DE60125507T2

DE60125507T2 - Nukleinsäuren und Proteine des mph3 Gens aus Mycoplasma hypopneumoniae und deren Verwendung

Info

Publication number: DE60125507T2
Application number: DE60125507T
Authority: DE
Inventors: Kendall Wayne Groton King; Rebecca Anne Groton Madura; Everett Lee Groton Rosey
Original assignee: Pfizer Products Inc
Current assignee: Pfizer Products Inc
Priority date: 2001-03-28
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2021-03-31
Also published as: ES2277893T3; JP2002306169A; CA2340455A1; DE60125507D1; DK1245677T3; EP1245677B1; CY1105947T1; EP1245677A1; ATE349530T1

Description

Das mhp3-Gen codiert für ein Protein von Mycoplasma hyopneumoniae. Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleotide und Proteine von mhp3. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin neue Apoprotein-Antigene, die durch mhp3 codiert werden, zur Verwendung in Vakzinen, um Krankheiten zu verhindern und zu behandeln, die durch Infektion mit Mycoplasma hyopneumoniae verursacht werden, und Verfahren zur rekombinanten Herstellung solcher Antigene.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae) ist ein bakterielles Pathogen, das enzootische Mycoplasma-Pneumonie beim Schwein verursacht. Enzootische Mycoplasma-Pneumonie ist eine chronische Krankheit, die in schlechter Futterumsetzung, Verkümmerung und Prädisposition für sekundäre Lungeninfektionen resultiert. M. hyopneumoniae wird leicht über Atemwegsabsonderungen und durch Übertragung von der Muttersau zum Ferkel übertragen und ist auf Schweinefarmen sehr verbreitet. Näherungsweise 99 % der US-Schweineherden sind infiziert, was die Schweineindustrie nach einer Schätzung von 1991 jährlich etwa 300 Millionen Dollar kostet.
Es gibt keine einfachen Tests zur Detektion von M. hyopneumoniae, noch gibt es wirksame Maßnahmen gegen die Infektion. Das Testen zur Detektion von M. hyopneumoniae wurde durch die Kreuzreaktivität der Antikörper, die gegen M. hyopneumoniae gerichtet sind, mit anderen Schweine-Mycoplasmaspezies behindert. Der Vakzinbereich war größtenteils abhängig von Membran-adjuvierten ("adjuvanted membrane") oder Ganzzellpräparationen von M. hyopneumoniae, die keine signifikanten Immunantworten auslösten. Zusätzlich scheiterten das Klonieren und die rekombinante Expression von M. hyopneumoniae-Genen, um Proteine zu produzieren, die zur kommerziellen Verwendung in Vakzinen ausreichend schützen.
Aufgrund des Mangels an geeigneten Vakzinen, wurde die enzootische Mycoplasma-Pneumonie weitgehend durch frühe Detektion und Isolierung von infizierten Tieren eingedämmt. Die Behandlung von M. hyopneumoniae-infizierten Tieren mit Antikörpern hatte begrenzten Erfolg beim Einschränken des Verlaufs der Infektion.
Somit besteht ein großer Bedarf, Mittel zum Verhindern der Ausbreitung dieser Krankheit zu finden, entweder durch Verhindern der Infektion oder durch Heilung. Ein Ansatz zur Prävention ist Immunisierung. Die Fähigkeit, große Mengen antigener M. hyopneumoniae-Proteine oder -Peptide in vitro zur Verwendung in Vakzinen-Formulierungen zu produzieren, würde daher die Entwicklung vorbeugender Vakzine außerordentlich vorantreiben.
Die Internationale Patentveröffentlichung WO 96/28472 identifiziert sechs Proteinantigenspezies von M. hyopneumoniae mit Molekulargewichten von 46-48, 52-54, 60-64, 72-75, 90-94 und 110-114 Kilodalton und offenbart Proteinteilsequenzen der 52-54, 60-64 und 72-75 Kilodalton-Antigene und Nucleotid- und Aminosäuresequenzen des 46-48 Kilodalton-Antigens in voller Länge. Das 46-48 Kilodalton-Antigen, hierin nachstehend als P46 bezeichnet, entspricht dem 44 Kilodalton-Antigen des US-Patents Nr. 5,252,328, Faulds, und einem 48 Kilodalton-Antigen, beschrieben bei Lee (Lee et al., 1996, J. Chromatogr. A. 737:273-279), wie auf der Basis der Offenbarungen der Peptidteilsequenzen von Fauld und Lee bestimmt. Das Gen, codierend P46, d.h. p46, wurde auch durch Futo et al. (1995; J. Bacteriol. 177:1915-1917) kloniert. Später zeigte die gleiche Gruppe, dass das in vitro exprimierte Genprodukt beim Diagnostizieren von Antikörperreaktionen auf M. hyopneumoniae-Infektionen ohne Kreuzreaktivität mit anderen Mycoplasmaspezies verwendbar war (Futo et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33:680-683). Die Sequenzen und die diagnostischen Verwendungen des p46-Gens, beschrieben von Futo et al., werden weiter in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 475 185 A1 offenbart.
Die Peptidteilsequenz des 60-64 Kilodalton-Antigens von WO 96/28472 hat eine signifikante Homologie zu einem Protein, das P102 genannt wird (siehe unten). Zusätzlich hat das Antigen eine signifikante Homologie zu einem 64 Kilodalton-Antigen, das von Faulds (US Patent Nr. 5,252,328) offenbart wurde.
Das 72-75 Kilodalton-Antigen von WO 96/28472 entspricht einem 65 Kilodalton-Protein, das von Wise und Kim (1987, J. Bacteriol., 169:5546-5555 und US-Patent Nr. 5,788,962) offenbart wurde, und das hierin nachstehend als P65 bezeichnet werden wird.
Das 52-54 Kilodalton-Antigen, das hierin nachstehend als Mhp3 bezeichnet werden wird, kann dem integralen 50 Kilodalton-Membranprotein, das von Wise und Kim (1987, J. Bacteriol. 169:5546-5555) beschrieben wurde, und/oder der 52 Kilodalton-Proteinspezies, die bei Faulds (US-Patent Nr. 5,252,328) offenbart wurde, entsprechen. Das 52-54 Kilodalton-Antigen wird hierin nachstehend als MHP3 bezeichnet. WO 96/28472 offenbart die Sequenzen des Aminoterminus des reifen Proteins und eines inneren Cyanogenbromid-Fragments.
Das 90-94 Kilodalton-Antigen von WO 96/28472 kann dem Adhäsin p97, wie von Hsu et al. offenbart, entsprechen, was unten beschrieben ist.
WO 96/28472 offenbart weiterhin die Ergebnisse von Vakzinuntersuchungen unter Verwendung des 60-64 Kilodalton-Antigens, P46 oder einer Kombination von P65 und Mhp3. Die Impfungen lösten einen signifikanten Schutz vor M. hyopneumoniae-Infektion aus.
Es gibt mehrere Berichte in der wissenschaftlichen und der Patentliteratur, die die Proteine der äußeren Membran von M. hyopneumoniae betreffen. Zum Beispiel berichten Wise und Kim (1987, J. Bacteriol., 169:5546-5555), dass es vier Spezies von integralen Membranproteinen bei M. hyopneumoniae, genannt p70, p65 (P65, supra), p50 und p44, gibt und dass die letzteren drei durch kovalente Lipidanfügungen modifiziert sind und eine starke humorale Immunantwort induzieren. Die schützenden Immunantworten wurden nicht untersucht. Das Gen, das das P65-Protein codiert, wurde kloniert und seine Sequenzen und ihre Verwendungen, z.B. in Vakzinen und Diagnostika, sind in dem US-Patent Nr. 5,788,962 beschrieben.
Die Internationale Patentveröffentlichung WO 91/15593 offenbart fünf Proteine von M. hyopneumoniae mit scheinbaren Molekulargewichten von 105, 90, 85, 70 und 43 Kilodalton. Eine Sequenz des Gens, das für das 85 Kilodalton-Protein (Protein C) codiert, wurde in voller Länge bereitgestellt, wie auch Nucleotidteilsequenzen, die für die anderen vier Proteine codieren, bereitgestellt wurden. Vakzin-Untersuchungen unter Verwendung von Protein C ermöglichten den Testtieren einen "signifikanten" Schutz gegen M. hyopneumoniae.
Das US-Patent Nr. 5,252,328, Faulds, offenbart Amino-terminale Sequenzen von immunreaktiven M. hyopneumoniae-Proteinen, deren Molekulargewichte 36, 41, 44, 48, 64, 68, 74,5, 79, 88,5, 96 und 121 Kilodalton sind. Andere Proteine, die basierend auf den elektrophoretischen Mobilitäten identifiziert wurden, aber für die keine Proteinsequenzen offenbart wurden, hatten scheinbare Molekulargewichte von 22,5, 34 und 52 Kilodalton. Obwohl das US-Patent Nr. 5,252,328 die Verwendung dieser Proteine in Vakzin-Formulierungen vorschlug, wurden keine Ergebnisse von Vakzin-Untersuchungen berichtet.
Die Internationale Patentveröffentlichung WO 95/09870 offenbart biochemische Verfahren zur Aufreinigung von M. hyopneumoniae-Adhäsinen, den integralen Membranproteinen von Mycoplasma, die für die Adhäsion an die Cilia des oberen Respirationsepithels des Wirts verantwortlich sind. WO 95/09870 schlägt auch Assays und Verwendungen für diese Proteine, z.B. in Vakzinen und Diagnostika, vor. Es wurde jedoch nicht über die Klonierung von Adhäsin-Genen berichtet, bis ein Gen, genannt p97, kloniert wurde und gezeigt wurde, dass sein Produkt, hierin nachfolgend "P97", eine Rolle bei der Fähigkeit des Organismus, Flimmerzellen innerhalb der Atemwege eines M. hyopneumoniae-infizierten Schweins zu binden, spielt (Hsu et al., 1997, J. Bacteriol. 179:1317-1323). Ein Forschungsartikel von King et al. (1997; Vaccine 15:25-35) offenbart Mhp1, ein 124 Kilodalton-Adhäsin, das eine Stammvariante ("strain variant") von P97 ist. Jedoch resultierten Versuche, Schweine gegen M. hyopneumoniae unter Verwendung eines GST-Mhp1-Fusionsproteins zu impfen, nicht in einem statistisch signifikanten Schutz gegen enzootische Mycoplasma-Pneumonie. Eine 94 Kilodalton-Variante von P97 wurde von Wilton et al. (1998, Microbiology 144:1931-1943) identifiziert. Zusätzlich wurde gezeigt, dass das p97-Gen Teil eines Operons ist, das auch für ein zweites Protein, als P102 bezeichnet, mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von näherungsweise 102 Kilodalton codiert (Hsu et al., 1998, Gene 214:13-23). Minion und Hsu schlugen die Verwendung von P102 in Vakzinen in der Internationalen Patentveröffentlichung WO 99/26664 vor, berichteten aber nicht über Vakzin-Untersuchungen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung umfasst Nucleotide und Proteine des M. hyopneumoniae-mhp3-Gens. Die vorliegende Erfindung umfasst auch neue Apoprotein-Antigene, codiert durch das mhp3-Gen, zur Verwendung in Vakzinen, um Krankheiten zu verhindern und zu behandeln, die durch Infektion mit M. hyopneumoniae verursacht werden. Verfahren für die rekombinante Produktion von apo-Mhp3 werden ebenfalls bereitgestellt.
Die Erfindung stellt eine Vakzin-Formulierung bereit, umfassend ein antigenes oder immunogenes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die SEQ ID NO: 4 umfasst, wobei das Polypeptid kein Fettsäure-acyliertes Cystein hat, dem die Aminosäuresequenz Trp Asp Lys Glu folgt, und kein C-terminales Homoserinlacton hat, und einen pharmazeutisch verträglichen bzw. annehmbaren Träger. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das antigene oder immunogene Polypeptid als ein Thioredoxin-Fusionsprotein exprimiert, vorzugsweise durch Klonierung in den Expressionsvektor pBAD/Thio-TOPO, und durch einen E. coli BL21-Stamm produziert. In einer hoch bevorzugten Ausführungsform umfasst das Vakzin weiterhin mindestens ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus M. hyopneumoniae P46, P65, P97 und P102 und Fragmenten, Varianten und Derivaten davon.
Die Erfindung stellt eine Verwendung eines antigenen oder immunogenen Polypeptids, umfassend eine Aminosäuresequenz, die SEQ ID NO: 4 entspricht, in der Herstellung einer Vakzin-Formulierung zum Behandeln oder Verhindern bzw. Vorbeugen einer Krankheit oder Störung bei einem Tier, die durch Infektion mit M. hyopneumoniae verursacht wird, bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Tier ein Schwein.
Die Erfindung stellt weiterhin Kits zur Detektion von M. hyopneumoniae bereit. In einer Ausführungsform stellt der Kit Reagenzien zur Detektion von zirkulierenden Antikörpern gegen M. hyopneumoniae-Mhp3-Protein bereit.
Diese Erfindung stellt ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die SEQ ID NO: 4 umfasst, bereit, wobei das Protein kein Fettsäure-acyliertes Cystein hat, dem die Aminosäuresequenz Trp Asp Lys Glu folgt und kein C-terminales Homoserinlacton hat. In einer weiteren Ausführungsform ist das Protein ein Fusionsprotein. In einer weiteren Ausführungsform ist das Fusionsprotein ein Thioredoxin-Fusionsprotein.
Diese Erfindung stellt ein beliebiges der oben genannten Proteine bereit, das ein isoliertes Protein ist. Diese Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung bereit, umfassend ein beliebiges der oben genannten Proteine und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung weiterhin ein Adjuvans. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung weiterhin wenigstens ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Mycoplasma hyopneumoniae P46, P65, P97 und P102.
Diese Erfindung stellt ein immunogenes Protein mit einer Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 4 dargestellt ist, bereit, wobei das immunogene Protein kein Fettsäureacyliertes Cystein hat, dem die Aminosäuresequenz Trp Asp Lys Glu folgt, und kein C-terminales Homoserinlacton hat.
Diese Erfindung stellt auch die Verwendung eines Proteins mit einer Aminosäuresequenz, die SEQ ID NO: 4 umfasst, wobei das Protein kein Fettsäure-adyliertes Cystein hat, dem die Aminosäuresequenz Trp Asp Lys Glu folgt, bei der Herstellung einer Vakzin- Formulierung zum Behandeln oder Verhindern bzw. Vorbeugen einer Krankheit oder Störung bei einem Tier, die durch Infektion mit Mycoplasma hyopneumoniae verursacht wird, bereit.
In einer Ausführungsform einer beliebigen der oben genannten Verwendungen ist das Tier ein Schwein.
Diese Erfindung stellt eine DNA, die im universellen genetischen Code für ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die SEQ ID NO: 4 umfasst, codiert oder ihr Komplement bereit.
In anderen Ausführungsformen ist die oben genannte DNA funktionell ("operably") mit einem heterologen Promotor verknüpft. In dieser Erfindung ist die funktionell mit einem heterologen Promotor verknüpfte DNA isolierte DNA. In noch anderen Ausführungsformen umfasst eine beliebige der oben genannten DNAs weiterhin einen Replikationsstart, der in einer prokaryotischen Zelle aktiv ist. In anderen Ausführungsformen umfasst eine beliebige der oben genannten DNAs weiterhin einen Replikationsstart; der in einer eukaryotischen Zelle aktiv ist.
Diese Erfindung stellt eine Wirtszelle, umfassend eine beliebige der oben genannten DNAs, funktionell verknüpft mit einem heterologen Promotor, bereit. In einer Ausführungsform ist die Wirtszelle E. coli BL21 und die DNA ist der Expressionsvektor pBAD/Thio-TOPO.
Diese Erfindung stellt ein Verfahren zur Produktion von apo-Mhp3 bereit, wobei das Verfahren umfasst: (i) Wachstum der oben genannten Zellen unter Bedingungen, unter denen apo-Mhp3 exprimiert wird, und (ii) Gewinnung des Proteins. In einer Ausführungsform wird das Protein in einer löslichen Form gewonnen. In einer anderen Ausführungsform wird das Protein in einer unlöslichen Form gewonnen.
Diese Erfindung stellt die Verwendung einer beliebigen der oben genannten DNAs in der Herstellung einer Vakzin-Formulierung zum Behandeln oder Verhindern einer Krankheit oder Störung bei einem Tier, die durch Infektion mit Mycoplasma hyopneumoniae verursacht wird, bereit. In einer Ausführungsform ist das Tier ein Schwein.
Diese Erfindung stellt einen Kit, umfassend in wenigstens einem Behälter ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die SEQ ID NO: 4 umfasst, wie oben stehend definiert, und eine Erklärung, die darauf hinweist, dass der Kit zur Diagnose von M. hyopneumoniae-Infektion nützlich bzw. verwendbar ist, bereit. In einer Ausführungsform umfasst der Kit weiterhin einen Anti-Schwein-Sekundärantikörper und in einer weiteren Ausführungsform ist der Sekundärantikörper mit einem Enzym konjugiert, das eine kolorimetrische Reaktion katalysiert. In noch einer weiteren Ausführungsform ist das Enzym ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus alkalischer Phosphatase und Merrettich-Peroxidase, und in noch einer weiteren Ausführungsform umfasst der Kit weiterhin Reagenzien für einen kolorimetrischen Assay.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine Clustal W (1,7)-Sequenzvergleichsanordnung zwischen Mhp3 aus M. hyopneumoniae (SEQ ID NO: 2) und Ag234-5 (SEQ ID NO: 41), bei der ursprünglich angenommen wurde, dass sie von M. arginini stammt, bei der aber später gezeigt wurde, dass sie aus M. hyorhinis stammt. Aminosäuregleichheit bzw. -identität wird durch Sternchen (*) abgebildet, hoch konservative Substitutionen werden durch Doppelpunkte (:) angezeigt und konservative Substitutionen werden durch Punkte ("periods") (.) angezeigt. Insgesamt teilen die beiden Proteine 36,2 % Aminosäureidentität.
2 ist ein Western Blot, der die Reaktivität von Antikörpern von einem Schwein, das experimentell mit M. hyopneumoniae provoziert wurde, gegen Proteinextrakte aus M. hyopneumoniae, M. hyorhinis oder M. mycoides oder gereinigtes rekombinantes Mhp3 zeigt.
ABKÜRZUNGEN UND DEFINITIONEN
Die Abkürzung M., wo sie dem Namen einer Spezies vorausgeht, bezieht sich auf den Genus Mycoplasma.
Der Begriff "rekombinantes mhp3" bezieht sich auf eine Nucleinsäure, die für das Mhp3-Antigen in dem universellen genetischen Code codiert. "M. hyopneumoniae-mhp3" betrifft eine Nucleinsäure, die für das Mhp3-Antigen in dem genetischen Code von M. hyopneumoniae codiert. Bei M. hyopneumoniae bedeutet das Codon TGA einen Tryptophanrest anstelle eines Translationsstopp-Codons. Somit unterscheidet sich das rekombinante mhp3-Gen von dem M. hyopneumoniae-mhp3 dadurch, dass es TGG-Codons anstelle von TGA-Codons hat.
Der Begriff "Mhp3" bezieht sich auf ein Protein, das durch ein mhp3-Gen codiert wird.
Der Begriff "Apoprotein" bezeichnet ein Protein, dem eine Lipidgruppierung fehlt, z.B. durch Deletion oder Mutation der Aminosäure, die als ein Akzeptor der Lipidgruppierung fungieren würde.
Der Begriff "ORF" bezeichnet ein "offenes Leseraster" ("open reading frame"), d.h. den codierenden Bereich eines Gens.
Der "Prozentsatz der Sequenzidentität" für Nucleinsäuren und Polypeptide wird durch Vergleichen zweier optimal vergleichend angeordneter Sequenzen über ein Vergleichsfenster bestimmt, wobei die optimale vergleichende Anordnung die Übereinstimmung höchsten Grades bereitstellt und Additionen oder Deletionen bei der Test- oder Referenzsequenz einführen kann. Der Prozentsatz der Identität wird durch Berechnen des Prozentsatzes der Aminosäuren, die in der Test- und der Referenzsequenz bei einer gegebenen Position identisch sind, bestimmt. Die optimale vergleichende Sequenzanordnung und der Prozentsatz der Identität können manuell bestimmt werden oder stärker bevorzugt durch einen Computeralgorithmus, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, GAP, BESTFIT und CLUSTALW (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-10; Pearson und Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-8; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22(22):4673-80; Devereux et al., 1984, Nuc. Acids. Res. 12:387-395); Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402). Vorzugsweise wird der NCBI-Blast-Server (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), eingestellt auf die voreingestellten Parameter, verwendet, um den Prozentsatz der Sequenzidentität zu bestimmen.
Der Begriff heterolog, wenn er hierin verwendet wird, um einen Promotor zu beschreiben, gibt an, dass der Promotor nicht nativ zu dem offenen Leseraster ist, dessen Expression er kontrolliert.
Der Begriff "isoliertes Protein" bezeichnet eine Zusammensetzung von Proteinen, in der das isolierte Protein mindestens 50 Gew.-% umfasst. Stärker bevorzugt umfasst die Zusammensetzung etwa 95 Gew.-% und am stärksten bevorzugt 99 Gew.-% des isolierten Proteins.
Der Begriff "gewonnen in einer löslichen Form" gibt an, dass ein Protein oder Polypeptid aus dem Zytoplasma der Zelle heraus, die das Protein oder Polypeptid exprimiert, gewonnen wird.
Der Begriff "gewonnen in einer unlöslichen Form" gibt an, dass ein Protein oder Polypeptid aus Einschlusskörpern ("inclusion bodies"), die in der Zelle vorhanden sind, die das Protein oder Polypeptid exprimiert, gewonnen wird.
Der Begriff "funktionell äquivalent", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Protein, das befähigt ist, einen Antikörper zu erkennen, der spezifisch für Mhp3 ist, welches ein Protein ist, das befähigt ist, eine im Wesentlichen ähnliche immunologische Antwort wie das endogene Mhp3-Protein auszulösen. Somit wird ein Antikörper, der gegen ein funktionell äquivalentes Protein erzeugt wurde, auch Mhp3 erkennen.
Der Begriff "Immunogenität" bezieht sich auf die Befähigung eines Proteins oder Polypeptids, eine Immunantwort auszulösen, die spezifisch gegen das Protein oder Polypeptid gerichtet ist.
Der Begriff "Antigenität" bezieht sich auf die Befähigung eines Proteins oder Polypeptids, immunspezifisch durch einen Antikörper gegen das Protein oder Polypeptid gebunden zu werden.
Der Begriff "Schutz" oder "schützen", wie hierin im Hinblick auf ein Vakzin verwendet, bedeutet, dass das Vakzin die Symptome der Krankheit, die durch den Organismus verursacht wird, aus dem das/die Antigene stammt/stammen, das/die in dem Vakzin verwendet wird/werden, verhindert oder verringert.
Der Begriff "Antikörper", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Immunglobulinmolekül, das an ein Antigen binden kann. Antikörper können ein polyklonales Gemisch oder monoklonal sein. Antikörper können intakte Immunglobuline, die aus natürlichen oder aus rekombinanten Quellen stammen, sein und sie können immunreaktive Teile der intakten Immunglobuline sein. Antikörper können in einer Vielzahl von Formen, einschließlich z.B. Fv, Fab', F(ab')₂, so wie als Einzelketten, vorkommen. Einzelketten-Antikörper, in denen Gene für eine schwere Kette und eine leichte Kette in einer einzelnen codierenden Sequenz kombiniert sind, können ebenfalls verwendet werden.
Der Begriff "wirksame Menge" bezieht sich auf eine Menge an mhp3-Nucleotid oder Mhp3-Polypeptid, die ausreichend ist, um eine Immunantwort bei dem Subjekt, an das sie verabreicht wird, auszulösen. Die Immunantwort kann, ohne Limitierung, die Induktion von zellulärer und/oder humoraler Immunität umfassen.
Der Begriff "Behandeln oder Verhindern bzw. Vorbeugen von M. hyopneumoniae-Infektion" bedeutet, dass die Replikation von M. hyopneumoniae-Bakterien inhibiert wird, dass die Übertragung von M. hyopneumoniae inhibiert wird oder dass M. hyopneumoniae daran inhibiert wird, sich selbst in seinem Wirt zu etablieren und dass die Symptome der Krankheit, die durch M. hyopneumoniae-Infektion verursacht wird, gemildert werden. Die Behandlung wird als therapeutisch angesehen, wenn es eine Reduktion bei der Bakterienlast, eine Abnahme bei den Lungeninfektionen und/oder einen Anstieg bei der Futteraufnahme und/oder dem Wachstum gibt.
Der Begriff "pharmazeutisch annehmbarer bzw. verträglicher Träger" bezieht sich auf ein Trägermedium, das nicht mit der Wirksamkeit der biologischen Aktivität des aktiven Inhaltsstoffs interferiert, chemisch inert ist und nicht-toxisch für das Subjekt ist, an das es verabreicht wird.
Der Begriff "therapeutisches Mittel" bezieht sich auf ein beliebiges Molekül, eine beliebige Verbindung oder Behandlung, vorzugsweise antibakteriell, die bei der Behandlung einer bakteriellen Infektion oder der dadurch verursachten Krankheiten unterstützt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie hierin beschrieben, entdeckten und charakterisierten die Erfinder ein M. hyopneumoniae-Gen, codierend Mhp3, von dem angenommen wird, dass es an die Plasmamembran von M. hyopneumoniae aufgrund einer Lipidkette, die kovalent an das Protein gebunden ist, angelagert bzw. gebunden ist. Die Erfindung stellt rekombinante Mittel zum Exprimieren von Mhp3-Proteinen bereit, denen eine Signalsequenz und das notwendige Signal für die Lipidmodifikation fehlt, wodurch somit eine effiziente Expression von Mhp3 und eine mit hoher Ausbeute zur Verwendung in Vakzinen gegen und Behandlungen für Krankheiten, die durch Infektion von M. hyopneumoniae verursacht werden, ermöglicht wird.
Die vorliegende Erfindung umfasst somit Proteine, die durch Nucleotidsequenzen von M. hyopneumoniae-mhp3 codiert werden und diese selbst. Die Erfindung umfasst weiterhin Nucleinsäuren, die für solche Proteine in dem universellen genetischen Code codieren, die zur Expression solcher Proteine in eubakteriellen und eukaryotischen Wirten, wie E. coli bzw. Baculovirus, geeignet sind.
Die Erfindung umfasst weiterhin Proteine mit einer Sequenz, die SEQ ID NO: 4 umfasst, und Nucleinsäuren, die für solche Proteine in dem universellen genetischen Code codieren.
Die Erfindung umfasst weiterhin Verwendungen der erfindungsgemäßen Proteine und/oder Antikörper bei der Herstellung der Vakzin-Formulierung zur Behandlung von Krankheiten, die durch M. hyopneumoniae verursacht werden.
Die Erfindung umfasst weiterhin Vakzin-Formulierungen, umfassend Mhp3-Proteine. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Vakzin-Formulierungen isolierte Proteine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus P46, P65, P97 und P102 und Fragmenten, Varianten und Derivaten davon.
Für die Klarheit der Offenbarung und nicht mittels Einschränkung wird die detaillierte Beschreibung der Erfindung in die folgenden Unterabschnitte unterteilt, die bestimmte Merkmale, Ausführungsformen oder Anwendungen der Erfindung beschreiben oder veranschaulichen.
NUCLEOTIDSEQUENZEN VON mhp3
Die vorliegende Erfindung umfasst Nucleotidsequenzen des mhp3-Gens und schließt jene Nucleotidsequenzen ein, die für Spezies-Varianten von Mhp3 codieren, wie sie bei anderen M. hyopneumoniae-Spezies gefunden werden können. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst die Nucleotidsequenzen, die für eine am Amino-Ende verkürzte Form ("amino truncated form") des Mhp3-Proteins, das nicht durch die kovalente Addition von Fettsäureketten modifiziert ist und das daher nicht in bzw. an der Membran lokalisiert ist ("membrane localized"), codieren. In einer Art der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die 5'-Deletion von mhp3, die dem Amino-Terminus von Mhp3 entspricht, die Nucleotidsequenzen, die für die Aminosäuren 2-29 von Mhp3 codieren. In anderen Arten der Ausführungsform entspricht die 5'-Deletion von mhp3 den ersten 30, 31-32 oder 33-40 Aminosäuren.
Die Erfindung stellt weiterhin eine DNA, welche im universellen genetischen Code für ein Protein codiert, das eine Aminosäuresequenz, umfassend SEQ ID NO: 4 aufweist, oder ihr Komplement bereit. Die Erfindung stellt weiterhin eine DNA bereit, die die Sequenz von SEQ ID NO: 3 aufweist.
mhp3-CODIERTE PROTEINE und POLYPEPTIDE
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Mhp3-Proteine bereit. In einer Ausführungsform weist das Protein eine Aminosäuresequenz, umfassend SEQ ID NO: 4, auf und ist nicht kovalent mit einer Fettsäure-Gruppierung verknüpft. In einer weiteren Ausführungsform ist das Protein ein isoliertes Protein. Die vorliegende Erfindung stellt auch Zusammensetzungen bereit, die solche Mhp3-Proteine umfassen. In bestimmten speziellen Ausführungsformen umfassen die Zusammensetzungen ein Mhp3-Protein und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein Mhp3-Protein und ein Adjuvans. In einer anderen speziellen Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung mindestens ein anderes Protein von M. hyopneumoniae, wie P46, P65, P97 oder P102, ist aber nicht auf diese beschränkt. In anderen Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung ein Mhp3-Protein und mindestens ein anderes immunogenes oder antigenes Polypeptid, das kein (M. hyopneumoniae-)Protein ist, vorzugsweise ein virales, bakterielles oder parasitäres Polypeptid. Eine solche Zusammensetzung ist als Kombinationsvakzin nützlich.
Weiterhin sind die Mhp3-Proteine der vorliegenden Erfindung für die Verwendung in Vakzinpräparaten bzw. -zubereitungen im Wesentlichen rein oder homogen. Verfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind, können verwendet werden, um die Proteinreinheit oder Homogenität zu bestimmen, wie Polyacrylamidgelelektrophorese einer Probe, gefolgt von Visualisierung einer einzelnen Polypeptidbande auf einem Färbegel. Eine höhere Auflösung kann unter Verwendung von HPLC oder anderen ähnlichen Verfahren, die im Fachgebiet gut bekannt sind, ermittelt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst Polypeptide, die typischerweise aus Wirtszellen, die rekombinante Nucleotidsequenzen, die für diese Proteine codieren, exprimieren, aufgereinigt sind. Eine solche Proteinaufreinigung kann durch eine Vielzahl von Verfahren, die im Fachgebiet gut bekannt sind, erreicht werden. In einer Ausführungsform wird das Mhp3-Protein der vorliegenden Erfindung als Fusionsprotein, z.B. mit Thioredoxin, exprimiert. Das resultierende rekombinante Fusionsprotein kann mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt werden. Bei einer Art der Ausführungsform wird das Mhp3-Protein von der heterologen Gruppierung abgespalten, was in einer im Wesentlichen reinen Mhp3-Proteinprobe resultiert. Andere Verfahren können verwendet werden, siehe z.B. die Techniken, die in "Methods In Enzymology", 1990, Academic Press, Inc., San Diego, "Protein Purification: Principles and practice", 1982, Springer-Verlag, New York, beschrieben sind.
EXPRESSIONSSYSTEME
Die vorliegende Erfindung umfasst Expressionssysteme, sowohl eukaryotische als auch prokaryotische Expressionsvektoren, die verwendet werden können, um sowohl verkürzte Formen als auch solche der vollen Länge des mhp3-Proteins zu exprimieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat die Nucleinsäure die Sequenz von SEQ ID NO: 3 und codiert für ein Protein von SEQ ID NO: 4, welches die Reste 30-444 von SEQ ID NO: 2 einschließt. Die TGA-Codons von M. hyopneumoniae wurden in TGG-Codons geändert.
Eine Vielzahl von Wirt-Expressionsvektor-Systemen kann eingesetzt werden, um die antigenen Proteinsequenzen der Erfindung zu exprimieren. Solche Wirt-Expressions-Systeme stellen Vehikel dar, durch die die codierenden Sequenzen von Interesse produziert und nachfolgend aufgereinigt werden können, sie stellen aber auch Zellen dar, die, wenn sie mit den geeigneten codierenden Nucleotidsequenzen transformiert oder transfiziert sind, die mhp3-Genprodukte der Erfindung in situ aufweisen können. Diese schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, Mikroorganismen, wie Bakterien (z.B. E. coli, B. subtilis), die mit rekombinanten Bakteriophagen-DNA-, Plasmid-DNA- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren transformiert sind, welche mhp3-codierende Sequenzen enthalten; Hefe (z.B. Saccharomyces, Pichia), die mit rekombinanten Hefeexpressionsvektoren, die das mhp3-Genprodukt codierende Sequenzen enthalten, transformiert ist; Insektenzellsysteme, die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z.B. Baculovirus), die die mhp3-codierenden Sequenzen enthalten, infiziert sind; Pflanzenzellsysteme, die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) infiziert oder mit rekombinanten Plasmidexpressionsvektoren (z.B. Ti-Plasmid) transformiert sind, welche mhp3-codierende Sequenzen enthalten; oder Säugerzellsysteme (z.B. COS, CHO, BHK, 293, 3T3), die rekombinante Expressionskonstrukte beherbergen, welche Promotoren enthalten, die aus dem Genom von Säugerzellen (z.B. Metallothionein-Promotor) oder von Säugerviren (z.B. der Adenovirus-Late-Promotor, der 7,5K-Promotor des Vaccinia-Virus) stammen, ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Expressionssystem ein bakterielles System. Eine Anzahl von Expressionsvektoren kann vorteilhafter Weise abhängig von der beabsichtigten Verwendung für das mhp3-Produkt, das exprimiert wird, ausgewählt werden. Wenn beispielsweise eine große Menge eines solchen Proteins produziert werden soll, zur Erzeugung von pharmazeutischen Zusammensetzungen von mhp3 oder zum Erzeugen von Antikörpern gegen mhp3, können z.B. Vektoren, welche die Expression hoher Level an Fusionsproteinprodukten, die leicht aufgereinigt werden, steuern, wünschenswert sein. Vorzugsweise enthalten die Vektoren Promotoren, die eine induzierbare Genexpression steuern. Geeignete Vektoren schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, den E. coli-Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), in dem die mhp3-codierenden Sequenzen einzeln in den Vektor in einem Leseraster mit den lac Z-codierenden Bereich ligiert sein können, so dass ein Fusionsprotein produziert wird; pIN-Vektoren (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509); pET-Vektoren (Studier und Moffatt, 1986, J. Mol. Biol. 189:113; Rosenberg et al., 1987, Gene 56:125-135; die Vektoren sind erhältlich von Novagen, Madison, Wisconsin), bei denen die mhp3-codierende Sequenz in einem Leseraster an eine Sequenz, die für mehrere (z.B. sechs) Histidinreste codiert, fusioniert sein kann; pBAD-Vektoren (Guzman et al., 1995, J. Bact. 177:4121-4130), bei deren Verwendung Mhp3 unter der Kontrolle eines Arabinose-induzierbaren Proteins exprimiert werden kann. pGEX-Vektoren (Promega Corporation) können ebenfalls verwendet werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine mit Glutathion S-Transferase (GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen sind solche Fusionsproteine löslich und können leicht aus lysierten Zellen durch Adsorption an Glutathion-Agarose-Perlen, gefolgt von Elution in Gegenwart von freiem Glutathion, aufgereinigt werden. Die pGEX-Vektoren sind konstruiert, um Thrombin- oder Faktor Xa-Protease-Spaltungsstellen einzuschließen, so dass das klonierte Zielgenprodukt von der GST-Gruppierung befreit werden kann. Die mhp3-Sequenzen können in einen λ-Expressionsvektor kloniert werden und in λ^–-Bakterienstämmen exprimiert werden. In einer bevorzugten Art der Ausführungsform ist der Bakterienstamm LW14, der einen Temperatursensitiven λ-Repressor enthält, so dass die Proteinexpression von einem λ-Vektor bei 30°C unterdrückt wird, aber bei 42°C aktiv ist. In einer hoch bevorzugten Ausführungsform wird das Protein Mhp3 als Thioredoxin-Fusionsprotein exprimiert, was die Löslichkeit von Proteinen fördert, die normalerweise unlöslich sind. Ein Thioredoxin-Mhp3-Fusionsprotein wird vorzugsweise durch Ligieren einer Mhp3-codierenden Sequenz in den pBAD-Vektor pBAD/Thio-TOPO (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Kalifornien) exprimiert. In einer hoch bevorzugten Art der Ausführungsform wird das Thioredoxin-Mhp3-Fusionsprotein in dem E. coli-Stamm BL21 exprimiert. Andere Vektoren können verwendet werden und sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
Mhp3-ANTIKÖRPER
Gemäß der Erfindung können mhp3-codierte Proteine und ihre Derivate und Analoga als Immunogene verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die immunspezifisch ein solches Immunogen binden.
Verschiedene Vorgehensweisen, die im Stand der Technik bekannt sind, können zur Herstellung polyklonaler Antikörper gegen Mhp3 verwendet werden. Zur Herstellung eines Antikörpers können verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit dem nativen Mhp3-Protein oder einer synthetischen Version oder einem Derivat davon immunisiert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Kaninchen, Mäuse, Ratten etc. Verschiedene Adjuvanzien können verwendet werden, um die immunologische Reaktion, abhängig von der Wirtsspezies zu erhöhen (siehe z.B. jene, die zur Herstellung von Vakzinen eingesetzt werden).
Zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die gegen eine mhp3-codierte Proteinsequenz oder ein Analogon davon gerichtet sind, kann jede Technik, die für die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur sorgt, verwendet werden. Zum Beispiel, die Hybridoma-Technik, ursprünglich entwickelt von Kohler und Milstein (Kohler und Milstein 1975, Nature 256:495-497), sowie die Triom-Technik ("trioma technique"), die humane B-Zell-Hybridoma-Technik (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), und die EBV-Hybridoma-Technik, um humane monoklonale Antikörper zu produzieren (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77-96). In einer zusätzlichen Ausführungsform der Erfindung können monoklonale Antikörper in keimfreien Tieren unter Verwendung neuester Technologie (siehe z.B. PCT/US90/02545) produziert werden. Gemäß der Erfindung können humane Antikörper verwendet werden und sie können erhalten werden, indem humane Hybridome (Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030) verwendet werden oder indem humane B-Zellen mit dem EBV-Virus in vitro (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77-96) transformiert werden. Tatsächlich können gemäß der Erfindung Techniken, die zur Produktion von "chimären Antikörpern" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454) entwickelt wurden, indem die Gene auf einem Maus-Antikörpermolekül, das spezifisch für ein mhp3-codiertes Protein ist, mit Genen aus einem humanen Antikörpermolekül geeigneter biologischer Aktivität zusammengespleißt werden, verwendet werden; solche Antikörper liegen innerhalb des Rahmens dieser Erfindung.
Gemäß der Erfindung können Techniken, die für die Produktion von Einzelketten-Antikörpern (US-Patent Nr. 4,946,778) beschrieben wurden, angepasst werden, um mhp3-Gen-produktspezifische Einzelketten-Antikörper zu produzieren. Eine zusätzliche Ausführungsform der Erfindung setzt die Techniken ein, die für die Konstruktion von Fab'-Expressionsbibliotheken (Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) beschrieben wurden, um eine rasche und leichte Identifizierung monoklonaler Fab-Fragmente mit der gewünschten Spezifität für mhp3-codierte Proteine, Derivate oder Analoga zu ermöglichen.
Antikörperfragmente, die den Idiotyp des Moleküls enthalten, können durch bekannte Techniken erzeugt werden. Zum Beispiel schließen solche Fragmente, sind aber nicht darauf beschränkt, das F(ab')₂-Fragment, das durch Pepsin-Verdau des Antikörpermoleküls produziert werden kann, die Fab'-Fragmente, die durch Reduzieren der Disulfidbrücken des F(ab')₂-Fragments erzeugt werden können, die Fab-Fragmente, die durch Behandeln des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden können, und Fv-Fragmente, ein.
Bei der Produktion von Antikörpern kann das Screening nach dem gewünschten Antikörper durch Techniken, die im Fachgebiet bekannt sind (z.B. Enzym-gekoppelte Immunadsorptionsbestimmung oder ELISA), erreicht werden. Um z.B. Antikörper auszuwählen, die eine spezielle Domäne eines mhp3-codierten Proteins erkennen, kann man erzeugte Hybridome auf ein Produkt hin untersuchen, das ein Mhp3-Fragment, das eine solche Domäne enthält, bindet. Zur Auswahl eines Antikörpers, der spezifisch ein erstes Mhp3-Homologes bindet, der aber nicht spezifisch ein davon verschiedenes Mhp3-Homologes bindet, kann man auf der Basis des positiven Bindens des ersten Mhp3-Homologen und eines Fehlens des Bindens des zweiten Mhp3-Homologen auswählen.
Antikörper, die für eine Domäne eines mhp3-codierten Proteins spezifisch sind, werden ebenfalls bereitgestellt. Antikörper, die spezifisch für ein Epitop eines mhp3-codierten Proteins sind, werden ebenfalls bereitgestellt.
Die vorangehenden Antikörper können in im Fachgebiet bekannten Verfahren bezüglich der Lokalisierung und der Aktivität der mhp3-codierten Proteinsequenzen der Erfindung, z.B. Messen der Level davon, in geeigneten physiologischen Proben, in diagnostischen Verfahren, in der Immuntherapie etc., verwendet werden.
mhp3-KITS
Die Erfindung stellt weiterhin Kits zur Detektion von M. hyopneumoniae bereit. In einer Ausführungsform stellt der Kit Reagenzien zur Detektion zirkulierender Antikörper gegen M. hyopneumoniae-Mhp3-Protein bereit. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Kits eine Aussage, die angibt, dass der Kit zur Diagnose einer M. hyopneumoniae-Infektion verwendbar ist. Als Minimum umfasst der Kit in mindestens einem Behälter ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die SEQ ID NO: 4 umfasst. In einer Art der Ausführungsform umfasst der Kit weiterhin einen Anti-Schweine-Sekundärantikörper. In einer bevorzugten Art der Ausführungsform ist der Sekundärantikörper mit einem Enzym konjugiert, das eine kolorimetrische Reaktion katalysiert, wie alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase. In einer weiteren Art der Ausführungsform umfasst der Kit weiterhin Reagenzien für einen kolorimetrischen Assay.
VAKZINFORMULIERUNGEN UND VERFAHREN ZUR VERABREICHUNG
Da das Mhp3-Protein-Antigen der vorliegenden Erfindung in großen Mengen hergestellt werden kann, findet das so hergestellte und aufgereinigte Antigen Verwendung in Vakzinpräparaten. Das Mhp3-Protein hat auch Anwendbarkeit in Immunassays, z.B. um in einer Probe einer Körperflüssigkeit eines geimpften oder potentiell infizierten Testtiers das Vorhandensein von Antikörpern gegen das Antigen zu detektieren oder zu messen und somit die Immunantwort zu überwachen und/oder eine Infektion des Tiers zu diagnostizieren.
Die Herstellung von Vakzinen, die ein immunogenes Polypeptid als aktiven Inhaltsstoff enthalten, ist den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
BESTIMMUNG DER VAKZIN-WIRKSAMKEIT
Die Immunpotenz des Mhp3-Antigens kann durch Überwachen der Immunantwort bei Testtieren, folgend auf die Immunisierung mit dem Mhp3-Antigen, allein oder in Kombination mit mindestens einem weiteren Polypeptid, oder durch Verwendung jedes im Fachgebiet bekannten Immunoassays bestimmt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das andere Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den P46-, P65-, P97- und P102-Proteinen von M. hyopneumoniae. Die Erzeugung einer humoralen (Antikörper-)Antwort und/oder einer Zell-vermittelten Immunität kann als ein Anzeichen einer Immunantwort genommen werden.
Verfahren zum Einbringen des Vakzins können orale, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, intranasale oder jegliche anderen Standardrouten der Immunisierung einschließen. Die Immunantwort der Testsubjekte kann durch verschiedene Herangehensweisen analysiert werden, wie: die Reaktivität des resultierenden Immunserums gegen das Mhp3-Antigen, wie durch bekannte Techniken bestimmt, z.B. Immunsorptionsbestimmung (ELISA), Immunoblots, Radioimmunpräzipationen etc., oder in dem Fall, wenn das Mhp3-Antigen Antigenität oder Immunogenität aufweist, durch Schutz des immunisierten Wirts vor einer Infektion durch M. hyopneumoniae und/oder Abmilderung von Symptome, die durch eine Infektion durch M. hyopneumoniae in dem immunisierten Wirt bedingt sind.
VAKZINFORMULIERUNGEN
Die Vakzine der Erfindung umfassen rekombinantes Mhp3 und/oder Fragmente, Varianten und Derivate davon. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Vakzine der Erfindung Mhp3 und mindestens ein anderes antigenes M. hyopneumoniae-Polypeptid. Geeignete antigene Polypeptide zur Verwendung in Kombination mit Mhp3 schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die P46-, P65-, P97- und P102-Proteine und/oder Fragmente, Varianten und Derivate dieser Polypeptide. Die Nicht-Mhp3-Polypeptide der Vakzine, wie die P46-, P65-, P97- und P102-Proteine und ihre Fragmente, Varianten und Derivate, können aus M. hyopneumoniae-Kulturen aufgereinigt werden oder rekombinant exprimiert werden.
Geeignete Zubereitungen solcher Vakzine schließen Injektionsmittel ein, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen; feste Formen, die zur Lösung in oder Suspension in Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Die Zubereitung kann auch emulgiert sein. Die aktiven immunogenen Inhaltsstoffe sind häufig mit Adjuvanzien vermischt, die pharmazeutisch annehmbar sind und mit dem aktiven Inhaltsstoff kompatibel sind.
Beispiele wirksamer Adjuvanzien schließen folgendes ein, sind aber nicht darauf beschränkt: Aluminiumhydroxid, N-Acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin.
Die Wirksamkeit eines Adjuvans kann bestimmt werden, indem die Induktion von Antikörpern, die gegen ein immunogenes Polypeptid, das ein Mhp3-Polypeptidepitop enthält, gerichtet sind, gemessen wird, wobei die Antikörper aus der Verabreichung dieses Polypeptids in Vakzinen resultieren, welche auch aus den verschiedenen Adjuvanzien bestehen.
Die Polypeptide können in dem Vakzin als neutrale oder Salzformen formuliert sein. Pharmazeutisch annehmbare Salze schließen die Säureadditionssalze (gebildet mit freien Aminogruppen des Peptids) ein und diese werden mit anorganischen Säuren, wie z.B. Salzsäure oder Phosphorsäure, oder mit organischen Säuren, wie Essig-, Oxal-, Wein-, Maleinsäure und dergleichen, gebildet. Salze, die mit freien Carboxylgruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen, wie z.B. Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisen(III)-hydroxiden und solchen organischen Basen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und dergleichen, stammen.
Viele Verfahren können verwendet werden, um die Vakzinformulierungen der Erfindung einzuführen; diese schließen, ohne Einschränkung darauf, orale, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, subkutane, intranasale Wege und den Weg über Skarifikation (Ritzen durch die oberen Schichten der Haut, z.B. unter Verwendung einer gegabelten Nadel) ein.
Das Subjekt, an das das Vakzin verabreicht wird, ist vorzugsweise ein Tier, am stärksten bevorzugt ein Schwein.
Die Vakzinformulierungen der Erfindung umfassen eine wirksame immunisierende Menge des Mhp3-Proteins und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Vakzinpräparate umfassen eine wirksame immunisierende Menge von einem oder mehreren Antigenen und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Pharmazeutisch annehmbare Träger sind im Fachgebiet gut bekannt und schließen, ohne Einschränkung darauf, Salzlösung, gepufferte Salzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, sterilen isotonischen wässrigen Puffer und Kombinationen davon ein. Ein Beispiel eines solchen annehmbaren Trägers ist ein Kulturmedium im physiologischen Gleichgewicht, das ein oder mehrere stabilisierende/s Mittel, wie stabilisierte, hydrolysierte Proteine, Lactose etc. enthält. Der Träger ist vorzugsweise steril. Die Formulierung sollte zur Art der Verabreichung passen.
In einer speziellen Ausführungsform wird ein lyophilsiertes Mhp3-Polypeptid der Erfindung in einem ersten Behälter bereitgestellt; ein zweiter Behälter umfasst ein Verdünnungsmittel, bestehend aus einer wässrigen Lösung von 50 % Glycerin, 0,25 % Phenol und einem Antiseptikum (z.B. 0,005 % Brilliantgrün).
Die Verwendung aufgereinigter Antigene als Vakzinpräparate kann mittels Standardverfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel sollte/n das/die aufgereinigte Proteine auf eine geeignete Konzentration eingestellt werden, mit einem beliebigen geeigneten Vakzinadjuvans formuliert werden und zur Verwendung verpackt werden. Geeignete Adjuvanzien können folgendes, ohne Einschränkung darauf, einschließen: Mineralgele, z.B. Aluminiumhydroxid; oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin; Glycoside, z.B. Saponin-Derivate, wie Quil A; Pluronic-Polyole ("pluronic polyols"); Polyanionen; nichtionische Blockpolymere, z.B. Pluronic F-127 (BASF, USA); Peptide; Mineralöle bzw. medizinische Öle, z.B. Montanide ISA-50 (Seppic, Paris, Frankreich), Ölemulsionen, z.B. eine Emulsion von Mineralöl, wie BayolF/Arlacel A und Wasser, oder eine Emulsion von Pflanzenöl, Wasser und einem Emulgator, wie Lecithin; Alaun und MDP. Das Immunogen kann auch in Liposomen eingearbeitet sein oder mit Polysacchariden und/oder anderen Polymeren zur Verwendung in einer Vakzin-Formulierung konjugiert sein. In Fällen, in denen das rekombinante Antigen ein Hapten ist, d.h. ein Molekül, das insofern antigen ist, dass es selektiv mit verwandten Antikörpern reagieren kann, aber insofern nicht immunogen ist, dass es keine Immunantwort auslöst, kann das Hapten kovalent an einen Träger oder ein immunogenes Molekül gebunden sein; z.B. wird ein großes Protein, wie Serumalbumin, Immunogenität an das Hapten verleihen, das daran gekoppelt ist. Der Hapten-Träger kann zur Verwendung als Vakzin formuliert sein.
Wirksame Dosen (immunisierende Mengen) der Vakzine der Erfindung können auch aus Dosis-Wirkungs-Kurven, die aus Modelltestsystemen stammen, extrapoliert werden.
Die Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Packung oder einen pharmazeutischen Kit bereit, umfassend einen oder mehrere Behälter, umfassend einen oder mehrere der Inhaltsstoffe der Vakzin-Formulierungen der Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Verfahren zum Immunisieren eines Tiers oder zum Behandeln oder Verhindern oder Vorbeugen verschiedener Krankheiten oder Störungen bei einem Tier bereit, umfassend das Verabreichen einer wirksamen immunisierenden Dosis eines Vakzins der vorliegenden Erfindung an das Tier.
VERWENDUNG VON ANTIKÖRPERN, DIE DURCH DIE VAKZINE DER ERFINDUNG ERZEUGT WURDEN
Die Antikörper, die gegen das Antigen durch Immunisierung mit den Mhp3-Proteinen der vorliegenden Erfindung erzeugt wurden, haben auch potentielle Anwendungen in diagnostischen Immunoassays, der passiven Immuntherapie und der Erzeugung antiidiotypischer Antikörper.
Die erzeugten Antikörper können mittels Standardtechniken, die im Fachgebiet bekannt sind (z.B. Immunoaffinitätschromatographie, Zentrifugation, Präzipition etc.), isoliert werden, und in diagnostischen Immunoassays verwendet werden. Die Antikörper können auch verwendet werden, um die Behandlung und/oder das Fortschreiten der Krankheit zu überwachen. Ein beliebiges Immunoassay-System, das im Fachgebiet bekannt ist, wie jene supra aufgelisteten, kann für diesen Zweck verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, kompetitive und nicht-kompetitive Assay-Systeme unter Verwendung von Techniken, wie Radioimmunoassays, ELISA (Enzym-gekoppelte Immunadosorptionsbestimmungen), "Sandwich"-Immunoassays, Präzipitinreaktionen, Geldiffusionspräzipitinreaktionen ("gel diffusion precipitin reactions"), Immunodiffusionsassays, Agglutinationsassays, Komplement-Bindungsassays, immunoradiometrische Assays, Fluoreszenzimmunoassays, Protein-A-Immunoassays und Immunelektrophorese-Assays, um nur ein paar zu nennen.
Die Vakzinformulierungen der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um Antikörper zur Verwendung in der passiven Immuntherapie zu produzieren, bei der ein kurzzeitiger Schutz eines Wirts durch Verabreichung zuvor gebildeter Antikörper, die gegen einen heterologen Organismus gerichtet sind, erzielt wird.
In Immunisierungsverfahren werden die zu verwendende Menge an Immunogen und der Immunisierungsplan von einem im Fachgebiet spezialisierten Arzt bestimmt werden und hinsichtlich der Immunreaktion und Antikörpertiter des Subjekts verabreicht werden.
VERPACKUNG
Die Zusammensetzungen können, falls gewünscht, in einer Packung oder einer Spendervorrichtung, die eine oder mehrere Einheitsdosierungsform/en, enthaltend den aktiven Inhaltsstoff, enthalten kann, präsentiert werden. Die Packung kann z.B. eine Metall- oder Kunststofffolie umfassen, wie eine Blister-Verpackung. Die Verpackung oder Spendervorrichtung kann von Anweisungen zur Verabreichung begleitet sein. Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Erfindung umfassen, die in einem kompatiblen pharmazeutischen Träger formuliert ist, können auch hergestellt werden, in einem geeigneten Behälter platziert werden und für die Behandlung eines angegebenen Zustands gekennzeichnet werden.
BEISPIELE
Isolierung von chromosomaler DNA von M. hyopneumoniae
Genomische DNA von M. hyopneumoniae wurde mittels des Verfahrens von Dybvig und Alderete (Plasmid, 20:33-41; 1988) isoliert, indem die Zellen durch Zentrifugation (10 min bei 6000 g bei 4°C) geerntet wurden, in Phosphat-gepufferter Salzlösung suspendiert wurden und durch Zugabe von 0,1 Volumina 10%iger Natriumdodecylsulfat-Lösung lysiert wurden. Das Lysat wurde mit einem Gemisch aus Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol (25:24:1), gesättigt mit Tris-HCl, extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit Chloroform extrahiert und die Nucleinsäuren wurden durch die Zugabe von 0,1 Volumina 3 M Natrium acetat und 2 Volumina von eiskaltem Ethanol ausgefällt. Nach Inkubation bei –20°C für 1 Stunde wurden die Nucleinsäuren durch Zentrifugation für 10 Minuten in einer Mikrozentrifuge gewonnen. Die Nucleinsäuren wurden in Wasser, enthaltend 20 μg RNase A/ml resuspendiert, und die Proben wurden bei –20°C gelagert.
Molekulare Klonierung von M. hyopneumoniae-mhp3
Degenerierte Olignonucleotidprimer KWK40, KWK41, KWK42, KWK43, KWK42RC und KWK43RC (SEQ ID NO: 10-15) wurden, basierend auf vorher identifizierten Aminosäureteilsequenzen (SEQ ID NO: 7-9) von Mhp3 (Internationale Patentveröffentlichung WO 96/28472), konstruiert und synthetisiert (Genosys Biotechnologies, Inc.; The Woodlands, TX). Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde mit verschiedenen Kombinationen dieser Primer in einem 50 μl-Reaktionsvolumen durchgeführt, das 1x PCR-Puffer (Perkin Elmer, Foster City, CA), 2,0 mM MgCl₂, 1 μM jedes Primers, 400 μM jedes Desoxy-NTP und 2,5 U AmpliTaq Gold (Perkin Elmer) enthielt. Die Bedingungen für die Vervielfältigung bestanden aus Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten, gefolgt von 25 Zyklen von Denaturierung (94°C, 1 min), Annealing (56°C, 1 min) und Polymerisierung (72°C, 1 min). Unter Verwendung der Primer KWK41 (SEQ ID NO: 11) und KWK42RC (SEQ ID NO: 14) wurde ein Fragment mit einer Länge von näherungsweise 250 bp unter Verwendung von 410 ng chromosomaler DNA (Passage n=5) des M. hyopneumoniae-Stamms 232 vervielfältigt. Das Fragment wurde in die TA-Klonierungsstelle von pCR2.1-TOPO (Invitrogen; Carlsbad, CA) subkloniert; das ligierte Produkt wurde in E. coli-TOP10-Zellen (Invitrogen) transformiert. Die Klonierung wurde durch Sequenzierung mittels Didesoxynucleotidkettenabbruch (Advanced Genetic Analysis Center, St. Paul, MN) und Restriktionsendonuclease-Verdau, gefolgt von Agarose-Gelelektrophorese, bestätigt.
Inverse PCR, ein Verfahren, das verwendet wird, um die Sequenzen zu vervielfältigen, die einen DNA-Kernbereich flankieren (H. Ochman, M.M. Medhora, D. Garza und D.L. Hartl, 1990. In "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, San Diego, CA), wurde verwendet, um die verbleibenden 5'- und 3'-Enden des Gens, das Mhp3 codiert, zu klonieren. Pools von chromosomalen DNA-Fragmenten des M. hyopneumoniae-Stamms 232 (Passage n=5) wurden erzeugt, indem ungeschnittene DNA einfach mit den folgenden Restriktionsendonucleasen verdaut wurde: AluI, BamHI, EcoRV, EcoRI, HaeIII, HincII, HindIII, NdeI, PvuII, Sau3AI, SpeI, SspI, XbaI. Folgend auf den Verdau wurden die Fragmente durch Ligation zirkularisiert und einer PCR unter Verwendung der Oligonucleotidprimer RAC3 (SEQ ID NO: 16) und RAC4 (SEQ ID NO: 17), die basierend auf der Sequenz des oben beschriebenen 250 bp-Fragments konstruiert wurden, unterworfen. Die Vervielfältigung mit diesen Primern wurde wie folgt durchgeführt: Denaturierung bei 94°C für 2 min, gefolgt von 40 Zyklen von Denaturierung (94°C, 1 min), Annealing (55°C, 1 min) und Polymerisierung (72°C, 2 min). Der Pool aus SspI-verdauter chromosomaler DNA ergab ein Fragment mit näherungsweise 600 bp, was in pCR2.1-TOPO subkloniert wurde. Die Sequenzanalyse des klonierten Fragments identifizierte das 5'-Ende des Gens. Die Oligonucleotide RAC7 (SEQ ID NO: 18) und RAC8 (SEQ ID NO: 19) wurden basierend auf dieser Sequenz konstruiert, um weiterhin die Sequenz, die dem 3'-Ende von mhp3 entspricht, zu erhalten. Die Bedingungen für die Vervielfältigung mit diesen Primern bestanden aus Denaturierung bei 94°C für 9 min, gefolgt von 40 Zyklen von Denaturierung (94°C, 30 s), Annealing (50°C, 30 s) und Polymerisierung (72°C, 1 min). Wenn der Pool aus SpeI-verdauter DNA als Matrize verwendet wurde, wurden mehrere Produkte (250 bp bis >1 kb) vervielfältigt; das Gemisch aus Fragmenten wurde in pCR2.1-TOPO kloniert. Die Sequenzanalyse des größten klonierten Fragments (~ 1,2 kb) stellte zusätzliche 3'-Sequenzdaten bereit. Aus diesen Daten wurden die Oligonucleotide RAC12 (SEQ ID NO: 20) und RAC15 (SEQ ID NO: 23) konstruiert und synthetisiert, um für eine PCR-Vervielfältigung unter Verwendung des Pools aus HindIII-verdauter DNA als Matrize verwendet zu werden. Die Parameter bestanden aus Denaturierung bei 94°C für 9 min, gefolgt von 40 Zyklen von Denaturierung (94°C, 30 s), Annealing (55°C, 30 s) und Polymerisierung (72°C, 2 min), plus einem endgültigen Polymerisierungsschritt bei 72°C für 7 min. Ein Fragment mit einer Länge von näherungsweise 600 bp wurde vervielfältig, in pCR2.1-TOPO kloniert und sequenziert. Die erhaltenen Daten stellten eine zusätzliche 3'-Sequenz innerhalb des Gens, codierend Mhp3, bereit. Eine weitere PCR-Vervielfältigung mit RAC12 (SEQ ID NO: 20) und RAC15 (SEQ ID NO: 23) wurde unter Verwendung des Pools aus HincII-verdauter DNA als Matrize durchgeführt. Die Bedingungen für die Vervielfältigung waren Denaturierung bei 94°C für 9 min, gefolgt von 35 Zyklen von Denaturierung (94°C, 1 min), Annealing (55°C, 1 min) und Polymerisierung (72°C, 3 min), plus einem endgültigen Polymerisierungsschritt (72°C, 7 min). Ein Fragment mit näherungsweise 700 bp wurde vervielfältigt und in pCR2.1-TOPO kloniert. Die Sequenzierung des klonierten Fragments erzeugte neue 3'-Sequenzdaten, einschließlich derjenigen, die für den Carboxyl-Terminus des Polypeptids codieren.
Die Ergebnisse aus der oben beschriebenen vorläufigen Sequenzierung wurden verwendet, um Oligonucleotidprimer für die spezifische Vervielfältigung des mhp3-Gens direkt aus chromosomaler DNA des M. hyopneumoniae-Stamms 232 aus einer niedrigen Passage (n=4) zu konstruieren. Diese Produkte wurden in einem Versuch, die Einführung von Sequenzartifakten aufgrund von möglichen Mutationen, die während der PCR-Vervielfältigung und den nachfolgenden Klonierungsschritten entstehen können, zu vermeiden, direkt sequenziert.
Synthetische Oligonucleotide, die das mhp3-Gen flankieren, wurden verwendet, um spezifisch das offene Leseraster (ORF) aus chromosomaler DNA zu vervielfältigen. PCR-Vervielfältigungen wurden dreifach durchgeführt und enthielten 1 μM jedes der Primer Mhp3-U1 (SEQ ID NO: 31) und Mhp3-D (SEQ ID NO: 33), 360 ng gereinigte chromosomale DNA, 1x PC2-Puffer (Ab Peptides, Inc., St. Louis, MO), 200 μM jedes dNTP, 7,5 U KlenTaq 1 (Ab Peptides, Inc.) und 0,15 U klonierte thermostabile Pfu-Polymerase (Stratagene, La Jolla, CA) in einem endgültigen Probenvolumen von 50 μl. Die Bedingungen für die Vervielfältigung bestanden aus Denaturierung bei 94°C für 5 min, gefolgt von 25 Zyklen von Denaturierung (94°C, 30 s), Annealing (55°C, 30 s) und Polymerisierung (72°C, 3 min, 45 s), plus einer endgültigen Verlängerung bei 72°C für 7 min. Folgend auf die Vervielfältigung wurden die Dreifachprobe vereinigt und das spezielle Produkt wurde mittels Extraktion mit Spin-Chromatographie ("spin chromatography") (QIAquick^TM PCR-Reinigungskit, Qiagen, Santa Clarita, CA) gereinigt. Das vereinigte Gemisch wurde dann einer direkten Sequenzanalyse unter Verwendung von DyeDeoxy-Abbruchreaktionen ("DyeDeoxy termination reactions") auf einem automatisierten ABI-DNA-Sequenziergerät (Lark Technologies Inc., Houston, TX) unterzogen.
Synthetische Oligonucleotidprimer (SEQ ID NO: 16-28, 31 und 33) wurden verwendet, um beide DNA-Stränge der vervielfältigten Produkte aus dem M. hyopneumoniae-Stamm 232 zu sequenzieren. Die Nucleotidsequenz des mhp3-Gens und das abgeleitete Mhp3-Protein, das innerhalb dieses Bereichs codiert ist, sind in SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 2 dargestellt.
Das mhp3-ORF erstreckt sich von den Nucleotiden 97-1452 von SEQ ID NO: 1 und codiert für ein Protein mit 451 Aminosäuren (SEQ ID NO: 2) mit einem theoretischen Molekulargewicht von 49.775 Dalton. Das codierte Polypeptid würde acht Tryptophan-Reste enthalten, von denen 7 durch das TGA-Codon (UGA in mRNA) codiert sind, von dem bekannt ist, dass es die Addition dieser Aminosäure in vielen Mycoplasma spp. festlegt (K. Dybvig, 1990. Ann. Rev. Microbiol. 44:81-104; F. Yamao, A. Muto, Y. Kawauchi, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2306-2309). Der Amino-Terminus des codierten Proteins scheint Eigenschaften zu haben, die charakteristisch für eine prokaryotische Signalsequenz sind (G. von Heijne, 1985, J. Mol. Biol. 184: 99-105; H. Nielsen, J. Engelbrecht, S. Brunak und G. von Heijne, 1997. Protein Engineering, 10: 1-6), obwohl die genaue Spaltstelle gegenwärtig nicht bekannt ist. Von dem Cysteinrest in Position 29 des codierten Proteins (SEQ ID NO: 2) wird angenommen, dass er, folgend auf die Prozessierung, durch Addition einer Sulfhydryl-verknüpften Fettsäure modifiziert wird, um aus Mhp3 ein Lipoprotein zu machen (S. Razin, D. Yogev und Y. Naot, 1998. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:1094-1156).
Als das mhp3-ORF gegen bestehende Nucleotid- und Proteindatenbanken unter Verwendung des Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)-Programms (S.F. Altschul, W. Gish, W. Miller, E.W. Myers, D.J. Lipman, 1990. J. Mol. Biol. 215:403-410) abgeglichen wurde, war der Eintrag, mit dem es die größte Homologie teilte, das Ag 234-5-Protein von M. arginini (GenBank Zugangs-Nr. D16674). Als diese zwei Polypeptide unter Verwendung von CLUSTAL W (J.D. Thompson, D.G. Higgins und T.J. Gibson, 1994, Nucl. Acids Res., 22:4673-4680) vergleichend angeordnet wurden, gab es eine 36,2 %ige Aminosäureidentität zwischen den Mhp3- und den Ag 234-5-Proteinen (1). Obwohl für das Ag 234-5-codierende Gen ursprünglich als in M. arginini (S. Ushio, K. Iwaki, M. Taniai, T. Ohta, S. Fukuda, K. Sugimura und M. Kurimoto, 1995. Microbiol. Immunol. 39:395-400) vorhanden identifiziert wurde, offenbarten neuere Beweise, dass dieses Gen tatsächlich aus M. hyorhinis (M. Droesse, K.S. Wise, 1998. Abstract E20, 12^th International Organisation of Mycoplasmology Conference, Sydney, AU) stammte. In diesen Studien wurde geschlossen, das Ag 234-5 unter anderen Mycoplasmen, einschließlich M. hyopneumoniae, nicht konserviert war, wie durch PCR, Southern-Blot-Hybridisierung und Western-Blot-Analyse bestimmt.
Unter Verwendung des STEMLOOP-Programms der Genetics Computer Group der Universität von Wisconsin (J. Devereux, P. Haeberli und O. Smithies, 1984, Nuc. Acids Res. 12:387-395) wurde eine Sequenz stromabwärts des mhp3-ORF identifiziert, speziell die Nucleotide 1519-1550 von SEQ ID NO: 1, die möglicherweise eine Stammschleifenstruktur bilden könnte(n). Der Stamm könnte durch invertierte Wiederholungen aus 14 Basen, getrennt durch eine 4-Basen-Schleife, gebildet werden. Das tatsächliche Vorhandensein und die mögliche Funktion dieser Struktur ist gegenwärtig unbekannt.
Ein zusätzliches ORF wird ebenfalls durch das DNA-Fragment, dargestellt in SEQ ID NO: 5, codiert. Dieses ORF ist auf dem entgegengesetzten Strang des mhp3-Gens vorhanden und erstreckt sich von Nucleotid 602 bis Nucleotid 1 von SEQ ID NO: 1. Dieses vorhergesagte ORF codiert für ein Protein von mindestens 200 Aminosäuren, bezeichnet als "ORF1" und dargestellt als SEQ ID NO. 6, das ein theoretisches Molekulargewicht von 22.528 Dalton hat. Die Tatsache, dass sich das ORF durch das Ende des DNA-Fragments (SEQ ID NO: 1) hindurch fortsetzt und offen bleibt, legt nahe, dass die tatsächliche Masse des codierten Polypeptids wahrscheinlich größer als 22.528 Dalton ist. Obwohl Mhp3 und "ORF1" auf entgegengesetzten Strängen codiert sind, ist ihnen die dritte Base jedes Codons (die "Wobble"-Position) gemeinsam. Somit teilen sich die entgegengesetzten Stränge, von denen einer für eine bestimmte Aminosäure in dem Mhp3-Gen codiert, die Wobble-Base bei jedem bestimmten Aminosäurecodon in "ORF1". Diese einzigartige Anordnung gemeinsamer codierender Sequenzen für zwei Proteine sollte theoretisch den Einfluss der genetischen Drift auf die Wobble-Positionen des Codons für Mhp3 und "ORF1" minimieren und die Konservierung der beiden codierten Proteine maximieren.
Herstellung von Plasmid- und Hinterlegungsmaterialien
Das mhp3-Genfragment wurde zur Hinterlegung bei der American Type Culture Collection (ATCC) hergestellt. Das vereinigte Gemisch, resultierend aus Dreifach-PCR-Reaktionen unter Einsatz der spezifischen 5'- und 3'-Primer Mhp3-U1 (SEQ ID NO: 31) und Mhp3-D (SEQ ID NO: 33), wie supra beschrieben, wurde durch Extraktion mit Spin-Chromatographie (QIAquick^TM) isoliert und in die TA-Klonierungsstelle von pCR2.1-TOPO insertiert. Einselsequenzverlängerungsreaktionen unter Verwendung Vektor-spezifischer Sequenzierungsprimer bestätigten die Endpunkte des vervielfältigten 1.692-Basenpaarfragments und offenbarten, dass sich das Mhp3-codierende Gen in entgegengesetzter Orientierung bezüglich des Lactose-Promotors befand. Dieses Plasmidkonstrukt wurde als pER427 bezeichnet und in E. coli TOP10-Zellen (Invitrogen, Carlsbad, CA) eingeführt. Der resultierende Stamm wurde als Pz427 bezeichnet.
Ortsspezifische Mutagenese des mhp3-Gens
Die Herstellung von Mhp3-codierender DNA zur Expression in E. coli erforderte das Modifizieren des mhp3-Gens von M. hyopneumoniae durch Entfernen der Sequenz, die für den/die angenommenen Leader(sequenz) und die Fettsäurebindungsstelle, Cystein 29, codiert, und die Umwandlung der 6 TGA-Codons in TGG-Codons. Die Oligonucleotidprimer, die zur Vervielfältigung des Gens verwendet wurden, dem die Sequenz fehlte, die für das Signalpeptid codiert, wurden als RAC 23 (SEQ ID NO: 29) und RAC 24 (SEQ ID NO: 30) bezeichnet. Die Bedingungen für die Vervielfältigung dieses Fragments aus der chromosomalen DNA des M. hyopneumoniae-Stamms 232 (Passage n=5) waren Denaturierung bei 94°C für 9 min, gefolgt von 25 Zyklen von Denaturierung (94°C, 1 min), Annealing (50°C, 1 min) und Polymerisierung (72°C, 2 min), plus einem endgültigen Polymerisierungsschritt (72°C, 7 min). Das vervielfältigte Fragment wurde in pCR2.1-TOPO kloniert. Die Bestätigung der Klonierung wurde mittels Sequenzierung und Restriktionsendonuclease-Verdau, gefolgt von Gelelektrophorese, durchgeführt. Die Sequenz am 5'-Ende des klonierten Fragments codiert für den Anfangsmethioninrest, dann für einen Tryptophanrest, welcher die Aminosäure ist, die auf den Cysteinrest an Position 29 des codierten Polypeptids (siehe SEQ ID NO: 2) folgt. Am 3'-Ende wurden Basenänderungen in die Wildtyp-Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) eingeführt, die eine Restriktionsschnittstelle für Klonierungszwecke schufen. Dies resultiert darin, dass die 2 carboxyterminalen Aminosäuren des Wildtyp-Polypeptids, Lys-Asn (SEQ ID NO: 2), durch die Sequenz Asn-Leu (siehe die Reste 422-423 in SEQ ID NO: 4) ersetzt wurden. Ein zusätzliches T-Nucleotid war im RAC 24-Primer (SEQ ID NO: 30), verglichen mit dem Wildtyp-Gen, vorhanden, war aber nicht im PCR-Produkt vorhanden. Die Oligonucleotide RAC 23 (SEQ ID NO: 29) und RAC 24 (SEQ ID NO: 30) enthielten die synthetischen Restriktionsschnittstellen NdeI bzw. XbaI nahe ihren 5'-Enden, um die Klonierung der Gene in verschiedene Plasmide zu erleichtern bzw. zu ermöglichen. Zusätzliche Nucleotide (6 für RAC 23 (SEQ ID NO: 29), 7 für RAC 24 (SEQ ID NO: 30)) wurden ebenfalls an das 5'-Ende jedes Primers hinzugefügt, um das Schneiden durch die entsprechenden Restriktionsenzyme zu erleichtern bzw. zu ermöglichen.
Sobald die Sequenz, die für das Signalpeptid codiert, entfernt war, verblieben sechs interne TGA-Codons in dem Gen. Um die Expression des Polypeptids in voller Länge in E. coli zu ermöglichen, wurden diese in TGG-Codons durch Oligonucleotid-spezifische ("oligonucleotide-directed") in vitro-Mutagenese umgewandelt. Das Plasmid pCR2.1-TOPO:mhp3 wurde in den E. coli-Stamm CJ236 (dut^– ung^–) transformiert. Die Zugabe des Helferphagen R408 zu den Zellen, die das Plasmid enthielten, führte zur Produktion von Phagenpartikeln mit Uracil-enthaltender einzelsträngiger ("single-stranded") (ss) DNA. Diese Partikel wurden isoliert und die ssDNA wurde durch Extraktion und Präzipitation gereinigt. Die Mutagenese wurde unter Verwendung dieser DNA als Matrize, der Oligonucleotide Mhp3-2M, Mhp3-3M, Mhp3-4M, Mhp3-5M, Mhp3-6M, Mhp3-7M (SEQ ID NO: 35-40) und von Reagenzien des MutaGene-Systems (BioRad Laboratories, Hercules, CA) durchgeführt. Die ssDNA, die Oligonucleotide und der Annealing-Puffer wurden gemischt auf 70°C erwärmt, dann über eine Dauer von 1 h auf 30°C abkühlen gelassen. Die Synthese des Komplementärstranges wurde durch Hinzufügen von T4-DNA-Ligase, T7-DNA-Polymerase und Synthesepuffer durchgeführt. Das Gemisch wurde 5 min lang auf Eis inkubiert, dann 5 min lang bei Raumtemperatur, gefolgt von 30 min bei 37°C. Die resultierenden doppelsträngigen DNA-Moleküle wurden in DH5α U1traComp-Zellen (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) transformiert. Die Klone wurden vermehrt und durch Sequenzierung auf die gewünschten Mutationen hin durchmustert. Alle Mutationen (TGA>TGG) wurden auf diese Weise bestätigt. Zusätzlich trat unbeabsichtigter Weise eine A>G-Transition bei Nucleotid 388 des Wildtyp-Gens (SEQ ID NO: 1) aufgrund der Sequenz des Oligonucleotids Mhp3-2M (SEQ ID NO: 35) auf. Dies resultierte in der Änderung des codierten Restes von Serin (AGT) bei dem Aminosäurerest 98 des Wildtyp-Mhp3 (SEQ ID NO: 2) zu Glycin (GGT) bei Aminosäurerest 70 des rekombinanten Mhp3 (SEQ ID NO: 4).
Das rekombinante mhp3-Gen (mit oder ohne die supra beschriebene unbeabsichtigte A>G-Transition), das aus den obigen Veränderungen resultierte, ist in SEQ ID NO: 3 abgebildet und das offene Leseraster, codiert durch das rekombinante mhp3-Gen (mit Glycin bei Aminosäurerest 70), ist in SEQ ID NO: 4 abgebildet.
Klonierung des rekombinanten mhp3-Gens in einen Expressionsvektor und einen Expressionswirtsstamm
Zum Zweck der rekombinanten Proteinexpression wurde das mutierte mhp3-Gen, dem die Sequenz fehlte, die für das Signalpeptid codiert (SEQ ID NO: 3) in das pBAD/Thio-TOPO-Expressionsplasmid (Invitrogen) kloniert; dieses Konstrukt wurde direkt in den Expressionswirt E. coli BL21 transformiert. Ein Klon, der das geeignete Plasmid enthielt, wurde identifiziert.
Expression des rekombinanten Mhp3-Proteins
Eine gefrorene Arbeitsstammkultur der E. coli BL21-Transformante, die das Thioredoxin-Mhp3-Fusionsprotein exprimiert, wurde aufgetaut und in einer 1:5000-Verdünnung in ein definiertes Medium, RWLDM/D vi, überimpft, welches das Folgende enthält: K₂HPO₄ (6 g/l), KH₂PO₄ (3 g/l), (NH₄)₂SO₄ (5 g/l), NaCl (2 g/l), 0,2 ml CaCl₂ (15 g/l), 0,4 ml FeCl₃·6H₂O (5 g/l), 0,4 ml MgSO₄·7H₂O (480 g/l), ZnCl₂ (6,5 g/l), MnSO₄·H₂O (12 g/l), Na₂MoO₄·2H₂O (5 g/l), CuSO₄ (1,5 g/l), CoCl₂·6H₂O (2 g/l), H₃BO₃ (0,5 g/l) und 37 % HCl (5 ml/l). Carbenicillin wurde ebenfalls in einer Konzentration von 125 μg/ml hinzugefügt. Die Kultur wurde unter fed-batch-Bedingungen (50 % Dextrose) in einen BioFlow 3000-Fermentor (New Brunswick Scientific, Edinson, NJ) mit 5 Liter Arbeitsvolumen bei 37°C wachsen gelassen, bis A₆₂₅ 10-20 war.
Feuchte Zellen der E. coli BL21-Transformante, die das rekombinante Thioredoxin-Mhp3 exprimiert, wurden durch Zentrifugation aus der 5 Liter-Fermentation geerntet und in Phosphat-gepufferter Salzlösung resuspendiert. Die Zellen wurden mechanisch lysiert. Folgend auf eine Zentrifugation wurde das Pellet verworfen. Der Überstand wurde über eine Ionenaustauscher-Säule gelassen und unter Verwendung eines NaCl-Gradienten eluiert. Fraktionen, die das Fusionsprotein enthielten, wurden vereinigt, dialysiert, um das NaCl zu entfernen und unter Verwendung eines 0,2 μm-Filters steril filtriert. Diese Zubereitung wird für die Impfungsuntersuchungen verwendet.
Immunologische Charakterisierung des rekombinanten Mhp3
Die Proteinkonzentration des rekombinanten Thioredoxin-Mhp3, das wie oben hergestellt wurde, wurde unter Verwendung eines BCA Protein Assay-Kits (Pierce) bestimmt. Kurz gesagt, wurde jede Probe 1/10, 1/20, 1/40 und 1/80 in sterilem, deionisiertem, destilliertem Wasser (ddH₂O) verdünnt. BSA (Proteinstandard) wurde auf Konzentrationen, die von 200 bis 800 μg/ml reichten, verdünnt. Ein Volumen von 20 μl der Probe oder des Standards wurde 3-fach in Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben und 200 μl Reagens B, das 1/50 in Reagens A verdünnt war, wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Platte wurde bei 37°C 30 min lang inkubiert. Die Probenabsorption wurde bei 560 nm bestimmt. Die Proteinkonzentration für jede Probe wurde durch Extrapolation unter Verwendung der BSA-Standardkurve berechnet.
Aliquots von rekombinantem Mhp3 (Proteineinsatzmenge war variabel) und Lysate ganzer Bakterienzellen von M. hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis und Mycoplasma mycoides Subspezies mycoides wurden in einem Endvolumen von 10 μl resuspendiert und 10 μl 2x reduzierender Probenpuffer (Ow1 Scientific) wurden hinzugefügt. Die Proben wurden 10 min lang bei 100°C erhitzt, und das gesamte Volumen wurde in getrennte Vertiefungen eines 1,5 mm dicken 10-Well-10% Tris-Glycin-Gels (Novex) aufgegeben. Ungefärbte Molekulargewichtsmarker mit großem Bereich (broad-range molecular weight markers) (Novex) wurden ebenfalls eingeschlossen.
Proteine, die durch SDS-PAGE getrennt worden waren, wurden auf eine PVDF-Membran (Ow1 Scientific) bei einem konstanten Strom von 100 mA für 1 h übertragen. Der Blot wurde in Blockierungspuffer, bestehend aus 5 % Magermilchpulver und 0,5 % Tween 20 in TBS (TBST), 1 h lang bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Schütteln inkubiert. Der Blockierungspuffer wurde entfernt und die Membran wurde 1 mal 5 min lang mit TBST gewaschen. Der Primärantikörper wurde folgend auf eine experimentelle Provokation mit dem M. hyopneumoniae-Stamm 232 aus einem Schwein erhalten. Verdünntes Serum wurde zu der Membran hinzugefügt, gefolgt von einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur. Mit alkalischem Phosphatase-konjugierter Protein G-Antikörper (Pierce) wurde verdünnt, zu der gewaschenen Membran hinzugefügt und 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membran wurde mit TBST gewaschen, und das Substrat BCIP/NBT (Kirkegaard and Perry Laboratories) wurde zu der Membran hinzugefügt und es wurde inkubiert, bis sich eine geeignete Farbreaktion entwickelte. Die Membran wurde dann mit Wasser gewaschen, um die Reaktion zu stoppen, und bei Raumtemperatur getrocknet.
Serum aus dem experimentell mit M. hyopneumoniae provozierten Schwein erkannte das gereinigte rekombinant exprimierte Mhp3 (2), weil eine Bande von 60 kDa identifiziert wurde. Dies legt nahe, dass das rekombinante Protein Epitope exprimierte, die durch Antikörper erkannt wurden, welche als Antwort auf das Aussetzen des Schweins gegenüber Ganzzell-Organismen von M. hyopneumoniae erzeugt wurden.
Tierstudie, um die Wirksamkeit von rekombinantem Mhp3 als einen Vakzin-Kandidaten zu testen
Gesunde durch Kreuzung erzeugte Schweine (näherungsweise im Alter von 12 bis 16 Tagen) ohne Vorgeschichte von vorheriger Impfung gegen M. hyopneumoniae oder durch M. hyopneumoniae verursachte Krankheit werden erhalten. Die Tiere werden statistisch bzw. zufällig durch den Wurf in Gruppen eingeordnet. Den Schweinen wird ermöglicht, sich für ein Minimum von fünf Tagen vor Beginn der Studie zu akklimatisieren.
Die Tiere werden mit 1 ml des geeigneten experimentellen Vakzins auf intramuskulärem Weg (i.m.; linker Nackenmuskel) am Tag "0" geimpft, wenn die Schweine näherungsweise im Alter von 19 bis 23 Tagen sind. Bei näherungsweise 2 bis 3 Wochen, folgend auf die erste Impfung, erhalten die Schweine eine zweite 1 ml-Dosis des geeigneten experimentellen Vakzins (i.m.; rechter Nackenmuskel). Alle Schweine werden genau (für bis zu 1 Stunde oder soweit berechtigt) auf jegliche post-vakzinale Zeichen, wie Erbrechen, Depression, Diarrhö, Ataxie-Inkoordination, erhöhte Atmung oder Zittern, hin beobachtet.
Bei näherungsweise 2 bis 4 Wochen, folgend auf die zweite Impfung, werden die Schweine intranasal mit 1 ml/Nasenloch ("nare") einer lebenden virulenten Lungenhomogenatkultur des M. hyopneumoniae-Stamms 232, enthaltend näherungsweise 5,0 × 10⁸ farbändernde Einheiten ("color changing units")/ml (CCU/ml), provoziert.
Alle provozierten Tiere werden bei näherungsweise 4 Wochen, folgend auf die Provokation, einer Nekropsie unterzogen. Die Lungen werden entfernt und grob hinsichtlich charakteristischer Läsionen beurteilt, die einer M. hyopneumoniae-Infektion zuzuschreiben sind. Individuelle Lungenläsionsanzahlen werden durch Bildanalyse bestimmt werden. Eine Schrägschnitt-Probe ("bias sample") von Lungengewebe kann von jedem provozierten Tier für Bakterienisolierung (CCU/g Gewebe), Histopathologie und IFA erhalten werden.
Hinterlegung von Mikroorganismen
Der folgende Mikroorganismus-Stamm wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA, am 09. September 1999 hinterlegt und erhielt die unten angegebene Zugangsnummer. Der Deponent war Pfizer Inc., dessen registrierte Adresse 235 East 42nd Street, New York, New York 10017, Vereinigte Staaten, ist.

Mikroorganismus Zugangsnummer

Pz427 PTA-634
Die vorliegende Erfindung soll in ihrem Rahmen nicht durch die hierin beschriebenen speziellen Ausführungsformen eingeschränkt werden. Tatsächlich werden verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu jenen hierin beschriebenen für Fachleute auf dem Gebiet aus der vorangehenden Beschreibung und der begleitenden Zeichnung offensichtlich werden. Es ist beabsichtigt, dass solche Modifikationen in den Rahmen der beigefügten Ansprüche fallen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Protein mit einer Aminosäuresequenz, die SEQ ID NO:4 umfasst, wobei das Protein kein mit einer Fettsäure acyliertes Cystein hat, dem die Aminosäuresequenz Trp Asp Lys Glu folgt, und kein C-terminales Homoserin-Lacton hat.
Protein nach Anspruch 1, das ein isoliertes Protein ist.
Protein nach Anspruch 1, das ein Fusionsprotein ist.
Protein nach Anspruch 3, in dem das Fusionsprotein ein Thioredoxin-Fusionsprotein ist.
Zusammensetzung, umfassend das Protein nach einem der Ansprüche 1-4 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, die weiterhin ein Adjuvans umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6, weiterhin umfassend wenigstens ein Polypeptid, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Mycoplasma hyopneumoniae P46, P65, P97 und P102.
Immunogenes Protein mit einer Aminsäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO:4 dargestellt ist, wobei das immunogene Protein kein mit einer Fettsäure acyliertes Cystein hat, dem die Aminosäuresequenz Trp Asp Lys Glu folgt, und kein C-terminales Homoserin-Lacton hat.
Verwendung eines Proteins, wie es in einem der Ansprüche 1-4 definiert ist, bei der Herstellung einer Vaccinformulierung zur Behandlung oder Verhütung einer Erkrankung oder Stö rung bei einem Tier, die durch Infektion mit Mycoplasma hyopneumoniae verursacht wird.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Tier ein Schwein ist.
DNA, die im universellen genetischen Code für ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die SEQ ID NO:4 umfasst, codiert, oder ihr Komplement.
DNA nach Anspruch 11 in funktioneller Verknüpfung mit einem heterologen Promotor.
DNA nach Anspruch 12, die weiterhin einen in einer prokaryotischen Zelle wirksamen Replikationsstartpunkt umfasst.
DNA nach Anspruch 12, die weiterhin einen in einer eukaryotischen Zelle wirksamen Replikationsstartpunkt umfasst.
Wirtszelle, umfassend die isolierte DNA nach Anspruch 12.
Wirtszelle nach Anspruch 15, wobei die Zelle E. coli BL21 ist und die DNA der Expressionsvektor pBAD/Thio-TOPO ist.
Verfahren zur Produktion des in Anspruch 1 beanspruchten Proteins, wobei das Verfahren umfasst: (i) Wachstum der Zellen nach Anspruch 15 und 16 unter Bedingungen, unter denen das Protein exprimiert wird und (ii) Gewinnung des Proteins.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Protein in einer löslichen Form gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Protein in einer unlöslichen Form gewonnen wird.
Verwendung der DNA nach Anspruch 11 bei der Herstellung einer Vaccinformulierung zur Behandlung oder Verhütung einer Erkrankung oder Störung bei einem Tier, die durch Infektion mit Mycoplasma hyopneumoniae verursacht wird.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Tier ein Schwein ist.
Kit, der zur Diagnose von M. hyopneumoniae-Infektion geeignet ist, der in wenigstens einem Behälter ein Protein mit einer Aminosäuresequenz umfasst, umfassend ein Protein wie es in Anspruch 1 definiert ist.
Kit nach Anspruch 22, der weiterhin einen Anti-Schwein-Sekundärantikörper umfasst.
Kit nach Anspruch 23, bei dem der Sekundärantikörper mit einem Enzym konjugiert ist, das eine colorimetrische Reaktion katalysiert.
Kit nach Anspruch 24, wobei das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus alkalischer Phosphatase und Meerrettich-Peroxidase.
Kit nach Anspruch 24, der weiterhin Reagenzien für einen colorimetrischen Assay umfasst.