyc整合入质粒pTrc99A-panDaspBaspA，得到质粒pTrc99A-panDaspBaspApyc；所述外源基因aspB核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，aspA基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，外源基因pyc核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
（7）对panD基因进行定点突变，得到突变后质粒pTrc99A-panD K104S aspBaspApyc，将其转入ALA6中，得到菌株ALA11，即为所述β-丙氨酸生产菌；所述panD K104S突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。
3.如权利要求1所述β-丙氨酸生产菌在微生物发酵制备β-丙氨酸中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述β-丙氨酸生产菌接种至发酵培养基中，于28~32 ℃、400~800 rpm条件下进行发酵培养48~100h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到β-丙氨酸；所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10~30g/L、硫酸铵10~20g/L、酵母浸粉1~5g/L、KH2PO4 1~5g/L、MgSO4 0.1~2.0g/L、甜菜碱0.1~1.0g/L、微量金属盐溶液0.5~5mL/L，pH 6.5~7.0，溶剂为去离子水；微量金属盐溶液组成为：10 g/L CuCl2、10 g/L FeSO4·7H2O、1 g/L ZnSO4·7H2O、0.20 g/L CuSO4、0.02 g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20 g/L，硫酸铵16 g/L，酵母粉2 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4 0.5 g/L，甜菜碱0.5 g/L，盐溶液 2 mL/L，溶剂为去离子水。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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