UA127497C2 - СПОСІБ ВЕЛИКОМАСШТАБНОГО ВИРОБНИЦТВА CRM<sub>197</sub> - Google Patents
СПОСІБ ВЕЛИКОМАСШТАБНОГО ВИРОБНИЦТВА CRM<sub>197</sub> Download PDFInfo
- Publication number
- UA127497C2 UA127497C2 UAA201911302A UAA201911302A UA127497C2 UA 127497 C2 UA127497 C2 UA 127497C2 UA A201911302 A UAA201911302 A UA A201911302A UA A201911302 A UAA201911302 A UA A201911302A UA 127497 C2 UA127497 C2 UA 127497C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- medium
- amino acids
- iron
- acid
- depleted
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 65
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 38
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 54
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 27
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 53
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 33
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 28
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 28
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 25
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 25
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims description 20
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 20
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- WLJVNTCWHIRURA-UHFFFAOYSA-N pimelic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCC(O)=O WLJVNTCWHIRURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 13
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 13
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 13
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 12
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 11
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 11
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 11
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 11
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 9
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 9
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 9
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 9
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 9
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 9
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 claims description 9
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 claims description 9
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 claims description 9
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 8
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 8
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 claims description 8
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 claims description 8
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 claims description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 7
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 6
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 claims description 6
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 claims description 6
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 claims description 6
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 5
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 3
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 claims description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 3
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 claims description 3
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 claims description 3
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 claims description 3
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241001669573 Galeorhinus galeus Species 0.000 claims description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 2
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 claims description 2
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 abstract description 4
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 abstract 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 60
- 230000008569 process Effects 0.000 description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 10
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 9
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 9
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 9
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 7
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 7
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 7
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 7
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 6
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 3
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- -1 hydrogen ions Chemical class 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- GHOKWGTUZJEAQD-SSDOTTSWSA-N 3-[[(2s)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 102000009062 ADP Ribose Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108010049290 ADP Ribose Transferases Proteins 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 101150103768 CAM gene Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000611265 Sathuvachari virus Species 0.000 description 1
- 101150020828 Scm gene Proteins 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000002505 iron Chemical class 0.000 description 1
- 238000010409 ironing Methods 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/05—Actinobacteria, e.g. Actinomyces, Streptomyces, Nocardia, Bifidobacterium, Gardnerella, Corynebacterium; Propionibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Manufacture Of Electron Tubes, Discharge Lamp Vessels, Lead-In Wires, And The Like (AREA)
- Forging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Винахід стосується способу виробництва CRM197 з високим виходом шляхом використання генно-модифікованого штаму Corynebacterium diphtheria зі збільшеною кількістю копій гена CRM197, який включає вирощування указаного штаму в ферментативному середовищі без компонентів тваринного походження, яке містить одну або більше амінокислот.
Description
генно-модифікованого штаму Согуперасіетит аїрнійегіа зі збільшеною кількістю копій гена
САМ:97, який включає вирощування указаного штаму в ферментативному середовищі без компонентів тваринного походження, яке містить одну або більше амінокислот.
Мол продовження керЕкеивання 2. . . . ї2 пердЕКРНЕННІВЕ дод петете
ДАжпитбівзпія слоти СІЯ Та 0 пранмераюні ВИС КІХ
Ве ВКНЕК Баня ЗЕВАКВ К С СК, : і вЕжогОТеу: Ківець АлеВрІвНІВ. лмплкввація рах СВУ От товесвюутий БЛОВТЖООРИМ каовун КА. зав СЕМИ трансерктці ЕВ ет ІК Ше то
ЕовіаВ Ії : Здеії, 5 туї вв. у і ОВК вок тост, ння ЗВ Б з ВЕСНУ й : ха я й Кашв дини ше смів: : т и Я А ї: вВБЕЖЕ От ета а щ гидко Ж стддах ЖЕфкатедЕ я: АХ. пд бо БТ БР ЛЕ Нишсіяев» і ВВЕМ 0 нюатояю) бнкооож- НОВІ СВИВ во Уві
ШЕРСТІ; ке ! Баиі 18 Хоохмдккня доаг га х нина) бвеї (ТК ей УМ
КЕ ХЕ
Фо «а
КУ Ії КУ Со о. п м Б
Я зпкзВ зв Шк зо ки І ко
НЯ Щх КОВО ке о. вок о
Фіг.
Даний винахід стосується покращеного способу великомасштабного виробництва СЕМ'97 з використанням генно-модифікованого штаму Согупебасіегійт аірнірегпає зі збільшеною кількістю копій гена СКМ 97.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
САМ!97 є генетично детоксифікованою формою дифтерійного токсину. Одинична мутація в положенні 52, що замінює глютамінову кислоту на гліцин, приводить до втрати АДФ- рибозилтрансферазної активності нативного токсину. Була з'ясована структурна основа
САМ!97, позбавлена токсичності, яка широко використовується як білок-носій для кон'югатних вакцин. СЕМ':97, подібно до дифтерійного токсину, являє собою один поліпептидний ланцюг з 535 амінокислот (58,4 кДа), що складається з двох субодиниць (зв'язаних дисульфідними містками).
САМ!:97 використовується як білок-носій в ряді схвалених до застосування кон'югатних вакцин, таких як кон'югат Наеторнийи5 іппййепла типу Б, що продається під торговим найменуванням Нірійег ТМ, 13-валентний пневмококовий полісахаридний кон'югат, що продається під торговим найменуванням РКЕММАК 136 і т.п.
Ай М. Огем єї а)!., Васіепої. 1951 Мом; 62(5):549-59; описали середовище з певним хімічним складом, прийнятне для виробництва дифтерійного токсину з високим титром, і визначили потреби в амінокислотах Согупебасіепит аїрнпійегпае, штаму Тогопіо Раїк-ММіШате Мо 8.
Середовище містить амінокислоти, які ефективно замінюють компонент тваринного походження, тобто гідролізат казеїну. Амінокислоти включають глютамінову кислоту, цистин, пролін, триптофан, лейцин, валін, метіонін і гліцин.
Варриої еї а!; Арріїєд апа Епмігоптепіа! Місторіоіоду 1983, Мої. 46(3):560-564 зазначають, що нетандемні подвійні лізогени є стабільними і здатні забезпечувати високі виходи СЕМ "97, які до трьох разів перевищують вихід, який забезпечується монолізогенами.
А ГРаз5. єї аї., Арріїеїй Містгоріооду апа Віоїесппоіоду; Аргії 1995, Моїште 43(1):83-88, описують підхід, що забезпечує ріст в умовах високої густини з метою отримання мутованого дифтерійного токсину з двох штамів Согупебасіепит аїрніпегіає: СТ (В) (0ох-201, їох-9) і С7 (В) (ох-107). Процедура включає використання модифікованого знезалізненого середовища, яке забезпечує швидкий і високощільний ріст бактерій і яке, у випадку одночасного виснаження
Зо глюкози і заліза, сприяє збільшенню вироблення токсинів. Для забезпечення росту бактерій до густини клітин з величиною поглинання 70 при 600 нм (15-20 г/л сухої ваги) подавали збагачене киснем повітря. Максимальна концентрація токсину в культуральному супернатанті становила 150 мг/л.
Рагад Р. Мадагкаг еї аї., дУоигпа! ої Арріїей Місгоріоіоду 2002, 92, 215-220; описують схему використання амінокислот під час росту дифтерії Согупебасіегіут і показують, що тільки чотири з дев'яти протестованих амінокислот, а саме цистин, гістидин, аспартат і метіонін, є критичними для росту дифтерії Согуперасіепит і вироблення нею токсинів.
У європейському патенті Мо 1 849 860 ВІ розкрите використання білкового матеріалу нетваринного походження, такого як білки з соєвих бобів, насіння бавовнику, картоплі і т.д., як поживного середовища для культивування патогенних бактерій.
У патенті США Мо 6 962 803 В2 розкритий спосіб очищення дифтерійного токсину шляхом ферментації штаму мікроорганізму, здатного продукувати дифтерійний токсин, причому вказаний спосіб включає додавання глюкози в зростаючу культуру, і таке додавання глюкози підтримує ріст мікроорганізмів на рівні, ефективному для продукування дифтерійного токсину.
Також вказано, що крім джерела вуглецю існують інші мінімальні вимоги до поживних речовин, необхідних для росту, які включають металеві мікроелементи, фосфат, джерело азоту, звичайно казамінокислоти і дріжджовий екстракт.
У публікації заявки на патент США Мо 2011/0097359 Аї розкрите середовище для культивування штаму Согупебасіепит аїрпіпегіаеє для виробництва дифтерійного токсину або його аналога, причому середовище по суті не містить продуктів тваринного походження і містить воду; джерело вуглеводів; джерело азоту; і кількість вільних амінокислот у вихідній концентрації, при цьому вихідна концентрація кожної вільної амінокислоти не обмежує рівень продукування дифтерійного токсину або його аналога. Також вказано, що джерело вуглеводів не містить глюкози.
У УМО 2006/100108 А1 розкритий ферментативний процес, що включає етап вирощування штаму Согуперасіепшт аїрнійепає ов середовищі всередині ферментера в умовах перемішування, достатніх для підтримки гомогенної культури і обмеженої аерації, такої, що роОг в культурі падає до менше ніж 495 протягом більшої частини етапу ферментації. Далі розкрито, що за рахунок ступеня аерації рН всередині ферментера підтримується на рівні від 7,0 до 7,8, 60 без необхідності додавання кислоти або основи.
Процес отримання СКМ!:97 звичайно чутливий до невеликих змін компонентів процесу, а також параметрів процесу. У всьому світі СЕМ1о7 отримують з Сосгупебасіепит аїріпегіає, хоча комерційний успіх такого виробництва обмежений. В жодному з вказаних вище документів не розкритий спосіб виробництва СЕМ:і»;7 з високим виходом, наприклад 2150 мг/л, з використанням генно-модифікованого штаму Согупебасіегішт аїрнійегпає. Автори даного винаходу розробили модель метаболічного потоку для великомасштабного виробництва
САМ!97 з використанням генно-модифікованого штаму Согупебасіепит аїрніпегіає.
ЗАДАЧА ВИНАХОДУ
Головна задача даного винаходу полягає в наданні покращеного способу великомасштабного виробництва СКМ 97.
Іншою метою даного винаходу є надання покращеного способу великомасштабного виробництва СЕМ':с7, який є економічно ефективним і може використовуватися для виробництва кон'югатних вакцин.
СУТЬ ВИНАХОДУ
Даний винахід забезпечує покращений спосіб виробництва СКМ:іо7 з високим виходом шляхом використання генно-модифікованого штаму Согупебасіепит аїрнінегіає зі збільшеною кількістю копій гена САМ:97, що включає вирощування штаму в ферментативному середовищі, яке містить одну або більше амінокислот і не містить компонентів тваринного походження.
Даний винахід забезпечує покращений спосіб виробництва СЕМ'иіо;, який включає культивування генно-модифікованого штаму Согупебасіегішт арнійепає зі збільшеною кількістю копій гена САМ:іо7 в ферментативному середовищі без компонентів тваринного походження, що містить більше 10 амінокислот, і доповнення середовища поживними речовинами.
Даний винахід також забезпечує покращений спосіб виробництва СЕМ':о7, який включає культивування генно-модифікованого штаму Согупебасіегішт арнійепає зі збільшеною кількістю копій гена САМ:іо7 в ферментативному середовищі без компонентів тваринного походження, що містить більше 10 амінокислот, і доповнення середовища поживними речовинами на основі моделі метаболічного потоку.
КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ
Зо На фіг. 1 показана конструкція плазміди, позначеної як РВЕЗ3.
Фіг. 2 являє собою блок-схему моделі метаболічного потоку.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Даний винахід стосується покращеного способу великомасштабного виробництва СЕМ'97 з використанням генно-модифікованого штаму Согупебасіепит арнпійепає зі збільшеною кількістю копій гена САМ!97, що включає вирощування штаму в ферментативному середовищі, що містить більше 10 амінокислот і не містить компонентів тваринного походження.
Генно-модифікований штам Согупебасіепит аїрніпепае (СТЕр) за даним винаходом стосується Согуперасіепит аїрнпіпегіає, що містить в формі епісом численні копії гена СЕМ 97, регульовані тим же механізмом, що і ген СЕМ:»; хазяя, а фоновим генотипом вказаного штаму є одиночний лізоген.
Амінокислоти, що використовуються в даному винаході, вибирають з аланіну, аргініну, аспарагінової кислоти, цистеїну, глютамінової кислоти, глютаміну, гліцину, гістидину, ізолейцину, лейцину, лізину, метіоніну, фенілаланіну, проліну, серину, треоніну, триптофану, валіну і їх солей, причому кожну амінокислоту використовують в кількості приблизно від 0,05 до 2 г/л.
Вивчений вплив амінокислот, вітамінів і умов процесу продукування САМ'!:97. Було виявлено, що деякі амінокислоти впливають негативним чином на ріст бактерій. Однак встановлено, що продукування САМ!97 збільшується, якщо в оптимальній концентрації використовується більше 10 амінокислот. Концентрація амінокислот була оптимізована в експериментах на основі плану
Плаккета-Бермана (Ріаскей-Виитап).
План Плаккета-Бермана являє собою план проведення експериментів по вивченню залежності деякої вимірюваної кількості від декількох незалежних змінних (чинників) для мінімізації дисперсії оцінок цієї залежності, використовуючи обмежену кількість експериментів.
Результати показали, що амінокислоти, такі як аспарагінова кислота, глютамін, гліцин, ізолейцин, лейцин, валін при температурі від 35 до 36"С впливають позитивним чином на синтез СКМ!І97, а амінокислоти, такі як аланін при температурі від 35 до 36"С впливають негативним чином на синтез СЕМ'197. Для досягнення великомасштабного виробництва СЕМ'ч97 виконували декілька рівнів плану експериментів при різних концентраціях. Використання тирозину і аспарагіну приводило до зниження загального виходу СЕМ'иіо7, і, отже, ці 60 амінокислоти не є частиною винаходу.
У переважному варіанті здійснення даного винаходу ферментативне середовище містить комбінацію фенілаланіну, аргініну ії однієї або більше інших амінокислот, причому кількість використовуваних фенілаланіну і аргініну складає приблизно менше ніж 1 г/л.
У більш переважному варіанті здійснення даного винаходу ферментативне середовище містить комбінацію фенілаланіну, аргініну і однієї або більше інших амінокислот, причому фенілаланін знаходиться в кількості від приблизно 0,25 до 0,75 г/л, а аргінін - від приблизно 0,1 до 0,5 г/л.
У даному винаході надається покращений спосіб виробництва СКМ:о7 з використанням генно-модифікованого штаму Согупебрасіепит аїрнінегіае зі збільшеною кількістю копій гена
САМ!97, що включає вирощування штаму в ферментативному середовищі, що містить більше 10 амінокислот, доповнення середовища вітамінами в діапазоні від приблизно 0,05 до 20 мг на літр, причому середовище не містить компонентів тваринного походження.
У іншому варіанті здійснення даного винаходу амінокислоти, вітаміни, мікроелементи і т.п. додають в ферментативне середовище як поживні речовини під час культивування.
Різні поживні речовини, що використовуються в даному винаході як добавки, включають вітаміни, вибрані з нікотинової кислоти, тіаміну, пантотенової кислоти, біотину, рибофлавіну, фолієвої кислоти; пімелінової кислоти; фосфату, джерела азоту і металевих мікроелементів, і т.п., і кожний вітамін використовується в кількості від приблизно 0,05 до 20 мг на літр.
Ферментативне середовище, що використовується в даному винаході, є знезалізненим середовищем і зовсім не містить компонентів тваринного походження. Крім того, вказане середовище також не містить традиційних середовищ Леффлера на основі м'яса і знезалізнених середовищ УС з низьким вмістом заліза на основі казамінової кислоти.
Компоненти ферментативного середовище за даним винаходом включають дріжджовий екстракт (УС), рослинний пептон, калію дигідрофосфат (КНегРО»), триптофан, глюкозу, розчин
УС з солями мікроелементів.
У іншому варіанті здійснення даного винаходу склад середовища для культивування генно- модифікованого штаму Согупебасіепит аїрнпіпегіає зі збільшеною кількістю копій гена САМ'97 включає базове ферментативне середовище, що містить дріжджовий екстракт, рослинний пептон, калію дигідрофосфат (КНеРО:ї), триптофан, глюкозу, розчин МС з солями мікроелементів; одну або більше амінокислот, вітаміни, мікроелементи і т.п.
Прийнятні металеві мікроелементи включають калій, магній, кальцій, хлорид, холін, мідь, марганець, сульфат, цинк і т.п.
У даному винаході надається покращений спосіб виробництва САМ:97 з використанням генно-модифікованого штаму Согупебрасіепит аїрнінегіае зі збільшеною кількістю копій гена
САМ!:97, що включає додавання в ферментативне середовище поживних речовин на основі моделі метаболічного потоку.
Модель метаболічного потоку стосується всієї мережі теплообміну, масоперенесення, швидкості перенесення кисню (ОТК), швидкості поглинання кисню (ОК) і кінетики перенесення іонів, де ОТК підтримується за рахунок перемішування, зворотного надмірного тиску і закачування чистого кисню. Ця модель показана на фіг 2.
Розробка моделі метаболічних потоків
Ця модель створена на основі інтерпретації онлайн даних про накопичення в процесі іонів водню, як основної змінної з подальшою конверсією розчиненого кисню в СО», що супроводжується виділенням тепла у вказаному процесі. Наприклад, модель працює в умовах обмеження джерела вуглецю. Джерело вуглецю подають порціями, і в процесі оцінюють відповідь. Виходячи з відповіді, коректують утворення іонів водню. Потім оптимізують поживні речовини для отримання постійного значення рН, розчиненого кисню (00) і швидкості теплопередачі (наприклад, для рН 7,4; залишкового БО »2-20; швидкості теплопередачі НТ).
У одному з варіантів здійснення даного винаходу спосіб включає додавання в середовище глюкози протягом всього процесу ферментації.
Даний винахід не включає використання мальтози як джерела вуглецю і етап знезалізнення.
САМ:іо7, отриманий відповідно до даного винаходу, можна використовувати для виготовлення кон'югатних вакцин, таких як пневмококовий кон'югат, тифозний кон'югат, Нір- кон'югат і т.п.
У іншому варіанті здійснення в даному винаході надається покращений спосіб виробництва
САМ!97, що включає культивування генно-модифікованого штаму Согупебасіепит аїрнінегіає зі збільшеною кількістю копій гена САМ:і97 в ферментативному середовищі без компонентів тваринного походження, що містить більше 10 амінокислот, і доповнення середовища бо поживними речовинами на основі моделі метаболічного потоку, при цьому амінокислоти вибирають з аланіну, аргініну, аспарагінової кислоти, цистеїну, глютамінової кислоти, глютаміну, гліцину, гістидину, ізолейцину, лейцину, лізину, метіоніну, фенілаланіну, проліну, серину, треоніну, триптофану, валіну і їх солей.
У іншому варіанті здійснення в даному винаході надається покращений спосіб виробництва
САМ!97, що включає культивування генно-модифікованого штаму Согупебасіепит аїрнінегіає зі збільшеною кількістю копій гена САМ:і97 в ферментативному середовищі без компонентів тваринного походження, що містить більше 10 амінокислот, причому кожну амінокислоту використовують в кількості від приблизно 0,05 до 2 г/л.
У іншому варіанті здійснення в даному винаході надається покращений спосіб виробництва
САМ!97, що включає культивування генно-модифікованого штаму Согупебасіепит аїрнінегіає зі збільшеною кількістю копій гена САМ:і97 в ферментативному середовищі без компонентів тваринного походження, що містить більше 10 амінокислот, і доповнення середовища поживними речовинами на основі моделі метаболічного потоку, причому кожну амінокислоту використовують в кількості від приблизно 0,05 до 2 г/л.
У іншому варіанті здійснення в даному винаході надається покращений спосіб виробництва
САМ!97, що включає культивування генно-модифікованого штаму Согупебасіепит аїрнінегіає зі збільшеною кількістю копій гена САМ:і97 в ферментативному середовищі без компонентів тваринного походження, що містить базове середовище, більше 10 амінокислот, і доповнення середовища поживними речовинами на основі моделі метаболічного потоку, причому кожну амінокислоту використовують в кількості від приблизно 0,05 до 2 г/л.
У іншому варіанті здійснення в даному винаході надається покращений спосіб виробництва
САМ!97, який включає культивування генно-модифікованого штаму Согупебасіепит аїрніпегіає зі збільшеною кількістю копій гена САМ:197 в ферментативному середовищі без компонентів тваринного походження, що містить більше 10 амінокислот, і доповнення середовища поживними речовинами на основі моделі метаболічного потоку, причому амінокислоти вибирають з аланіну, аргініну, аспарагінової кислоти, цистеїну, глютамінової кислоти, глютаміну, гліцину, гістидину, ізолейцину, лейцину, лізину, метіоніну, фенілаланіну, проліну, серину, треоніну, триптофану, валіну і їх солей, причому кожну амінокислоту використовують в кількості від приблизно 0,05 до 2 г/л.
Зо У іншому варіанті здійснення в даному винаході надається покращений спосіб виробництва
САМ!97, що включає культивування генно-модифікованого штаму Согупебасіепит аїрнінегіає зі збільшеною кількістю копій гена САМ:і97 в ферментативному середовищі без компонентів тваринного походження, що містить більше 10 амінокислот, причому амінокислоти вибирають з аланіну, аргініну, аспарагінової кислоти, цистеїну, глютамінової кислоти, глютаміну, гліцину, гістидину, ізолейцину, лейцину, лізину, метіоніну, фенілаланіну, проліну, серину, треоніну, триптофану, валіну і їх солей, причому кожну амінокислоту використовують в кількості від приблизно 0,05 до 2 г/л.
У переважному варіанті здійснення в даному винаході надається покращений спосіб виробництва СЕМ'97, що включає її культивування генно-модифікованого штаму Согуперасіегіит аїрніпегіає зі збільшеною кількістю копій гена САМ:і97 в ферментаційному середовищі без компонентів тваринного походження, що містить базове середовище і більше 10 амінокислот, вибрану з аланіну, аргініну, аспарагінової кислоти, цистеїну, глютамінової кислоти, глютаміну, гліцину, гістидину, ізолейцину, лейцину, лізину, метіоніну, фенілаланіну, проліну, серину, треоніну, триптофану, валіну і їх солей, і і) доповнення середовище глюкозою і поживними речовинами, основане на моделі метаболічного потоку.
У іншому варіанті здійснення у час ферментативного процесу температуру підтримують в діапазоні від ЗО до 40"С, а рН підтримують на рівні від 7,0 до 8,0, переважно від 7,4 до 7,6, використовуючи 2095 ортофосфорну кислоту і 12,595 гідроксид амонію. Ферментативний процес триває від 15 до 24 годин, переважно від 16 до 20 годин.
У одному з варіантів здійснення даний винахід стосується композиції і способу ферментації, в яких відсутні тирозин і аспарагін. У одному з варіантів здійснення спосіб за даним винаходом не містить знезалізнене середовище УС з низьким вмістом заліза на основі казамінової кислоти, мальтозу як джерело вуглецю і етап знезалізнення.
У даному винаході надається покращений спосіб виробництва СКМ'иіо7, який включає культивування генно-модифікованого штаму Согупебасіегішт арнійепає зі збільшеною кількістю копій гена САМ:іо7 в ферментативному середовищі без компонентів тваринного походження, що містить комбінацію фенілаланіну і аргініну в кількості приблизно менше 1 г/л і 60 одну або більше інших амінокислот.
У одному з варіантів здійснення в даному винаході надається покращений спосіб виробництва СЕМ:о;7, який включає культивування генно-модифікованого штаму
Согуперасіепит аїрнійегіае зі збільшеною кількістю копій гена САМіо7 в ферментативному середовищі без компонентів тваринного походження, що містить більше 10 амінокислот, і доповнення середовища поживними речовинами на основі моделі метаболічного потоку, де вихід отриманого СВМ:97 складає більше 150 мг/л.
У одному з варіантів даний винахід забезпечує можливість виготовлення кон'югатної вакцини, що включає кон'югування полісахаридів з ба/топе/а урні, бгеріососсив рпеитопіає, тепіпдососсих, Наеторнйиз іпіцепгає з СЕМ!97, отриманим відповідно до даного винаходу.
У даному винаході надається покращений спосіб виробництва СКМ:97 з високим виходом з використанням генно-модифікованого штаму Согупебасіепит арнпійепає зі збільшеною кількістю копій гена САМ'іо7, що включає вирощування штаму в середовищі без компонентів тваринного походження, що містить більше 10 амінокислот, і доповнення середовища поживними речовинами на основі моделі метаболічного потоку.
У одному з варіантів здійснення в даному винаході надається покращений спосіб виробництва СЕМ'!97 з виходами, такими як 150 мг/л, 200 мг/л, 300 мг/л, 500 мг/л, 1 г/л, 1,5 г/л, 2 г/л, 2,5 г/л, З г/л, 3,5 г/л, 4 г/л, 4,5 г/л і 5 г/л.
У одному з варіантів здійснення даний винахід стосується генно-модифікованому штаму
Согуперасіепит аїрпійегіае С7 (8-197), в який методом електропорації переносять плазміду
РВЕЗЗ.
Кількісну оцінку СЕКМ:і97, отриманого відповідно до даного винаходу, виконують за допомогою ферментно-зв'язаного імуно-сорбентного аналізу (ІС-ЕГ ІЗА).
Розробка генно-модифікованого штаму Согуперасіепит аїрніпегіає зі збільшеною кількістю копій гена САМ ;97 в плазмідному векторі експресії
Согуперсаіепит арнпійепає С7 (8-197) АТСС 53821, ген, що кодує СЕМ:97, існує у вигляді єдиної копії, а секреція мутантного білка СЕМ!:97 в культуральне середовище знаходиться під контролем заліза. Вихід СЕМ:іо7 збільшується в три рази, якщо використовувати штам
Согуперасіепит арнірепає Ст, що містить дві копії коринефагу бета (АТСС 39255). Це дозволяє передбачити, що кількість копій гена пов'язана зі збільшеною продуктивністю. Для досягнення промислових масштабів виробництва СКМ:іо;7 за допомогою Согупебасіепит аїрпіпегіае бажано підвищити рівень експресії. Інтеграція більшої кількості піків в бактеріальний геном технічно складна. Інтегранти з великою кількістю піків фага генетично нестабільні і втрачають додаткові копії гена СКМ. Автори даного винаходу мали намір підвищити рівні експресії СЕМ:1о7 шляхом збільшення копій гена САМ':97, що доставляються на плазмідах, які нарівні з нативними регуляторними елементами СКМ':97 містять селективний маркер стійкості до антибіотика. Відповідно, автори винаходу розробили штам Согуплебасіепит аїрнінегіає зі збільшеною кількістю копій гена САМ'о7 і оцінили стабільність цього штаму. Модифікований штам мав більш високі рівні експресії СКМ:і97 порівняно з немодифікованими штамами
Согуперасіепит.
Даний винахід більш конкретно проілюстрований з посиланням на наведені нижче приклади. Однак потрібно розуміти, що даний винахід жодним чином не обмежений цими прикладами, і включає їх варіації в межах параметрів, розкритих в даному описі, як відомо фахівцям в даній галузі техніки.
Приклад 1
Покращення експресії СКМ»? за рахунок епісомальної копії СКМ':97
Отримували вектор, який може стабільно реплікуватися в Согуперасіепит аїрнпіпепає Ст (Д- 197). Виділення нативної плазміди з дифтерії Согуперасіеєлит Ст7 виконували згідно з протоколом виділення великої плазміди, описаним в Т.С Ситгтієг еї аї., Апа! Віоспет. 1976; 76 (2):431441. Використовуючи препарат нативної плазмідної ДНК ампліфікували ділянку ініціації реплікації 1,87 КБ (опік). Одночасно ампліфікували послідовність Кап 1,033Ккб, використовуючи матричну ДНК риОсСа-КІХУ, і тупий кінець лігували з огік з утворенням РВЕЗО.
Крім того, з геномної ДНК Согулебасіепит аїрніпегіае С7 (8-197) ампліфікували послідовність гена СКМ':97 розміром 2.13 Кр, що містить промоторну область ртТох (Воуа еї аї., 1988), сги і передбачену термінаторну послідовність, і клонували в унікальний сайт рестрикції 5реї, сконструйований в рВвВЕЗО. Мутацію САС в цьому ампліконі підтверджували за допомогою алель-специфічного аналізу ПЛР (РизПппома еї аї., Апаїуїйса! Віоспетівігу. 1998; 260:24 29) і секвенування ДНК. Отриманим таким чином плазміду назвали рВЕЗЗ (Фіг. 1).
Плазміду рВвВЕЗЗ переносили методом електропорації згідно з процедурами, оптимізованими для Согупебасіеєгшт аїрнійепає С7 (8-197). Трансформовані колонії бо Согуперасіепит аїрпійегіае С7 (8-197) (рВЕЗ33) підтверджували ПЛР скринінгом специфічних колоній і виділенням плазміди і рестрикційними розщепленням. Експресію СКМ':97 в колоніях аналізували з допомогою 505 РАСЕ і вестерн-блотингом. САМ:і9о7 в середовищі кількісно визначали методом ІФА і ВЕРХ і представляли у вигляді концентрації СКМ':о7, вираженої на літр культурального середовища.
Приклад 2
Продукування САМ:97 генно-модифікованим штамом Согупебасіепит аїрнійепае СТЕр в базовому середовищі без компонентів тваринного походження
У цьому процесі використовували штам Согупебасієпит аїрніпепае С7Ер. Інокулят отримували у струшуваній колбі методом двоетапного культивування. Середовище для культивування у струшуваній колбі містило 10 г/л дріжджового екстракту (УЕ), 15 г/л рослинного пептону, 4,3 г/л КНегРОх, 50 мг/л триптофану, 4,0 г/л глюкози, 0,8 мг/л нікотинової кислоти, 0,08 мг/л пімелінової кислоти, 25 мг/л СизЗО4.5Н2О, 12,5 мг/л 2п1505.5Н20, 6,25 мг/л МпсСі2.4НгО, 0,5 г/л цистину, 25 мг/л канаміцину і 4,0 г/л глюкози.
Для запуску процесу в середовище ферментера об'ємом 20 л додавали 595 інокулята.
Середовище для культивування ферментера містило 15 г/л УЕ, 30 г/л рослинного пептону, 4,3 г/л КНеРоОх, 50 мг/л триптофану, 0,8 мг/л нікотинової кислоти, 0,08 мг/л пімелінової кислоти, 25 мг/л СиЗО»4.5Н2гО, 12,5 мг/л 2п505.5Н20, 6,25 мг/л МпсСі».4Н2О, 0,5 г/л цистину, 25 мг/л канаміцину, 4,0 г/л глюкози.
Всю партію культури перемішували при 300 об./хв. Температуру підтримували на рівні 357С, а рН підтримували на рівні 7,4, використовуючи 2095 ортофосфорну кислоту і 5 н Ммаон.
Культуру аерували потоком 1,0 об./об./хв. повітря. Культуру збагачували киснем для підтримки розчиненого кисню (090) на рівні 2095. Після перших декількох годин рівень БО продовжував падати нижче 2095, коли була досягнута межа збагачення 0». Рівень БО в решті частини партії залишався близьким до нуля і підвищувався в останні години. Коли рівень залишкової глюкози в бульйоні падав нижче 0,5 г/л, вводили підживлення, що містить 4095 глюкози, зі швидкістю 2 г/л/годину. Партію збирали через 14 годин культивування при досягненні густини клітин, що дорівнює приблизно 90 одиниць оптичної густини при 600 нм. Піну в реакторі контролювали, використовуючи 3095 органічний піногасник. Продукція СКМ!97 досягала титру від 60 до 65 мг/л ферментативного бульйону.
Зо Ферментація, яка проводиться в схожих умовах з використанням немодифікованого штаму
Согуперасіепит аїрпіпегіае С7 СВМ!97, давала приблизно 35-40 мг/л СЕМ!97, щО нижче за вихід, який спостерігається у випадку генно-модифікованого штаму. Це показує вплив додаткових копій гена на збільшення продукування САМ 97.
Приклад З:
Продукування САМ!:97 генно-інженерним штамом Согупебасієпит аїрнпійепае Ст7Ер в базовому середовищі без компонентів тваринного походження з використанням моделі балансу метаболічного потоку
У цьому процесі використовували штам Согупебасієпит аїрніпепае С7Ер. Інокулят отримували у струшуваній колбі методом двоетапного культивування. Середовище для культивування у струшуваній колбі містило 10 г/л МЕ, 15 г/л рослинного пептону, 4,3 г/л
КНегРО», 50 мг/л триптофану, 4,0 г/л глюкози, 0,8 мг/л нікотинової кислоти, 0,08 мг/л пімелінової кислоти, 25 мг/л Си5О4.5НгО, 12,5 мг/л 2п5052.5Н2О, 6,25 мг/л МпсСі».4Н2О, 0,5 г/л цистину, 25 мг/л канаміцину, 4,0 г/л глюкози.
Для запуску процесу в середовище ферментера об'ємом 20 л додавали 595 інокулята.
Середовище для культивування ферментера містило 15 г/л УЕ, 30 г/л рослинного пептону, 4,3 г/л КНгРОх, 50 мг/л триптофану, 0,8 мг/л нікотинової кислоти, 0,08 мг/л пімелінової кислоти, 25 мг/л СиЗО»4.5Н2гО, 12,5 мг/л 2п505.5Н20, 6,25 мг/л МпсСі».4Н2О, 0,5 г/л цистину, 25 мг/л канаміцину і 4,0 г/л глюкози.
Всю партію культури перемішували при 300 об./хв. Температуру підтримували на рівні 357С, а рН підтримували на рівні 7,4 з використанням 2095 ортофосфорної кислоти і 12,595 гідроксиду амонію. Культуру аерували потоком повітря 1,0 об./об./хв. Культуру збагачували киснем для підтримки СО на рівні 2095. Вводили модель, яка відстежувала рівень метаболічної конверсії в заданий момент часу, ця модель брала дані з онлайн-параметра залишкового БО відповідно до змін з урахуванням рН, СО», тепловиділення. У лог-фазі рівні БО продовжували падати нижче 2095, незважаючи на досягнення межі збагачення О2. Рівень БО в решті частини партії залишався близьким до нуля і підвищувався в останні години. Коли рівень залишкової глюкози в бульйоні падав нижче 0,5 г/л, вводили підживлення, що містить 4095 глюкози, для відповідності моделі метаболічного потоку. Партію збирали через 14 часів культивування при досягненні густини клітин, яка дорівнює приблизно 90 одиниць оптичної густини при 600 нм. Піну в реакторі 60 контролювали, використовуючи 3095 органічний піногасник. Продукція СКМ:97 досягала титру б
150 мг/л ферментативного бульйону.
Приклад 4:
Продукування СВМ:97 згідно з даним винаходом
Інокулят отримували методом триєтапного культивування. Перші два етапи виконували у струшуваних колбах. Середовище для культивування у струшуваних колбах містило 10 г/л МЕ, 15 г/л рослинного пептону, 4,3 г/л КНегРОх», 50 мг/л триптофану, 4,0 г/л глюкози, 2 мл/л розчину
УС з солями мікроелементів, 1 мл/л цистинової добавки, 25 мг/л канаміцину, 4,0 г/л глюкози.
Склад базового середовища для посівного ферментера був наступним: 15 г/л МЕ, 30 г/л рослинного пептону, 4,3 г/л КНеРОх, 50 мг/л триптофану, 0,8 мг/л нікотинової кислоти, 0,08 мг/л пімелінової кислоти, 25 мг/л Си5О4.5Н2гО, 12,5 мг/л 7п5054.5Н20, 6,25 мг/л МпсСі2.4НгО, 0,5 г/л цистину, 25 мг/л канаміцину, 4,0 г/л глюкози.
Нижче наведений склад середовища в ферментері (таблиця І) і інгредієнти, який був розроблений відповідно до плану Плаккета-Бермана.
Таблиця зрашеи Геереню, вжи ре енн середовища середовища кислота кислота 6 | Глутамат/ | 01 | гл |23| Кальцй | 2 | мг/л 8 | Пстидин/ | 1 | гл |25| Холн./ | 01 | мг/л 9 | І'золейцин./ | 1 | гл |26| Мідь | 10 | мг/л кислота кислота
У ферментер об'ємом 20 л з вказаними вище компонентами в базовому середовищі (15 г/л
МЕ, 30 г/л рослинного пептону, 4,3 г/л КН2РО:, 50 мг/л триптофану, 0,8 мг/л нікотинової кислоти, 0,08 мг/л пімелінової кислоти, 25 мг/л Си5ЗО4.5Н2О, 12,5 7п5054.5Н20О мг/л, 6,25 мг/л
Мпсї2.4Н2О, 0,5 г/л цистину, 25 мг/л канаміцину, 4,0 г/л глюкози) додавали 595 інокулята з посівного ферментера для запуску процесу. Температуру підтримували на рівні 35"С, і. рн підтримували на рівні 7,4-7,6 з використанням 2095 ортофосфорної кислоти, 12,595 гідроксиду амонію, і використовуючи модель, основану на модуляції метаболічного потоку (фіг. 2) подачі глюкози і ОТК. Культуру аерували потоком повітря 1,0 об./об./хв. Культуру збагачували киснем для підтримки БО на рівні 2095. У лог-фазі рівні 0О продовжували падати нижче 20905, незважаючи на досягнення межі збагачення ОО». Рівень БО в решті частини партії залишався близьким до нуля і підвищувався в останні години. Коли залишкова глюкоза в бульйоні падала нижче 0,5 г/л, подавали 4095 розчин глюкози зі швидкістю 4,5 г/л/годину. Періодично додавали вітаміни і мікроелементи в наступних кількостях: 6,425 мг/л нікотинової кислоти, 0,465 мг/л
Зо пімелінової кислоти, 25 мг/л Си5О4.5Н2О, 12,5 мг/л 7п504.5Н2О, 6,25 мг/л МпсСі».4НгО, 0,08 мг/л тіаміну, 0,25 мг/л пантотенової кислоти, 0,006 мг/л біотину, 0,3 мг/л рибофлавіну, 0,06 мг/л фолієвої кислоти. Партію збирали через 18 годин культивування при досягненні густини клітин приблизно 132 одиниць ОО при 600 нм. Піну в реакторі контролювали, використовуючи 3095 органічний піногасник. Продукція СЕКМ:іо7 досягла титру 450-500 мг/л ферментативного бульйону.
Приклад 5
Порівняння виходів СКМ:197 при використанні нативного Согупебасіепит аїрнійегіає С7 і генно-модифікованого штаму Согупебасієепит аїрпіпегіае СТЕ р
Ферментацію виконували в базовому середовищі без компонентів тваринного походження, використовуючи раніше отримані покращення процесу на основі моделі, і середовище і способи відповідно до даного винаходу з використанням нативного штаму Согупебасіепит аїрпіпегіае Ст і генно-модифікованого штаму Согуперасіепит аїрнпіпепіає.
Для оптимізації процесу використовували один лізогенний штам Согулебасіепит аїрнпіпегіає
С7 ії генно-модифікований штам з епізодично розміщеними додатковими копіями гена СКМ'97 (С7ТЕр). У типовому знезалізненому середовищі МС, що містить компоненти тваринного походження, С7 давав від 22 до 25 мг/л СКМ':97, тоді як С7Ер давав від 40 до 45 мг/л. Коли середовище було модифіковане шляхом заміни компонентів тваринного походження рослинним пептоном, штам С7 давав від 40 до 45 мг/л СЕМ':97, в той час як С7Ер давав 65 мг/л
САМ!97. При зміні умов процесу шляхом зміни параметрів штам С7Ер продукував від 120 до 150 мг/л СКМ!і97. Модель була розроблена з використанням вихідних даних базового процесу.
Остаточний результат оптимізованого методу забезпечив вихід 120 мг/л СЕМ':97 у С7 і »500 мг/л
САМ!97 у С7ТЕр. Порівняння результатів наведене в таблиці ЇЇ:
Таблиця ЇЇ
Порівняння виходу, отриманого при використанні нативного штаму С7 - Согуперасіепит арпіпегіає, з виходом, отриманим при використанні епісомально модифікованого С7Ер, при різних умовах процесу.
Мо ! Організм : Виходи СВМ 97 в мг/л згідно з результатами ІФА ! " Базове середовище без Покращення, | Середовище . : , | компонентівтваринного отриманів 000 процесза : ! походження о попередніх | даним ! 00100100 СогупебасівтитсСі 20-25 БО 00001020 нн НаТИВНИЙ) 0 іт : 2 Согуперасіейит С7 Ер. ! | ' 8 додатковими копіями 60-65 ояабяво 00 5ОВЇ СС ! ! гена, введеними в ! !
Сооформіелісом) нн
Claims (14)
1. Спосіб отримання СЕМ!:97, який включає вирощування штаму Согуперасіепит аїіріпепає в знезалізненому ферментативному середовищі без компонентів тваринного походження, яке містить 10 або більше амінокислот, де амінокислоти не є тирозином або аспаргіном, і де знезалізнене ферментативне середовище без мальтози.
2. Спосіб за п. 1, який включає додавання у ферментативне середовище поживних речовин.
3. Спосіб за п. 2, в якому додавання поживних речовин у ферментативне середовище включає використання метаболічного потоку.
4. Спосіб за п. 1, в якому 10 або більше амінокислот вибирають з групи, яка складається з аланіну, аргініну, аспарагінової кислоти, цистеїну, глютамінової кислоти, глютаміну, гліцину, Зо гістидину, ізолейцину, лейцину, лізину, метіоніну, фенілаланіну, проліну, серину, треоніну, триптофану, валіну і їхніх солей.
5. Спосіб за п. 4, в якому 10 або більше амінокислот присутні в знезалізненому ферментативному середовищі в кількості від 0,05 до 2 г/л.
6. Спосіб за п. 1, в якому знезалізнене ферментативне середовище містить фенілаланін і аргінін в кількості менше ніж 1 г/л.
7. Спосіб за п. 2, в якому поживні речовини вибирають з групи, яка складається з нікотинової кислоти, тіаміну, пантотенової кислоти, біотину, рибофлавіну, фолієвої кислоти, пімелінової кислоти, фосфату, джерелу азоту і металевих мікроелементів.
8. Спосіб за п. 1, в якому склад знезалізненого ферментативного середовища включає базове ферментативне середовище, де базове ферментативне середовище містить дріжджовий екстракт (УС), рослинний пептон, дигідрофосфат калію (КНгРоОх), триптофан і глюкозу.
9. Спосіб за п. 1, який додатково включає додавання в знезалізнене ферментативне середовище глюкози.
10. Спосіб отримання СКМ!"97, який включає: ї) культивування штаму Согуперасіегіит аірпітпегіає зі збільшеною кількістю копій гена СЕМ'97 В знезалізненому ферментативному середовищі, яке містить базове середовище і 10 або більше амінокислот, вибраних з групи, яка складається з аланіну, аргініну, аспарагінової кислоти, цистеїну, глютамінової кислоти, глютаміну, гліцину, гістидину, ізолейцину, лейцину, лізину, метіоніну, фенілаланіну, проліну, серину, треоніну, триптофану, валіну і їхніх солей, і і) додавання в знезалізнене ферментативне середовище глюкози і поживних речовин з використанням метаболічного потоку, де знезалізнене ферментативне середовище без мальтози.
11. Спосіб отримання СЕМ:97, який включає культивування штаму Согупебасіепит адірпіпегіає зі збільшеною кількістю копій гена СЕМ:іо7 в знезалізненому ферментативному середовищі без компонентів тваринного походження, і яке містить 10 або більше амінокислот, і додавання в знезалізнене ферментативне середовище поживних речовин з використанням метаболічного потоку, причому кожна з 10 або більше амінокислот присутня в знезалізненому ферментативному середовищі в кількості від 0,05 до 2 г/л, де амінокислоти не є тирозином або аспаргіном, і де знезалізнене ферментативне середовище без мальтози.
12. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що спосіб проводять при температурі від 30 до 40 "С і при рН від 7,0 до 8,0.
13. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що вихід отриманого СЕМ:97 становить від 50 до 500 мг/л СКМ 97.
14. Спосіб отримання кон'югатної вакцини, який включає кон'югування полісахаридів, отриманих з ба/топе/а урні, бгеріососсиз рпеитопіае, Наеторнийи5 іпПшепгає, з СЕМіо7, отриманим згідно з п. 1. цех краде перекинвання Ажмитчбікзсія клевтк СЕМКІО 7 з 0 прявжеражну БУЄ Х КБ ТОЮ Еш зжлплювваців джпліканія й СЕМПЕ? трексхритий квсета з Ше какр. пк шт возвідтвитІ Бр ТО еНМ . Врецо 1: вв ї ї дк ля ї З щ жит БУ КТК Як їх З тв 7 найшов» 5 0ОВВЕМ соноштомо бно де НОВІ ВУ те я ВТОХИ вве из див СІ БЕОБІВИЗЮ Зоо ов рег Емі - г пиечМ З З мо я зник тав мк ток вх 2 Ко: ков в поко о
Фіг. 1
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IN201741014335 | 2017-04-22 | ||
| PCT/IN2018/050235 WO2018193475A2 (en) | 2017-04-22 | 2018-04-19 | An improved method for high level production of crm |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA127497C2 true UA127497C2 (uk) | 2023-09-13 |
Family
ID=63678648
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201911302A UA127497C2 (uk) | 2017-04-22 | 2018-04-19 | СПОСІБ ВЕЛИКОМАСШТАБНОГО ВИРОБНИЦТВА CRM<sub>197</sub> |
Country Status (30)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11098089B2 (uk) |
| EP (1) | EP3612553B1 (uk) |
| JP (1) | JP7161493B2 (uk) |
| KR (1) | KR102637436B1 (uk) |
| CN (1) | CN110741013B (uk) |
| AU (1) | AU2018255959B2 (uk) |
| BR (1) | BR112019022093A2 (uk) |
| CA (1) | CA3060723A1 (uk) |
| CL (1) | CL2019003003A1 (uk) |
| CO (1) | CO2019011643A2 (uk) |
| CU (1) | CU24668B1 (uk) |
| DK (1) | DK3612553T3 (uk) |
| EA (1) | EA201992527A1 (uk) |
| ES (1) | ES2926535T3 (uk) |
| HR (1) | HRP20221060T1 (uk) |
| HU (1) | HUE059629T2 (uk) |
| IL (1) | IL270075B2 (uk) |
| LT (1) | LT3612553T (uk) |
| MX (1) | MX2019012563A (uk) |
| MY (1) | MY194242A (uk) |
| PH (1) | PH12019550214A1 (uk) |
| PL (1) | PL3612553T3 (uk) |
| PT (1) | PT3612553T (uk) |
| RS (1) | RS63551B1 (uk) |
| SA (1) | SA519410306B1 (uk) |
| SG (1) | SG11201909765XA (uk) |
| SI (1) | SI3612553T1 (uk) |
| UA (1) | UA127497C2 (uk) |
| WO (1) | WO2018193475A2 (uk) |
| ZA (1) | ZA201906270B (uk) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210062669A (ko) | 2018-09-23 | 2021-05-31 | 바이오로지칼 이 리미티드 | 스트렙토코쿠스 뉴모니아에의 정제된 협막 다당류 |
| CN113755380A (zh) * | 2021-09-23 | 2021-12-07 | 艾美卫信生物药业（浙江）有限公司 | 一种发酵生产白喉毒素crm197蛋白的菌种培养基、配制方法以及菌种复苏培养方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2231770T3 (es) * | 1993-03-05 | 2005-05-16 | Wyeth Holdings Corporation | Nuevos plasmidos para la produccion de proteina crm y toxina difterica. |
| PT1849860E (pt) | 1997-05-28 | 2011-02-23 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Processo de preparação de um factor imunogénico de corynebacterium diphtheriae utilizando um meio de cultura com extracto de levedura como fonte de aminoácidos e sem complexos proteicos de origem animal |
| US20040087020A1 (en) * | 1997-05-28 | 2004-05-06 | Chiron S.P.A. | Culture medium with yeast or soy bean extract as amino acid source and no protein complexes of animal origin |
| GB9904582D0 (en) | 1999-02-26 | 1999-04-21 | Nycomed Imaging As | Process |
| KR20060133994A (ko) | 2003-12-12 | 2006-12-27 | 사노피 파스퇴르 리미티드 | 디프테리아 독소의 생산 방법 |
| GB0505996D0 (en) | 2005-03-23 | 2005-04-27 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Fermentation process |
| AU2010201410B2 (en) * | 2010-03-30 | 2015-04-30 | Pelican Technology Holdings, Inc. | High level expression of recombinant CRM197 |
| GB2495341B (en) * | 2011-11-11 | 2013-09-18 | Novartis Ag | Fermentation methods and their products |
| FR2992656B1 (fr) * | 2012-07-02 | 2016-10-07 | Sanofi Pasteur | Procede de production d'antigenes haemophilus influenzae type b |
| ITMI20130142A1 (it) * | 2013-01-31 | 2014-08-01 | Biosynth Srl | Vaccini glicoconiugati comprendenti unita' di base di un costrutto molecolare esprimente epitopi multipli incorporati |
| JP6473460B2 (ja) * | 2014-03-03 | 2019-02-20 | スカラブ ゲノミクス， エルエルシー | 大腸菌における組換えｃｒｍ１９７の産生強化 |
-
2018
- 2018-04-19 US US16/606,958 patent/US11098089B2/en active Active
- 2018-04-19 SG SG11201909765X patent/SG11201909765XA/en unknown
- 2018-04-19 BR BR112019022093A patent/BR112019022093A2/pt unknown
- 2018-04-19 KR KR1020197033074A patent/KR102637436B1/ko active IP Right Grant
- 2018-04-19 ES ES18773868T patent/ES2926535T3/es active Active
- 2018-04-19 CU CU2019000083A patent/CU24668B1/es unknown
- 2018-04-19 LT LTEPPCT/IN2018/050235T patent/LT3612553T/lt unknown
- 2018-04-19 HU HUE18773868A patent/HUE059629T2/hu unknown
- 2018-04-19 HR HRP20221060TT patent/HRP20221060T1/hr unknown
- 2018-04-19 RS RS20220813A patent/RS63551B1/sr unknown
- 2018-04-19 EP EP18773868.7A patent/EP3612553B1/en active Active
- 2018-04-19 MX MX2019012563A patent/MX2019012563A/es unknown
- 2018-04-19 WO PCT/IN2018/050235 patent/WO2018193475A2/en active Application Filing
- 2018-04-19 DK DK18773868.7T patent/DK3612553T3/da active
- 2018-04-19 AU AU2018255959A patent/AU2018255959B2/en active Active
- 2018-04-19 JP JP2019557469A patent/JP7161493B2/ja active Active
- 2018-04-19 PT PT187738687T patent/PT3612553T/pt unknown
- 2018-04-19 IL IL270075A patent/IL270075B2/en unknown
- 2018-04-19 EA EA201992527A patent/EA201992527A1/ru unknown
- 2018-04-19 CN CN201880026461.2A patent/CN110741013B/zh active Active
- 2018-04-19 CA CA3060723A patent/CA3060723A1/en active Pending
- 2018-04-19 UA UAA201911302A patent/UA127497C2/uk unknown
- 2018-04-19 MY MYPI2019006169A patent/MY194242A/en unknown
- 2018-04-19 PL PL18773868.7T patent/PL3612553T3/pl unknown
- 2018-04-19 SI SI201830744T patent/SI3612553T1/sl unknown
-
2019
- 2019-09-23 ZA ZA2019/06270A patent/ZA201906270B/en unknown
- 2019-10-16 PH PH12019550214A patent/PH12019550214A1/en unknown
- 2019-10-16 SA SA519410306A patent/SA519410306B1/ar unknown
- 2019-10-21 CO CONC2019/0011643A patent/CO2019011643A2/es unknown
- 2019-10-21 CL CL2019003003A patent/CL2019003003A1/es unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6961819B2 (ja) | Ｌ−リジンを生産する組換え菌、その構築方法およびｌ−リジンの生産方法 | |
| EP2102337B1 (en) | A microorganism of corynebacterium genus having enhanced l-lysine productivity and a method of producing l-lysine using the same | |
| US8058036B2 (en) | Microorganism of Corynebacterium genus having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the same | |
| JP2021500914A5 (uk) | ||
| CN103497979B (zh) | 用于改良生产天冬氨酸衍生的氨基酸及化学品的改变的乙醛酸支路 | |
| JP5897197B2 (ja) | 有用物質の製造法 | |
| KR20130082124A (ko) | 자일로즈 이용능이 부여된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산방법 | |
| UA127497C2 (uk) | СПОСІБ ВЕЛИКОМАСШТАБНОГО ВИРОБНИЦТВА CRM<sub>197</sub> | |
| CN105980544B (zh) | 生产l-氨基酸的微生物及使用所述微生物生产l-氨基酸的方法 | |
| CN106701649B (zh) | 生产l-谷氨酰胺的菌株和生产l-谷氨酰胺的方法 | |
| CN114107159B (zh) | 一种高产β-丙氨酸生产菌、构建方法及应用 | |
| KR100816472B1 (ko) | 글루타메이트 에이비씨-타입 트랜스포터 활성이 결실된코리네박테리아 및 이를 이용한 엘-라이신 생산방법 | |
| EA045614B1 (ru) | Улучшенный способ крупномасштабного производства crm197 | |
| Masilamani et al. | Method for high level production of CRM 197 | |
| KR100389580B1 (ko) | Ｌ-트레오닌 생산 변이주 및 그를 이용한 ｌ-트레오닌생산방법 | |
| KR20120098235A (ko) | 비천연 아미노산 생산 균주 및 이를 이용한 비천연 아미노산의 제조 방법 | |
| OA20586A (en) | An improved method for high level production of CRM | |
| CN117487732A (zh) | 一种无质粒无缺陷型l-亮氨酸生产菌株的构建 | |
| TW202248206A (zh) | 新穎MdtH變異體及藉由使用其生產O-磷絲胺酸及半胱胺酸及半胱胺酸之衍生物的方法 | |
| CN116478976A (zh) | yejG基因及其突变体及其在制备氨基酸中的应用 | |
| JP2009232840A (ja) | 有用物質の製造方法 |