DE60033291T2

DE60033291T2 - Multi-komponenten impfstoff zum schutz vor krankheiten die durch haemophilus influenza und moxarella catarrhalis ausgelöst werden

Info

Publication number: DE60033291T2
Application number: DE60033291T
Authority: DE
Inventors: M. Sheena Aurora LOOSMORE; Yan-Ping Toronto YANG; H. Michel Toronto KLEIN; Ken Toronto SASAKI
Original assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1999-07-15
Filing date: 2000-07-11
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2020-07-12
Also published as: EP1200122A2; AU767096B2; AU5958600A; CY1107620T1; DE60033291D1; SI1200122T1; DK1200122T3; ATE353223T1; ES2280230T3; PT1200122E; CA2378862A1; CA2378862C; US6391313B1; WO2001005424A3; EP1880734A3; WO2001005424A2; EP1200122B1; EP1880734A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Vakzinologie und im Besonderen einen Multi-Komponenten-Impfstoff, der rekombinante Proteine von Haemophilus influenzae und Moraxella catarrhalis umfasst.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Haemophilus influenzae ist die Ursache mehrerer ernster humaner Erkrankungen, wie Meningitis, Epiglottitis, Septikämie und Mittelohrentzündung. Es gibt sechs Serotypen von H. influenzae, mit a bis f bezeichnet, die durch ihr kapselförmiges Polysaccharid identifiziert werden. H. influenzae Typ b (Hib) war eine Hauptursache von bakterieller Meningitis bis zur Einführung mehrerer Hib-Konjugatimpfstoffe in den 1980igern (Ref. 1. In der ganzen Anmeldung wird auf verschiedene Literaturhinweise in Klammern Bezug genommen, um den Stand der Technik, den diese Erfindung betrifft, vollständiger zu beschreiben. Die vollständige bibliographische Information für jede Literaturstelle ist am Ende der Beschreibung, unmittelbar nach den Ansprüchen zu finden). Impfstoffe, die auf dem kapselförmigem Polysaccharid von H. influenzae Typ b basieren, konjugiert mit Diptherietoxoid (Ref. 2), Tetanustoxoid (Ref. 3, und US-Patent Nr. 4 496 538) oder Neisseria meningitidis Außenmembranprotein (Ref. 4), waren sehr wirksam in der Reduzierung der durch H. influenzae Typ b induzierten Meningitis. Die anderen Serotypen von H. influenzae werden mit invasiver Erkrankung bei geringen Häufigkeiten in Verbindung gebracht, obwohl es eine Zunahme in der Häufigkeit bei der durch diese Stämme verursachten Erkrankung zu geben scheint, während die Häufigkeit der Hib-Erkrankung zurückgeht (Ref. 5, 6). Nicht-gekapselte oder nicht-typisierbare H. influenzae (NTHi) sind auch für einen weiten Bereich an humanen Erkrankungen verantwortlich, einschließlich Mittelohrentzündung, Epiglottitis, Lungenentzündung und Tracheobronchitis. Das Auftreten der durch NTHi induzierten Erkrankung wurde durch die Einführung der Hib-Impfstoffe nicht beeinflusst (Ref. 7).
Die Mittelohrentzündung ist die häufigste Erkrankung der frühen Kindheit, wobei 60 bis 70% aller Kinder im Alter von weniger als 2 Jahren zwischen eine und drei Ohrinfektionen durchmachen (Ref. 8). Chronische Mittelohrentzündung ist verantwortlich für Gehör-, Sprach- und kog nitive Schwächen bei Kindern. H. influenzae Infektionen sind für etwa 30% der Fälle von akuter Mittelohrentzündung und etwa 60% von chronischer Mittelohrentzündung verantwortlich. M. catarrhalis Infektionen sind für weitere 15 bis 20% von akuter Mittelohrentzündung verantwortlich. Allein in den Vereinigten Staaten kostet die Behandlung von Mittelohrentzündung zwischen 1 und 2 Milliarden Dollar pro Jahr für Antibiotika und chirurgische Behandlungen, wie Tonsillektomien, Adenoidektomien, und dem Einsetzen von Paukenröhrchen. Es wird geschätzt, dass weitere 30 Milliarden $ pro Jahr für zusätzliche Therapien, wie Sprachtherapie und spezielle Unterrichtsklassen ausgegeben werden. Moraxella (Branhamella) catarrhalis ist die dritthäufigste Ursache von Mittelohrentzündung und Sinusitis bei Kindern, verantwortlich für 15 bis 20% der Krankheit. Es wurde auch mit der Erkrankung des unteren Respirationstraktes bei Kindern und Erwachsenen in Zusammenhang gebracht, einschließlich der Lungenentzündung und der chronischen Bronchitis, und seltener kann es Bakteriämie und Meningitis verursachen (Ref. 9, 10, 11). Es sind keine Impfstoffe vorhanden, um gegen eine M. catarrhalis Erkrankung zu schützen. Darüber hinaus werden viele Erreger von Mittelohrentzündung resistent gegen eine Antibiotika-Behandlung. Ein wirksamer, prophylaktischer Impfstoff gegen Mittelohrentzündung ist daher höchst wünschenswert.
Während der natürlichen Infektion sind oberflächen-exponierte Außenmembranproteine, die eine Antikörperantwort stimulieren, potentiell wichtige Ziele für bakterizide und/oder schützende Antikörper und daher potentielle Impfstoffkandidaten. Barenkamp und Bodor (Ref. 12) zeigten, dass die Seren von genesenden Kindern, die aufgrund von NTHi an Mittelohrentzündung litten, Antikörper gegen Proteine mit hohem Molekulargewicht (HMW) enthielten. Etwa 70 bis 75% der NTHi-Stämme exprimieren die HMW-Proteine und die meisten dieser Stämme enthalten zwei mit hmw1ABC und hmw2ABC bezeichnete Gen-Komplexe (Ref. 13, 14). Es wurde gezeigt, dass die HMWA-Proteine Adhäsine sind, die das Anhaften an humane Epithelzellen vermitteln (Ref. 15). Eine Immunisierung mit einer Mischung von nativen HMW1A- und HMW2A-Proteinen führt zu einem teilweisen Schutz im Chinchilla-Intrabulla Belastungsmodell von Otitis media (Ref. 16).
Das US-Patent Nr. 5 603 938 (Barenkamp), übertragen an die St. Louis University und die Washington University, beschreibt das Klonieren, die Expression und das Sequenzieren der Gene, die die HMW1- und HMW2-Proteine aus dem Stamm 12 von nicht-typisierbarem Haemophilus kodieren. Die HMW-Proteine sind eine Familie von Proteinen aus nicht-typisierbarem Haemophilus mit einem Molekulargewicht von etwa 120 bis 125 kDa, die in nicht-typisierbaren Haemophilus-Stämmen gefunden werden. Die HMW-Proteine fehlen bei gekapselten Stämmen von Haemophilus.
Die Herstellung von nativen HMW-Proteinen aus H. influenzae Stämmen ist sehr gering, und ein Verfahren für die Herstellung von schützenden rekombinanten HMW(rHMW)-Proteinen wurde in der WO 00/20609, veröffentlicht am 13. April 2000, beschrieben, die auf den Rechtsnachfol ger hiervon übertragen wurde. Ein Chinchilla-Nasopharyngeal-Kolonisationsmodell wurde speziell entwickelt, um die Impfstoffwirksamkeit von Adhäsinen zu zeigen (Ref. 17), und die rHMW-Proteinen sind in diesem Modell schützend, wie in der oben erwähnten WO 00/20609 beschrieben. Es wurde gezeigt, dass die rHMW1A- und rHMW2A-Proteine einen zueinander äquivalenten Schutz gewähren, und für die weiteren Impfstoffstudien wurde das rHMW1A-Protein gewählt. In dieser Anmeldung bezeichnet rHMW ein rekombinantes HMW1A aus einem NTHi-Stamm 12, obwohl das entsprechende rekombinante HMW1A-Protein aus anderen NTHi-Stämmen und ein entsprechendes rHMW2A-Protein aus NTHi-Stämmen verwendet werden können. Die entsprechenden natürlich vorkommenden Proteine können verwendet werden.
Eine zweite Familie von Adhäsionsproteinen mit hohem Molekulargewicht wurde in etwa 25% der NTHI und in gekapselten H. influenzae Stämmen identifiziert (Ref. 18, 19, 20). Das US-Patent Nr. 5 646 259 (St. Geme, III et al), übertragen an die St Louis University und die Washington University, beschreibt das Klonieren, die Expression und die Sequenzen von Genen, die Proteine kodieren, die darin als die HA1- und HA2-Proteine bezeichnet werden, welche eine begrenzte Homologie zu den HMW1- und HMW2-Proteinen von USP 5 603 938 aufweisen.
Das NTHi-Mitglied dieser zweiten Familie wird als Haemophilus influenzae-Adhäsin oder Hia (HA1) bezeichnet, und das homologe Protein, das in gekapselten Stämmen gefunden wird, wird als Haemophilus influenzae-Oberflächenfibrillenprotein oder Hsf (HA2) bezeichnet. Das hia-Gen wurde ursprünglich aus einer Expressionsbibliothek unter Verwendung von konvaleszenten Seren von einem Mittelohrentzündungs-Patient kloniert, was darauf hinweist, dass es ein wichtiges Immunogen während der Erkrankung ist. Die Hia- und Hsf-Musterproteine zeigen etwa 82% Sequenzähnlichkeit, obwohl das Hsf-Protein beträchtlich größer ist. Die Proteine bestehen aus konservierten Amino- und Carboxy-Enden und mehreren Wiederholmotiven, wobei das Hsf mehr Wiederholsequenzen enthält als das Hia.
Volllängen- und N-terminal trunkierte Versionen des Hia-Proteins (rHia) in E. coli schützen gegen Bakteriämie, die durch H. influenzae Typ a- und -Typ b-Organismen verursacht wird, und verleihen einen partiellen Schutz gegen eine nasopharyngeale Kolonisation durch einen nicht-typisierbaren H. influenzae. In dieser Anmeldung bezeichnet rHia ein V38-rHia aus einem NTHi-Stamm 11, obwohl andere rekombinante Volllängen- und N-terminal trunkierte Hia-Proteine aus anderen NTHi-Stämmen verwendet werden können. Entsprechende natürlich vorkommende Proteine können ebenfalls verwendet werden.
Ein in M. catarrhalis identifiziertes Adhäsin mit hohem Molekulargewicht wurde mit 200 kDa bezeichnet und wird im US-Patent Nr. 5 808 024 (Sasaki et al), das auf den Rechtsnachfolger hiervon übertragen wurde, sowie in der WO 96/34960, veröffentlicht am 7. November 1996, die auf den Rechtsnachfolger hiervon übertragen wurde, beschrieben. Das 200 kDa-Protein wurde in 96 von 109 M. catarrhalis-Stämmen identifiziert, einschließlich 73 von 74 von Otitis media stammenden Stämmen und wird als ein Virulenzfaktor postuliert. Es gibt eine Sequenzhomologie zwischen dem M. catarrhalis 200 kDa-Protein und den H. influenzae Hia- und Hsf-Proteinen. Darüber hinaus erkannte anti-nativer 200 kDa-Antikörper das rHia-Protein auf einem Immunoblot, was auf die antigene Verwandtheit hinweist.
Es gibt kein geeignetes Tiermodell für eine M. catarrhalis-Infektion und -Erkrankung, aber es wurde ein bakterizider Antikörpertest als ein Ersatztest entwickelt, wie beschrieben im oben erwähnten US-Patent Nr. 5 808 024. Ein N-terminal trunkiertes V56 r200 kDa-Protein wurde in E. coli exprimiert, und es wurde gezeigt, dass ein gegen V56 r200 kDa gezüchteter Antikörper gegen homologe und heterologe Stämmne von M. catarrhalis bakterizid ist, womit sich seine Nützlichkeit als ein Vakzin-Antigen zeigt. Ein V56 r200 kDa-Protein aus einem M. catarrhalis-Stamm 4223 wird in diesem Bezug verwendet, obwohl andere rekombinante Volllängen- oder N-terminal trunkierte 200 kDa-Proteine aus anderen M. catarrhalis-Stämmen verwendet werden können. Entsprechende natürlich vorkommende Proteine können ebenfalls verwendet werden.
Wenn unter umgebungsbedingtem Stress, wie hoher Temperatur, überproduzieren Organismen Stressantwort- oder Hitzeschockproteine (hsps). Bakterielle hsps haben sich als wichtige Immunogene erwiesen, die sowohl B-Zellen als auch T-Zellen stimulieren (Ref. 21). Die bakteriellen HtrA- oder DegP-Hitzeschockproteine werden unter Stressbedingungen exprimiert, und es wurde gezeigt, dass das H. influenzae HtrA- oder Hin47-Protein ein partiell schützendes Antigen im Intrabulla-Belastungsmodell von Otitis media ist (Ref. 22). Die HtrA-Proteine sind Serin-Proteasen und ihre proteolytische Aktivität macht sie instabil. Darüber hinaus, als Komponenten eines Multi-Komponenten-Impfstoffs, wird das Wildtyp-HtrA-Protein beigemischte Antigene abbauen. Die ortsgerichtete Mutagenese des H. influenzae htrA-Gens (als hin47 bezeichnet) und die Eigenschaften der Mutanten wurde vollständig im US-Patent Nr. 5 506 139 (Loosmore et al), übertragen an den Rechtsnachfolger, beschrieben.
Das US-Patent Nr. 5 506 139 (Loosmore et al) beschreibt die Präparation von Analoga des Haemophilus influenzae Hin47-Proteins, die eine verringerte Proteaseaktivität aufweisen, welche weniger als etwa 10% derjenigen des natürlichen Hin47-Proteins beträgt, und die vorzugsweise im Wesentlichen die gleichen immunogenen Eigenschaften wie das natürliche Hin47-Protein besitzen. Das Patent beschreibt auch die Isolierung, Reinigung und Charakterisierung der Nukleinsäuremoleküle, die für die Hin47-Analoga kodieren. Das natürliche Hin47-Protein ist immunologisch zwischen nicht-typisierbaren und gekapselten Isolaten von H. influenzae konserviert. Die Aminosäuresequenz des natürlichen Hin47-Proteins und die Nukleotidsequenz des kodierenden hin47-Gens sind in der WO 94/00149, veröffentlich am 6. Januar, 1994, beschrieben.
Die Hin47-Analoga vom US-Patent Nr. 5 506 139 werden präpariert, in dem mindestens eine Aminosäure des natürlichen Hin47, die zur Proteaseaktivität beiträgt, deletiert oder durch eine unterschiedliche Aminosäure ersetzt wird, oder indem wenigstens eine Aminosäure in das natür liche Hin47-Protein eingefügt wird, wie darin besonders beschrieben. Die mindestens eine deletierte oder ersetzte Aminosäure kann aus den Aminosäuren 195 bis 201 des Hin47 gewählt werden und kann besonders das Serin-197 sein, das deletiert oder durch Alanin ersetzt werden kann. Darüber hinaus kann die mindestens eine deletierte oder ersetzte Aminosäure His-91 sein und kann deletiert oder durch Alanin, Lysin oder Arginin ersetzt werden. Darüber hinaus kann die wenigstens eine deletierte oder ersetzte Aminosäure Asp-121 sein und kann deletiert oder durch Alanin ersetzt werden.
Im Patent der Vereinigten Staaten Nr. 5 869 302, auf den Rechtsnachfolger hiervon übertragen, werden mehrere an unterschiedlichen Aminosäuren des natürlichen Hin47-Proteins bewirkte Mutationen beschrieben, um das nicht-proteolytische Hin47-Analogon bereit zu stellen.
In der vorliegenden Erfindung wird die Mutation von Histidin 91 zu Alanin (manchmal hierin als „H91A" bezeichnet) als eine Veranschaulichung des mutanten Hin47-Proteins verwendet, obwohl andere Hin47-Mutanten mit einer verringerten Proteaseaktivität, wie in dem/der oben erwähnten Patent und Anmeldung beschrieben, verwendet werden können.
Es wurde gezeigt, dass das nicht-proteolytische HtrA-Analogon, H91A Hin47, ein Schutz-Antigen gegen durch H. influenzae Typ b verursachte Bakteriämie und gegen durch nicht-typisierbare H. influenzae verursachte Mittelohrentzündung ist (Ref. 22). HtrA wurde in allen untersuchten H. influenzae-Stämmen, einschließlich der gekapselten Stämme, gefunden. Es gab auch einen Hinweis auf eine Kreuzreaktivität mit einem spezifischen Protein aus M. catarrhalis auf einem Immunoblot, was die Möglichkeit eines HtrA-Analogons in diesem Organismus nahe legt.
Das Hauptziel eines prophylaktischen Impfstoffs gegen Mittelohrentzündung ist es, die Etablierung einer nasopharyngealen Kolonisation durch das Einfügen von Adhäsinen als Immunogene zu verhindern. Die H. influenzae HMW- und Hia-Proteine sind Adhäsine, von denen nachgewiesen wurde, dass sie die Kolonisation verhindern. Jedoch, da es einen kleinen Prozentsatz an H. influenzae-Stämmen geben kann, der die hmw- oder hia-Gene nicht enthält, wurde das H91A Hin47-Antigen zugefügt, um einen Schutz gegen solche Stämme bereit zu stellen, obwohl ein beliebiges anderes nicht-proteolytisches Analogon von Hin47 verwendet werden kann. Die Zugabe von einem oder mehreren M. catarrhalis 200 kDa-Adhäsinen sorgt für einen Schutz gegen die Kolonisation durch diesen Organismus. Die vorliegende Erfindung sieht einen Multi-Komponenten-Impfstoff vor, um gegen die Kolonisation und Erkrankung, die durch gekapselte oder ungekapselte H. influenzae- und M. catarrhalis-Organismen verursacht werden, zu schützen.
Es wäre wünschenswert, wirksame Kombinationsimpfstoffe bereit zu stellen, umfassend H. influenzae- und M. catarrhalis-Komponenten, die jeweilig ausgewählte Mengen an ausgewählten Antigenen enthalten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist gerichtet auf eine multivalente immunogene Zusammensetzung zur Verleihung eines Schutzes in einem Wirt gegen eine Erkrankung, die durch eine Infektion mit Haemophilus influenzae und Moraxella catarrhalis verursacht wird, die durch mindestens vier unterschiedliche Antigene gekennzeichnet ist, umfassend mindestens ein Antigen aus Haemophilus influenzae und mindestens ein Antigen aus Moraxella catarrhalis, wobei wenigstens drei dieser Antigene Adhäsine sind und wenigstens eines dieser Adhäsine aus Moraxella catarrhalis ist.
Eines der Antigene, welches ein Adhäsin ist, kann ein Protein mit hohem Molekulargewicht (HMW) eines nicht-typisierbaren Stamms von Haemophilus insbesondere ein HMW1- oder HMW2-Protein eines nicht-typisierbaren Stamms sein, der rekombinant hergestellt werden kann.
Ein weiteres der Antigene, das ein Adhäsin ist, kann ein Haemophilus influenzae-Adhäsin(Hia)-Protein eines nicht-typisierbaren Stamms von Haemophilus influenzae oder ein Haemophilus influenzae-Oberflächenfibrillen(Hsf)-Protein eines typisierbaren Stamms von Haemophilus influenzae sein, der rekombinant hergestellt sein kann.
Ein Antigen von Haemophilus influenzae, das kein Adhäsin ist, kann ein nicht-proteolytisches Hitzeschockprotein eines Stamms von Haemophilus influenzae sein, welches ein Analogon des Haemophilus influenzae Hin47-Proteins sein kann, das eine verringerte Proteaseaktivität aufweist, die weniger als etwa 10% derjenigen des natürlichen Hin47-Proteins beträgt.
Eines der Antigene, das ein Adhäsin ist, kann ein Außenmembranprotein von Moraxella catarrhalis sein mit einem apparenten Molekulargewicht von etwa 200 kDa, wie bestimmt durch SDS-PAGE, und kann rekombinant hergestellt sein.
In Übereinstimmung mit einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine multivalente immunogene Zusammensetzung zur Verleihung eines Schutzes in einem Wirt gegen eine Erkrankung bereit gestellt, die sowohl durch Haemophilus influenzae als auch Moraxella catarrhalis verursacht wird, die umfasst: (a) ein Analogon des Haemophilus influenzae Hin47-Proteins mit einer verringerten Proteaseaktivität, die weniger als etwa 10% derjenigen des natürlichen Hin47-Proteins beträgt, (b) ein Haemophilus influenzae-Adhäsin(Hia)-Protein eines nicht-typisierbaren Stamms von Haemophilus influenzae, (c) ein Protein mit hohem Molekulargewicht (HMW) eines Stamms von nicht-typisierbarem Haemophilus influenzae und (d) ein Außenmembranprotein von Moraxella catarrhalis mit einem apparenten Molekulargewicht von etwa 200 kDa, wie durch SDS-PAGE bestimmt.
In einer solchen Zusammensetzung können die Hin47-, Hia-, HMW- und 200 kDa-Proteine in Mengen vorliegen, die die einzelnen immunogenen Aktivitäten der Proteine nicht beeinträchtigen, so dass es keine Beeinflussung der Komponenten bezüglich ihrer individuellen immunogenen Aktivitäten gibt.
Das Analogon des Hin47-Proteins kann eines sein, bei dem mindestens eine Aminosäure des natürlichen Hin47-Proteins, die zur Proteaseaktivität beiträgt, deletiert oder durch eine unterschiedliche Aminosäure ersetzt wurde und das im Wesentlichen dieselben immunogenen Eigenschaften wie das natürliche Hin47-Protein aufweist.
Solche mindestens eine Aminosäure kann aus der Gruppe, bestehend aus den Aminosäuren 91, 121 und 195 bis 207 des natürlichen Hin47-Proteins, gewählt werden. Besondere Mutanten, die verwendet werden können, schließen Serin-197 ersetzt durch Alanin, Histidin-91 ersetzt durch Alanin, Lysin oder Arginin und Asp-121 ersetzt durch Alanin ein.
Das HMW-Protein des nicht-typisierbaren Stamms von Haemophilus influenzae kann ein HMW1- oder ein HMW2-Protein sein und kann rekombinant hergestellt sein. Die HMW1- und HMW2-Proteine stammen von den jeweiligen Stämmen von nicht-typisierbarem Haemophilus influenzae und weisen die in der folgenden Tabelle I dargestellten jeweiligen Molekulargewichte auf:
Molekulargewicht (kDa) nicht-typisierbarer Haemophilus influenzae-Stamm
Die Hia- und 200 kDa-Proteine können rekombinant hergestellt sein und können N-terminale Trunkierungen umfassen, V38 rHia bzw. V56 r200 kDa.
Die immunogene Zusammensetzung der Erfindung kann ferner mit einem Adjuvans formuliert werden. Solch ein Adjuvans für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid, QS21, Quil A, Derivate und Komponenten davon, ISCOM-Matrix, Calciumphosphat, Calciumhydroxid, Zinkhydroxid, ein Glycolipidanalogon, ein Octadecylester einer Aminosäure, ein Muramyl-Dipeptid, ein Polyphosphazen, ISCOPREP, DC-chol, DDBA und ein Lipoprotein und andere Adjuvantien einschließen (ohne darauf beschränkt zu sein). Vorteilhafte Kombinationen von Adjuvantien werden im Patent der Vereinigten Staaten Nr. 5 837 250 (WO 95/34308, veröffentlicht am 21. November, 1995) beschrieben. Das Adjuvans kann vorzugsweise Aluminiumphosphat oder Aluminiumhydroxid (gemeinhin als Alaun bekannt) umfassen.
Die Komponenten der Zusammensetzung können in geeigneten Mengen vorliegen, um für die erwünschte Immunantwort zu sorgen. Die Komponenten können als ein Impfstoff für die in vivo-Verabreichung an den Wirt formuliert sein. Die Impfstoffzusammensetzung kann umfassen:

(a) etwa 25 bis etwa 100 μg des Hin47-Protein-Analogons,
(b) etwa 25 bis etwa 100 μg des Hia-Proteins,
(c) etwa 25 bis etwa 100 μg des HMW-Proteins, und
(d) etwa 25 bis etwa 100 μg des 200 kDa-Proteins.

Die immunogenen Zusammensetzungen können mit anderen antigenen Komponenten formuliert werden, um einen multivalenten Impfstoff bereit zu stellen, bei dem die zusätzliche(n) Antigenkomponente(n) einen Schutz gegen eine Erkrankung verleiht/verleihen, die durch (ein) andere(s) Pathogen(e) verursacht wird. Solche zusätzlichen Antigene sollten derart sein, dass, und in Mengen vorliegen, dass die immunogene Aktivität der einzelnen Komponenten des resultierenden Impfstoffs nicht durch andere einzelne Komponenten der Zusammensetzung beeinträchtigt ist. Solche zusätzlichen Antigene sind vorzugsweise gereinigte Antigene in definierten Mengen um einen Komponenten-Impfstoff herzustellen.
Solche zusätzlichen Antigene können jene sein, die traditionell in multivalenten Schutzimpfstoffen gefunden werden, wie Diphtherietoxoid, Tetanustoxoid und Pertussisantigene, einschließlich Pertussistoxoid, filamentöses Hämagglutinin, Pertaktin und/oder Agglutinogene.
Der resultierende multivalente Impfstoff kann auch nicht-virulenten Poliovirus, wie inaktivierten Poliovirus enthalten, der Poliovirus vom Typ 1, Typ 2 und/oder Typ 3 sein kann. Der Multi-Komponenten-Impfstoff kann ferner ein Konjugat eines Tetanus- oder Diphtherietoxoids und ein kapselförmiges Polysaccharid von Haemophilus influenzae, vorzugsweise PRP-T, umfassen.
Die Erfindung erstreckt sich auf ein Verfahren der Immunisierung eines Wirts gegen eine Erkrankung, die durch eine Infektion mit sowohl Haemophilus influenzae als auch Moraxella catarrhalis verursacht wird, einschließlich der Mittelohrentzündung, welches die Verabreichung einer immunoeffektiven Menge der hierin bereit gestellten immunogenen Zusammensetzung an einen Wirt umfasst.
Vorteile der vorliegenden Erfindung schließen einen multivalenten Impfstoff ein, der einen Schutz gegen gekapselte und ungekapselte Haemophilus influenzae- und Moraxella catarrhalis-Erkrankungen auf eine sichere und wirksame Weise verleihen kann.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung wird darüber hinaus aus der folgenden Beschreibung mit Bezug auf die Zeichnungen verstanden werden, in denen:
1, mit den Feldern A und B, die anti-H91A Hin47-Immunantworten für H91A Hin47 + rHMW + rHia + r200 kDa-Kombinationsimpfstoffe bei Mäusen zeigt. In Feld A lagen die H91A Hin 47 + rHMW + rHia Komponenten in einer Konzentration von jeweils 0,3 μg vor, und in Feld B lagen sie in einer Konzentration von jeweils 3,0 μg vor. Zunehmende Mengen an r200 kDa wurden in 0, 0,3, 1,0, 3,0 und 10,0 μg zugegeben;
2, mit den Feldern A und B, die anti-rHMW-Immunantworten für H91A Hin47 + rHMW + rHia + r200 kDa-Kombinationsimpfstoffe bei Mäusen zeigt. In Feld A lagen die H91A Hin 47 + rHMW + rHia Komponenten in einer Konzentration von jeweils 0,3 μg vor, und in Feld B lagen sie in einer Konzentration von jeweils 3,0 μg vor. Zunehmende Mengen an r200 kDa wurden in 0, 0,3, 1,0, 3,0 und 10,0 μg zugegeben;
3, mit den Feldern A und B, die anti-rHia-Immunantworten für H91A Hin47 + rHMW + rHia + r200 kDa-Kombinationsimpfstoffe bei Mäusen zeigt. In Feld A lagen die H91A Hin 47 + rHMW + rHia Komponenten in einer Konzentration von jeweils 0,3 μg vor, und in Feld B lagen sie in einer Konzentration von jeweils 3,0 μg vor. Zunehmende Mengen an r200 kDa wurden in 0, 0,3, 1,0, 3,0 und 10,0 μg zugegeben;
4, mit den Feldern A, B, C und D, die anti-r200 kDa-Immunantworten für H91A Hin47 + rHMW + rHia + r200 kDa-Kombinationsimpfstoffe bei Mäusen zeigt. In Feld A wurden zunehmende Mengen von H91A Hin47 + rHMW + rHia in jeweils 0, 0,3, oder 3,0 μg zu 0,3 μg r200 kDa zugegeben. In Feld B wurden zunehmende Mengen von H91A Hin47 + rHMW + rHia in jeweils 0, 0,3, oder 3,0 μg zu 1,0 μg r200 kDa zugegeben. In Feld C wurden zunehmende Mengen von H91A Hin47 + rHMW + rHia in jeweils 0, 0,3, oder 3,0 μg zu 3,0 μg r200 kDa zugegeben. In Feld D wurden zunehmende Mengen von H91A Hin47 + rHMW + rHia in jeweils 0, 0,3, oder 3,0 μg zu 10,0 μg r200 kDa zugegeben;
5, mit den Feldern A und B, die anti-H91A Hin47-Immunantworten für H91A Hin47 + rHMW + rHia + r200 kDa-Kombinationsimpfstoffe bei Meerschweinchen zeigt. In Feld A lagen die H91A Hin 47 + rHMW + rHia-Komponenten in einer Konzentration von jeweils 25 μg vor, und in Feld B lagen sie in einer Konzentration von jeweils 50 μg vor. Zunehmende Mengen an r200 kDa wurden in 0, 25, 50 und 100 μg zugegeben;
6, mit den Feldern A und B, die anti-HMW-Immunantworten für H91A Hin47 + rHMW + rHia + r200 kDa-Kombinationsimpfstoffe bei Meerschweinchen zeigt. In Feld A lagen die H91A Hin 47 + rHMW + rHia-Komponenten in einer Konzentration von jeweils 25 μg vor, und in Feld B lagen sie in einer Konzentration von jeweils 50 μg vor. Zunehmende Mengen an r200 kDa wurden in 0, 25, 50 und 100 μg zugegeben;
7, mit den Feldern A und B, die anti-Hia-Immunantworten für H91A Hin47 + rHMW + rHia + r200 kDa-Kombinationsimpfstoffe bei Meerschweinchen zeigt. In Feld A lagen die H91A Hin 47 + rHMW + rHia-Komponenten in einer Konzentration von jeweils 25 μg vor, und in Feld B lagen sie in einer Konzentration von jeweils 50 μg vor. Zunehmende Mengen an r200 kDa wurden in 0, 25, 50 und 100 μg zugegeben;
8, mit den Feldern A, B und C, die anti-200 kDa-Immunantworten für H91A Hin47 + rHMW + rHia + r200 kDa-Kombinationsimpfstoffe bei Meerschweinchen zeigt. In Feld A wurden zunehmende Mengen von H91A Hin47 + rHMW + rHia in 0, 25 oder 50 μg jeweils zu 25 μg r200 kDa zugegeben. In Feld B wurden zunehmende Mengen von H91A Hin47 + rHMW + rHia in 0, 25 oder 50 μg jeweils zu 50 μg r200 kDa zugegeben. In Feld C wurden zunehmende Mengen von H91A Hin47 + rHMW + rHia in 0, 25 oder 50 μg jeweils zu 100 μg r200 kDa zugegeben;
9 den Schutz des H91A Hin47 + rHMW + rHia + r200 kDa-Kombinationsimpfstoffs im Chinchilla-Modell der nasopharyngealen Kolonisation zeigt. Der durch den Vierkomponenten-Impfstoff gewährte Schutz wird mit dem für einen einkomponentigen rHMW-Impfstoff, einen zweikomponentigen rHMW + H91A Hin47-Impfstoff einen dreikomponentigen rHMW + H91A Hin47 + rHia-Impfstoff und konvaleszenten Kontrollen verglichen;
10 den durch den H91A Hin47 + rHMW + rHia + r200 kDa-Kombinationsimpfstoff gewährten Schutz im Chinchilla-Modell der Intrabulla-Belastung darstellt. Der durch den Vierkomponenten-Impfstoff gewährte Schutz wird mit dem für einen einkomponentigen H91A Hin47(H91A)-Impfstoff, einen zweikomponentigen rHMW + H91A Hin47-Impfstoff, einen dreikomponentigen rHMW + H91A Hin47 + rHia-Impfstoff und Alaun-Kontrollen verglichen;
11 eine schematische Darstellung des Konstruktionsschemas für die Herstellung des Plasmids DS-2150-1 ist, das das Gen enthält, welches das H91 Hin 47-Analogon kodiert;
12 eine schematische Darstellung des Konstruktionsschemas für die Herstellung des Plasmids BK-76-1-1 ist, das den Genkomplex hmw1ABC aus dem NTHi-Stamm 12 enthält;
13 eine schematische Darstellung des Konstruktionsschemas für die Herstellung des Plasmids BK-96-2-11 ist, das das Gen enthält, welches das N-trunkierte V38 trunkierte Hia aus dem NTHi-Stamm 11 kodiert; und
14A und 14B eine schematische Darstellung des Konstruktionsschemas für die Herstellung des Plasmids pKS348 sind, das das Gen enthält, welches das N-trunkierte V56 r200 kDa aus dem M. catarrhalis-Stamm 4223 kodiert.
ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Herstellung und Reinigung der rekombinanten H. influenzae-Antigene rHMW, rHia und H91A Hin47 wurden vollständig in der oben erwähnten WO 00/20609 bzw. dem oben erwähnten US-Patent Nr. 5 506 139 beschrieben.
Die Kolonisation der Nasopharynx ist für viele bakterielle oder virale Pathogene der erste Schritt in der Krankheitsentwicklung, und Impfstoffe, die Adhäsin-Moleküle enthalten, sollten gegen diesen ersten Schritt im Krankheitsverlauf schützen. Es wurde gezeigt, dass die Proteine mit hohem Molekulargewicht (HMW), die in etwa 75% der nicht-typisierbaren H. influenzae gefunden werden, Adhäsine sind, die gegen eine Kolonisation schützend sind, wenn sie in einer Impfstoff-Komposition verabreicht werden. Die HMW-Proteine sind in gekapselten H. influenzae-Stämmen oder in etwa 25% der nicht-typisierbaren H. influenzae-Stämme nicht vorhanden, daher sind sie nicht ausreichend für einen vollständig wirksamen Impfstoff, welcher einen stammweiten Schutz aufweist.
Es wurde gezeigt, dass auch die Hia/Hsf-Proteine Adhäsine sind, und sie sind in allen gekapselten H. influenzae-Stämmen und in der Mehrheit von jenen nicht-typisierbaren H. influenzae-Stämmen, die keine HMW-Proteine produzieren, vorhanden. Das rHia-Protein ist schützend gegen eine Kolonisation durch NTHi und gegen durch H. influenzae Typ a- und -Typ b-Organismen verursachte Bakteriämie. Es gibt einen kleinen Prozentsatz an NTHi-Stämmen, der weder HMW- noch Hia-Proteine produziert.
Das HtrA-Protein oder Hin47 wird in allen gekapselten und nicht-typisierbaren H. influenzae-Stämmen gefunden. Hin47 oder sein nicht-proteolytischer H91A Hin47-Mutant, ist schützend gegen durch H. influenzae Typ b verursachte Bakteriämie und gegen durch nicht-typisierbare H. influenzae verursachte Mittelohrentzündung, verhindert aber eine Kolonisation nicht. Hin47 ist proteolytisch und kann selbst nicht in Proteinformulierungen verwendet werden. Ein Kombinations-Impfstoff, der rHMW-, rHia- und H91A Hin47-Antigene umfasst, kann formuliert werden, um gegen eine H. influenzae-Erkrankung, einschließlich der Mittelohrentzündung, zu schützen.
Das M. catarrhalis-200 kDa-Protein ist genetisch und antigenetisch mit der Hia/Hsf-Familie von Adhäsinen verwandt. Eine Immunisierung mit r200 kDa-Protein löst kreuzreaktive bakterizide Antikörper aus. Ein Kombinationsimpfstoff, der die drei H. influenzae-Antigene und das M. catarrhalis-r200 kDa-Protein umfasst, kann formuliert werden, um gegen eine H. influenzae- und M. catarrhalis-Erkrankung, einschließlich der Mittelohrentzündung, zu schützen.
Die Zusammensetzung der Multikomponenten-Impfstoffe ist wichtig. Die Impfstoff-Komponenten müssen kompatibel sein und sie müssen in geeigneten Verhältnissen vereint werden, um eine antigene Interferenz zu vermeiden und beliebige mögliche Synergien zu optimieren. Wenn sie mit anderen, etablierten Impfstoffen verabreicht werden, dürfen sie den Schutz, der durch den Impfstoff gegen (eine) andere Erkrankung(en) gewährt wird, nicht beeinträchtigen.
Die Herstellung, immunogene und schützende Eigenschaften eines zweikomponentigen rHMW + H91A Hin47-Impfstoffs wurde in der WO 00/35477, veröffentlicht am 22. Juni, 2000, beschrieben.
Verschiedene Antigen-Verhältnisse wurden für den vierkomponentigen H91A Hin47 + rHMW + rHia + r200 kDa-Impfstoff verglichen, und die immunogene Aktivität wurde bei zwei Tierarten verglichen. Bei Mäusen verstärkte die Zugabe der r200 kDa-Komponente zu dem niedrig dosierten Dreikomponenten-Impfstoff (0,3 μg jeweils) die primäre anti-H91A Hin47-Antwort, jedoch wurde die Antwort für höher dosierten Impfstoff (3,0 μg jeweils) nicht beeinflusst. Bei Meerschweinchen war die anti-H91A Hin47-Antwort für den 3- oder 4-Komponenten-Impfstoff äquivalent. Bei Mäusen war die anti-rHMW-Antwort auf den niedrig dosierten Dreikomponenten-Impfstoff mit oder ohne zugegebenes r200 kDa-Antigen sehr schwach. Es schien dort weder einen synergetischen noch einen inhibierenden Effekt auf die anti-rHMW-Antwort auf die Zugabe der r200 kDa-Komponente zum hoch dosierten Impfstoff zu geben. Es gab keinen sichtbaren Effekt auf die anti-rHia-Antwort auf die Zugabe der r200 kDa-Komponente zum niedrig oder hoch dosierten Dreikomponenten-Impfstoff. Die Immunantwort auf die r200 kDa-Komponente mit oder ohne den zugegebenen Dreikomponenten-Impfstoff war im allgemeinen schwächer, als es für die anderen Komponenten beobachtet wurde. Bei der 1,0 μg Dosis von r200 kDa setzte die Zugabe des Dreikomponenten-Impfstoffs zu 3 μg jeweils die Immunantwort auf das r200 kDa herab. Jedoch bei höheren Dosen war die anti-r200 kDa-Antwort durch die Gegenwart der anderen Komponenten unbeeinflusst. Bei Meerschweinchen war die Immunantwort auf jedes Antigen unbeeinflusst durch die Gegenwart der anderen drei.
Der durch den Vierkomponenten-Impfstoff gewährte Schutz wurde im Chinchilla-Modell der nasopharyngealen Kolonisation bestimmt. Die Tiere waren gegen eine Kolonisation gut geschützt, in Graden, die zu einem einkomponentigen rHMW-Impfstoff, einem zweikomponentigen rHMW + H91A Hin47-Impfstoff oder einem dreikomponentigen rHMW + rHia + H91A Hin47-Impfstoff äquivalent sind. Der durch den Vierkomponenten-Impfstoff gewährte Schutz wurde auch im Chinchilla-Intrabulla-Belastungsmodell der Mittelohrentzündung bestimmt. Die Tiere waren zum Teil gegen eine Mittelohrentzündung geschützt, in Graden, die zu einem einkomponentigen H91A Hin47-Impfstoff, einem zweikomponentigen H91A Hin47 + rHMW-Impfstoff oder einem dreikomponentigen H91A Hin47 + rHMW + rHia-Impfstoff äquivalent sind. Diese Daten zeigen, dass die Zugabe von mehreren Antigenen zum Impfstoff keine schädliche Wirkung auf den durch eine einzelne Komponente gewährten Schutz hatte.
Auf die 1 Bezug nehmend, wird dort die Immunantwort bei Mäusen auf das H91A Hin47-Antigen eines Drei- oder Vier-Komponenten-Impfstoffs veranschaulicht, in welchem die H91A Hin47 + rHMW + rHia-Komponenten auf jeweils 0,3 oder 3,0 μg festgesetzt sind und r200 kDa in Konzentrationen von 0, 0,3, 1,0, 3,0 und 10,0 μg zugegeben wird. Hohe Antikörper-Titer werden in den abschließend entnommenen Seren für alle Kombinationen erhalten.
Auf die 2 Bezug nehmend, wird dort die Immunantwort bei Mäusen auf das rHMW-Antigen eines Drei- oder Vier-Komponenten-Impfstoffs veranschaulicht, in welchem die H91A Hin47 + rHMW + rHia-Komponenten auf jeweils 0,3 oder 3,0 μg festgesetzt sind und r200 kDa in Konzentrationen von 0, 0,3, 1,0, 3,0 und 10,0 μg zugegeben wird. Die Immunantwort auf den niedrig dosierten Impfstoff ist sehr schwach, aber hohe Antikörper-Titer werden in den abschließend entnommenen Seren für die hoch dosierten Drei- oder Vier-Komponenten-Impfstoffe erhalten.
Auf die 3 Bezug nehmend, wird dort die Immunantwort bei Mäusen auf das rHia-Antigen eines Drei- oder Vier-Komponenten-Impfstoffs veranschaulicht, in welchem die H91A Hin47 + rHMW + rHia-Komponenten auf jeweils 0,3 oder 3,0 μg festgesetzt sind und r200 kDa in Konzentrationen von 0, 0,3, 1,0, 3,0 und 10,0 μg zugegeben wird. Hohe Antikörper-Titer werden in den abschließend entnommenen Seren für alle Kombinationen erhalten.
Auf die 4 Bezug nehmend, wird dort die Immununantwort bei Mäusen auf das r200 kDa-Antigen eines Ein- oder Vier-Komponenten-Impfstoffs veranschaulicht, in welchem die H91A Hin47 + rHMW + rHia-Komponenten auf jeweils 0, 0,3 oder 3,0 μg festgesetzt sind und r200 kDa in Konzentrationen von 0,3, 1,0, 3,0 und 10,0 μg zugegeben wird. Die Immunantwort auf die r200 kDa-Komponente ist bei den 0,3 μg und 1,0 μg Dosen sehr schwach. Bei den höheren Dosen von 3 oder 10 μg von r200 kDa wurden hohe Antikörper-Titer für die abschließend entnommenen Seren erhalten, unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit der anderen Komponenten.
Auf die 5 Bezug nehmend, wird dort die Immunantwort bei Meerschweinchen auf das H91A Hin47-Antigen eines Drei- oder Vier-Komponenten-Impfstoffs veranschaulicht, in welchem die H91A Hin47 + rHMW + rHia-Komponenten auf 25 oder 50 μg jeweils festgesetzt sind und r200 kDa in Konzentrationen von 0, 25, 50 oder 100 μg zugegeben wird. Hohe Antikörper-Titer werden in den abschließend entnommenen Seren von allen Kombinationen erhalten.
Auf die 6 Bezug nehmend, wird dort die Immunantwort bei Meerschweinchen auf das rHMW-Antigen eines Drei- oder Vier-Komponenten-Impfstoffs veranschaulicht, in welchem die H91A Hin47 + rHMW + rHia-Komponenten auf 25 oder 50 μg jeweils festgesetzt sind und r200 kDa in Konzentrationen von 0, 25, 50 oder 100 μg zugegeben wird. Hohe Antikörper-Titer werden in den abschließend entnommenen Seren von allen Kombinationen erhalten.
Auf die 7 Bezug nehmend, wird dort die Immunantwort bei Meerschweinchen auf das rHia-Antigen eines Drei- oder Vier-Komponenten-Impfstoffs veranschaulicht, in welchem die H91A Hin47 + rHMW + rHia-Komponenten auf 25 oder 50 μg jeweils festgesetzt sind und r200 kDa in Konzentrationen von 0, 25, 50 oder 100 μg zugegeben wird. Hohe Antikörper-Titer werden in den abschließend entnommenen Seren von allen Kombinationen erhalten.
Auf die 8 Bezug nehmend, wird dort die Immunantwort bei Meerschweinchen auf das r200 kDa-Antigen eines Ein- oder Vier-Komponenten-Impfstoffs veranschaulicht, in welchem die H91A Hin47 + rHMW + rHia-Komponenten auf 0, 25 oder 50 μg jeweils festgesetzt sind und r200 kDa in Konzentrationen von 25, 50 oder 100 μg zugegeben wird. Hohe Antikörper-Titer werden in den abschließend entnommenen Seren von allen Impfstoffen erhalten.
Auf die 9 Bezug nehmend, wird dort der Schutz veranschaulicht, der durch den vierkomponentigen H91A Hin47 + rHMW + rHia + r200 kDa-Impfstoff gegen eine nasopharyngeale Kolonisation in einem Chinchilla-Modell gewährt wird. Der Schutz ist vergleichbar mit dem, der durch einen monovalenten rHMW-Impfstoff, einen zweikomponentigen rHMW + H91A Hin47-Impfstoff und einen dreikomponentigen rHMW + rHia + H91A Hin47-Impfstoff gewährt wird.
Auf die 10 Bezug nehmend, wird dort der Schutz veranschaulicht, der durch den vierkomponentigen H91A Hin47 + rHMW + rHia + r200 kDa-Impfstoff gegen eine Mittelohr-Infektion in einem Chinchilla-Modell gewährt wird. Der Schutz ist vergleichbar mit dem, der durch einen monovalenten rHMW-Impfstoff, einen zweikomponentigen H91A Hin47 + rHMW-Impfstoff und einen dreikomponentigen H91A Hin47 + rHMW + rHia-Impfstoff gewährt wird.
BEISPIELE
Die obige Offenlegung beschreibt im Allgemeinen die vorliegende Erfindung. Ein vollständigeres Verständnis kann durch den Bezug auf die folgenden spezifischen Beispiele erhalten werden. Diese Beispiele werden einzig und allein zu Zwecken der Veranschaulichung beschrieben und sind nicht dazu gedacht, den Umfang der Erfindung einzuschränken. Änderungen in der Form und Substitution von Äquivalenten werden eingehend betrachtet, wie es die Umstände nahe legen oder zweckdienlich machen können. Obwohl hierin bestimmte Begriffe verwendet wurden, sind solche Begriffe in einem beschreibenden Sinn und nicht zu Zwecken der Einschränkungen gedacht.
Verfahren der molekularen Genetik, der Protein-Biochemie, der Immunologie und der Fermentations-Technologie, die in dieser Offenbarung verwendet, aber nicht explizit beschrieben werden, und diese Beispiele, werden umfänglich in der wissenschaftlichen Literatur berichtet und liegen gut in der Befähigung der Fachleute im Fachbereich.
Beispiel 1
Dieses Beispiel beschreibt die Präparation der H91A Hin47-Impfstoff Komponente.
Der H91A Hin47-Mutant wurde präpariert, wie in dem oben erwähnten US-Patent Nr. 5 506 139 beschrieben. In Kürze, ein Oligonukleotid 5' ATCAATAACAGCATTATTGGT 3' (SEQ ID NO: 1) wurde synthetisiert, das den Histidin-Rest bei 91 zu einem Alanin ändern würde (Ref. 17).
Das Plasmid JB-1276-1-2 ist ein pUC-basiertes Plasmid, das das T7/hin47-Gen auf einem EcoR I-Fragment enthält, und wurde verwendet, um das hin47-Gen in M13mp18 für eine ortsgerichtete Mutagenese mit dem In Vitro Site-Directed Mutagenesis-Kit von Amersham zu klonieren. Die Präparation des Plasmids JB-1276-1-2 wird im USP 5 506 139 beschrieben. Die Mutation des His91-Kodons zu Ala91 wurde durch örtliches Sequenzieren bestätigt. Das H91A-mutante hin47-Gen wurde in einen pT7-7 subkloniert, um das Plasmid DS-1277-19 zu erzeugen (11).
Das H91A Hin47-Expressionsplasmid (DS-1277-19) verwendet eine Ampicillin-Selektion. Das T7/H91A hin47-Gen wurde in pBR328 kloniert, so dass eine Tetracyclin-Selektion verwendet werden konnte. Der Vektor DS-1312-12 war daher ein pBR328-basiertes Plasmid, das die T7/H91A hin47-Gensequenzen zwischen den EcoR I- und Cla I-Stellen enthielt, das funktionale Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenzgenen aufwies und eine Wiederholung der Hind III – BamH I-Sequenzen enthielt, welche sowohl in pBR328 als auch in pEVvrfl gefunden werden.
Ein neues auf DS-1312-12 basierendes Plasmid wurde konstruiert, das eine Kanamycin-Selektion verwendet. Das Konstruktionsschema ist in 11 gezeigt. Plasmid-DNA von DS-1312-12 wurde mit Hind III verdaut, wodurch zwei Fragmente erzeugt wurden. Das größere 5,9 kb-Fragment enthielt ein tetR-Gen ohne Promoter, das ampR-Gen und das T7/H91A hin47-Gen und wurde wieder an sich selbst ligiert, um den Vektor DS-2140-3 zu erzeugen. Das Plamid DS-2140-3 wurde mit Pst I verdaut, und das kan-Gen von Plasmid pUC-4K (P-L Biochemicals) wurde in die Pst I-Stelle eingefügt, um das Plasmid DS-2150-1 zu erzeugen, das kann ist und sensitiv sowohl gegen Ampicillin als auch Tetracyclin.
Plasmid-DNA aus DS-2150-1 wurde aus einer 50 ml Kultur hergestellt, indem ein Protokoll, das auf der Holmes und Quigley-Prozedur basiert (Ref. 23), verwendet wurde und Extraktionen mit Phenol und Chloroform einschließend. E. coli BL21(DE3)-Zellen wurden wie folgt elektrokompetent gemacht. In Kürze, 10 ml der Übernacht-Kultur wurden in 500 ml YT-Medium eingeimpft, und die Zellen wurden bei 37°C unter Schütteln wachsen gelassen, bis sie einen A₆₂₀ = 0,540 erreichten. Die Kultur wurde 30 min lang auf Eis gekühlt, bei 5K U/min 15 min lang zentrifugiert, und das Zell-Pellet in 500 ml eiskaltem sterilem Wasser resuspendiert. Die Zell-Suspension wurde wie zuvor zentrifugiert und das Zell-Pellet in 250 ml eiskaltem sterilem Wasser resuspendiert. Die Zell-Suspension wurde wieder zentrifugiert, und die Zellen wurden in 10 ml 10%-igem Glycerin resuspendiert. Die Glycerin-Suspension wurde zentrifugiert und die Zellen wurden in 1,5 ml 10%-igem Glycerin resuspendiert, als 40 μl-Proben aliquotiert und bei –70°C gelagert.
Ein Aliquot der elektrokompetenten BL21(DE3)-Zellen wurde auf Eis aufgetaut und etwa 9 ng der DS-2150-1-DNA wurde hinzugefügt. Die Proben wurden 3 min lang auf Eis inkubiert, anschließend in eine –20°C BioRad Gene Pulser Elektroden-Küvette überführt und einem elektrischen Puls ausgesetzt. 900 μl SOC-Medium wurde zugefügt und die Mischung wurde in ein Kulturröhrchen überführt, wo es bei 37°C 1 Stunde lang inkubiert wurde, bevor es auf 25 μg/ml Kanamycin enthaltenden YT-Agar ausplattiert wurde. Die Platte wurde über Nacht bei 37°C inkubiert und einzelne Kolonien wurden für die Expressionsstudien verwendet.
Einzelne Klone wurden in NZCYM-Medium bis zu einem A_600nm von etwa 0,3 wachsen gelassen und Laktose wurde zu 1% hinzugegeben, um die Expression zu induzieren. Die Zellen wurden während 4 Stunden wachsen gelassen, anschließend geerntet und mit SDS-PAGE analysiert. Der Klon DS-2171-1-1 wurde als ein repräsentativer Klon gewählt, der hohe Level an H91A Hin47 exprimierte.
Der den DS-2171-1-1 enthaltenden E. coli wurde in 2 × 2 l-Kolben wachsen gelassen, die 250 ml ECGM (enthaltend 8 g/l Glucose, pH 6,5) enthielten, und unter Schütteln bei 37°C während etwa 9 Stunden im Dunkeln bei 250 U/min inkubiert. Die Kulturflüssigkeit (2 × 250 ml) wurde in einen 10 l-Fermenter geimpft und die Kultur wurde bei 37°C wachsen gelassen. Nach etwa 10 Stunden der Inkubation wurde 1% Lactose (Endkonzentration) für die Induzierung zugegeben, gefolgt von einer zusätzlichen 4-stündigen Inkubation.
Die Kulturflüssigkeit wurde in sterile Transferflaschen geerntet und aufkonzentriert und durch eine Querfluss-Filtration gegen 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8,0 diafiltriert. Die Zellen im Konzentrat wurden lysiert unter Verwendung eines Hochdruck-Homogenisators (2 Durchläufe bei 15 000 psi), um das H91A Hin47-Protein freizusetzen. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 15 000 U/min 1,5 Stunden lang entfernt. Der Überstand wurde durch Zentrifugation weiter geklärt und durch einen 0,22 μm Filter ohne Ausgang filtriert. Die Produkte können bei –70°C gefroren bis zur weiteren Verarbeitung gelagert werden.
Natriumchlorid (NaCl) wurde zu der geklärten Probe auf eine Endkonzentration von 100 mM hinzugegeben. Die Probe wurde dann auf einer Anionenaustausch-Chromatographiesäule (TMAE-Fractogel) gereinigt, die mit 100 mM NaCl enthaltendem 50 mM Tris pH 8,0 äquilibriert wurde. Das H91A Hin47-Protein wurde im Durchlauf erhalten.
Die wässrige Schicht wurde auf eine keramische Hydroxyapatit Typ 1(CHTP-1)-Säule geladen, die mit 10 mM Natriumphosphat-Puffer pH 8,0 äquilibriert war. Die Säule wurde anschließend mit 150 mM Natriumphosphat-Puffer pH 8,0 gewaschen und das H91A Hin47 wurde mit 175 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 8,0, der 1 M NaCl enthielt, eluiert.
Das gereinigte H91A Hin47-Protein wurde unter Verwendung einer Membran mit einer 10 kDa Molekulargewichtsgrenze aufkonzentriert, gefolgt von einer Diafiltration mit etwa 10 Volumina Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,5.
Das gereinigte H91A Hin47-Protein in PBS wurde durch einen Q600 Sartobind Membranadsorber laufen gelassen. Nach dem Durchlaufen der Lösung wurde die Membran unter Verwendung von 1,0 M KCl/1,0 M NaOH regeneriert, gefolgt von Waschen mit 1 M KCl und anschließendem Äquilibrieren mit PBS. Der Prozess wurde zweimal wiederholt. Das konzentrierte diafiltrierte H91A Hin47-Protein wurde steril durch einen 0,22 μm Membranfilter filtriert. Das sterile H91A Hin47-Protein wurde mit Aluminiumphosphat als Hilfsstoff versehen. Das adsorbierte gereinigte Konzentrat wurde verdünnt, um die adsorbierte Masse in 400 μg/ml herzustellen.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt die Präparation der rHMW-Impfstoff-Komponente.
Die Herstellung und Reinigung des rHMW-Proteins wurde in der WO 00/20609, veröffentlicht am 13. April, 2000, beschrieben.
In Kürze, das Plasmid pHMW1-15 (Ref. 13) enthält eine Xba I-Stelle innerhalb der T7-Promotorsequenz und eine singuläre BamH I-Stelle innerhalb der kodierenden Sequenz des reifen HMW1A-Proteins des nicht-typisierbaren Haemophilus-Stamms 12. Das 1,8 kb Xba I-BamH I-Fragment von pHMW1-15 wurde deletiert und durch ein aus Oligonukleotiden erzeugtes etwa 114 bp Xba I-BamH I-Fragment ersetzt. Das resultierende 11,3 kb-Plasmid, DS-1046-1-1, enthält daher den T7-Promotor, der mit dem hmw1ABC-Operon, welches das reife 125 kDa HMW1A-Protein kodiert, im Rahmen verbunden ist (12).
Das Plasmid DS-1046-1-1 enthält die T7-hmw1ABC-Genkassette und weist eine singuläre Bgl II-Stelle außerhalb der kodierenden Region des reifen HMW1A-Gens auf. Das Plasmid DS-2224-1-4 enthält das E. coli cer-Gen, das sich auf einem BamH I-Fragment befindet. Dieses Fragment wurde isoliert und in die Bgl II-Stelle des Plasmids DS-1046-1-1 ligiert, um das Plasmid BK-35-4 zu erzeugen (12). Die Kanamycin-Resistenz-Kassette wurde aus einem pUC 4K durch eine Sal I-Restriktion herausgeschnitten und in das Sal I-geschnittene BK-35-4-Plasmid ligiert, um das Plasmid BK-76-1-1 zu erzeugen (12).
Plasmid-DNA von BK-76-1-1 wurde aus einer 50 ml Kultur hergestellt, indem ein Protokoll, das auf der Holmes und Quigley-Prozedur basiert (Ref. 23), verwendet wurde und Extraktionen mit Phenol und Chloroform einschließend. Die Plasmid-DNA wurde in E. coli BL21(DE3)-Zellen durch Elektroporation unter Verwendung einer BioRad-Apparatur eingeführt. Die Stämme wurden bei 37°C in NZCYM-Medium bis auf eine optische Dichte von A₅₇₈ = 0,3 wachsen gelassen, anschließend durch die Zugabe von Lactose auf 1,0% 4 Stunden lang induziert. Die Proben wurden mit SDS-PAGE-Lyse + -Ladepuffer auf 0,2 OD/μl eingestellt und die gleiche Menge der Proteinprobe wurde auf SDS-PAGE-Gele geladen. Klon BK-116-1 wurde als ein repräsentativer Klon gewählt, der gute Level an rHMW exprimierte.
Rekombinantes HMW-Protein wurde als Einschlußkörper in E. coli exprimiert und wurde wie folgt gereinigt. E. coli Zell-Pellets aus 500 ml Kultur wurden in 50 ml von 0,1 M NaCl enthaltenden 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung auseinander gebrochen. Das Extakt wurde bei 20 000 g 30 min lang zentrifugiert und der resultierende Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde weiter extrahiert in 50 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, das 0,5% Triton X-100 und 10 mM EDTA enthielt, anschließend bei 20 000 g 30 min lang zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde weiter extrahiert in 50 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, das 1% Octylglucosid enthielt, anschließend bei 20 000 g 30 min lang zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen.
Das resultierende Pellet, das nach den oben genannten Extraktionen erhalten wurde, enthielt die Einschlusskörper. Das Pellet wurde in 6 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, das 6 M Guanidin und 5 mM DTT enthielt, solubilisiert. Zwölf ml von 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 wurde zu dieser Lösung hinzugefügt, und die Mischung wurde bei 20 000 g 30 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde mit Polyethylenglycol (PEG) 4000 in einer Endkonzentration von 7% ausgefällt. Das resultierende Pellet wurde durch Zentrifugation bei 20 000 g während 30 min entfernt, und der Überstand wurde durch (NH₄)₂SO₄ in einer 50%-igen Sättigung präzipitiert. Nach der Zugabe von (NH₄)₂SO₄ durchlief die Lösung eine Phasenseparation, wobei das Protein zur oberen Phase ging, welche dann einer Zentrifugation bei 20 000 g während 30 min unterworfen wurde. Das resultierende Pellet wurde in 2 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, das 6 M Guanidin HCl und 5 mM DTT enthielt, gelöst, und die klare Lösung wurde auf einer Superdex 200 Gelfiltrationssäule, äquilibriert in 2 M Guanidin HCl enthaltenden 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, gereinigt. Die Fraktio nen wurden durch SDS-PAGE analysiert, und jene, die das gereinigte rHMW1 enthielten, wurden vereinigt und über Nacht bei 4°C gegen PBS dialysiert und anschließend bei 20 000 g 30 min lang zentrifugiert. Das Protein blieb unter diesen Bedingungen löslich und Glycerin wurde zu der rHMW1-Präparation in einer Endkonzentration von 20% für eine Lagerung bei –20°C zugefügt.
Die Konzentration einer rHMW-Impfstoffkomponente wurde auf 400 μgml^–1 in PBS (pH 7,3) eingestellt und wurde mit Aluminiumphosphat als Adjuvans auf eine Endkonzentration von 3 μgml^–1 versehen. Unterschiedliche Dosen wurden hergestellt, indem die Stock-Lösung mit 3 μgml^–1 Aluminiumphosphat in Wasser verdünnt wurde.
Beispiel 3
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung der rHia-Impfstoffkomponente.
In Kürze, das Plasmid DS-1843-2 ist ein pBR328-basiertes Plasmid, in welches eine Mehrfach-Klonierungsstelle und zwei Transkriptionsterminatoren auf Oligonukleotiden eingeführt wurden, zwischen den EcoR I- und Pst I-Stellen, wodurch sowohl das Chloramphenicol- als auch das Ampicillin-Resistenz-Gen zerstört wird (6B). Das Kanamycin-Resistenz-Gen aus pUC-4K wurde an der Sal I-Stelle eingefügt, um Plasmide DS-2147-1 zu generieren, das Kanamycin-resistent und Tetracyclin-sensitiv ist. Das Plasmid DS-2224-1-4 ist ein pUC-Plasmid, das ein synthetisches E. coli cer-Gen enthält (Ref. 15), konstruiert aus Oligonukleotiden und flankiert durch BamH I-Stellen. Das 290 bp BamH I-Fragment des cer-Gens wurde in die BamH I-Stelle von DS-2147-1 eingefügt, wodurch das Plasmid BK-2-1-2 erzeugt wurde. Dieses pBR-basierte Plasmid enthält daher eine Mehrfach-Klonierungsstelle, das Kanamycin-Resistenz-Gen und das cer-Gen. Das Plasmid BK-2-1-2 wurde mit Bgl II linearisiert und dephosphoryliert. Das Plasmid DS-2186-2-1 wurde mit Bgl II und BamH I verdaut und das 3,6 kb T7 V38 hia-Fragment wurde in BK-2-1-2 eingefügt, wodurch das Plasmid BK-96-2-11 erzeugt wurde (13).
Plasmid-DNA von BK-96-2-11 wurde aus einer 50 ml Kultur hergestellt, indem ein Protokoll, das auf der Holmes und Quigley-Prozedur basiert (Ref. 23), verwendet wurde und Extraktionen mit Phenol und Chloroform einschließend. Die Plasmid-DNA wurde in elektrokompetente E. coli BL21(DE3)-Zellen durch einen Elektroporator unter Verwendung eines BioRad Elektroporators eingeführt. Die Stämme wurden bei 37°C in NZCYM-Medium unter Verwendung der geeigneten antibiotischen Selektion auf eine optische Dichte von A₅₇₈ von 0,3 wachsen gelassen, vor der Induktion durch die Zugabe von Lactose zu 1,0% während 4 Stunden. Die Proben wurden mit SDS-PAGE-Lyse + -Ladepuffer auf 0,2 OD/μl eingestellt, und die gleiche Menge von jeder Proteinprobe wurde auf SDS-PAGE-Gele geladen. Der Klon BK-131-1-1 wurde als ein repräsentativer Klon gewählt, der gute Level an V38 rHia exprimierte (13).
Rekombinantes trunkiertes Hia-Protein wurde als Einschlusskörper in E. coli exprimiert und wurde wie folgt gereinigt. E. coli Zell-Pellets aus 500 ml Kultur wurden in 50 ml von 0,1 M NaCl enthaltenden 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen. Das Extakt wurde bei 20 000 g 30 min lang zentrifugiert, und der resultierende Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in 50 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, das 0,5% Triton X-100 und 10 mM EDTA enthielt, weiter extrahiert, anschließend bei 20 000 g 30 min lang zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde weiter extrahiert in 50 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, das 1% Octylglucosid enthielt, anschließend bei 20 000 g 30 min lang zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen.
Das resultierende Pellet, das nach den oben genannten Extraktionen erhalten wurde, enthielt die Einschlusskörper. Das Pellet wurde in 6 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, das 6 M Guanidin und 5 mM DTT enthielt, solubilisiert. Zwölf ml von 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 wurde zu dieser Lösung hinzugefügt, und die Mischung wurde bei 20 000 g 30 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde mit Polyethylenglycol (PEG) 4000 in einer Endkonzentration von 7% präzipitiert. Das resultierende Pellet wurde durch Zentrifugation bei 20 000 g während 30 min entfernt, und der Überstand wurde durch (NH₄)₂SO₄ in einer 50%-igen Sättigung präzipitiert. Das (NH₄)₂SO₄-Präzipitat wurde durch Zentrifugation bei 20 000 g während 30 min gesammelt. Das resultierende Pellet wurde in 2 ml von 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, das 6 M Guanidin HCl und 5 mM DTT enthielt, gelöst, und die klare Lösung wurde auf einer Superdex 200 Gelfiltrationssäule, äquilibriert in 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 M Guanidin HCl enthaltend, gereinigt. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert, und jene, die das gereinigte rHia enthielten, wurden vereinigt und über Nacht bei 4°C gegen PBS dialysiert, anschließend bei 20 000 g 30 min lang zentrifugiert. Das Protein blieb unter diesen Bedingungen löslich und Glycerin wurde zu der rHia-Präparation in einer Endkonzentration von 20% für eine Lagerung bei –20°C zugefügt.
Die Konzentration der rHia-Impfstoffkomponente wurde auf 400 μgml^–1 in PBS (pH 7,3) eingestellt und wurde mit Aluminiumphosphat als Adjuvans auf eine Endkonzentration von 3 mgml^–1 versehen. Unterschiedliche Dosen wurden hergestellt, indem die Stammlösung mit 3 mgml^–1 Aluminiumphosphat in H₂O verdünnt wurde.
Beispiel 4
Dieses Beispiel veranschaulicht die Präparation der r200 kDa-Impfstoffkomponente.
Das USP 5 808 024, dem Rechtsnachfolger hiervon zugewiesen, und die WO 96/34960 beschreiben die Isolierung aus einem Genom, eine M. catarrhalis -Genom-Bibliothek in Phage Lambda, einen Lambda-Phagen-Klon 8II, der das etwa 200 kDa-Protein exprimierte. DNA wurde extrahiert und eine Reihe von Plasmid-Vektoren wurde aus DNA-Fragmenten präpariert. Das Plasmid pKS348 wurde konstruiert, wie schematisch in den 14 und 14B gezeigt. Das, ein 1,1 kb KpnI/XhoI-Fragment enthaltende Plasmid pKS47 wurde mit XhoI und KpnI verdaut und durch Agarose-Gelelektrophorese separiert. Das 1,1 kb-Fragment wurde aus dem Gel isoliert und in das Plasmid pKS5, das ein 4,9 kb XhoI/SalI-Fragment enthielt, eingefügt, welches vorher mit den gleichen beiden Enzymen verdaut und gereinigt worden war, um pKS80 zu bilden. Ein etwa 5,8 kb PstI-Fragment aus pKS80 wurde in einen pT7-7-Vektor eingefügt (Ref. 24), der mit PstI verdaut und dephosphoryliert worden war. Die Orientierung des Inserts wurde durch eine Restriktionsenzym-Analyse bestimmt und pKS122 wurde für die weitere Konstruktion gewählt (siehe 14A).
Eine etwa 500 bp 5'-Region des 200 kDa-Gens wurde mit PCR aus einem M. catarrhalis-Stamm 4223 aus chromosomaler DNA unter Verwendung der Primer 5471.KS (CGCTCGCTGTCCATATGATCGGTGCAACGCTCA – SEQ ID No: 2) und 4257.KS (GACCCTGTGCATATGACATGGCT – SEQ ID No: 3) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit NdeI verdaut, gereinigt und in das NdeI-verdaute und dephosphorylierte pKS122 insertiert, um pKS348 bereit zu stellen (siehe 14B). Das Plasmid pKS348 wurde durch Restriktionsenzym-Analysen und durch Sequenzierung des PCR-amplifizierten DNA-Stücks und seiner verbundenen Regionen bestätigt. Solches Plasmid enthält eine Nukleinsäure, die ein N-trunkiertes etwa 200 kDa-Protein kodiert, in dem das Kodon, das die V56-Aminosäure kodiert, durch ein Start-Kodon, das die M56-Aminosäure kodiert, ersetzt ist (M56 r200 kDa-Protein)
Eine einzelne Kolonie von E. coli, BL21(DE3)/pLysS, (KS358), das das pKS348 trug, wurde in 5 ml BHI-Brühe, die Amp (100 μM) und 0,4% Glucose enthielt, suspendiert und über Nacht bei 37°C kultiviert. 2,5 ml der Übernacht-Kultur wurde zu 250 ml von LB(Luria-Bertani)-Brühe, die Amp (100 μM) und Cm (50 μM) enthielt, zugegeben und unter Schütteln bei 37°C auf A₆₀₀ = 0,26 bis 0,44 wachsen gelassen. Genexpression aus den Kulturen wurde durch die Zugabe von IPTG (Endkonzentration: 4 mM) induziert. Die Bakterien wurden wachsen gelassen und zu unterschiedlichen Zeitpunkten durch Zentrifugation geerntet. Die Expression des 200 kDa-Proteingens in der Kultur wurde bestätigt durch SDS-PAGE-Analyse mittels einer Coomassie Blue-Färbung und durch Westernblot-Analyse unter Verwendung eines anti-200 kDa-Protein-Meerschweinchenserums, wie es im USP 5 808 024 und der WO 96/34960 beschrieben ist.
Wenn E. coli, BL21(DE3)/pLysS mit pKS348 transformiert wurde, wuchsen die Transformanten gut, sogar auf LB-Agarplatten und in LB-Brühe, die Antibiotika enthielten, bei 37°C. Nach der Induktion mit IPTG produzierten diese Klone eine große Menge des N-terminal trunkierten r200 kDa-Proteins. Das N-terminal trunkierte r200 kDa-Protein wurde aus der E. coli-Kultur gereinigt, wie in 13 gezeigt.
E. coli Zell-Pellets wurden aus den Kulturen erhalten, präpariert durch Zentrifugation, und wurden in 50 ml von 0,1 M NaCl enthaltenden 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen. Das Sonikat wurde bei 20 000 × g 30 min lang zentrifu giert, und der resultierende Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in 50 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, das 0,5% Triton X-100 und 10 mM EDTA enthielt, extrahiert, anschließend bei 20 000 × g 30 min lang zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde weiter extrahiert in 50 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, das 1% Octylglucosid enthielt, anschließend bei 20 000 × g 30 min lang zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen.
Das resultierende Pellet enthielt die Einschlusskörper. Das Pellet wurde in 6 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, das 6 M Guanidin und 5 mM DTT enthielt, solubilisiert. Zwölf ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 wurde zugefügt, und die Mischung wurde bei 20 000 × g 30 min lang zentrifugiert und das Pellet verworfen. Der Überstand wurde durch Zugabe von Polyethylenglycol (PEG) 4000 in einer Endkonzentration von 5% präzipitiert und bei 4°C 30 min lang inkubiert. Das resultierende Pellet wurde durch Zentrifugation bei 20 000 × g während 30 min entfernt. Der Überstand wurde dann durch (NH₄)₂SO₄ in einer 50%-igen Sättigung bei 4°C über Nacht präzipitiert. Nach der Zugabe des (NH₄)₂SO₄ durchlief die Lösung eine Phasenseparation, wobei das Protein zur oberen Phase ging (wie nach der Trübung der Schicht geurteilt). Die obere Phase wurde gesammelt, anschließend einer Zentrifugation bei 20 000 × g während 30 min unterworfen. Das resultierende Pellet wurde aufgefangen und in 2 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, das 6 M Guanidin HCl und 5 mM DTT enthielt, gelöst. Die klare Lösung wurde auf einer Superdex 200 Gelfiltrationssäule gereinigt, die in 2 M Guanidin HCl enthaltenden 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 äquilibriert war. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert, und jene, die das gereinigte r200 kDa enthielten, wurden vereinigt. Die vereinigte Fraktion wurde unter Verwendung einer Centriprep 30 5- bis 10-fach aufkonzentriert und anschließend über Nacht bei 4°C gegen PBS dialysiert und zur Klärung bei 20 000 × g 30 min lang zentrifugiert.
Das Protein blieb unter diesen Bedingungen löslich und Glycerin wurde zu der M56 r200 kDa-Präparation in einer Endkonzentration von 20% für eine Lagerung bei –20°C zugefügt. Die durchschnittliche Ausbeute des gereinigten M56 r200 kDa-Proteins beträgt etwa 10 mgl^–1 Kultur Die Konzentration der r200 kDa-Impfstoffkomponente wurde auf 400 μgml^–1 in PBS (pH 7,3) eingestellt und wurde mit Aluminiumphosphat als Adjuvans auf eine Endkonzentration von 3 mgml^–1 versehen. Unterschiedliche Dosen wurden hergestellt, indem die Stammlösung mit 3 mgml^–1 Aluminiumphosphat in H₂O verdünnt wurde.
Beispiel 5
Dieses Beispiel beschreibt die Kombination von H91A Hin47 + rHMW + rHia + r200 kDa als einen Vierkomponenten-Impfstoff.
Kurz gesagt, Impfstoffe wurden präpariert, die eine Kombination von rHia mit einem zweikomponentigen H91A Hin47 und rHMW-Impfstoff umfassten, präpariert wie in der WO 00/35477, veröffentlicht am 22. Juni, 2000, beschrieben. Die Komponenten wurden am Tag 0 kombiniert, über Nacht bei 4°C gemischt und am Tag 1 aliquotiert. Die kombinierten Impfstoffe wurden bei 4°C während der gesamten Immunisierungsdauer gelagert.
Impfstoffe wurden präpariert, die die folgenden Kombinationen von r200 kDa mit dem Dreikomponenten-Impfstoff wie in Tabelle II umfassten: TABELLE II

Anmerkungen: 3-Komponenten bezieht sich auf H91A Hin47 + rHMW + rHia
m besagt, dass der Impfstoff verwendet wurde, um Mäuse zu immunisieren.
gp besagt, dass der Impfstoff verwendet wurde, um Meerschweinchen zu immunisieren.

Die Impfstoff-Komponenten in Tabelle II wurden an Tag 0 kombiniert, über Nacht bei 4°C gemischt und am Tag 1 aliquotiert. Alle Impfstoffe wurden bei 4°C während der gesamten Immunisierungsdauer gelagert.
Beispiel 6
Dieses Beispiel beschreibt die Analyse der immunogenen Aktivität des Multikomponenten-Impfstoffs bei Tieren.
Die immunogene Aktivität eines Drei-Komponenten-Impfstoffs, umfassend H91A Hin47 + rHMW + rHia, wurde in der oben erwähnten, gleichzeitig abhängigen Patentanmeldung der Vereinigten Staaten Nr. 09/261 182 beschrieben.
Gruppen von fünf BALB/c-Mäusen (Charles River, Quebec) wurden subkutan (s.c.) an den Tagen 1, 29 und 43 mit einem der in Beispiel 5 beschriebenen Maus-Impfstoffe immunisiert. Blutproben wurden an den Tagen 0, 14, 28, 42 und 56 genommen.
Gruppen von fünf Hartley-Auszucht-Meerschweinchen (Charles River, Quebec) wurden intramuskulär (i.m.) an den Tagen 1, 29 und 43 mit einem der in Beispiel 5 beschriebenen Meerschweinchen-Impfstoffe immunisiert. Blutproben wurden an den Tagen 0, 14, 28, 42 und 56 genommen.
Die anti-H91A Hin47, anti-rHMW, anti-rHia und anti-r200 kDa IgG-Antikörper-Titer wurden durch Antigen-spezifische Enzym-gekoppelte Immunadsorptionstests (ELISAs) bestimmt. Mikrotiter-Mulden (NuncMAXISORB, Nunc, Dänemark) wurden mit 100 μl der Proteinlösung (0,2 μgml^–1) beschichtet. Die verwendeten sekundären Antikörper waren affinitätsgereinigte F(ab')₂-Fragmente von Ziegen-anti-Maus-IgG (Fc-spezifischen) oder -anti-Meerschweinchen-IgG(Fc-spezifischen)Antikörpern, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase (Jackson ImmunoResearch Labs, Mississauga, Ontario). Die Reaktionen wurden unter Verwendung von Tetramethylbenzidin (TMB/H2O2, ADI, Mississauga, Ontario) entwickelt, und die Absorbanzen wurden bei 450 nm (unter Verwendung von 540 nm als eine Referenzwellenlänge) in einem Flow Multiskan MCC Mikroplattenlesegerät (ICN Biomedicals, Mississauga, Ontario) gemessen. Der reaktive Titer eines Antiserums wurde definiert als das Reziproke der Verdünnung, welcher durchgehend eine zweifache Zunahme in der Absorbanz zeigte gegenüber dem, der mit der vorab entnommenen Serumprobe erhalten wurde.
Die Ergebnisse der Immunogenitäts-Studien sind in den 1 bis 8 dargestellt. Wie in der 1, Felder A und B, gezeigt, wiesen die abschließend entnommenen Seren, die aus Mäusen, welche mit 0,3 μg oder 3,0 μg von jeweils H91A Hin47 + rHMW + rHia mit 0, 0,3, 1,0, 3,0 oder 10,0 μg des zugefügten r200 kDa immunisiert wurden, erhalten wurden, alle hohe Antikörper-Titer gegen die H91A Hin47-Komponente auf. Mit dem niedrig dosierten Drei-Komponenten-Impfstoff könnte es einen synergetischen Effekt auf die primäre anti-H91A Hin47-Antwort mit zugegebenem r200 kDa geben.
Wie in der 2, Felder A und B, gezeigt, wiesen die abschließend entnommenen Seren, die aus Mäusen, welche mit je 3,0 μg von H91A Hin47 + rHMW + rHia mit 0, 0,3, 1,0, 3,0 oder 10,0 μg des zugefügten r200 kDa immunisiert wurden, erhalten wurden, alle hohe Antikörper-Titer gegen die rHMW-Komponente auf. Der niedrig dosierte Impfstoff war schwach immunogen. Es gab keinen sichtbaren verstärkenden oder inhibierenden Effekt auf die anti-rHMW-Antwort mit der Zugabe der r200 kDa-Komponente.
Wie in der 3, Felder A und B, gezeigt, wiesen die abschließend entnommenen Seren, die aus Mäusen, welche mit je 0,3 μg von H91A Hin47 + rHMW + rHia mit 0, 0,3, 1,0, 3,0 oder 10,0 μg des zugefügten r200 kDa immunisiert wurden, erhalten wurden, alle hohe Antikörper-Titer gegen die rHia-Komponente auf. Es gab keinen sichtbaren verstärkenden oder inhibierenden Effekt auf die anti-rHia-Antwort mit der Zugabe der r200 kDa-Komponente.
Wie in der 4, Felder A bis D, gezeigt, wiesen die abschließend entnommenen Seren, die aus Mäusen, welche mit 10,0 μg von r200 kDa, zugefügt zu 0, 0,3 μg oder 3,0 μg von jeweils H91A Hin47 + rHMW + rHia immunisiert wurden, erhalten wurden, alle hohe Antikörper-Titer gegen die r200 kDa-Komponente auf. Es gab keinen sichtbaren verstärkenden oder inhibierenden Effekt auf die anti-r200 kDa-Antwort mit der Zugabe der anderen Impfstoff-Komponenten. Jedoch war der Impfstoff bei geringen Dosen an r200 kDa schwach immunogen und bei der 1,0 μg Dosis gab es einen statistisch signifikanten hemmenden Effekt der zugegebenen Komponenten auf die anti-r200 kDa-Antwort.
Die Daten bei Mäusen zeigen die bevorzugte Natur der Zusammensetzung eines Multi-Komponenten-Impfstoffs, indem die Supression der Antworten auf einzelne Antigene verhindert wird.
Die immunogene Aktivität bei Meerschweinchen ist in den 5 bis 8 dargestellt. Wie in der 5, Felder A und B, gezeigt, wiesen die abschließend entnommenen Seren, die von Meerschweinchen, welche mit 25 μg oder 50 μg jeweils von H91A Hin47 + rHMW + rHia mit 0, 25, 50 oder 100 μg des zugefügten r200 kDa immunisiert wurden, erhalten wurden, alle hohe Antikörper-Titer gegen die H91A Hin47-Komponente auf. Es gab keinen sichtbaren verstärkenden oder inhibierenden Effekt auf die anti-H91A Hin47-Antwort auf die Zugabe des r200 kDa-Antigens.
Wie in der 6, Felder A und B, gezeigt, wiesen die abschließend entnommenen Seren, die von Meerschweinchen, welche mit 25 μg oder 50 μg jeweils von H91A Hin47 + rHMW + rHia mit 0, 25, 50 oder 100 μg des zugefügten r200 kDa immunisiert wurden, erhalten wurden, alle hohe Antikörper-Titer gegen die rHMW-Komponente auf. Es gab keinen sichtbaren verstärkenden oder inhibierenden Effekt auf die anti-rHMW-Antwort bei der Zugabe des r200 kDa-Antigens.
Wie in der 7, Felder A und B, gezeigt, wiesen die abschließend entnommenen Seren, die von Meerschweinchen, welche mit 25 μg oder 50 μg jeweils von H91A Hin47 + rHMW + rHia mit 0, 25, 50 oder 100 μg des zugefügten r200 kDa immunisiert wurden, erhalten wurden, alle hohe Antikörper-Titer gegen die rHia-Komponente auf. Es gab keinen sichtbaren verstärkenden oder inhibierenden Effekt auf die anti-rHia-Antwort bei der Zugabe des r200 kDa-Antigens.
Wie in der 8, Felder A, B und C, gezeigt, wiesen die abschließend entnommenen Seren, die von Meerschweinchen, welche mit 25, 50 oder 100 μg von r200 kDa mit zugefügten 0, 25 oder 50 μg jeweils von H91A Hin47 + rHMW + rHia immunisiert wurden, erhalten wurden, alle hohe Antikörper-Titer gegen die r200 kDa-Komponente auf. Es gab einen statistisch signifikanten Effekt auf die anti-r200 kDa-Antikörper-Titer für einige der zwischenzeitlichen Entnahmen, wenn zunehmende Mengen der anderen Komponenten zugefügt wurden. Es gab jedoch keinen signifikanten Effekt auf die abschließenden Entnahmen.
Beispiel 7
Dieses Beispiel beschreibt das Schutzvermögen eines Multi-Komponenten-Impfstoffs in Tiermodellen von Erkrankung.
Es wurde gezeigt, dass bei jungen Chinchillas eine nasopharyngeale Kolonisation mit nicht-typisierbarem H. influenzae zu einer Mittelohrentzündung führt (Ref. 17). rHMW ist in einem Chinchilla-Belastungsmodell einer nasopharyngealen Kolonisation zum Teil schützend, wie in der oben erwähnten US-Patentanmeldung Nr. 09/167 568 beschrieben. In diesem Modell wurden Tiere i.m. an den Tagen 0, 14 und 28 mit 25, 50 oder 100 μg von an Alaun adsorbiertem rHMW immunisiert und an Tag 44 mit 10⁸ cfu von lebenden Bakterien, die intranasal abgegeben wurden (50 μl pro Nasenhöhlen) belastet. Eine nasopharyngeale Spülung wurde 4 Tage nach der Belastung unter Verwendung von 1 ml steriler Salzlösung als Wäsche durchgeführt. 25 μl der Wäsche wurde auf einen Schokoladen-Agar in Gegenwart von Streptomycin plattiert, und die Platten wurden bei 37°C 24 h lang inkubiert. (Das Belastungsfärbemittel wurde durch seriellen Durchgang Streptomycin-resistent gemacht, um die Quantifizierung der zurückgewonnenen Bakterien in der Gegenwart der natürlichen Flora, die durch das Streptomycin getötet werden, zu erleichtern.) Genesende Tiere oder jene, die allein mit Alaun Schein-immunisiert wurden, wurden als Kontrollen verwendet. Für die Multi-Komponentenimpfstoff-Studie, wurden je 50 μg von H91A Hin47, rHMW, rHia und r200 kDa wie in Beispiel 5 beschrieben gemischt, und Chinchillas wurden, wie oben beschrieben, immunisiert. Die Ergebnisse der Schutz-Studie sind in 9 gezeigt, was darauf hinweist, dass dort immer noch ein exzellenter Schutz im Belastungsmodell der nasopharyngealen Kolonisation durch die Kombination von rHMW + rHia + H91A Hin47 + r200 kDa gewährt wird.
H91 Hin47 ist im Chinchilla-Modell der Mittelohrentzündung zum Teil schützend, wie im oben genannten US-Patent Nr. 5 506 139 beschrieben ist. In diesem Modell wurden 1 bis 2 Jahre alte Chinchillas (Moulton Chinchilla Ranch, Rochester, Minnesota) an den Tagen 0, 14 und 28 mit 30 μg von auf Alaun adsorbiertem H91A Hin47 i.m. immunisiert und am Tag 44 mit 50 bis 350 cfu von lebenden Organismen belastet, welche über die epitympanale Bulla in den Mittelohrraum abgegeben wurden (Ref. 14). Die Tiere werden durch Tympanometrie überwacht, und Mittelohrflüssigkeit wird 4 Tage nach der Belastung gesammelt, mit 200 μl BHI-Medium gemischt und Verdünnungen werden auf Schokoladen-Agar-Platten plattiert, die 24 h lang bei 37°C inkubiert werden. Genesende Tiere oder jene, die mit Alaun alleine Schein-immunisiert wurden, wurden als Kontrollen verwendet. Für die Multi-Komponentenimpfstoff-Studie, wurden je 50 μg von H91A Hin47, rHMW, rHia und r200 kDa wie in Beispiel 5 beschrieben kombiniert, und die Chinchillas wurden, wie oben beschrieben, immunisiert. Die Ergebnisse der Schutz-Studie sind in 10 gezeigt, was darauf hinweist, dass dort immer noch ein partieller Schutz im Intrabulla-Belastungsmodell durch die Kombination von rHMW + rHia + H91A Hin47 + r200 kDa gewährt wird.
Beispiel 8
Dieses Beispiel veranschaulicht die bakteriziden Eigenschaften der Zusammensetzung.
Es gibt kein relevantes Tiermodell für eine Infektion durch Moraxella catarrhalis, aber es wurde ein bakterizider Antikörpertest als ein Ersatztest entwickelt. Kurz gesagt, ein M. catarrhalis-Stamm 4223 wurde über Nacht in einer Gehirn-Wärme-Infusions(BHI)-Brühe (Difco Laboratories, Detroit, MI) bei 37°C kultiviert. Die Übernacht-Kultur wurde in 10 ml BHI-Brühe subkultiviert und auf A₅₇₈ = 0,5 wachsen gelassen.
Die Bakterien wurden verdünnt (10^–3 oder 10^–4) in Veronal-gepufferter Salzlösung (VBS, pH 7,6), die 140 mM NaCl, 93 mM NaHCO₃, 2 mM Na-Barbiturat, 4 mM Barbitursäure, 0,5 mM MgCl₂·6H₂O, 0,4 mM CaCl₂·2H₂O und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt. Meerschweinchenanti-r200 kD-Serum und pre-immunes Kontrollserum wurde bei 56°C 30 min lang erwärmt, um das endogene Komplement zu inaktivieren. Serum und Antiserum wurden in VBS verdünnt und auf Eis gestellt.
Fünfundzwanzig μl des verdünnten pre-immunen Serums oder Test-Antiserums wurden zu den Mulden einer 96-Mulden Nunclon-Mikrotiterplatte (Nunc, Roskilde, Dänemark) zugegeben. Fünfundzwanzig μl der verdünnten Bakterienzellen wurden zu jeder der Mulden zugefügt. Ein Meerschweinchen-Komplement (BioWhittaker, Walkerville, MD) wurde 1:10 in VBS verdünnt und 25 μl Portionen wurden zu jeder Mulde hinzugefügt. Die Platten wurden 60 min lang inkubiert, behutsam bei 70 U/min auf einer rotierenden Plattform geschüttelt. Fünfzig μl von jeder Reaktionsmischung wurden auf Mueller Hinton Agarplatten (Becton-Dickinson, Cockeysville, MD) plattiert. Die Platten wurden bei 37°C 24 Stunden lang inkubiert, und anschließend für weitere 24 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Die Anzahl der Kolonien pro Platte wurde gezählt und gemittelte Werte der Kolonien pro Platte wurde von doppelten Paaren abgeschätzt.
Wenn prä-immune Serumplatten mit PBS-Kontrollplatten (kein Serum) verglichen wurden, wies das pre-immune Serum keinen bakteriziden Effekt auf den homologen Stamm 4223 auf. Daher wurde angenommen, dass die Anzahl der Kolonien pro Platte auf pre-immunen Serumplatten 100% Lebensfähigkeit für jeden Stamm repräsentierte, und das prozentuale bakterizide Abtöten wurde wie folgt berechnet:
Unter Verwendung dieses Tests wurde die relative bakterizide Antikörperaktivität der anti-r200 kDa- und anti-4-Komponenten (H91A Hin47 + rHMW + rHia + r200 kDa) Antiseren verglichen und gefunden, dass sie äquivalent sind. Diese in den Tabellen III und IV unten dargestellten Daten weisen darauf hin, dass es keinen nachteiligen Effekt auf die bakterizide Aktivität des anti-r200 kDa-Antikörpers gibt, wenn Antikörper gegen zusätzliche Antigene vorhanden sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER OFFENBARUNG
In Zusammenfassung dieser Offenbarung, stellt die vorliegende Erfindung einen multivalenten Impfstoff gegen eine Erkrankung zur Verfügung, die sowohl durch Haemophilus influenzae als auch Moraxella catarrhalis verursacht ist, einschließlich der Mittelohrentzündung, welcher ein weites Spektrum an Wirksamkeit besitzt, und umfassend drei unterschiedliche Antigene von Haemophilus influenzae, wobei zwei der unterschiedlichen Antigene ein Adhäsin ist, und ein Antigen von Moraxella catarrhalis, welches antigenisch zu einem der Antigene von Haemophilus influenzae verwandt ist. Modifikationen sind innerhalb des Umfangs der Erfindung möglich. TABELLE III PROZENTUALES ABTÖTEN VON 4223 DURCH GP 1409-13 α r200kD (Alaun) UND GP 1449-53 rH91, α Hia, HMW, r200kD (Alaun)

LM613, 11.12.98
Basierend auf einer log₁₀ = –4 Verdünnung von 4223
Mittl. Vorentnahme-Kolonienzählung betrug 482

LM615, 16.12.98
Mittl. Vorentnahme-Kolonienzählung bei log₁₀–4-Verdünnung von 4223 betrug 720
Mittl. Vorentnahme-Kolonienzählung bei log₁₀–3-Verdünnung von 4223 betrug 58

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Claims

Multivalente immunogene Zusammensetzung zur Verleihung eines Schutzes in einem Wirt gegen eine Erkrankung, die sowohl durch Haemophilus influenzae als auch Moraxella catarrhalis verursacht ist, gekennzeichnet durch: wenigstens vier unterschiedliche Antigene, die wenigstens ein Antigen aus Haemophilus influenzae und wenigstens ein Antigen aus Moraxella catarrhalis umfassen, wobei wenigstens drei dieser Antigene Adhäsine sind und wenigstens eines dieser Adhäsine aus Moraxella catarrhalis ist.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei eines der Antigene, das ein Adhäsin ist, ein Protein mit hohem Molekulargewicht (HMW) eines nicht-typisierbaren Stamms von Haemophilus influenzae, vorzugsweise ein HMW1- oder HMW2-Protein des nicht-typisierbaren Stamms von Haemophilus influenzae, vorzugsweise rekombinant hergestellt, ist.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die HMW1- und HMW2-Proteine aus dem jeweiligen Stamm von nicht-typisierbarem Haemophilus influenzae stammen und die in der folgenden Tabelle dargestellten jeweiligen Molekulargewichte aufweisen: Molekulargewicht (kDa) nicht-typisierbarer H. influenzae Stamm
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei ein anderes der Antigene, das ein Adhäsin ist, ein Haemophilus influenzae-Adhäsin(Hia)-Protein eines nicht-typisierbaren Stamms von Haemophilus influenzae oder ein Haemophilus influenzae-Oberflächenfibrillen(Hsf)-Protein eines typisierbaren Stamms von Haemophilus influenzae, vorzugsweise rekombinant hergestellt, ist.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das rekombinant hergestellte Hia-Protein eine N-terminale Trunkierung V38 rHia ist.
Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei ein Antigen von Haemophilus influenzae, das kein Anhäsin ist, ein nicht-proteolytisches Hitzeschockprotein eines Stamms von Haemophilus influenzae, vorzugsweise ein Analogon des Haemophilus influenzae Hin47-Proteins ist, das eine verringerte Proteaseaktivität aufweist, die weniger als 10% derjenigen des natürlichen Hin47-Proteins beträgt.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das Analogon des Hin47-Proteins eines ist, in dem wenigstens eine Aminosäure des natürlichen Hin47-Proteins, die zur Proteaseaktivität beiträgt, deletiert oder durch eine unterschiedliche Aminosäure ersetzt wurde und das im Wesentlichen dieselben immunogenen Eigenschaften wie das natürliche Hin47-Protein aufweist.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei die wenigstens eine Aminosäure aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 91, 121 und 195 bis 201 des natürlichen Hin47-Proteins ausgewählt ist, vorzugsweise ist Serin-197 durch Alanin ersetzt, Histidin-91 durch Alanin, Lysin oder Arginin, insbesondere Alanin, oder Asp-121 durch Alanin.
Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei eines der Antigene, das ein Adhäsin ist, ein Außenmembranprotein von Moraxella catarrhalis mit einem apparenten Molekulargewicht von 200 kDa, bestimmt durch SDS-PAGE, vorzugsweise rekombinant hergestellt, ist.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das rekombinant hergestellte 200 kDa-Protein eine N-terminale Trunkierung V56 r200 kDa ist.
Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, die umfasst: (a) ein Analogon des Haemophilus influenzae Hin47-Proteins mit einer verringerten Proteaseaktivität, die weniger als 10% derjenigen des natürlichen Hin47-Proteins beträgt, (b) ein Haemophilus influenzae-Adhäsin(Hia)-Protein eines nicht-typisierbaren Stamms von Haemophilus influenzae, (c) ein Protein mit hohem Molekulargewicht (HMW) eines Stamms von nicht-typisierbarem Haemophilus influenzae, und (d) ein Außenmembranprotein von Moraxella catarrhalis mit einem apparenten Molekulargewicht von 200 kDa, bestimmt durch SDS-PAGE.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die Hin47-, Hia-, HMW- und 200 kDa-Proteine in Mengen vorliegen, welche die einzelnen immunogenen Aktivitäten der Proteine nicht beeinträchtigen.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 12, umfassend: (a) 25 bis 100 μg des Hin47-Protein-Analogons, und (b) 25 bis 100 μg des Hia-Proteins, (c) 25 bis 100 μg des HMW-Proteins, und (d) 25 bis 100 μg des 200 kDa-Proteins.
Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, die ferner ein Adjuvans, vorzugsweise Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat, umfasst.
Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, die ferner wenigstens eine zusätzliche Antigenkomponente zur Verleihung eines Schutzes gegen eine Infektion, die durch ein anderes Pathogen verursacht ist, umfasst, die vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Diphtherietoxoid, Tetanustoxoid, Pertussisantigenen, nicht-virulentem Poliovirus und PRP-T ausgewählt ist, insbesondere sind die Pertussisantigene aus der Gruppe bestehend aus Pertussistoxoid, filamentösem Hämagglutinin, Pertaktin und Agglutinogenen ausgewählt.
Multivalente immunogene Zusammensetzung, die wenigstens vier unterschiedliche Antigene umfasst, welche wenigstens ein Antigen aus Haemophilus influenzae und wenigstens ein Antigen aus Moraxella catarrhalis umfassen, wobei wenigstens drei dieser Antigene Adhäsine sind und wenigstens eines dieser Adhäsine aus Moraxella catarrhalis ist, zur Verwendung bei der Verleihung eines Schutzes in einem Wirt gegen eine Erkrankung, die sowohl durch Haemophilus influenzae als auch Moraxella catarrhalis verursacht ist.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die wenigstens vier unterschiedlichen Antigene wie in einem der Ansprüche 2 bis 15 definiert sind.
Verwendung von wenigstens vier unterschiedlichen Antigenen, die wenigstens ein Antigen aus Haemophilus influenzae und wenigstens ein Antigen aus Moraxella catarrhalis umfassen, wobei wenigstens drei dieser Antigene Adhäsine sind und wenigstens eines dieser Adhäsine aus Moraxella catarrhalis ist, zur Herstellung einer multivalenten immunogenen Zusammensetzung zur Verleihung eines Schutzes in einem Wirt gegen eine Erkrankung, die sowohl durch Haemophilus influenzae als auch Moraxella catarrhalis verursacht ist.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die wenigstens vier unterschiedlichen Antigene wie in einem der Ansprüche 2 bis 15 definiert sind.