CN108101969A

CN108101969A - 一种与猪支原体肺炎相关的抗原及其应用

Info

Publication number: CN108101969A
Application number: CN201711125981.2A
Authority: CN
Inventors: 朱燕锋; 卢业云; 杨德明
Original assignee: Nanjing Dayao Network Technology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Dayao Network Technology Co Ltd
Priority date: 2017-11-13
Filing date: 2017-11-13
Publication date: 2018-06-01

Abstract

一种与猪支原体肺炎相关的抗原及其应用，该猪肺炎支原体脂质体微颗粒疫苗是由大肠杆菌表达猪肺炎支原体脂蛋白、特异性膜蛋白，并解析猪肺炎支原体细胞膜成分结构，通过脂质体化学合成具有的生物膜双分子层形成的微颗粒将猪肺炎支原体所含抗原的主要组分脂蛋白、特异性膜蛋白抗原进行包含。该猪肺炎支原体脂质体微颗粒疫苗在脂质体的作用下，能将包含的抗原高效、靶向地载给抗原递呈细胞，能同时刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，具有广谱性和持久性，并且具有治疗作用，在脂质体的作用下具有缓慢释放抗原的效能，且可被机体降解无毒副作用。该疫苗有利于大规模生产。

Description

一种与猪支原体肺炎相关的抗原及其应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，涉及一种与猪支原体肺炎相关的抗原及其应用。

背景技术

猪支原体肺炎又称猪气喘病，是由猪肺炎支原体引起的一种接触性慢性呼吸道传染病，广泛存在于世界各地。猪只感染后除导致饲料转化率降低、生长发育不良外，且易继发病毒或细菌感染，造成猪死亡率升高，导致经济损失惨重。疫苗免疫是预防本病最重要的手段。

猪肺炎支原体要在呼吸道上皮细胞定植、增殖并造成肺部损伤，必须克服粘液纤毛系统的清除作用，穿过糖基化粘蛋白层，克服宿主胞外成分对猪肺炎支原体定植的阻断逃避宿主适应性免疫应答，牢固地粘附在呼吸器官的纤毛上，细胞膜成为了其致病性的关键。

脂质体(liposome)是单层或多层脂质双分子膜以同心圆的形式包封而成,类似细胞膜的微球体。其主要成分为磷脂和胆固醇。20世纪70年代初用脂质体作为药物载体包埋淀粉葡萄糖苷酶治疗糖原沉积病首次获得成功。脂质体是主要由作为细胞膜的组分的两亲性磷脂(phospholipid)形成的脂质双层(lipid‐bilayer)囊泡(vesicle)。亲水性物质可以被包封在脂质体的内部水性隔室(aqueous compartment)中，或者疏水性物质可以被装载在脂质双层中。脂质体的层结构与细胞膜的结构相似，因此脂质体具有低的毒性，并且其可以通过与细胞融合或通过内吞作用递送物质。

但由于一些问题，脂质体难以被广泛使用。脂质体的一个问题在于，在脂质体中包封的效率低。特别地，亲水性物质仅可以被包封在脂质体的内部水性隔室中，并且因为内部水性隔室的体积小，包封的效率也必然是低的。其通常显示约10‐20％的包封效率，并且显示严重的技术限制，因为相对于脂质体的总重量，包封的蛋白质的量非常低。在一些情况下，亲脂性物质可以使脂质双层不稳定以降低脂质体的稳定性。

使用脂质体作为蛋白质递送载体的另一个问题在于，生理学活性蛋白质在一般的脂质体制备过程中严重变性以失去其特征性的生理学活性。作为一般的脂质体制备方法，Bangham法(Bangham等人,1965J.Mol.Biol.13:238‐252)或高压均质(high‐pressurehomogenization)法被广泛使用。如果使用这些方法捕获生理学活性蛋白质，由于其暴露在由微孔中的剪切应力引起的严酷条件(如高压、高温、摩擦热)中，并且由于有机溶剂的使用，蛋白质可以聚集、变性、氧化或降解，因此很可能失去其特征性的生理学活性，存在亟待克服的问题。

针对猪肺炎支原体疫苗研制，主要以国外的猪支原体肺炎灭活疫苗产品和国内的猪支原体肺炎活疫苗产品为主，针对猪支原体肺炎的预防控制都取得了一定的成绩，但是各自存在一些问题，灭活疫苗要使用强度株培养，免疫效果差，容易造成生物安全污染的问题；弱毒活疫苗存在着培养困难，免疫效果好，存在毒力返强的风险。

因此，为了预防猪肺炎支原体的发生及其病原的传播，需要重新研究制备具有高免疫保护力的疫苗。因此，我们希望在猪肺炎支原体主要蛋白抗原研究方面的基础上，采用生物工程手段，通过大量表达猪肺炎支原体主要抗原，运用脂质体微粒技术，来封装来猪肺炎支原体主要抗原蛋白，生产高效的猪肺炎支原体疫苗。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种与猪支原体肺炎相关的抗原及其应用，具体来说，本发明提供了所述猪支原体肺炎脂质体微颗粒疫苗在预防猪支原体肺炎中的用途，能够激发粘膜免疫、体液免疫、细胞免疫。

技术方案：一种与猪支原体肺炎相关的抗原，所述抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

编码权利要求1所述抗原的基因，基因序列如SEQ ID NO.2所示。

上述SEQ ID NO.2基因序列运用大肠杆菌表达系统制备得到的猪肺炎支原体基因工程表达抗原。

上述抗原在制备猪支原体肺炎脂质体微颗粒疫苗中的应用。

应用制备步骤为：将SEQ ID NO.1所示的抗原用pH值为7.2含终浓度50wt.％甘油的PBS缓冲液制备成抗原原液；将脂质体微粒原料按照20wt.％‐50wt.％比例溶于三氯甲烷，将所得脂质体溶液于旋转蒸发仪中真空旋转蒸发，成膜；在膜材中加入2％体积比生理盐水缓冲液，并加入小玻璃珠，旋转蒸发，待薄膜从瓶壁上完全脱落后，静置得空脂质体；所述的猪肺炎支原体脂质体微颗粒终浓度50‐300μg每毫升加入制得的空脂质体中，用高压匀浆机高压均质循环脂质体颗粒，除菌过滤，即成所述猪肺炎支原体脂质体微颗粒疫苗。

上述脂质体微粒原料为卵磷脂、豆磷脂、脑磷脂、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇乙酰、牛胆酸钠、蛋磷脂酰胆碱、磷脂酰丝胺酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯、二肉豆蔻卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、硬质酰胺、二氧乙烯十六烷基醚、四氧乙烯十二烷基醚中至少一种。

上述单位剂量中所述抗原含量为50‐400μg。

优选的，上述单位剂量中所述抗原含量为50‐100μg。

上述猪肺炎支原体脂质体微颗粒为正电性脂质体。

进一步优选地设计合成膜蛋白和特异性脂蛋白基因(命名为PP基因)，中间加柔性(GGGSG)linker，最终预测蛋白质全长735个氨基酸如下，约有分子量大小为80.2kD：

MAKNFDFHPSIQGYKKIAHQLLLKLTLDQEEKDDSNAEELKNTTNFDDFDENKPTYSKVIDLSVFAKSNKEFLEKLNENKQTSEFIAQKSTFDTDQEAAIKDDKRTFGNIVREIVSLPIFDNFDFRELIPVKNPFVKAIINSYLGKPAGSLIKDIEQLENKVKDYARPNIKIFDTIIDSFIRKMVAFFAELNTDQEIKEFKMSPQILFLTLRNAILSPFDLTKLKDSATFKILMGLKPEQILTLLGLGKTPSVPKPEKPKDQGSMPQTDTSSQKQESGTGSTDSTKATTENQKPAEQTNSSEQSSTDSKSNGGGSGMKKMLRKKFLYSSAIYATSLASIIAFVAAGCGQTESGSTSDSKPQAETLKHKVSNDSIRIALTDPDNPRWISAQKDIISYVDETEAATSTITKNQDAQNNWLTQQANLSPAPKGFIIAPENGSGVGTAVNTIADKGIPIVAYDRLITGSDKYDWYVSFDNEKVGELQGLSLAAGLLGKEDGAFDSIDQMNEYLKSHMPQETISFYTIAGSQDDNNSQYFYNGAMKVLKELMKNSGNKIIDLSPEGENAVYVPGWNYGTAGQRIQSFLTINKDPAGGNKIKAVGSKPASIFKGFLAPNDGMAEQAITKLKLEGFDTQKIFVTGQDYNDKAKTFIKDGDQNMTIYKPDKVLGKVAVEVLRVLIAKKNKASRSEVENELKAKLPNISFKYDNQTYKVQGKNINTILVSPVIVTKANVDNPDA

进一步优选地根据上述氨基酸序列预测，使用大肠杆菌表达系统常用密码子合成最终序列，共2205bp如下：

ATGGCTAAAAACTTCGACTTCCACCCGTCTATCCAGGGTTACAAAAAAATCGCTCACCAGCTGCTGCTGAAACTGACCCTGGACCAGGAAGAAAAAGACGACTCTAACGCTGAAGAACTGAAAAACACCACCAACTTCGACGACTTCGACGAAAACAAACCGACCTACTCTAAAGTTATCGACCTGTCTGTTTTCGCTAAATCTAACAAAGAATTCCTGGAAAAACTGAACGAAAACAAACAGACCTCTGAATTCATCGCTCAGAAATCTACCTTCGACACCGACCAGGAAGCTGCTATCAAAGACGACAAACGTACCTTCGGTAACATCGTTCGTGAAATCGTTTCTCTGCCGATCTTCGACAACTTCGACTTCCGTGAACTGATCCCGGTTAAAAACCCGTTCGTTAAAGCTATCATCAACTCTTACCTGGGTAAACCGGCTGGTTCTCTGATCAAAGACATCGAACAGCTGGAAAACAAAGTTAAAGACTACGCTCGTCCGAACATCAAAATCTTCGACACCATCATCGACTCTTTCATCCGTAAAATGGTTGCTTTCTTCGCTGAACTGAACACCGACCAGGAAATCAAAGAATTCAAAATGTCTCCGCAGATCCTGTTCCTGACCCTGCGTAACGCTATCCTGTCTCCGTTCGACCTGACCAAACTGAAAGACTCTGCTACCTTCAAAATCCTGATGGGTCTGAAACCGGAACAGATCCTGACCCTGCTGGGTCTGGGTAAAACCCCGTCTGTTCCGAAACCGGAAAAACCGAAAGACCAGGGTTCTATGCCGCAGACCGACACCTCTTCTCAGAAACAGGAATCTGGTACCGGTTCTACCGACTCTACCAAAGCTACCACCGAAAACCAGAAACCGGCTGAACAGACCAACTCTTCTGAACAGTCTTCTACCGACTCTAAATCTAACGGTGGTGGTTCTGGTATGAAAAAAATGCTGCGTAAAAAATTCCTGTACTCTTCTGCTATCTACGCTACCTCTCTGGCTTCTATCATCGCTTTCGTTGCTGCTGGTTGCGGTCAGACCGAATCTGGTTCTACCTCTGACTCTAAACCGCAGGCTGAAACCCTGAAACACAAAGTTTCTAACGACTCTATCCGTATCGCTCTGACCGACCCGGACAACCCGCGTTGGATCTCTGCTCAGAAAGACATCATCTCTTACGTTGACGAAACCGAAGCTGCTACCTCTACCATCACCAAAAACCAGGACGCTCAGAACAACTGGCTGACCCAGCAGGCTAACCTGTCTCCGGCTCCGAAAGGTTTCATCATCGCTCCGGAAAACGGTTCTGGTGTTGGTACCGCTGTTAACACCATCGCTGACAAAGGTATCCCGATCGTTGCTTACGACCGTCTGATCACCGGTTCTGACAAATACGACTGGTACGTTTCTTTCGACAACGAAAAAGTTGGTGAACTGCAGGGTCTGTCTCTGGCTGCTGGTCTGCTGGGTAAAGAAGACGGTGCTTTCGACTCTATCGACCAGATGAACGAATACCTGAAATCTCACATGCCGCAGGAAACCATCTCTTTCTACACCATCGCTGGTTCTCAGGACGACAACAACTCTCAGTACTTCTACAACGGTGCTATGAAAGTTCTGAAAGAACTGATGAAAAACTCTGGTAACAAAATCATCGACCTGTCTCCGGAAGGTGAAAACGCTGTTTACGTTCCGGGTTGGAACTACGGTACCGCTGGTCAGCGTATCCAGTCTTTCCTGACCATCAACAAAGACCCGGCTGGTGGTAACAAAATCAAAGCTGTTGGTTCTAAACCGGCTTCTATCTTCAAAGGTTTCCTGGCTCCGAACGACGGTATGGCTGAACAGGCTATCACCAAACTGAAACTGGAAGGTTTCGACACCCAGAAAATCTTCGTTACCGGTCAGGACTACAACGACAAAGCTAAAACCTTCATCAAAGACGGTGACCAGAACATGACCATCTACAAACCGGACAAAGTTCTGGGTAAAGTTGCTGTTGAAGTTCTGCGTGTTCTGATCGCTAAAAAAAACAAAGCTTCTCGTTCTGAAGTTGAAAACGAACTGAAAGCTAAACTGCCGAACATCTCTTTCAAATACGACAACCAGACCTACAAAGTTCAGGGTAAAAACATCAACACCATCCTGGTTTCTCCGGTTATCGTTACCAAAGCTAACGTTGACAACCCGGACGCT

进一步按照分子克隆方法，将基因序列，设计酶切位点连接到PET‐28a载体上，构建好表达质粒，转化大肠杆菌DH5a菌株感受态，筛选好阳性克隆，经测序正确，进行下一步研究。

进一步将经过鉴定的表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE)菌株感受态，经阳性克隆鉴定，摸索诱导条件，进行蛋白表达，超声破碎菌体后，验证表达蛋白在细胞上清或包涵体中，再用镍柱层析方法将表达蛋白提纯，再用western‐blotting方法验证所表达蛋白能与特异性血清能够结合反应，得到抗原。

有益效果：本发明猪支原体肺炎脂质体微颗粒疫苗在预防猪支原体肺炎中的用途，能够激发粘膜免疫、体液免疫、细胞免疫。优选地疫苗可以一定有效剂量肺内接种或肌肉注射，优选肺内注射能够产生足够有效的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫反应，减少病变反应，保护动物免于猪肺炎支原体的攻击，保持正常的生长速度。此外，在本发明的实施方案中，通过对疫苗进行实验室安全性试验，表明本发明所述的猪支原体肺炎脂质体微颗粒疫苗是安全的。

附图说明

图1为SDS‐PAGE分析PET‐28a‐PP融合蛋白上清纯化结果；

图中Lane M:SDS‐PAGE Protein marker

Lane 1:全菌破菌离心后上清

Lane 2:上清同Ni‐IDA孵育后流出液

Lane 3:50mM咪唑的洗脱组分

Lane 4:100mM咪唑的洗脱组分

Lane 5‐9:500mM咪唑的洗脱组分

图2为SDS‐PAGE分析包涵体中PET‐28a‐PP融合蛋白纯化结果图；

图中Lane M:SDS‐PAGE Protein marker

Lane 1:包涵体溶解离心后上清

Lane 2:上清同Ni‐IDA孵育后流出液

Lane 3‐4:50mM Imidazole的洗脱组分

Lane 5‐9:100mM Imidazole的洗脱组分

Lane 10‐14:500mM Imidazole的洗脱组分

图3为western blotting分析PET‐28a‐PP融合蛋白结果图。

图中Lane M:Protein marker

Lane 1:与鼠抗HIS单克隆抗体反应。

具体实施方式

实施例中所述的具体试验方法描述仅是示例性描述，用于详细阐述本发明，但并不构成对本发明范围的限制。

实施例1猪支原体肺炎基因的融合表达

1材料与方法

1.1菌株猪支原体肺炎活疫苗(168株)购自于贵州福斯特生物科技有限公司；PET‐28a载体，引物，序列合成，大肠杆菌DH5α感受态和大肠杆菌BL21(DE3)感受态购自于上海生工。

1.2试验动物体质量约25g的BALB/c雌性小鼠，购自南京医科大学动物实验中心。

1.3主要试剂DNA质粒小提试剂盒，鼠抗组氨酸标签(His)IgG，HRP标记的山羊抗鼠IgG，辣根过氧化物酶(HRP)，HindⅢ和XholⅠ限制性内切酶等购自上海生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4表达载体的构建DNA质粒小提试剂盒提取大肠杆菌DH5α中含有PET‐28a‐pp融合蛋白质粒。

1.4.1进行HindⅢ和XholⅠ双酶切鉴定，50μL反应体系为限制性内切酶HindⅢ1μL；限制性内切酶XholⅠ1μL；质粒4μL；10x K buffer 5μL；ddH₂O 39μL；置于37℃反应3小时，产物经凝胶电泳，发现有2200bp目的片段及4000bp左右的载体片段。

1.4.2进行PCR鉴定，50μL扩增体系为ddH2O 20.5μL；2xPCRmix 25μL；引物1(50mmol/L)2μL；引物2(50mmol/L)2μL；质粒模板(100mmol/L)0.5μL；反应条件为94℃5min；94℃45s，60℃45s，72℃90s，循环30次；72℃10min，，产物经凝胶电泳，扩增出2200bp左右目的条带。

经过双酶切鉴定，PCR鉴定，合成的质粒完全正确，进行下一步实验。

1.5含有PET‐28a‐PP融合质粒的蛋白表达

将重组表达载体PET‐28a‐PP融合基因质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取阳性转化子培养至OD600达到0.5，加入终浓度为1mmol/L IPTG，分别于37℃诱导5小时；28℃诱导5小时；16℃诱导10小时，4℃8000r/min离心10min收集菌体。加入6mL生理盐水重悬菌体，超声破碎菌悬液至溶液清亮，12000r/min离心10min，所收集的上清和沉淀液采用SDS‐PAGE分析检测目的蛋白的表达部位。

随后，将表达蛋白转印硝酸纤维素膜，并在室温下先后孵育鼠抗HIS抗体(一抗，1:2000)和羊抗鼠IgG‐HRP抗体(二抗，1:2000)各2小时；随后将硝酸纤维素膜置于DAB染色液中浸泡3‐15min，进行western blotting检测。表达蛋白由镍柱亲和层析法分离纯化获得目的蛋白，SDS‐PAGE分析蛋白纯度。

2结果与分析

2.1PET‐28a‐PP融合蛋白的诱导表达

取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS‐PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳。电泳前10min时，100V稳压电泳，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后200V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶用考马斯亮兰染色液染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰。发现有80KD的目的条带，空质粒对照未出现，与预期相符合。

2.2上清中亲和层析纯化PET‐28a‐PP融合蛋白

全菌采用50mM Tris(pH8.5)，150mM NaCl含1％Triton X‐100，1μg/mL PepstatinA，1μg/mL Leupeptin超声裂解，同时以50mM Tris(pH8.5)，150mM NaCl缓冲液平衡Ni‐IDA亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS‐PAGE分析检测，分析结果见图1。经Ni‐IDA亲和层析纯化分析，PET‐28a‐PP融合蛋白表未在上清中表达。

2.3包涵体通过亲和层析纯化PET‐28a‐PP融合蛋白

包涵体采用50mM Tris(pH8.0)，150mM NaCl含1％Triton X‐100，2mM EDTA，2mMDTT洗涤后，以20mM Tris(pH8.0)，150mM NaCl，8M Urea，20mM Imidazole缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni‐IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS‐PAGE分析检测。分析结果见图2。

经Ni‐IDA亲和层析纯化分析，收集纯度较高的Lane10‐14，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液[50mM Tris(pH8.5)，4mM GSH，0.4mM GSSG，2mM EDTA，0.4M L‐Arginine，2M Urea]中复性，复性后PET‐28a‐PP融合蛋白最终透析于储存液50mMTris，150mM NaCl，10％Glycerol，pH8.5溶液约6‐8h。透析复性结束后，上清用0.22μm滤器过滤后分装，并将其冻存至‐80℃。

2.4PET‐28a‐PP融合蛋白western blotting检测

将纯化好的蛋白，进行SDS‐PAGE电泳，切下后，附在硝酸纤维素膜上，用石墨电极转印硝酸纤维素膜，并在室温下先后孵育鼠抗HIS抗体(一抗，1:2000)和羊抗鼠IgG‐HRP抗体(二抗，1:2000)各2小时；随后将硝酸纤维素膜置于DAB染色液中浸泡3‐15min显色，出现目的条带大小的反应，分析结果见图3。

实施例2猪支原体肺炎脂质体微粒疫苗的制备

本发明所述的猪支原体肺炎脂质体微粒疫苗的制备方法用薄膜法，包括以下操作步骤：

1材料与方法

1.1将大豆卵磷脂m1、胆固醇m2、维生素E(Ve)m3按表1的量混合溶于V1三氯甲烷中，将该溶液置于旋转蒸发仪的茄型瓶中，50℃水浴作为蒸发温度，真空旋转蒸发，成膜。

1.2按膜材终浓度为2％(W/W)加生理盐水，加入几粒小玻璃珠，45℃旋转蒸发，待薄膜从瓶壁上完全脱落后，静置约30min，使瓶中液体呈乳白色悬浊液。

1.3将不同浓度和体积的PET‐28a‐PP融合蛋白抗原液(含1.5％海藻糖)V3加入制得的空脂质体中，用高压匀浆机在15‐30Kpa的高压下均质循环脂质体颗粒5次，除菌过滤后即为所制备的猪支原体肺炎脂质体微粒疫苗，单位剂量中含PET‐28a‐PP融合蛋白组分的含量分别为300、100、100、50μg(详情见表1)。并对制得的流感疫苗进行适当的稀释，过滤除菌后进行分装，1mL含有PET‐28a‐PP融合蛋白和相应脂质体为一头份，共10mL/瓶。

表1不同膜材和PET‐28a‐PP融合抗原液制备出的疫苗

2结果与分析

2.1形态、粒径及其分布

按照上述方法制备的猪支原体肺炎脂质体微粒疫苗，采用扫描电镜测定，所制备的四组猪支原体肺炎脂质体微粒疫苗的粒径在40‐300nm之间，且分布均匀，呈正态性，具体见表2。

2.2包封率和载药量

用超速离心法将溶液中游离PET‐28a‐PP融合抗原和脂质体分离，分别测定，计算脂质体的药物包封率最高达80％以上，载药量各组显示不同。

表2不同疫苗组分不同的物理及性能性状

疫苗类型	微粒粒径范围(nm)	包封率％	载药量％
				组1	80‐300	65	63
组2	80‐226	75	72
				组3	65‐210	81	80
组4	43‐150	76	70

附注：1、包封率：包封率＝(脂质体中包封的药物/脂质体中药物总量)×100％

2、载药量：载药量＝[脂质体中药物量/(脂质体中药物+载体总量)]×100％

实施例3猪肺炎支原体脂质体微颗粒疫苗的动物安检实验

1材料

1.1疫苗：猪肺炎支原体脂质体微颗粒疫苗由南京大爻网络科技有限公司提供，组1、组2、组3、组4。

1.2试验动物：18～20g Balb/C小白鼠购自南京医科大学实验动物中心。5～15日龄健康仔猪购自于江苏省农科院。

2方法

2.1小鼠安检每批疫苗任取5瓶加生理盐水10倍稀释混合后，接种18～22g清洁级小鼠5只，每只皮下接种2头份，观察10日，应全部健活。如个别死亡，可重检一次。重检应全部健活。

2.2猪安检用5～15日龄健康易感猪3头，各右侧肺内注射疫苗2头份，观察25日。记录如下重要的症状：咳嗽、呼吸困难、俯卧、呕吐、食欲不振、震颤和死亡，注射后第1～25日的每日上午检测直肠温度。根据猪安检实验临床症状评判标准，猪安检实验全部累计总分不大于2判为安全，累计总分大于5判为不安全，累计总分2～5分，可重检1次。重检累计总分不大于2判为安全。

2.3猪安检试验临床症状判定标准

记录如下症状：咳嗽、呼吸困难、俯卧、呕吐、食欲不振、震颤、死亡和直肠温度等。发病猪临床症状评判标准见表3。

猪安检试验中，每头试验猪症状全部累计，总分不大于2判为安全，累计总分大于5判为不安全，累计总分2～5，可重检1次，重检累计总分大于2判为安全。

表3猪支原体肺炎发病猪临床评判标准

3结果

3.1疫苗对小白鼠的安全性试验

使用安全检验剂量免疫后，所有小鼠的食欲、精神和健康状况无异常，与对照组一致，无死亡发生，可见猪肺炎支原体脂质体微颗粒疫苗对小白鼠是安全的，见表4。

表4疫苗对小白鼠的安全性试验结果

组别	体温	食欲	精神	健活	对小鼠是否安全
						组1	正常	正常	正常	5/5	是
组2	正常	正常	正常	5/5	是
						组3	正常	正常	正常	5/5	是
组4	正常	正常	正常	5/5	是

3.2疫苗对仔猪的安全性试验

整个试验观察期内，所有免疫的仔猪，体温、精神和食欲均正常，没有出现任何临床异常现象，按照2.3进行评价，各组累计总分都不大于2，这说明，猪肺炎支原体脂质体微颗粒疫苗对仔猪是安全的，见表5。

表5疫苗对仔猪的安全性试验结果

组别	累计总分	对猪是否安全
			组1	1	是
组2	1	是
			组3	0	是
组4	1	是

实施例4猪肺炎支原体脂质体微颗粒疫苗的动物效力实验

1材料

1.1动物：5～15日龄健康仔猪(猪肺炎支原体抗体阴性)，购自于江苏省农科院。

1.2疫苗：猪肺炎支原体脂质体微颗粒疫苗由南京大爻网络科技有限公司提供，组1、组2、组3、组4，猪支原体肺炎活疫苗(168株)购自于贵州福斯特生物科技有限公司。猪支原体肺炎组织强毒来源于江苏省农科院。

2方法

2.1分组设计：动物饲养在隔离室，动物分为随机7个组，猪肺炎支原体脂质体微颗粒疫苗免疫4组，猪支原体肺炎活疫苗(168株)免疫1组，空白攻毒组(非免疫攻毒)和空白组(非免疫非攻毒)非免疫非攻毒。5头/组，见表6。免疫后42天，免疫组和非免攻毒对照组用组织强毒JS，1∶100稀释后，气管内注射5mL攻毒。

表6猪肺炎支原体免疫后动物效力检验研究

分组

数量

免疫时间

免疫方式

免疫剂量

攻毒日龄

剖杀日龄

组1

5头

10日龄

肺内注射

1头份

38日龄

65日龄

组2

5头

10日龄

肺内注射

1头份

38日龄

65日龄

组3

5头

10日龄

肺内注射

1头份

38日龄

65日龄

组4

5头

10日龄

肺内注射

1头份

38日龄

65日龄

168免疫组

5头

10日龄

肺内注射

1头份

38日龄

65日龄

空白攻毒组

5头

10日龄

肺内注射

1mL PBS

38日龄

65日龄

空白组

5头

‐

65日龄

2.2攻毒发病与免疫保护判定标准

试验猪扑杀后，分别记录左尖叶、左心叶、左隔叶、右隔叶、右尖叶、右心叶、副叶病变比率，将0％～25％计1；26％～50％计2；51％～75％计3；76％～100％计4，统计每个试验猪肺脏病变指数(最高28)。试验病变指数大于10判为发病，小于4为健康(排除猪肺炎支原体感染)，根据肺脏病变指数，按照以下公式计算试验猪攻毒保护指数。

试验猪攻毒保护指数＝(攻毒不免疫对照组(阳性对照组)肺脏病变指数平均值‐试验猪(试验组)肺病变指数)/(攻毒不免疫对照组(阳性对照组)肺病变指数平均值‐不攻毒不免疫对照(阴性对照组)组肺病变指数平均值)％。

试验猪攻毒保护指数小于60％为无保护，大于或等于60％为有保护，再按以下公式计算攻毒保护率。试验猪攻毒保护率＝有保护试验猪数/试验猪数

试验在阳性对照全部发病、阴性对照至少全部健康时有效。

3结果与分析

免疫后攻毒保护结果见表7，从攻毒保护结果看，猪肺炎支原体脂质体微颗粒疫苗组1，组2，组3的免疫效果与猪肺炎支原体活疫苗免疫组保护效果相当，肺脏病变平均得分小于3，空白攻毒组100％发病无保护，说明制备的猪肺炎支原体脂质体微颗粒疫苗具有较高的保护效果。

表7猪肺炎支原体疫苗免疫攻毒保护结果

分组	副反应	肺脏病变平均得分	攻毒保护率
				组1	无	3	100％
组2	无	3	100％
				组3	无	2.5	100％
组4	无	5	75％
				168免疫组	无	2.5	100％
空白攻毒组	无	25	0
				空白组	无	0	0

序列表

<110> 南京大爻网络科技有限公司

<120> 一种与猪支原体肺炎相关的抗原及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 735

<212> PRT

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

Met Ala Lys Asn Phe Asp Phe His Pro Ser Ile Gln Gly Tyr Lys Lys

1 5 10 15

Ile Ala His Gln Leu Leu Leu Lys Leu Thr Leu Asp Gln Glu Glu Lys

20 25 30

Asp Asp Ser Asn Ala Glu Glu Leu Lys Asn Thr Thr Asn Phe Asp Asp

35 40 45

Phe Asp Glu Asn Lys Pro Thr Tyr Ser Lys Val Ile Asp Leu Ser Val

50 55 60

Phe Ala Lys Ser Asn Lys Glu Phe Leu Glu Lys Leu Asn Glu Asn Lys

65 70 75 80

Gln Thr Ser Glu Phe Ile Ala Gln Lys Ser Thr Phe Asp Thr Asp Gln

85 90 95

Glu Ala Ala Ile Lys Asp Asp Lys Arg Thr Phe Gly Asn Ile Val Arg

100 105 110

Glu Ile Val Ser Leu Pro Ile Phe Asp Asn Phe Asp Phe Arg Glu Leu

115 120 125

Ile Pro Val Lys Asn Pro Phe Val Lys Ala Ile Ile Asn Ser Tyr Leu

130 135 140

Gly Lys Pro Ala Gly Ser Leu Ile Lys Asp Ile Glu Gln Leu Glu Asn

145 150 155 160

Lys Val Lys Asp Tyr Ala Arg Pro Asn Ile Lys Ile Phe Asp Thr Ile

165 170 175

Ile Asp Ser Phe Ile Arg Lys Met Val Ala Phe Phe Ala Glu Leu Asn

180 185 190

Thr Asp Gln Glu Ile Lys Glu Phe Lys Met Ser Pro Gln Ile Leu Phe

195 200 205

Leu Thr Leu Arg Asn Ala Ile Leu Ser Pro Phe Asp Leu Thr Lys Leu

210 215 220

Lys Asp Ser Ala Thr Phe Lys Ile Leu Met Gly Leu Lys Pro Glu Gln

225 230 235 240

Ile Leu Thr Leu Leu Gly Leu Gly Lys Thr Pro Ser Val Pro Lys Pro

245 250 255

Glu Lys Pro Lys Asp Gln Gly Ser Met Pro Gln Thr Asp Thr Ser Ser

260 265 270

Gln Lys Gln Glu Ser Gly Thr Gly Ser Thr Asp Ser Thr Lys Ala Thr

275 280 285

Thr Glu Asn Gln Lys Pro Ala Glu Gln Thr Asn Ser Ser Glu Gln Ser

290 295 300

Ser Thr Asp Ser Lys Ser Asn Gly Gly Gly Ser Gly Met Lys Lys Met

305 310 315 320

Leu Arg Lys Lys Phe Leu Tyr Ser Ser Ala Ile Tyr Ala Thr Ser Leu

325 330 335

Ala Ser Ile Ile Ala Phe Val Ala Ala Gly Cys Gly Gln Thr Glu Ser

340 345 350

Gly Ser Thr Ser Asp Ser Lys Pro Gln Ala Glu Thr Leu Lys His Lys

355 360 365

Val Ser Asn Asp Ser Ile Arg Ile Ala Leu Thr Asp Pro Asp Asn Pro

370 375 380

Arg Trp Ile Ser Ala Gln Lys Asp Ile Ile Ser Tyr Val Asp Glu Thr

385 390 395 400

Glu Ala Ala Thr Ser Thr Ile Thr Lys Asn Gln Asp Ala Gln Asn Asn

405 410 415

Trp Leu Thr Gln Gln Ala Asn Leu Ser Pro Ala Pro Lys Gly Phe Ile

420 425 430

Ile Ala Pro Glu Asn Gly Ser Gly Val Gly Thr Ala Val Asn Thr Ile

435 440 445

Ala Asp Lys Gly Ile Pro Ile Val Ala Tyr Asp Arg Leu Ile Thr Gly

450 455 460

Ser Asp Lys Tyr Asp Trp Tyr Val Ser Phe Asp Asn Glu Lys Val Gly

465 470 475 480

Glu Leu Gln Gly Leu Ser Leu Ala Ala Gly Leu Leu Gly Lys Glu Asp

485 490 495

Gly Ala Phe Asp Ser Ile Asp Gln Met Asn Glu Tyr Leu Lys Ser His

500 505 510

Met Pro Gln Glu Thr Ile Ser Phe Tyr Thr Ile Ala Gly Ser Gln Asp

515 520 525

Asp Asn Asn Ser Gln Tyr Phe Tyr Asn Gly Ala Met Lys Val Leu Lys

530 535 540

Glu Leu Met Lys Asn Ser Gly Asn Lys Ile Ile Asp Leu Ser Pro Glu

545 550 555 560

Gly Glu Asn Ala Val Tyr Val Pro Gly Trp Asn Tyr Gly Thr Ala Gly

565 570 575

Gln Arg Ile Gln Ser Phe Leu Thr Ile Asn Lys Asp Pro Ala Gly Gly

580 585 590

Asn Lys Ile Lys Ala Val Gly Ser Lys Pro Ala Ser Ile Phe Lys Gly

595 600 605

Phe Leu Ala Pro Asn Asp Gly Met Ala Glu Gln Ala Ile Thr Lys Leu

610 615 620

Lys Leu Glu Gly Phe Asp Thr Gln Lys Ile Phe Val Thr Gly Gln Asp

625 630 635 640

Tyr Asn Asp Lys Ala Lys Thr Phe Ile Lys Asp Gly Asp Gln Asn Met

645 650 655

Thr Ile Tyr Lys Pro Asp Lys Val Leu Gly Lys Val Ala Val Glu Val

660 665 670

Leu Arg Val Leu Ile Ala Lys Lys Asn Lys Ala Ser Arg Ser Glu Val

675 680 685

Glu Asn Glu Leu Lys Ala Lys Leu Pro Asn Ile Ser Phe Lys Tyr Asp

690 695 700

Asn Gln Thr Tyr Lys Val Gln Gly Lys Asn Ile Asn Thr Ile Leu Val

705 710 715 720

Ser Pro Val Ile Val Thr Lys Ala Asn Val Asp Asn Pro Asp Ala

725 730 735

<210> 2

<211> 2205

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

atggctaaaa acttcgactt ccacccgtct atccagggtt acaaaaaaat cgctcaccag 60

ctgctgctga aactgaccct ggaccaggaa gaaaaagacg actctaacgc tgaagaactg 120

aaaaacacca ccaacttcga cgacttcgac gaaaacaaac cgacctactc taaagttatc 180

gacctgtctg ttttcgctaa atctaacaaa gaattcctgg aaaaactgaa cgaaaacaaa 240

cagacctctg aattcatcgc tcagaaatct accttcgaca ccgaccagga agctgctatc 300

aaagacgaca aacgtacctt cggtaacatc gttcgtgaaa tcgtttctct gccgatcttc 360

gacaacttcg acttccgtga actgatcccg gttaaaaacc cgttcgttaa agctatcatc 420

aactcttacc tgggtaaacc ggctggttct ctgatcaaag acatcgaaca gctggaaaac 480

aaagttaaag actacgctcg tccgaacatc aaaatcttcg acaccatcat cgactctttc 540

atccgtaaaa tggttgcttt cttcgctgaa ctgaacaccg accaggaaat caaagaattc 600

aaaatgtctc cgcagatcct gttcctgacc ctgcgtaacg ctatcctgtc tccgttcgac 660

ctgaccaaac tgaaagactc tgctaccttc aaaatcctga tgggtctgaa accggaacag 720

atcctgaccc tgctgggtct gggtaaaacc ccgtctgttc cgaaaccgga aaaaccgaaa 780

gaccagggtt ctatgccgca gaccgacacc tcttctcaga aacaggaatc tggtaccggt 840

tctaccgact ctaccaaagc taccaccgaa aaccagaaac cggctgaaca gaccaactct 900

tctgaacagt cttctaccga ctctaaatct aacggtggtg gttctggtat gaaaaaaatg 960

ctgcgtaaaa aattcctgta ctcttctgct atctacgcta cctctctggc ttctatcatc 1020

gctttcgttg ctgctggttg cggtcagacc gaatctggtt ctacctctga ctctaaaccg 1080

caggctgaaa ccctgaaaca caaagtttct aacgactcta tccgtatcgc tctgaccgac 1140

ccggacaacc cgcgttggat ctctgctcag aaagacatca tctcttacgt tgacgaaacc 1200

gaagctgcta cctctaccat caccaaaaac caggacgctc agaacaactg gctgacccag 1260

caggctaacc tgtctccggc tccgaaaggt ttcatcatcg ctccggaaaa cggttctggt 1320

gttggtaccg ctgttaacac catcgctgac aaaggtatcc cgatcgttgc ttacgaccgt 1380

ctgatcaccg gttctgacaa atacgactgg tacgtttctt tcgacaacga aaaagttggt 1440

gaactgcagg gtctgtctct ggctgctggt ctgctgggta aagaagacgg tgctttcgac 1500

tctatcgacc agatgaacga atacctgaaa tctcacatgc cgcaggaaac catctctttc 1560

tacaccatcg ctggttctca ggacgacaac aactctcagt acttctacaa cggtgctatg 1620

aaagttctga aagaactgat gaaaaactct ggtaacaaaa tcatcgacct gtctccggaa 1680

ggtgaaaacg ctgtttacgt tccgggttgg aactacggta ccgctggtca gcgtatccag 1740

tctttcctga ccatcaacaa agacccggct ggtggtaaca aaatcaaagc tgttggttct 1800

aaaccggctt ctatcttcaa aggtttcctg gctccgaacg acggtatggc tgaacaggct 1860

atcaccaaac tgaaactgga aggtttcgac acccagaaaa tcttcgttac cggtcaggac 1920

tacaacgaca aagctaaaac cttcatcaaa gacggtgacc agaacatgac catctacaaa 1980

ccggacaaag ttctgggtaa agttgctgtt gaagttctgc gtgttctgat cgctaaaaaa 2040

aacaaagctt ctcgttctga agttgaaaac gaactgaaag ctaaactgcc gaacatctct 2100

ttcaaatacg acaaccagac ctacaaagtt cagggtaaaa acatcaacac catcctggtt 2160

tctccggtta tcgttaccaa agctaacgtt gacaacccgg acgct 2205

Claims

1.一种与猪支原体肺炎相关的抗原，其特征在于所述抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.编码权利要求1所述抗原的基因，其特征在于基因序列如SEQ ID NO.2所示。

3.由权利要求2所述SEQ ID NO.2基因序列运用大肠杆菌表达系统制备得到的猪肺炎支原体基因工程表达抗原。

4.权利要求1所述抗原在制备猪支原体肺炎脂质体微颗粒疫苗中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于制备步骤为：将SEQ ID NO.1所示的抗原用pH值为7.2含终浓度50wt.%甘油的PBS缓冲液制备成抗原原液；将脂质体微粒原料按照20wt.%-50wt.%比例溶于三氯甲烷，将所得脂质体溶液于旋转蒸发仪中真空旋转蒸发，成膜；在膜材中加入2%体积比生理盐水缓冲液，并加入小玻璃珠，旋转蒸发，待薄膜从瓶壁上完全脱落后，静置得空脂质体；所述的猪肺炎支原体脂质体微颗粒终浓度50-300μg每毫升加入制得的空脂质体中，用高压匀浆机高压均质循环脂质体颗粒，除菌过滤，即成所述猪肺炎支原体脂质体微颗粒疫苗。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述脂质体微粒原料为卵磷脂、豆磷脂、脑磷脂、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇乙酰、牛胆酸钠、蛋磷脂酰胆碱、磷脂酰丝胺酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯、二肉豆蔻卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、硬质酰胺、二氧乙烯十六烷基醚、四氧乙烯十二烷基醚中至少一种。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于单位剂量中所述抗原含量为50-400μg。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于单位剂量中所述抗原含量为50-100μg。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的猪肺炎支原体脂质体微颗粒为正电性脂质体。