KR20060133994A - 디프테리아 독소의 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 디프테리아 독소 생산용 코리네박테리움 디프테리아 배양 배지 및 독소 생산 방법에 관한 것이다. 당해 배지에는 동물 기원 생성물이 실질적으로 부재이고 물, 탄수화물 공급원, 질소원 및, 각각의 유리 아미노산의 초기 농도가 독소의 생산을 제한하지 않는 초기 농도의 유리된 다수의 아미노산이 포함되어 있다.
코리네박테리움 디프테리아, 디프테리아 독소, 톡소이드
Description
본 발명은 디프테리아 독소 생산용 세균 증식 배지 및 방법에 관한 것이다.
디프테리아는 그람 양성이고 호기성이며 간균 형태인 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae)의 감염에 의해 유발되는 치명적인 질환이다. 당해 질환은 씨. 디프테리아의 독소 생산 균주가 비인두 조직을 국부적으로 침입하여 유발된다. 당해 유기체는 편도선 또는 비인두 영역내에 위치할 수 있는 통증성, 출혈성 및 괴사성 병변 위에 위치한 단단한 섬유성 막에서 증식한다. 과거의 전형적인 유행병 발생 동안에, 당해 질환은 소적(droplet) 감염에 의해 전염되었다. 디프테리아로부터 회복한 환자는, 항생제로 집중적으로 치료받지 못한다면, 환자의 인후 및 비인두에서 수주 또는 수개월동안 독성 세균을 보유할 수 있다.
디프테리아의 임상적 증상 대부분은 tox 유전자를 갖고 있는 코리네박테리오프로파아지(corynebacterioprophage)로부터 생성된 강력한 디프테리아 독소 때문이다. 프로파아지가 씨. 디프테리아 균주에 감염되고 용원화가 유발된 후 당해 균주는 독성이 된다. 디프테리아 독소의 비독성 형태(톡소이드(toxoid))를 사용한 능 동 면역화에 의해 유도된 독소 중화 항체(항독소)는 디프테리아를 예방할 수 있다. 현재 면역화 전략은 디프테리아 독소를 포름알데하이드 처리에 의해 비독성이지만 항원성인 톡소이드로 전환시켜 제조되는 디프테리아 백신을 사용하는 것이다. 디프테리아 톡소이드는 전세계적으로 대량 면역화를 위해 기타 백신 성분과 다양하게 배합하여 사용된다. 세계 보건 기구(WHO)는 최근에 전세계적으로 연간 100,000건의 사례가 발생하고 있고 8,000명 가량이 사망하는데 그 이유는 어린이의 면역화 감소, 성인에서의 디프테리아에 대한 면역력의 쇠퇴 및 백신의 불충분한 공급으로 인한 것으로 추정하고 있다.
흔히, 코리네박테리움 디프테리아의 파르케 윌리엄스(Parke Williams) 8 (PW8) 균주의 변이체는 외독소를 제조하기 위해 사용되고 있고 이로부터 화학적 변형에 의해 톡소이드가 제조된다. 일반적으로, 아미노산, 미량 비타민, 무기염 및 말토스와 같은 탄수화물 공급원을 함유한 배지 제형이 당해 세균의 우수한 증식을 촉진한다. 카제인의 산 분해물 및 소 근육의 효소(트립신 또는 파파인)적 분해물과 같은 또 다른 배지가 독소 생산을 위해 적합한 배지이다. 통상적인 방법에서, 당해 세균은 동물 기원의 단백질성 물질을 함유하는 배지에서 배양된다. 디프테리아 생산에 일반적으로 사용되는 배지는 NZ-아민 A형 배지이고 이는 카제인 분해물을 함유한다. 최적의 조건하에서, NZ-아민 A형 배지를 사용하여 생산되는 독소의 양은 라임스(Limes)의 침전 방법으로 측정했을때 180Lf/ml이다(참조문헌 1 내지 3, 본원 전반에 걸쳐 다양한 참조문헌이 본 발명이 속하는 기술 분야의 정황을 보다 완전하게 기재하기 위해 괄호내에 인용되고 있다. 각각의 인용을 위한 완전한 도서 목록 정보는 특허청구범위 바로 직전 명세서 후반에 기재되어 있다. 이들 참조문헌 각각의 내용은 본원에서 참조하기 위해 인용된다).
동물 기원의 단백질성 물질의 사용은 당해 배지를 사용하여 생산되는 디프테리아 독소에 바람직하지 못한 오염물을 도입시킬 수 있다.
루피누스 루테우스(Lupinus luteus)의 발아된 종자 기원 영양 배양 배지 제제(대두 추출물)는 엘 크홀리(El Kholy)등(1967)(문헌참조 5)이 씨. 디프테리아의 증식 배지에 사용하였다. 세균은 양호하게 증식하지만 디프테리아 톡소이드의 생산은 매우 적다. 엘크홀리 및 카라미야(Kraramya)(1979)(참조문헌 5)는 대두 추출물중의 사포닌이 독소 생산 억제제인 것으로 결론지었다. 타하(Taha) 및 크홀리(1985)(참조문헌 6)는 연속 추출전에 대두를 고온고압살균 시킨 후 물을 비등시켜 Lf값이 대조군(육수)에 필적하는 독소를 생성시키는 수성 추출물을 수득하였는데 이러한 이유는 고온고압 증기에 의해 트립신 억제제가 파괴되고 연속 비등에 의해 추출물의 사포닌 함량이 감소될 수 있기때문이다. pH 4.6에서 대두 밀의 산 추출은 대조군(육수)의 Lf값에 필적하는 Lf 값을 갖는 추출물을 유도하는데 이는 사포닌 및 트립신 억제제 둘다가 당해 pH에서 제한된 양으로 추출되기 때문이다.
월페(Wolfe) 등의 출원인으로 2000년 8월 31일자로 공개되고 출원인 NYCOMED IMAGING AS로 양도된 국제 특허 공보 제WO 00/50449호는 디프테리아 독소 생산용 배지 및 방법을 기재하고 있다. 당해 제WO 00/50449호에 기재된 모든 배지는 유단백질 카제인의 산 가수분해에 의해 수득되는 카사미노산을 함유한다. 따라서, 제WO 00/50449호에 기재된 모든 배지는 동물 기원의 단백질성 물질을 함유한다. 올 리베리(Oliveri) 등의 출원인으로 1998년 12월 3일자로 공개되고 출원인 Chiron S.P.A.로 양도된 국제 특허 공보 제WO 98/541296호는 소이톤(soytone)을 함유하는, 디프테리아 독소 생산용 배지를 기재하고 있다.
비독성이고 흔히 CRM(교차 반응 물질)로서 언급되는 디프테리아 독소 유사체는 보고되어 있다(예를 들어, 참조문헌 7). 이들의 예는 CRM-197, CRM-9, CRM-45, CRM-102, CRM-103 및 CRM-107이다.
씨. 디프테리아의 배양 및 디프테리아 독소 및 이의 유사체의 생산을 위해서는 동물 성분이 실질적으로 부재이거나 제거된 세균 증식 배지가 여전히 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 디프테리아 독소 및 이의 유사체 생산용 증식 배지 및 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 1측면에서, 디프테리아 독소 또는 이의 유사체 생산용 배양 배지가 제공되고, 여기서 배지는 동물 기원 생성물이 실질적으로 부재이고 물, 탄수화물 공급원 및 질소원 및 초기 농도의 다수의 유리된 아미노산을 함유하며 여기서, 각각의 유리된 아미노산의 초기 농도는 디프테리아 독소 또는 이의 유사체의 생산 수준을 제한하지 않는다. 당해 배양 배지는 모든 천연의 아미노산을 포함할 수 있고 탄수화물 공급원은 말토스를 포함할 수 있으며 당해 배지는 글루코스 부재일 수 있다. 질소원은 효모 추출물을 포함할 수 있다. 배양 배지는 동물 기원 생성물이 제거된 것일 수 있다.
본 발명의 제2 측면에서, 탄수화물 공급원 및 질소원, 및 각각의 아미노산이 코리네박테리움 디프테리아에 의한 디프테리아 독소 또는 이의 유사체 수준의 생산을 촉진시키는데 충분한 양으로 존재하는 4개 이상의 유리된 아미노산을 포함하는 부가 시스템을 포함하는, 동물 기원 생성물이 실질적으로 부재인 코리네박테리움 디프테리아용 배양 배지가 제공된다. 배양 배지는 모든 천연의 아미노산을 포함할 수 있고 탄수화물 공급원은 말토스일 수 있다. 질소원은 효모 추출물일 수 있다. 적합한 아미노산 농도는 배지 리터당 약 0.5g 내지 약 1g의 범위이다. 배양 배지는 동물 기원 생성물이 제거된 것일 수 있다.
본 발명의 제3 측면에서, 본원에서 제공된 바와 같은 임의의 배양 배지에서 씨. 디프테리아 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 디프테리아 독소 또는 이의 유사체의 생산 방법이 제공된다. 씨. 디프테리아 균주는 정체기때까지 증식시킬 수 있고 100Lf/ml 이상의 디프테리아 독소 또는 이의 유사체가 생산될 수 있다. 디프테리아 독소 또는 이의 유사체는 회수되고 정제되며 탈독화되어 씨. 디프테리아 감염에 의해 발병된 질환에 대해 숙주를 면역화시키기 위한 백신으로 제형화될 수 있는 디프테리아 톡소이드가 수득될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은, 본원에 제공된 바와 같은 백신을 숙주에게 투여하는 단계를 포함하는, 씨. 디프테리아의 감염에 의해 발병된 질환에 대해 숙주를 면역화시키는 방법으로 확장된다. 따라서, 본원에서 제공된 바와 같은 백신은 씨. 디프테리아의 감염에 의해 발병된 질환에 대해 숙주를 면역화시키기 위해 사용될 수 있고 본원에 제공된 바와 같은 디프테리아 톡소이드는 씨. 디프테리아의 감 염에 의해 발병된 질환에 대해 숙주를 면역화시키기 위한 약물 제조에 사용될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본원에서 제공된 바와 같은 씨. 디프테리아 균주 및 배양 배지를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 코리네박테리움 디프테리아를, 실질적으로 동물 기원 생성물을 갖지 않는 배지에서 증식시키는 단계 및 선택된 아미노산의 농도가 독소(또는 이의 유사체) 생산을 제한하지 않도록 하나 이상의 선택된 아미노산을 배양물에 제공하는 단계를 포함하는, 디프테리아 독소 또는 이의 유사체를 생산하는 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 특정 수준의 디프테리아 독소 또는 이의 유사체를 생산하기 위해 아미노산을 함유하는 배지에서 코리네박테리움 디프테리아를 배양하는 동안 하나 이상의 선택된 아미노산이 고갈되어 디프테리아 독소 또는 이의 유사체의 생산 수준을 제한하게 되는 방법에 있어서, 당해 배양동안에 하나 이상의 선택된 아미노산 추가량을 외부에서 첨가하는 단계를 포함하여 하나 이상의 선택된 아미노산이 디프테리아 독소 또는 이의 유사체의 생산 수준을 제한하지 않도록 하는 개선된 방법을 제공한다. 하나 이상의 선택된 아미노산은 Glu, Asn, Ser, His, Gly, Thr, Met, Trp 및 이소류신으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 도면을 참조로 하기의 기재로부터 추가로 이해될 것이다.
도 1은 효모 추출 아미노산 상호작용 효과에 의한 독소 수율에서 가변적인 상호작용 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 동물 성분 함유 및 동물 성분 부재 배지를 사용하여 생산되는 디프테리아 독소 및 톡소이드의 SDS-PAGE 분석이다.
도 3은 동물 성분 함유 및 동물 성분 부재 배지를 사용하여 생산되는 디프테리아 독소 및 톡소이드의 웨스턴 블롯 분석이다.
도 4는 동물 성분 함유 및 동물 성분 부재 배지를 사용하여 생산되는 디프테리아 독소 및 톡소이드의 등전점 겔 분석이다.
도 5는 동물 성분 함유 및 동물 성분 부재 배지를 사용하여 생산되는 디프테리아 독소의 원편광 2색성 분광 분석이다.
도 6은 동물 성분 함유 및 동물 성분 부재 배지를 사용하여 생산되는 디프테리아 톡소이드의 원편광 2색성 분광 분석이다.
도 7은 동물 성분 함유 및 동물 성분 부재 배지를 사용하여 200L 규모로 생산되는 디프테리아 톡소이드의 원편광 2색성 분광 분석이다.
동물 성분 부재 유리 아미노산 배지의 제형
NZ 아민은 카제인의 효소적 분해에 의해 제조된 아미노산 및 펩타이드 공급원이다. 이는 아미노 질소(유리된 아미노산) 및 유기 질소(펩타이드)의 우수한 공급원이다. 디프테리아 톡소이드 제조용 씨. 디프테리아 배지에서 또 다른 아미노산 및 펩타이드 공급원은 동물 기원 톡시프로톤-D이다. 이들 배지의 조성은 하기의 표에 나타낸다.
NZ 아민 함유 배지의 조성
동물 성분 부재 유리 아미노산 배지의 제형
아미노산 배지의 제조에서, 당해 방법은 톡시프로톤-D 및 NZ 아민 동물 성분 둘다를 함유하는 배지에서 보다 고농도(mM)의 아미노산 각각을 선별하여 씨. 디프테리아의 증식 및 이의 독소 생산을 지지할 수 있는 배지를 제조하는 것이다.
씨. 디프테리아는 NZ-아민 함유 배지에서 증식시켰다. 몇몇 아미노산은 상이한 시간 간격(24, 30 및 41시간)에서 발효 동안에 소비되는 것으로 밝혀졌다(표 4).
아미노산 농도는 mM이다.
아미노산 소비와 독소 생산과의 관계를 규명함에 의해, 아미노산 Asn, Glu, Ser, His, Gly, Thr, Met, Trp, Iso 및 Leu를 함유하는 하기의 배지를 사용하여 발효 실험을 수행하였다.
그러나, 이들 소수의 아미노산을 사용해서는 세포 증식 또는 독소 생산을 유도하지 못했다.
천연의 모든 아미노산을 함유하는 배지(CDM)를 고안하였다. 모든 아미노산은 비-동물 공급원으로 부터 유래하는 것이다. 당해 배지의 조성은 하기 표 6에 나타낸다.
NZ 아민 또는 톡시프로톤 함유 배지를 사용한, 20L 규모로 수행되는 씨. 디프테리아 균주의 발효조에 대한 비교 분석
NZ 아민 함유 배지를 사용한 발효
제1 전배양에서, 동결건조된 씨드(seed)를 이로부터 로플러(Loeffler) 사면 배양물로 파종하였고 여기서 당해 배양물은 36 ±2℃에서 22 ±2시간동안 증식시켰다. 제2 전배양에서, 22 ±2 시간의 배양 후, 사면 배양으로부터 세포를 NZ 아민 배지의 100ml들이 제1 플라스크로 옮기고 180rpm에서 22시간동안 36 ±2℃에서 배양하였다. 당해 플라스크는 또한 1ml의 1:10 희석된 포스페이트 용액(32%(w/v)) 및 0.5ml의 1:2 희석된 염화칼슘 용액(53%(w/v))을 함유하였다. 제3 전배양에서, 약 5ml의 제1 배양물을 100ml의 제1 진탕 플라스크로부터 취하고 250ml들이 NZ 아민 배지에 접종하고 36 ±2℃ 및 180rpm에서 22시간동안 배양하였다. 당해 배양물은 또한 2.5ml의 1:10 희석된 포스페이트 용액(32%(w/v)) 및 1.25ml의 1:2 희석된 염화칼슘 용액(53%(w/v))을 함유하였다. 발효에서, 15ml의 제3 전배양물을 사용하여 발효기내 15L의 NZ 아민 배지에 접종하였다. 또한 당해 배양물은 100.7ml의 0.32%(w/v) 포스페이트 용액 및 125ml의 1:2 희석된 염화칼슘 용액(53%(w/v)) 및 23.44 ml의 황화철 7수화물 용액(0.1%(w/v))을 함유하였다. 발효는, 1루쉬톤 터빈 임펠러를 장착한 브라운 발효기에서 600rpm의 진탕, 헤드스페이스를 통한 1.57 vvm의 통기를 사용하여 36 ±2℃의 통제 온도하에 수행하였다. 25시간의 발효 후, 800rpm으로 진탕을 증가시키고 발효기는 0.4bar로 가압하였다. 추가로 16시간동안 발효를 계속하였다.
톡시프로톤 함유 배지를 사용한 발효
제1 전배양에서, 동결건조된 씨드를 이로부터 5%의 양의 혈액 한천 플레이트내의 박토트립토스 한천 배양물로 파종하고 36 ±2℃에서 24 ±2시간동안 증식시켰다. 제2 전배양에서, 혈액 한천 플레이트 기원의 세포를 90ml의 배지 함유 제1 플라스크로 옮기고 실온에서 48시간동안 정체 배양함에 이어서 24시간동안 180rpm 및 36 ±2℃에서 배양하였다. 제1 배양물 약 1.6ml을 90ml의 제1 진탕 플라스크로부터 취하고 800ml의 배지에 접종하고 36 ±2℃에서 22시간동안 180rpm으로 배양하였다. 이어서 800ml의 배양물을 사용하여 발효기내 10L의 배지를 접종하였다. 발효는, 2개의 루쉬톤 터빈 임펠러, 1개 살포기 및 4개의 배플을 장착한 뉴 브라운스윅 사이언티픽 발효기내에서 수행하였다. 배양물은 220rpm에서 진탕시키고 36 ±2℃에서 0.2vvm으로 통기시켰다. pH는, 32시간의 발효가 완료될때까지 8시간 전부터 용액 덱스트로스 아미노산을 사용하여 7.5 내지 7.6으로 조절하였다. 생성된 Lf/ml은 80 내지 90Lf/ml이었다.
CDM 배지를 사용한 발효
제1 전배양
습윤 동결된 씨드(글리세롤 스톡)를 CDM + 5g/LYE 한천 배지상에 파종하고 24시간동안 36℃에서 배양하였다.
제2 전배양
플레이트의 배양물을 5ml의 CDM + 3g/LYE 배지에 재현탁시키고 이의 2.5ml을 사용하여 90ml의 CDM + 3g/LYE 배지를 함유하는 제1 플라스크에 접종하였다. 당해 플라스크를 200rpm의 일정한 진탕하에 36℃에서 24시간동안 배양하였다. 제1 플라스크는 또한 0.9ml의 1:10 희석된 포스페이트 용액(32%(w/v)) 및 0.45ml의 1:2 희석된 염화칼슘 용액(53%(w/v))을 함유하였다.
발효
약 800ml의 제3 전배양물을 사용하여 발효기내 10L의 CDM + 3g/L YE 배지에 접종하였다. 100ml의 1:10 희석된 포스페이트 용액(32%(w/v)) 및 50ml의 1:2 희석된 염화칼슘 용액(53%(w/v)) 및 3.4ml의 황화철 7수화물 용액(0.1%(w/v))을 발효에 첨가하였다. 발효는 뉴 브라운스윅 사이언티픽 또는 비. 브라운 발효기내에서 36℃의 통제 온도하에 수행하였다. 공정 계수는 다음과 같다: 진탕 250rpm, 통기 0.45vvm. pH는 발효 동안에 5N의 수산화나트륨 및 2.5M의 인산을 사용하여 6.5 내지 7.6으로 조절하였다.
침전 방법(Lf 시험) 및 ELISA에 의해 정량된 독소의 양(표 7)
발효는 말토스, 철 및 포스페이트가 다양한 농도로 배합된 CDM 배지를 사용하여 240L 규모로 수행하였다. 당해 결과는 하기 표 8에 요약한다.
OD600이 15 내지 20인 증식이 성취되지만 생산되는 독소 수준은 NZ 아민 또는 피톤과 같은 동물 기원의 단백질성 물질을 함유하는 배지가 사용되는 경우에 수득되는 수준의 미만인 90 내지 100Lf/ml이었다.
시간 경과에 따른 아미노산 소비에 대한 연구는 Asp, Glu, Asn, Ser, Gln, Gly 및 Thr과 같은 아미노산이 20L 발효조에서 나타나는 바와 같이 발효 12시간이내에 소비되고 독소 발현 단계동안에는 유용하지 못함을 보여준다(표 9).
이들 결과는 배지가 유기 또는 무기 질소로 보충되어야만 함을 제안하였다.
유기 및 무기 질소 보충물의 스크리닝
발효 과정동안에 시간 경과에 따른 아미노산 소비의 연구는 주요 아미노산이 처음 증식 12 내지 18시간이내에 소비되고 독소가 생산되는 발효 후반 단계에서는 유용하지 못함을 밝혔다. 배지는, 독소 합성을 위한 전구체로서 배지내의 아미노산을 사용하기 위해서는 질소로 보충되어 증식을 지지해야만 한다.
씨. 디프테리아의 증식 및 디프테리아 독소 생산을 위해 사용되는 상이한 배지는 다음과 같다:
a) CDM + 5g/l의 효모 추출물;
b) CDM + 5g/l의 황산암모늄 및
c) 배지내 절반 농도의 아미노산 + 5g/L 효모 추출물 및 5g/L의 황산암모늄을 함유하는 변형된 CDM.
이들 제형중에서 디프테리아 독소의 생산은 하기 표 10에 나타낸다.
보다 높은 독소 수율을 수득하기 위해 통계학적 디자인을 사용한 배지내 상이한 성분들의 최적화
컴퓨터 통계학적 디자인(FusionProR)을 사용하여 배지 조성을 최적화시켰다. 당해 디자인에서, 각각 상이한 농도의 3개의 성분(효모 추출물, 아미노산 혼합물 및 철)은 통계학적 디자인에서 입력 데이타로서 사용된다. 부분 요인 디자인(fractional factorial design)을 하기와 같이 선택하였다:
포스페이트 및 염화칼슘 용액을 불변 변수로서 유지한다.
실험은 상이한 조건하에 수행하고 생산되는 독소의 양은 ELISA로 정량하였다. 독소 농도가 약 150Lf/ml이지만 생산되는 독소는 동물 성분이 발효 공정에 사용되는 경우 보다 순수하다. 효모 추출물과 아미노산 양의 반응 그래프를, 도 1에 나타낸 바와 같이, 0.34ml/l의 철 농도에서 아미노산 혼합물의 농도를 2배로하여 외삽하였다. 효모 추출물 농도(3g/L) 및 아미노산 농도(2x)의 이들 조건하에서, 독소의 양은 등고선도 분석에 따르면 2배가 된다. 그러나, 실질적으로 이것은 비용을 증가시키고 배지의 삼투압도를 증가시켜 세포 사멸을 유도하기 때문에 용이하게 수행될 수 없다.
통계학적 디자인은 독소 수율에서 중요한 변수 상호작용 효과가 있음을 보여주었다. 가장 중요한 효과(도 1에 나타낸 바와 같이)는 효모 추출물-아미노산 상호작용 효과(A*B)이다. 효모 추출물 및 아미노산은 독소 수율에 음성 효과를 갖는다. 효모 추출물 농도가 너무 높은 경우(즉, 5g/L), 당해 조건은 세균 증식을 지지하지만 독소 생산을 지지하지는 않는다. 또한, 아미노산 농도가 2배로 증가하는 경우, 이것은 증식에 비선호적인 환경을 창출할 수 있는데 이는 삼투압의 불균형때문이다. 따라서, 효모 추출물 및 아미노산 농도는 고농도의 독소 생산을 위해 최적화되어야만 한다. 도 5에서의 일반적인 회귀 통계 분석은 R제곱 값이 0.92임을 보여준다. 이것은 관찰된 독소 수율 데이타가 퓨전프로R 디자인에 의해 작성된 독소 수율 예측 값에 매우 근접함을 의미한다. 생산되는 독소 최적량은 3g/l의 효모 추출물 농도, 1배의 아미노산 농도 및 0.34ml/L의 철 농도에서 수득된다.
초기 발효 실험 및 증식 및 독소 생산 단계 동안에 아미노산 소비 프로필을 기준으로, 아미노산 Asp, Glu, Asn, Ser, Gln, Gly 및 Thr이 보다 신속하게 소비되어 독소 발현 단계동안에는 유용하지 못한 것으로 관찰되었다. 이들은 모든 19개 아미노산 대신 퓨전프로 외삽된 반응 곡선에 의해 2배 농도로 요구되는, 독소의 보다 높은 수율을 성취하기 위한 주요 아미노산이다. 따라서, 독소 합성에 대한 2배 농도의 주요 아미노산(변형된 CDM1 + 3g/L YE)의 효과에 대한 진탕 플라스크 연구가 수행되었다. 상기 언급된 주요 아미노산의 농도를 2배로 함으로써 1배 농도(157㎍/ml)와 비교하여, 독소 수준이 2배(289㎍/ml)가 되었고 이는 이들 아미노산이 독소 합성을 위해 필요하고 이들이 증식동안에 완전히 소비된다는 추측을 지지한다. 이들 아미노산의 2배 농도 조건이 20L 발효기내로 스케일-업되는 경우 세포 증식이 불량한 것으로 관찰되었다. 최적화된 동물 성분 부재 배지는 하기 표 12에 나타낸 바와 같이 CDM + 3g/L의 효모 추출물이다.
디프테리아 톡소이드의 정제 및 탈독화
발효로부터 배양물 10ℓ를 4℃에서 20분동안 12,500 x g에서 원심분리하고 상등액을 수거하였다. 이어서 상등액을 0.22㎛ 막 필터를 통해 여과시켜 잔류 세균을 제거하였다. 황산암모늄 27%(w/v)를 4℃에서 일정한 교반하에 여과된 상등액으로 첨가함에 이어서 4℃에서 20분동안 12,500g에서 원심분리하였다. 상등액을 추가의 공정을 위해 수거하였다. 황산암모늄 13%(w/v)를 일정한 교반하에 당해 상등액으로 첨가하였다. 당해 혼합물을 4℃에서 밤새 추가로 교반함에 이어서 4℃에서 20분동안 12,500g에서 원심분리하였다. 수득한 펠렛을 약 1000ml의 0.9%(w/v)의 식염수중에 용해시켰다.
상기 독소 용액을, 10kDa 카세트를 갖는 초여과 유니트를 사용하여 0.9%(w/v) 식염수에 대해 투석 여과하여 황산암모늄을 제거하였다. 잔류액을 0.22㎛ 막 필터를 통해 여과하고 4 내지 8℃에서 저장하였다. 잔류액을 탈독화시키기 전에 0.9% (w/v) 식염수를 사용하여 500Lf/ml로 희석하였다. 디프테리아 독소는 75% 이상의 순도를 나타내었다. 포르말린 0.5%(v/v) 및 중탄산나트륨 0.5%(w/v)를 실온에서 20분동안 일정한 교반하에 희석된 독소 용액으로 첨가하였다. 20분 후, 식염수 0.9%(w/v)중의 L-라이신 용액 0.913%(w/v)를 첨가하고 혼합물을 0.22㎛ 막 필터를 통해 여과시키고 탈독화를 위해 일정한 교반하에 6주동안 37℃에서 배양하였다. 톡소이드를 4 내지 8℃에서 저장하였다.
동물 성분 함유 및 동물 성분 부재 배지를 사용하여 생산되는 디프테리아 독소 및 톡소이드의 특성 분석
동물 성분 함유 및 동물 성분 부재 배지를 사용하여 생산되는 디프테리아 독소 및 톡소이드는 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, CD 스펙트럼 측정, N-말단 서열 분석으로 분석하였다. 당해 결과는, 동물 성분 함유 및 동물 성분 부재 배지를 사용하여 수득된 독소 및 톡소이드 둘다가 근본적으로 구별될 수 없음을 지적한다.
총 단백질 농도는 마이크로플레이트 BCA 분석에서 비신코닌산(BCA)을 사용하고 공지된 농도의 참조 표분 단백질과 비교하여 측정하였다.
SDS PAGE
SDS-PAGE는 디프테리아 독소 및 톡소이드의 상대적 분자량(Mr)을 측정하고 독소 및 톡소이드의 순도를 평가하며 단백질 밴드의 분포 패턴을 평가하기 위해 수행하였다. 단백질은 환원 조건하에 12.5%의 폴리아크릴아미드 겔상에서 SDS-PAGE에 의해 분석한다. 당해 겔을 쿠마시 블루로 염색함에 이어서 밀도 측정기로 분석한다. 도 2를 참조로, 디프테리아 독소 및 톡소이드의 상대적 분자량(Mr)을 측정하고 독소 및 톡소이드의 순도를 평가하며 단백질 밴드의 분포 패턴을 평가하기 위해 SDS-PAGE가 수행됨을 보여준다. 단백질은 환원 조건하에서 12.5% 폴리아크릴아미드 겔상에서 SDS-PAGE로 분석하였다. 당해 겔을 쿠마시 블루로 염색함에 이어서 밀도 측정기로 분석하였다. 레인은 다음과 같다: 1. MW 마커(kDa), 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 15, 10 kDa; 2. 디프테리아 독소, CO3105(동물 성분 함유 배지); 3. 디프테리아 독소 Diph-20L-40F(동물 성분 함유 배지); 3. 디프테리아 독소 Diph-20L-48F(CDM + 효모 추출물 함유 배지); 4. 디프테리아 독소 Diph-20L-50F(CDM + 효모 추출물 함유 배지); 5. 디프테리아 독소 Diph-20L-55F(CDM + 효모 추출물 함유 배지); 6. 디프테리아 톡소이드 CO3152; 7. 디프테리아 톡소이드 Diph-20L-40F(동물 성분 함유 배지); 8. 디프테리아 톡소이드 Diph-20L-48F(CDM + 효모 추출물 함유 배지); 9. 디프테리아 톡소이드 Diph-20L-50F(CDM + 효모 추출물 함유 배지).
웨스턴 블롯 분석
도 3을 참조로, 디프테리아 독소 특이적 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석이 수행되었다. 샘플을 12.5%의 SDS-PAGE 겔상에서 분리하고 PVDF 막으로 옮긴 다음 DT 특이적 항체로 블롯팅하였다. 레인은 다음과 같다: 1. 상대적 분자량 마커(kDa), 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 15, 10kDa; 바이오래드 MW 마커; 2. 디프테리아 독소 CO3105; 3. 디프테리아 독소 Diph-20L-40F(동물 성분 함유 배지); 4. 디프테리아 독소 Diph-20L-48F(CDM + 효모 추출물 함유 배지); 5. 디프테리아 독소 Diph-20L-50F(CDM + 효모 추출물 함유 배지); 6. 디프테리아 독소 Diph-20L-55F(CDM + 효모 추출물 함유 배지); 7. 디프테리아 톡소이드 CO3152; 8. 디프테리아 톡소이드 Diph-20L-40F(동물 성분 함유 배지); 9. 디프테리아 톡소이드 Diph-20L-48F(CDM + 효모 추출물 함유 배지); 10. 디프테리아 톡소이드 Diph-20L-50F(CDM + 효모 추출물 함유 배지).
N-말단 서열 분석
N-말단 서열 분석을 사용하여 N 말단 전하가 변형된 임의의 단백질을 모니터하였다. 당해 단백질을 12.5%의 SDS-PAGE 겔상에서 분리하고 PVDF와 같은 고형 지지체로 옮겼다. N-말단 아미노산을 방출시키고 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)로 동정하기 전에 통상적인 에드만 분해 과정에 의해 유도체화하였다. 예상되는 N-말단 서열을, 동물 부재 독소/톡소이드 뿐만 아니라 디프테리아 독소 및 톡소이드에 대한 제조 대조군에 대해 관찰하였다.
- 장치 결함으로 인해 소실된 서열 주기
등전점 포커싱(IEF)
디프테리아 독소의 등전점은 표준 단백질을 사용하여 평가하였다. 도 3은 등전점 포커싱 겔을 나타낸다. 레인은 다음과 같다: 1. IEF stds - pI = 7.80, 7.50, 7.10, 7.00, 6.50, 6.00, 5.10, 4.65; 2. 디프테리아 독소 CO3105(동물 성분 함유 배지); 3. 디프테리아 독소 Diph-20L-11(NZ 아민 함유 배지); 4. 디프테리아 독소 Diph-20L-31(CDM + 효모 추출물 함유 배지); 5. 디프테리아 독소 Diph-20L-31(CDM + 효모 추출물 함유 배지); 6. 디프테리아 독소 CO3152(동물 성분 함유 배지); 7. 디프테리아 톡소이드 Diph-20L-11(CDM + 효모 추출물 함유 배지); 8. 디프테리아 톡소이드 Diph-20L-31(CDM + 효모 추출물 함유 배지); 9. 디프테리아 톡소이드 Diph-20L-31(CDM + 효모 추출물 함유 배지).
CD 분광 분석
원편광 2색성 분광(CD) 분석을 사용하여 다양한 로트의 형태 또는 2차 구조의 불일치를 결정하였다. 샘플의 원편광에 대한 흡광 스펙트럼은 소프트웨어 프로그램에 의해 분석하여 알파-헬릭스, 베타-쉬트, 역-회전 및 랜덤 코일 구조의 상대적 % 구성을 밝혔다. 디프테리아 독소 및 톡소이드는 야스코 CD 분광 편광기를 사용하여 22℃에서 분석하였다(도 5 내지 7 참조).
N-말단 서열 분석. 당해 단백질을 12.5%의 SDS-PAGE 겔상에서 분리하고 PVDF와 같은 고형 지지체로 옮겼다. N-말단 아미노산을 방출시키고 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)로 동정하기 전에 통상적인 에드만 분해 과정에 의해 유도체화하였다.
참조문헌
Claims (40)
- 동물 기원 생성물이 실질적으로 부재이고,a. 물;b. 탄수화물 공급원 및 질소원 및c. 각각의 초기 농도의 유리 아미노산이 디프테리아 독소 또는 이의 유사체의 생산 수준을 제한하지 않는 초기 농도의 다수의 유리된 아미노산을 포함하는, 특정 수준의 디프테리아 독소 또는 이의 유사체를 생산하기 위한 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) 균주 배양용 배양 배지.
- 제1항에 있어서, 모든 천연의 아미노산을 포함하는 배양 배지.
- 제1항에 있어서, 탄수화물 공급원이 말토스를 포함하는 배양 배지.
- 제1항에 있어서, 글루코스가 실질적으로 부재인 배양 배지.
- 제1항에 있어서, 질소원이 효모 추출물을 포함하는 배지.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 동물 기원 생성물이 제거된 배양 배지.
- 탄수화물 공급원, 질소원 및 각각의 유리 아미노산이 코리네박테리움 디프테리아에 의해 생산되는 디프테리아 독소 또는 이의 유사체의 수준을 증가시키기에 충분한 양으로 존재하는 4개 이상의 유리된 아미노산을 포함하는 부가 시스템을 포함하고 동물 기원 생성물이 실질적으로 부재인 코리네박테리움 디프테리아용 배지.
- 제7항에 있어서, 모든 천연의 아미노산을 포함하는 배양 배지.
- 제7항에 있어서, 탄수화물 공급원이 말토스인 배지.
- 제7항에 있어서, 질소원이 효모 추출물인 배지.
- 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 농도가 배지 리터당 약 0.5g 내지 약 1g의 범위인 배지.
- 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 동물 기원 생성물이 제거된 배양 배지.
- 동물 기원 생성물이 실질적으로 부재이고 물,a. 탄수화물 공급원 및 질소원 및b. 각각의 유리 아미노산의 초기 농도가 디프테리아 독소 또는 이의 유사체의 생산 수준을 제한하지 않는 초기 농도의 다수의 유리된 아미노산을 포함하는 배양 배지에서 디프테리아 독소의 생산을 허용하는 조건하에서 씨. 디프테리아를 배양하는 단계를 포함하는, 디프테리아 독소 또는 이의 유사체를 생산하는 방법.
- 제13항에 있어서, 배양 배지가 모든 천연의 아미노산을 포함하는 방법.
- 제13항에 있어서, 탄수화물 공급원이 말토스를 포함하는 방법.
- 제13항에 있어서, 배양 배지에 글루코스가 실질적으로 부재인 방법.
- 제13항에 있어서, 질소원이 효모 추출물을 포함하는 방법.
- 제13항에 있어서, 씨. 디프테리아 균주가 정체기때까지 증식되는 방법.
- 제13항에 있어서, 100Lf/ml 이상의 디프테리아 독소 또는 이의 유사체가 생산되는 방법.
- 제10항에 있어서, 디프테리아 독소 또는 이의 유사체를 회수하여 회수된 디프테리아 독소 또는 이의 유사체를 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제17항에 있어서, 회수된 디프테리아 독소 또는 이의 유사체를 정제하여 정제된 디프테리아 독소 또는 이의 유사체를 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 회수되거나 정제된 디프테리아 독소 또는 이의 유사체를 탈독화하여 디프테리아 톡소이드 또는 이의 유사체를 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제19항에 있어서, 씨. 디프테리아 감염에 의해 발병된 질환에 대해 숙주를 면역화시키기 위한 백신으로서 디프테리아 톡소이드 또는 이의 유사체를 제형화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 배지로부터 동물 기원 생성물이 제거된 방법.
- 제23항에 기재된 백신을 숙주에게 투여함을 포함하는, 씨. 디프테리아의 감염에 의해 발병된 질환에 대해 숙주를 면역화시키는 방법.
- 씨. 디프테리아의 감염에 의해 발병된 질환에 대해 숙주를 면역화시키기 위한 제23항에 기재된 백신의 용도.
- 씨. 디프테리아의 감염에 의해 발병된 질환에 대해 숙주를 면역화시키기 위한 약물 제조에 있어서, 제22항에 기재된 디프테리아 톡소이드 또는 이의 유사체의 용도.
- 동물 기원 생성물이 실질적으로 부재이고,a. 물;b. 탄수화물 공급원 및 질소원 및c. 각각의 유리 아미노산의 초기 농도가 디프테리아 독소 또는 이의 유사체의 생산 수준을 제한하지 않는 초기 농도의 다수의 유리된 아미노산을 포함하는 디프테리아 독소 또는 이의 유사체 생산용 배양 배지 및 씨. 디프테리아 균주를 포함하는 조성물.
- 제24항에 있어서, 배양 배지가 모든 천연의 아미노산을 포함하는 조성물.
- 제24항에 있어서, 탄수화물 공급원이 말토스를 포함하는 조성물.
- 제24항에 있어서, 배양 배지에 글루코스가 실질적으로 부재인 조성물.
- 제24항에 있어서, 질소원이 효모 추출물을 포함하는 조성물.
- 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 동물 기원 생성물이 제거된 배양 배지.
- 동물 기원 생성물이 실질적으로 부재인 배지에서 코리네박테리움 디프테리아의 배양물을 증식시키는 단계 및 선택된 아미노산의 농도가 독소 생산을 제한하지 않도록 하나 이상의 선택된 아미노산을 당해 배양물에 제공하는 단계를 포함하는, 디프테리아 독소 또는 이의 유사체를 생산하는 방법.
- 제1항에 있어서, 배지가 효모 추출물을 추가로 포함하는 방법.
- 제4항에 있어서, 효모 추출물이 약 3g/L의 아미노산 농도로 존재하는 방법.
- 특정 수준의 디프테리아 독소 또는 이의 유사체를 생산하기 위해 아미노산을 함유하는 배지에서 코리네박테리움 디프테리아를 배양하는 동안 하나 이상의 선택된 아미노산이 배양동안에 고갈되어 디프테리아 독소 또는 이의 유사체의 생산 수준을 제한하게 되는 방법에 있어서, 당해 배양동안에 하나 이상의 선택된 아미노산 추가량을 외부에서 첨가하는 단계를 포함하고, 이때 하나 이상의 선택된 아미노산이 디프테리아 독소 또는 이의 유사체의 생산 수준을 제한하지 않는 개선된 방법.
- 제33항에 있어서, 하나 이상의 선택된 아미노산이 Glu, Asn, Ser, His, Gly, Thr, Met, Trp 및 이소류신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제33항에 있어서, 배지가 효모 추출물을 포함하는 방법.
- 제35항에 있어서, 효모 추출물이 약 3g/L의 농도로 존재하는 방법.
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