DE19523554A1 - Helicobacter pylori-Impfstoffe und therapeutische Zusammensetzungen - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Helicobacter pylori (H. pylori) Impfstoffe/therapeutische Zusammen­ setzungen und insbesondere Impfstoffe/therapeutische Zu­ sammensetzungen gegen H. pylori-Infektionen, die H. pylori- Haemagglutinin/Protease (HAP)-Proteine oder ein Fragment davon enthalten.

H. pylori (früher Campylobacter pyloridis oder C. pylori) ist ein spiralförmiges gramnegatives Pathogen für den menschlichen Magen. Der Zusammenhang zwischen Magen- und Zwölffingerdarmgeschwürerkrankungen ebenso wie von Magenkrebs mit H. pylori ist gut dokumentiert. Der Mikro­ organismus wurde beschrieben als das am häufigsten chroni­ sche Infektionen beim Menschen erzeugende Mittel.

Eine Anzahl von verschiedenen Determinanten, die H. pylori aufweisen, wurden vorgeschlagen als mögliche patho­ gene Faktoren des Mikroorganismus, einschließlich der Urease, dem Haemagglutinin und den Hitzeschockproteinen ebenso wie die Flagelli und Cytotoxine. Jedoch müssen die genaue Rolle dieser Determinanten in der Pathogenizität des Mikroorganismus und daher der Nutzen zur Verhütung und/oder Behandlung von H. pylori-Infektionen noch geklärt werden.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß das H. pylori-Genom ein Gen einschließt, das fast identisch ist mit dem Zinkmetalloproteasegen von Vibrio cholerae (bekannt als Haemagglutinin/Protease-(hap)-Gen). Es wurde gefunden, daß das H. pylori-hap-Gen, das identifiziert wurde, zu mehr als 99% dem V. cholerae-hap-Gen gleicht. Bei V. cholerae wurde gezeigt, daß das HAP-Enzym wichtig ist für das Anbin­ den und die Ablösung des Organismus während der Cholera- Infektion.

Das von dem H. pylori-hap-Gen codierte Enzym wurde als lösliches sekretiertes Zinkmetalloproteaseenzym identi­ fiziert. Es ist wohlbekannt, daß Zinkmetalloproteaseenzyme wichtige Marker der Pathogenizität bei Bakterien, die bei Säugetieren Krankheiten verursachen, sind. Außerdem ist dieses Protein mit der Pathogenizität des Mikroorganismus verbunden, was dadurch gezeigt wurde, daß Patienten, die unter einer H. pylori-Infektion leiden, einen hohen Titer an Antikörpern gegen das H. pylori-HAP-Protein haben.

Es ist bekannt, daß Zinkmetalloproteaseenzyme einen schnellen Substratumsatz und breite Substratprofile haben. Einen Überblick über den Stand der Technik geben Frausto da Silva J.J.R. und Williams R.J.P. in The Biological Chemistry of the Elements, 1993, Clarendon Press, Oxford, Kapitel 11, und Vallee B.L. und Auld D.S., Biochemistry, 29, 5647-5659.

Es wurde gezeigt, daß das Zinkmetalloproteaseenzym von Pseudomonas aeruginosa (auch bekannt als Elastaseenzym) eine wesentliche Rolle spielt bei Prozessen, die das Lun­ gengewebe zerstören, die durch diesen Organismus verursacht werden bei Patienten mit Mukoviscidose (Bever R.A. und Iglewski B.H., J. Bacteriol., 1988, 170, 4309-4314). In ähnlicher Weise wurde gezeigt, daß das Zinkmetalloprotease­ enzym von Vibrio cholerae (V. cholerae) (auch bekannt als Mucinaseenzym oder Haemagglutinin/Protease-(HAP)-Enzym) we­ sentlich ist für das Anbinden und die Ablösung dieser Orga­ nismen während der Choleraerkrankung. Hinweise auf diesen Stand der Technik schließen ein: Hase C.C. und Finkelstein R.A., J. Bacteriol., 1991, 173, 3311-3317, und Finkelstein R.A. et al., Infect. Immunol. 1992, 60, 472-478.

Die obigen Merkmale und die bekannte Bedeutung des V. cholerae-HAP-Enzyms bei der Pathogenizität beim Menschen machen das H. pylori-HAP-Protein zu einem äußerst geeigne­ ten Objekt für einen Peptid- oder Proteinimpfstoff/eine therapeutische Zusammensetzung gegen eine H. pylori-Infek­ tion.

Somit liefert die vorliegende Erfindung einen Impf­ stoff/eine therapeutische Zusammensetzung, die ein H. pylori-HAP-Protein oder ein Fragment davon enthält, wobei das Helicobacter pylori-HAP-Protein die Aminosequenz, wie in Fig. 1 der beigefügten Zeichnung gezeigt, einschließt.

Unter dem Ausdruck "Protein" wird das vollständige oder im wesentlichen vollständige H. pylori-HAP-Protein verstanden.

Unter dem Ausdruck "Fragment" wird irgendein Teil des H. pylori-Proteins verstanden, der eine Antikörperant­ wort bei einem Patienten hervorruft.

Es versteht sich, daß die Ausdrücke "Protein" und "Fragment", wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, jedes Protein bzw. jedes Proteinfragment ein­ schließen, mit einer Aminosäuresequenz, die der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz oder einem Derivat davon entspricht. Der Ausdruck "Derivat" schließt jedes Protein, Polypeptid oder Peptid mit Aminosäurevariationen der natür­ lich vorkommenden Aminosäuresequenz ein, die die gleiche Funktion wie die natürlich vorkommende Aminosäuresequenz haben und/oder eine schützende Antikörperantwort bei Men­ schen hervorrufen. Solche Derivate schließen oft einen kon­ servativen Ersatz von Aminosäuren ein, der innerhalb der Familie der Aminosäuren stattfindet.

Das H. pylori-HAP-Protein oder Fragment davon in dem Impfstoff/der therapeutischen Zusammensetzung kann eine im wesentlichen gereinigte natürlich vorkommende Aminosäu­ resequenz oder synthetische Aminosäuresequenz sein. Ein Vorteil von synthetischen Impfstoffen/therapeutischen Zu­ sammensetzungen besteht darin, daß sie frei von irgendwel­ chen konkurrierenden Antigenen und frei von kontaminieren­ den und möglicherweise schädlichen Produkten hergestellt werden können. Bevorzugt ist das H. pylori-HAP-Protein oder Fragment davon ein rekombinantes Protein, Polypeptid oder Peptid. Die rekombinante DNA- und Protein-Technologie kann nun Protein- und Polypeptidprodukte in hoher Qualität und großer Menge liefern.

Nur bestimmte Bereiche von Proteinen und Polypepti­ den bilden antigene Stellen, die eine Antikörperantwort bei Patienten hervorrufen. Es ist daher vorteilhaft, daß der Impfstoff/die therapeutische Zusammensetzung ein oder meh­ rere H. pylori-HAP-Proteinfragmente aufweist, die identifi­ zierten antigenen Stellen des H. pylori-HAP-Proteins ent­ sprechen. Bekannte antigene Stellen des H. pylori-HAP-Pro­ teins schließen den zinkbindenden Bereich und die als Pro­ tease aktive Stelle ein. Diese funktionellen Bereiche wur­ den durch Röntgenstrahlkristallographie von gereinigten Zinkmetallproteasen mit ähnlicher Aminosäuresequenz wie das H. pylori-HAP-Protein identifiziert, zum Beispiel bei P. aeruginosa-Elastase, die in Vallee, B.L. & Auld, D.S., (1990), Zinc Coordination, Function and Structure of Zinc Enzymes and Other Proteins, Biochemistry 29: 5647-5659, in einem Überblick angegeben sind.

Der erfindungsgemäße Impfstoff/die therapeutische Zusammensetzung kann zwei oder mehr Komponenten ausgewählt aus H. pylori-HAP-Protein oder Fragmenten davon enthalten. Zum Beispiel kann der Impfstoff zwei H. pylori-HAP-Protein­ fragmente enthalten, zum Beispiel den zinkbindenden Bereich des H. pylori-HAP-Proteins und die als Protease aktive Stelle.

Der Impfstoff/die therapeutische Zusammensetzung wird bevorzugt so formuliert, daß er das ausgewählte H. pylori-HAP-Protein oder Fragment davon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält. Ein solcher Trä­ ger schließt jede Substanz ein, die nicht selbst die Erzeu­ gung von Antikörpern, die für den Patienten, der den Impf­ stoff/die therapeutische Zusammensetzung erhält, schädlich sind, induziert. Geeignete Träger sind typischerweise große, langsam metabolisierte Makromoleküle, wie Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäurecopolymere, Lipidaggregate (zum Bei­ spiel Öltröpfchen oder Liposome) und inaktive Virusteil­ chen. Außerdem können diese Träger als immunstimulierende Mittel oder Adjuvanzien dienen. Weiterhin kann das Antigen mit einem bakteriellen Toxoid als Adjuvans konjugiert sein, zum Beispiel ein Toxoid aus Diphtheria, Tetanus, Cholera oder H. pylori.

Bevorzugte Adjuvanzien zur Verbesserung der Wirk­ samkeit des Impfstoffs/der therapeutischen Zusammensetzung schließen ein: Aluminiumsalze (Alaun), zum Beispiel Alumi­ niumhydroxid, Aluminiumphosphat oder Aluminiumsulfat; Öl-in- Wasser-Emulsionen (mit oder ohne andere spezifische immun­ stimulierende Mittel wie Muramylpeptide oder Zellwandkompo­ nenten von Bakterien), zum Beispiel MF59, SAF und Ribi^TM; komplettes Freunds-Adjuvans (CFA) und inkomplettes Freunds- Adjuvans (IFA); Cytokine, wie Interleukine; Kolonie stimu­ lierenden Faktor aus Makrophagen (M-CSF); Tumor-Nekrose- Faktor (TNF) und andere Substanzen, die als immunstimulie­ rende Mittel dienen, um die Wirksamkeit der Zusammensetzung zu verbessern. Das bevorzugte bekannte Adjuvans ist Alaun.

Der Impfstoff/die therapeutische Zusammensetzung kann auch ein oder mehrere zusätzliche Antigene, die von einer anderen Quelle stammen, enthalten. Solche Antigene können andere H. pylori-Proteine oder Fragmente davon, zum Beispiel das H. pylori-Cytotoxin, das mit dem immundominie­ renden (CAI) Protein verbunden ist, Hitzeschockprotein (HSP) oder Ureaseprotein, umfassen. Andere geeignete Anti­ gene schließen V. cholerae-Toxin A- und/oder B-Unterein­ heiten ein.

Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin einen Impfstoff/eine therapeutische Zusammensetzung, wie vorher beschrieben, zur Verhütung oder Behandlung einer H. pylori- Infektion. Es wird auch die Verwendung von H. pylori-HAP- Protein oder einem Fragment davon zur Herstellung eines Impfstoffs/einer therapeutischen Zusammensetzung zur Be­ handlung einer H. pylori-Infektion bereitgestellt.

Die vorliegende Erfindung wird nun genauer unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung Fig. 1 beschrie­ ben, die die Nukleotid- und entsprechende Aminosäuresequenz eines klonierten 1,5 kb H. pylori-hap-Genfragmentes zeigt, die etwa 1 kb der codierenden Sequenz und etwa 500 bp der 3′-flankierenden Sequenz zeigt. Die Numerierung erfolgt von der ersten Adenosinbase der EcoRI-Stelle. Die Deletion von drei Basen im Leseraster (mit ΔH markiert) des V. cholerae- hap-Gens ist an Position 222 und der Bereich, der identisch ist mit dem V. cholerae-hap-Gen, erstreckt sich von Posi­ tion 1 über den codierenden Bereich (doppelt unterstrichen) mit der einzigen Ausnahme einer Addition an Position 798 und einer einzigen Deletion (eines T) an Position 843. Das Stopcodon ist mit *** bezeichnet.

Innerhalb der identifizierten Nukleinsäuresequenz für H. pylori-hap wurden zwei Bereiche identifiziert als solche, die die codierenden Regionen für die aktive Kompo­ nente des Proteins umfassen. Die zwei Regionen sind rund um die mit 16 bis einschließlich 18 numerierten Nukleinsäuren, die einen Tyrosinrest codieren, und die mit 220 bis ein­ schließlich 222 numerierten Nukleinsäuren, die einen Histi­ dinrest codieren.

Der Bereich um die Nukleinsäuren, die mit 43 bis einschließlich 45 numeriert sind, die einen Glutaminsäure­ rest codieren, wurde identifiziert als mutmaßlicher, die Zinkbindung codierender Bereich.

Die in Fig. 1 gezeigte Aminosäuresequenz oder ir­ gendein Fragment davon können mit irgendeiner im Stand der Technik bekannten Polypeptidsynthesemethode konstruiert werden. In ähnlicher Weise kann die in Fig. 1 gezeigte Nukleinsäuresequenz oder ein Fragment davon mit irgendeinem im Stand der Technik bekannten Standardverfahren kon­ struiert werden. Der Einbau der Nukleotidsequenz in einen bekannten Expressionsvektor, zum Beispiel Lambda gt11 oder Bluescript, unter geeigneten Bedingungen führt zu einem re­ kombinanten H. pylori-HAP-Protein oder einem Fragment da­ von.

Der Impfstoff/die therapeutische Zusammensetzung der Erfindung enthält typischerweise Verdünnungsmittel, wie Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin oder Ethanol. Zusätzlich können Hilfssubstanzen wie Benetzungs- oder Emulsionsmit­ tel, pH-Puffersubstanzen und dergleichen in dem Impfstoff/ der therapeutischen Zusammensetzung vorhanden sein.

Der Impfstoff/die therapeutische Zusammensetzung kann in injizierbarer Form hergestellt werden, entweder als flüssige Lösung oder Suspension oder in fester Form, die auch geeignet sein kann zur Herstellung einer Lösung zur Injektion. Der Impfstoff/die therapeutische Zusammensetzung kann auch emulgiert werden oder in Liposomen eingekapselt werden für eine verbesserte Adjuvanswirkung.

Die Verabreichung des Impfstoffs/der therapeuti­ schen Zusammensetzung kann prophylaktisch oder therapeu­ tisch geschehen und kann ein Verfahren zur Behandlung des Patienten umfassen.

Der Impfstoff/die therapeutische Zusammensetzung der Erfindung wird in einer ausreichenden Menge verab­ reicht, um eine schützende Antwort des Wirts hervorzurufen. Diese Menge hängt, neben anderen Faktoren, von der Größe und Gesundheit des Patienten, der Fähigkeit des Immun­ systems des Patienten, eine Immunantwort zu liefern, dem Grad und der Schnelligkeit des gewünschten Schutzes und der Formulierung des Impfstoffs/der therapeutischen Zusammen­ setzung ab.

Der Impfstoff/die therapeutische Zusammensetzung wird üblicherweise parenteral verabreicht, zum Beispiel durch Injektion, entweder subkutan oder intramuskulär. Zusätzliche Präparate, die für andere Arten der Verabrei­ chung geeignet sind, schließen orale und pulmonare Präpa­ rate, Zäpfchen und transdermale Anwendungen ein. Orale Prä­ parate sind am meisten bevorzugt für H. pylori-Impfstoffe oder therapeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Er­ findung, da H. pylori-Infektionen fast ausschließlich im Magen auftreten. Die Dosierung kann eine einzelne Dosierung oder eine Mehrfachdosierung sein. Der Impfstoff/die thera­ peutische Zusammensetzung kann zusammen mit anderen immun­ regulierenden Mitteln verabreicht werden.

Die vorliegende Erfindung wird nun genauer unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben:

Beispiel 1 Wachstum von H. pylori-Stämmen und Extraktion von DNA und Proteinen

Die H. pylori-Stämme NCTC (National Collection of Type Cultures, London) 11637, 11638, 11916 und HP 34 (kli­ nisches Isolat einer Biopsie, die während der Endoskopie eines Patienten im Queen′s Medical Centre, The University Hospital, Nottingham, entnommen wurde) wurden auf Columbia- Blutagar mit 5% Pferdeblut (Oxoid) als Rasen für die DNA- Extraktion 2 Tage unter mikroaerophilen Bedingungen (Campypak, BBL) bei 37°C gezüchtet. Der entstehende Rasen wurde von vier Platten geerntet und zuerst nach Gram gefärbt, um die charakteristische Morphologie festzu­ stellen. Die Zellen wurden mit 1 ml Lysepuffer (50 mM EDTA, 100 mM NaCl) gewaschen und wieder in 400 µl Lysepuffer re­ suspendiert, dem 30 µl Lysepuffer, der 20% N-Lauroyl­ sarcosin (Sigma) enthielt, zugegeben wurden. Nach 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Suspension wieder­ holt mit Phenol, das mit TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) Puffer gesättigt war, extrahiert, bis keine Zwischen­ schicht mehr sichtbar war. Die Nukleinsäuren wurden dann über Nacht mit Ethanol ausgefällt, durch Zentrifugation ge­ sammelt, in 70% Ethanol gewaschen und das Pellet 10 Minuten lang luftgetrocknet. Die DNA wurde dann mit Proteinase K versetzt und gereinigt unter Verwendung einer Qiagen-Mini­ säule nach den Anleitungen des Herstellers. H. pylori Stamm NCTC 11638 wurde in Flüssigkultur gezüchtet, indem eine geerntete Kulturplatte zu 100 ml Brucella-Brühe (Difco), die 2% β-Cyclodextrin (Sigma) und 0,2 ml für H. pylori selektives rekonstituiertes Ergänzungsmaterial (Oxoid) enthielt, in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben wurde. Der Kolben wurde unter vorsichtigem Schütteln (100 Upm) in einem anaeroben Gefäß 3 Tage lang unter mikroaerophilen Bedingungen (Campypak, BBL) bei 37°C inkubiert. Die H. pylori-Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und die Proteine im Überstand ausgefällt, wie von Milton D.L., Norqvist, A. und Wolf Watz, H., (1992), in J. Bacteriol., 174: 7235-7244, beschrieben. Die cellulären Proteine wurden extrahiert, indem zwei Wachstumsplatten in 1,5 ml Protein­ extraktionspuffer (10 mM Tris pH 7,5, 1 mM MgCl₂, 0,15 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 2 µg/ml Pepstatin A (Sigma), 0,5 µg/ml Leupeptin (Sigma)) resuspendiert wurden, 200 µl 10% SDS zugegeben wurde und 5 Minuten zum Sieden erhitzt wurde. Die Suspension wurde dann 5 Minuten auf Eis gekühlt und der Überstand durch Zentrifugation mit 12 500 Upm 5 Minuten lang gesammelt. Die Proteinkonzentration wurde bestimmt gemäß Bradford, M., (1976), Anal. Biochem., 72, 248-252 (1976).

Beispiel 2 Identifikation eines H. pylori-Proteaseenzyms

40 µg aller Proteine aus Zellen und Überstand von H. pylori NCTC 11638 und einem klinischen Isolat von P. aeruginosa wurden auf vertikalen Minigelen (Hoeffer Scien­ tific), die 5% Acrylamidsammelgelschicht und 13% Trenngel umfaßten, aufgetrennt gemäß dem Verfahren von Laemmli, U.K., (1970), Nature, 227: 680-685. Die Elektrophorese wurde mit 20 mA durchgeführt. Die Hälfte des Gels wurde direkt angefärbt und die andere Hälfte wurde vor dem Anfärben inkubiert, um Proteaseaktivität zu zeigen. Der Gelteil, der direkt angefärbt worden war, wurde 1 Stunde lang in eine Lösung mit 0,1% Coomassie Brilliant-blau R-250 in Entfär­ bungslösung (40% Methanol, 10% Essigsäure, 50% Wasser) gelegt und dann in mehrere Austauschentfärbungslösungen. Das ungefärbte Gel wurde inkubiert und die Proteaseaktivi­ tät dieses Gels wurde nachgewiesen mit dem von Milton et al., (1992), in J. Bacteriol., 174: 7235-7244, beschriebenen Verfahren, außer daß das Gel schließlich mit Coomassie Brilliant-blau R-250 wie oben gefärbt wurde, statt mit Ami­ doschwarz. Die Proteaseaktivität wurde in dem Gel durch klare Banden identifiziert (Verdau der Gelatine und anderer Proteine). Die Proteaseaktivität war eindeutig vorhanden in den Spuren mit H. pylori-Zellen, Überstand und P. aerugi­ nosa. In den H. pylori-Spuren waren zahlreiche proteolyti­ sche Banden vorhanden. Ein überladenes Gel (100 µg Gesamt- H. pylori-Protein) zeigte bei dem obigen Verfahren eine klare Proteasebande bei etwa 35 kDa.

Die elektrophoretische Auftrennung wurde auf eine Nitrocellulosemembran durch semi-Trockenblotten überführt unter Verwendung von Transferpuffer (48 mM Tris pH 8, 30 mM Glycin, 20% Methanol, 1,3 mM SDS) und einer ATTO AE-6675- Horizblot-Übertragungseinheit (Genetic Research Internatio­ nal) nach den Anleitungen des Herstellers. Die Nitrocellu­ losemembran wurde dann getrocknet und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter konstantem Hin- und Herbewegen in eine Blockierungslösung gelegt (1% Rinderserumalbumin in Wasch­ puffer (10 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20)). Die Membran wurde entweder mit Kaninchen-Anti-P. aerugi­ nosa-Elastase, Bever und Iglewski, (1988), J. Bacteriol. 170: 4309-4314, oder mit mit E. coli absorbierten gepoolten menschlichen Seren mit im Stand der Technik wohlbekannten Techniken sondiert. Die primären Antikörper wurden zu dem Blockierungspuffer 1 : 1000 zugegeben und die Inkubation wur­ de 1 bis 4 Stunden lang fortgesetzt. Die Membran wurde dann kurz zweimal mit Waschpuffer, einmal 15 Minuten lang und einmal 5 Minuten lang unter Hin- und Herbewegen gewaschen. Mit HRP-markierter Antikörper (entweder Antikaninchen oder Antihuman) wurde zu der Membran in einer Konzentration von 1 : 1000 in Waschpuffer zugegeben und 1 Stunde lang wie oben inkubiert. Die Membran wurde dann einmal 15 Minuten lang und viermal 5 Minuten lang mit Waschpuffer wie oben gewa­ schen. Die Membran wurde dann entwickelt unter Verwendung von ECL-Substratreagenzien (Amersham) und einem Fuji RX Röntgenfilm ausgesetzt und nach den Anleitungen des Her­ stellers entwickelt. Ein erneutes Sondieren der Blots wurde durchgeführt nach Abziehen und Inkubieren in 20 mM Glycin pH 2,5, 0,055% Tween 20 über Nacht bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln.

Nach dem Sondieren mit HRP-markierten Antikanin­ chen-Antikörpern war eine starke Bande in der P. aerugi­ nosa-Spur und eine Bande mit ähnlichem Molekulargewicht wie die P. aeruginosa-Elastase bei den H. pylori-Zellpro­ teinextrakten sichtbar. Nach dem Sondieren mit den gepool­ ten Seren von fünf Patienten mit hohem Antikörpertiter gegen H. pylori wurde eine große Anzahl von Banden beob­ achtet einschließlich einer starken Reaktion auf die Bande (35 kDa), die vorher durch Anti-P. aeruginosa-Elastase- Antikörper identifiziert wurde. Nach dem Sondieren mit den gepoolten Seren von fünf Patienten, die nicht mit H. pylori infiziert waren, waren keine Banden sichtbar. Somit wurde gezeigt, daß ein Protein mit ähnlicher Größe und immunolo­ gischer Reaktivität wie das P. aeruginosa-Elastase-Protein in den cellulären Proteinextrakten und dem Überstand von H. pylori NCTC 11638 vorhanden ist.

Beispiel 3 Klonieren des H. pylori-hap-Gens

5 µg mit HindIII oder BamHI verdaute genomische DNA von H. pylori NCTC 11638 wurden getrennt und auf Hybond N (Amersham) geblottet, wie von Smith et al., (1992), in Gene, 114: 211-216, beschrieben. Die genomischen Blots wur­ den über Nacht mit 200 ng eines 3,2 kb HindIII-Fragments von V. cholerae-hap-Gen-DNA und mit 5 ng mit HindIII verdauter DNA des Phagen Lambda, die direkt mit HRP (Amersham ECL-Kit) markiert war, sondiert, gewaschen, ent­ wickelt und einem Fuji RX Röntgenfilm ausgesetzt nach den Anleitungen des Herstellers. Ein 4 kb HindIII- und ein 1,5 kb BamHI-Fragment von H. pylori-DNA hybridisierte stark mit der V. cholerae-hap-Gensonde.

Sowohl das 4 kb (HindIII) als auch das 1,5 kb (BamHI) Fragment wurden von der genomischen H. pylori NCTC 11638 DNA mit dem folgenden Verfahren kloniert:

Zwei 10 µg Anteile der genomischen DNA wurden ent­ weder mit BamHI oder HindIII verdaut und der Größe nach auf einem 0,5×TBE Minigel aufgetrennt. Das 4 kb HindIII-Frag­ ment und das 1,5 kb BamHI-Fragment wurden von dem Gel ex­ trahiert und getrennt entweder in mit HindIII oder BamHI verdauten und mit alkalischer Kälberphosphatase behandelten pUC18, pUC19 und pAT153 ligiert, wie von Smith, A.W., (1990), Ph.D. Thesis, University of Nottingham, Nottingham, Vereinigtes Königreich, beschrieben. Die entstehenden Plas­ mide wurden in den E. coli Stamm DH5α transformiert und auf LBroth-Platten, die 100 mg/l Ampillicin enthielten, plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die gewünsch­ ten Rekombinanten wurden identifiziert, indem Kolonien abgehoben wurden auf Hybond N und durch die Hybridisierung der Kolonie gescreent wurden unter Verwendung einer 3,2 kb HindIII V. cholerae (ECL)-Sonde gemäß den Anleitungen des Herstellers. Das 1,5 kb BamHI-Fragment wurde in beide Rich­ tungen sequenziert unter Verwendung von im Handel erhält­ lichen, universellen und revers sequenzierenden Primern und von Sequenase Version 2 (United States Biochemical Corpora­ tion) nach den Anleitungen des Herstellers.

Das Sequenzieren des 1,5 kb-Fragmentes zeigte kein Startcodon, lieferte aber eine Region von etwa 1 kb, die zu mehr als 99% identisch war mit der V. cholerae-hap-Gense­ quenz, bei nur drei Basendeletionen im Leserahmen, entspre­ chend einem Histidinrest in der Codierungsregion (ΔH in Fig. 1). Die Sequenzen divergieren vollständig etwa 50 bp stromabwärts von dem Stopcodon, wobei sich die anderen Basen vor der vollständigen Divergenz unterscheiden. Die klonierte Sequenz ist dann ziemlich unterschiedlich von der 3′-flankierenden Region des V. cholerae-hap-Locus. Eine solche Konservierung der codierenden Sequenz ist höchst un­ gewöhnlich und schwierig zu erklären, weder durch ein übli­ ches Vorläufergen noch durch einen intragenerischen Gen­ transfer. Der Prozentgehalt G+C für H. pylori ist 34-37%, während er für V. cholerae 46-48% ist, der anschließende Unterschied in der Codonverwendung zwischen den zwei Arten sollte es zugelassen haben, daß die DNA-Sequenzen divergie­ ren könnten, sogar wenn die Aminosäuresequenzen immer noch konserviert wären.

Claims (10)

1. Impfstoff/therapeutische Zusammensetzung enthaltend Helicobacter pylori-HAP-Protein oder ein Fragment davon, wobei das Helicobacter pylori-HAP-Protein die in Fig. 1 der beigefügten Zeichnung gezeigte Aminosäuresequenz ein­ schließt.

2. Impfstoff/therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Helicobacter pylori-HAP-Protein oder Fragment davon ein rekombinantes Protein, Polypeptid oder Peptid ist.

3. Impfstoff/therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Helicobacter pylori-HAP-Proteinfragment die zinkbindende Region des Proteins umfaßt.

4. Impfstoff/therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Helicobacter pylori-HAP-Proteinfragment die als Protease aktive Stelle des Proteins umfaßt.

5. Impfstoff/therapeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Kombination aus zwei oder mehr Komponenten ausgewählt aus Helicobacter pylori-HAP-Protein oder Fragmenten davon um­ faßt.

6. Impfstoff/therapeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie wei­ terhin einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.

7. Impfstoff/therapeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein oder mehrere zusätzliche Antigene, die aus einer anderen Quelle stammen, umfaßt.

8. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs/einer the­ rapeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man ein Helicobacter pylori-HAP-Protein oder Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vereinigt.

9. Impfstoff/therapeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verhütung oder Behandlung einer H. pylori-Infektion.

10. Verwendung von Helicobacter pylori-HAP-Protein oder eines Fragments davon zur Herstellung eines Impfstoffs/ einer therapeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Verhütung einer Helicobacter pylori-Infektion.