CN103071151B

CN103071151B - 猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂及其制备方法

Info

Publication number: CN103071151B
Application number: CN201310017232.3A
Authority: CN
Inventors: 熊祺琰; 邵国青; 韦艳娜; 刘茂军; 冯志新; 白方方
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-01-17
Filing date: 2013-01-17
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2033-01-17
Also published as: CN103071151A

Abstract

本发明的猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂，主要含重组P97R1蛋白免疫刺激复合物（ISCOM-P97R1），此外还可能含有其他水性佐剂成分，包括左旋咪唑、或/和黄芪多糖、或/和卡波姆。所述稀释剂的每ml溶液中含有QuilA0.1-1毫克，胆固醇0.02-0.2毫克，磷脂酰胆碱0.02-0.2毫克，P97R1抗原0.4-4毫克，此外还可能进一步含有左旋咪唑2-20毫克、或/和黄芪多糖20-100毫克、或/和卡波姆3-10毫克，其余为磷酸盐缓冲液。该稀释剂专用于溶解或稀释猪支原体肺炎疫苗，包括活疫苗和灭活疫苗。兼具补充疫苗抗原保护谱和增强疫苗细胞及体液免疫刺激能力的双重效果，可显著提高疫苗的攻毒保护效力。同时由于采用水溶剂体系，还具有操作简便，通针性好，无明显毒副反应的优势。

Description

猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种专用于猪支原体肺炎疫苗的稀释剂，特别是一种能适用于猪支原体肺炎活疫苗和灭活疫苗、能特异性增强疫苗保护能力的猪支原体肺炎疫苗的稀释剂。

背景技术

猪支原体肺炎，俗称猪气喘病，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的一种猪的慢性呼吸道传染性疾病，主要症状为咳嗽和气喘。该病主要引起猪的饲料转化率下降和生长受阻，发病率高、死亡率低。猪支原体肺炎在世界范围内广泛流行，给现代养猪业造成重大经济损失。

猪支原体肺炎是一种顽固性慢性传染病，药物治疗效果不够理想，停药后容易复发，该病一旦在猪场流行, 就很难根除。因此，预防、控制和净化猪支原体肺炎须采取早期诊断、及时隔离、抗生素治疗或淘汰病猪、疫苗预防、全进全出、严格消毒等综合性措施，其中疫苗预防在控制猪支原体肺炎中起着关键性的作用。目前，国内外对于该病的防治主要依靠国外进口灭活疫苗，主要公司及产品包括美国辉瑞动物保健品公司开发的瑞倍适(RespiSure^®)、瑞倍适-旺(RespiSure^®One)、海博莱公司的喜可舒(MYPRAVAC SUIS^®)、先灵葆雅公司的安百克(M⁺PAC^®)、勃林格殷格翰公司的茵格发猪支原体肺炎灭活疫苗(Ingelvac ^®M.hyo)等等，其中以瑞倍适灭活疫苗应用最为广泛。

目前占领主导市场的灭活疫苗在临床使用上虽然显示出明显功效，但仍不能达到令人满意的完全保护效果。在研究中我们发现，由于体内自然感染和体外培养时的生长环境不同，猪肺炎支原体在体外无细胞培养条件下，有一些基因不能有效表达，而这些差异表达的蛋白往往与病原菌的感染过程密切相关。因此体外培养病原菌制备疫苗可能会缺失一部分重要的免疫原，使得保护谱不完全，不能达到类似动物感染康复后所获得的保护效果。P97蛋白是猪肺炎支原体的主要黏附因子，介导猪肺炎支原体侵入机体，继而诱发纤毛脱落炎症应答等病理变化。尤其是其中包含的重复片段区P97R1更被证明为猪肺炎支原体黏附细胞的关键区域。研究者将P97R1作为靶片段开发基因工程疫苗，可以使动物获得明显的攻毒保护能力，证明P97R1片段是猪肺炎支原体的重要免疫原，单独可诱导有效免疫保护效力。而同时，多项研究却发现免疫现有的几种商品化猪支原体肺炎灭活疫苗后猪体无法产生P97R1抗体，说明P97（含P97R1片段），无法在体外培养条件下大量表达，对P97R1抗原免疫的缺失成为现有猪支原体肺炎疫苗的一大缺陷。因此通过另外补充P97R1抗原将能进一步完善猪支原体肺炎疫苗的抗原谱，增强疫苗的免疫保护力。

基于此，本研究拟开发一种含有P97R1抗原的新型猪支原体肺炎疫苗稀释剂，通过添加P97R1抗原补充疫苗保护谱，同时采用制备免疫刺激复合物的方法增强P97R1及疫苗本身的细胞及体液免疫刺激能力。另一方面，该稀释剂还可能同时含有适用于猪支原体肺炎疫苗的其他水性佐剂成分，进一步提高疫苗免疫效力。

免疫刺激复合物（ immunostimulating complex ， ISCOM ）是由 Quil A （皂苷活性成分）、胆固醇、磷脂酰胆碱和抗原成分相互作用形成的纳米级笼状颗粒物。由于其含有免疫增强剂活性成分 Quil A ，同时为纳米级颗粒，因而能够有效激活机体免疫系统，显著增加嵌入抗原的免疫刺激能力。研究证明 ISCOM 能有效地活化辅助型 T 细胞和细胞毒性 T 细胞，促进细胞免疫应答，尤其是 Th1 型细胞免疫应答，同时也能够有效增强体液免疫应答水平。另一方面由于与胆固醇和磷脂酰胆碱相互作用后 Quil A 的毒副反应大大降低，因此 ISCOM 也具有良好的安全性。另外，研究发现将不含有抗原的免疫刺激复合物即免疫刺激复合物基质（ ISCOM-matrix ）和疫苗混合后也同样能够起到免疫佐剂的效果，因此我们将所制备的含 ISCOM-P97R1 的专用稀释剂溶解或稀释猪支原体肺炎疫苗，既能够获得对 P97R1 抗原的有效保护，同时也能够增强活疫苗和灭活疫苗本身的免疫刺激能力。

发明内容

本发明的主要目的在于公开一种专用于猪支原体肺炎疫苗的稀释剂，特别是一种能适用于猪支原体肺炎活疫苗、灭活疫苗，能特异性增强疫苗保护效力的猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂。

本发明的另一个目的是为上述疫苗专用稀释剂提供一种操作简单方便的制备方法。

本发明的另一个目的是公开该疫苗稀释剂在猪支原体肺炎疫苗免疫中的应用。

本发明的猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂，主要含有以重组P97R1蛋白制备的免疫刺激复合物。所述稀释剂的每ml溶液中ISCOM-P97R1各成分含量为：Quil A 0.1-1毫克、胆固醇0.02-0.2毫克、磷脂酰胆碱0.02-0.2毫克、P97R1抗原0.4-4毫克。其具体制备方法为：取磷酸盐缓冲液溶解得到的10 mg/ml的P97R1溶液3 ml，向其中加入Mega-10粉末,使Mega-10浓度为2%,于37℃下放置12 h。然后向其中加入脂类混合物储备液150μl（含10 mg/ml磷脂酰胆碱和10 mg/ml胆固醇的20% Mega-10溶液）和QuilA 溶液1350μl（含5.56mg/mlQuilA的磷酸盐缓冲液）,混匀后于室温下放置2 h。冰浴超声处理30min，再于室温放置2h，然后转移至透析袋中以磷酸盐缓冲液为外液于4 ℃透析72 h，0.22μm滤膜过滤除菌即得到Quil A浓度为1.67mg/ml的ISCOM-P97R1母液。配制猪支原体肺炎疫苗专用稀释液时，取ISCOM-P97R1母液适量，用磷酸盐缓冲液进行一定稀释，即得到每ml溶液中含有Quil A 为0.1-1毫克的ISCOM-P97R1的疫苗稀释液。

本发明中涉及到的重组P97R1蛋白是猪肺炎支原体黏附因子P97的关键抗原片段R1片段的重组蛋白。用pET-32a(+)载体表达的重组P97R1蛋白的基因序列（SEQ ID No.1）为：

ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCGAATTCTTACCTCAGCCGCCAGCAGCTAAACCTGAAGCAGCAAAACCAGTAGCAGCTAAACCTGAAGCAGCAAAACCAGTAGCAGCTAAACCTGAAGCAGCAAAACCAGTAGCAGCTAAACCTGAAGCAGCAAAACCAGTAGCGGCTAAACCTGAAGCAGCTAAACCAGTAGCAGCTAAACCAGTTGCTACTAATACTAATACTAATACTGGCTTTTCACTTACAAATAAACCAAAAGAAGACTATTTCCCAATGGCTTAA

蛋白序列(SEQ ID No.2)为：

MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSEFLPQPPAAKPEAAKPVAAKPEAAKPVAAKPEAAKPVAAKPEAAKPVAAKPEAAKPVAAKPVATNTNTNTGFSLTNKPKEDYFPMA

重组P97R1蛋白具体的制备方法可以为：设计引物从猪肺炎支原体基因组中扩增P97R1基因片段。上游引物为5‘-CCGAATTCTTACCTCAGCCGCCAGCAG-3’ (SEQ ID No.3)；下游引物为5‘-GCGAAGCTTAAGCCATTGGGAAATAGTCT-3’(SEQ ID No.4)。上下游引物中分别包含EcoRⅠ位点和 HindⅢ位点。扩增片段经EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切后插入pET-32a(+)载体中，得到表达重组P97R1蛋白的原核质粒载体pET-32a(+)-P97R1。转化大肠杆菌BL-21（DE3），筛选阳性克隆，DNA测序验证，得到表达重组P97R1蛋白重组基因工程菌。工程菌经IPTG诱导表达，裂解取上清液，经镍柱亲和层析纯化得到重组P97R1蛋白。详细制备步骤可参见：刘茂军,邵国青,张映,聂向庭. 猪肺炎支原体P97基因抗原决定簇R1区的克隆与表达.江苏农业学报.2005,21(3):207-211.

本发明中所涉及的重组P97R1蛋白，包括将P97R1基因装入各种表达载体表达得到的含P97R1及P97R1部分片段的重组融合蛋白。

本发明的猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂，除ISCOM-P97R1外，还可能含有其他水性佐剂，包含左旋咪唑、或/和黄芪多糖、或/和卡波姆。所述稀释剂的每ml溶液中含有左旋咪唑2-20毫克、或/和黄芪多糖20-100毫克、或/和卡波姆3-10毫克，其余为磷酸盐缓冲液。制备方法为先配制高浓度母液，再将各种母液混合均匀，最后用磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度即得，具体步骤如下：

（1）ISCOM-P97R1母液的制备：同上所述方法制备得到Quil A浓度为1.67mg/ml的ISCOM-P97R1母液；

（2）左旋咪唑母液的制备：取适量的左旋咪唑溶解于磷酸盐缓冲液中配制得到200mg/ml的左旋咪唑母液；

（3）黄芪多糖母液的制备：取适量的黄芪多糖溶解于磷酸盐缓冲液中配制得到250mg/ml的黄芪多糖母液；

（4）卡波姆母液的制备：取适量卡波姆（卡波姆974P或971P）溶解于蒸馏水，室温放置过夜使其充分溶胀得到20mg/ml的卡波姆溶液，加入3M氢氧化钠溶液调节溶液pH值至7.2，加适量蒸馏水调节卡波姆浓度为15mg/ml,得到15mg/ml的卡波姆母液；

（5）猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂的制备

以100ml稀释剂为例进行配制时，取Quil A浓度为1.67mg/ml的ISCOM-P97R1母液适量，同时取200mg/ml的左旋咪唑母液、或/和250mg/ml的黄芪多糖母液、或/和15mg/ml的卡波姆母液中的一种或多种各适量，用磷酸盐缓冲液进行一定稀释，即得到每ml溶液中含有Quil A 0.1-1毫克的ISCOM基质、左旋咪唑2-20毫克、或/和黄芪多糖20-100毫克、或/和卡波姆3-10毫克的猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂。

本发明中涉及到的水性佐剂包括左旋咪唑、黄芪多糖、卡波姆。经典的油包水乳剂型佐剂具有较强的毒副作用，而水性佐剂具有较好的安全性，同时对于活疫苗而言，采用合适配方的水性佐剂能够避免油相对活疫苗活力的损伤作用。左旋咪唑是一种广谱驱虫药，作为常用的疫苗佐剂，具有较强的直接免疫刺激能力；中草药多糖是常用的免疫增强剂，其中黄芪多糖能够较好地激活细胞免疫应答；卡波姆为高分子物质，974P和971P是常用于疫苗佐剂的卡波姆型号，具有良好的储库作用，能够帮助疫苗抗原实现持续释放达到长时间免疫。

所述稀释剂在猪支原体肺炎疫苗中应用时，每头份猪支原体肺炎疫苗使用所述猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂0.5-3毫升，优选使用剂量为每头份猪支原体肺炎疫苗使用所述猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂1-2毫升。

本发明的猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂专门用于猪支原体肺炎疫苗，包括活疫苗和灭活疫苗。

目前市场上的猪支原体肺炎疫苗分为灭活疫苗和活疫苗两种，其中进口灭活疫苗占领了绝大部分市场。灭活疫苗所采用的佐剂包括经典的白油佐剂即油包水体系、水包油体系、水包油包水体系和全水相体系四种。油包水佐剂体系效果最好，但安全性相对较差，猪用疫苗已逐渐向水包油包水、水包油及全水相体积转变。这些体系通针性好，容易注射，且安全性好。由于灭活疫苗在体外进行培养时无法大量表达P97R1抗原，免疫后无法诱导机体产生相应的免疫应答，因此当本稀释剂用于猪支原体肺炎灭活疫苗时，由于其中含有ISCOM-P97R1及其他水溶性佐剂成分，既能够补充抗原谱同时又能增强灭活疫苗的免疫刺激能力。

目前市场上唯一的猪支原体肺炎活疫苗为猪支原体肺炎（168株）活疫苗，采用肺内注射途径免疫。该疫苗的免疫效果优于国外进口灭活疫苗，但由于采用肺内注射方式免疫，操作难度大，不易于为广大养殖户所接受，限制了其的广泛应用。试验证明该疫苗直接通过肌肉注射途径免疫无法获得有效保护，因此该疫苗改进的关键在于选择合适的免疫增强剂加强疫苗的免疫刺激能力，使得其通过肌肉注射途径免疫能够起效。同时前期试验结果显示活疫苗通过肌肉注射途径免疫时同样不能诱导针对P97R1的免疫应答，这可能与肌肉免疫和自然感染的状态差异较大有关。因此当本稀释剂用于猪支原体肺炎活疫苗肌肉注射免疫时，由于其中含有ISCOM-P97R1及其他水溶性佐剂成分，既能够补充抗原谱同时又能增强活疫苗的免疫刺激能力。

本发明的猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂，应用时只需用稀释剂直接溶解或稀释猪支原体肺炎活疫苗或灭活疫苗抗原即可，具有操作简便，通针性好等优点。不仅可补充疫苗抗原保护谱，同时可显著增强疫苗的细胞及体液免疫刺激能力，提高活疫苗和灭活疫苗的攻毒保护效力。同时也能克服现有商品化的肺内注射疫苗无法直接用于肌肉注射免疫动物的严重缺陷。

附图说明

图1 电镜观察ISCOM-P97R1母液的笼状颗粒结构形态图；

图2 活疫苗免疫后猪肺炎支原体全菌蛋白抗体检测图；

图3 活疫苗免疫后猪肺炎支原体P97R1蛋白抗体检测图；

图4 灭活疫苗免疫后猪肺炎支原体全菌蛋白抗体检测图；

图5 灭活疫苗免疫后猪肺炎支原体P97R1蛋白抗体检测图；

图6使用专用稀释剂的猪支原体肺炎灭活疫苗及活疫苗的攻毒保护效果评价图。

具体实施方式

结合具体实施例对本发明进行进一步描述和论证，但是本发明所包括的内容并不局限于此。

为了验证本发明的猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂的制备和鉴定，应用于猪支原体肺炎活疫苗和灭活疫苗时对抗原谱的补充能力和免疫增强能力，以及攻毒保护效力，特做以下实验和制备。

实施例 1 重组猪肺炎支原体 P97R1 蛋白的制备

按照GenBank公开的猪肺炎支原体基因组序列，设计引物扩增P97R1片段。上游引物：5‘-CCGAATTCTTACCTCAGCCGCCAGCAG-3’ (SEQ ID No.3)；下游引物：5‘-GCGAAGCTTAAGCCATTGGGAAATAGTCT-3’ (SEQ ID No.4)。上下游引物中分别包含EcoRⅠ位点和 HindⅢ位点。以168株F344代猪肺炎支原体基因组为模板，PCR扩增获得P97R1基因片段，经EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切后插入pET-32a(+)载体中，得到表达重组P97R1蛋白的原核质粒载体pET-32a(+)-P97R1。转化大肠杆菌BL-21（DE3），筛选阳性克隆，DNA测序验证，得到表达重组P97R1蛋白重组基因工程菌。

用pET-32a(+)载体表达的重组P97R1蛋白的基因序列(SEQ ID No.1)为：

表达蛋白序列(SEQ ID No.2)为：

工程菌经IPTG诱导表达，所表达蛋白分子量大小与预期相符。裂解后取上清液，经镍柱亲和层析纯化得到重组P97R1蛋白，透析除盐，冻干保存。电泳纯度达90%。经Western Blot鉴定可与猪肺炎支原体阳性血清反应。

实施例2 含重组P97R1蛋白的免疫刺激复合物ISCOM-P97R1的制备

（1）20% Mega-10贮备液制备

0.4 g Mega-10（又名“N-奎酰基-N-甲基葡糖胺”）干粉溶于1.6 ml 蒸馏水中，37℃溶解后定容至2 ml。

（2）脂类混合物储备液制备

将100 mg磷脂酰胆碱与100 mg胆固醇加至10 ml 20% Mega-10中，稍加热（30-60℃）并缓慢搅拌使之完全溶解，过滤后分装，存放于-20℃备用。

（3） Quil A溶液制备

将25 mg Quil A溶于4.5 ml pH为7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中。

（4）猪肺炎支原体P97R1蛋白溶液

同实施例1所述方法制备并纯化重组P97R1蛋白，磷酸盐缓冲液溶解，测定其蛋白浓度并稀释至10 mg/ml，-20℃保存备用。

（5）ISCOM-P97R1母液的制备

取10 mg/ml的P97R1溶液3 ml，向其中加入Mega-10粉末,使Mega-10浓度为2%,于37℃下放置12 h。然后向其中加入脂类混合物储备液150μl和QuilA 溶液1350μl,混匀后于室温下放置2 h。冰浴超声处理30min，再于室温放置2h，然后转移至透析袋中以磷酸盐缓冲液为外液于4 ℃透析72 h，0.22μm滤膜过滤除菌即得, 4℃保存。负染透射电镜检查，见附图1，可见笼状颗粒结构。

实施例3 猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂的制备

当制备仅含ISCOM-P97R1成分的猪支原体肺炎疫苗专用稀释液时，其制备方法为：取Quil A浓度为1.67mg/ml的ISCOM-P97R1母液适量，用适量磷酸盐缓冲液进行稀释，即得到每ml溶液含有：Quil A 0.1-1毫克，胆固醇0.02-0.2毫克，磷脂酰胆碱0.02-0.2毫克，P97R1抗原0.4-4毫克的ISCOM-P97R1的疫苗专用稀释液。

当制备含有ISCOM-P97R1成分，以及其他水佐剂成分的猪支原体肺炎疫苗专用稀释液时，其制备方法为：先分别配制ISCOM-P97R1母液、左旋咪唑母液、黄芪多糖母液、卡波姆母液，再用磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度即得疫苗专用稀释剂。具体步骤如下：

（1）ISCOM-P97R1母液的制备：同上所述方法制备得到Quil A浓度为1.67mg/ml的ISCOM-P97R1母液。

（2）左旋咪唑母液的制备：取适量的左旋咪唑溶解于磷酸盐缓冲液中配制得到200mg/ml的左旋咪唑母液。

（3）黄芪多糖母液的制备：取适量的黄芪多糖溶解于磷酸盐缓冲液中配制得到250mg/ml的黄芪多糖母液。

（4）卡波姆母液的制备：取适量卡波姆（卡波姆974P或971P）溶解于蒸馏水，室温放置过夜使其充分溶胀得到20mg/ml的卡波姆溶液，加入3M氢氧化钠溶液调节溶液pH值至7.2，加适量蒸馏水调节卡波姆浓度为15mg/ml,得到15mg/ml的卡波姆母液。

（5）猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂的制备：以100ml稀释剂为例进行配制时，取Quil A浓度为1.67mg/ml的ISCOM-P97R1母液适量，同时取200mg/ml的左旋咪唑母液、或/和250mg/ml的黄芪多糖母液、或/和15mg/ml的卡波姆母液中的一种或多种各适量，用磷酸盐缓冲液进行一定稀释，即得到每ml溶液中含有Quil A 0.1-1毫克的ISCOM-P97R1、左旋咪唑2-20毫克、或/和黄芪多糖20-100毫克、或/和卡波姆3-10毫克的猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂。

实施例4 使用猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂的活疫苗的免疫原性评价

一、实验材料：

1．动物：4-5周龄BALB/c小鼠，雄性，购自扬州大学比较医学中心；

2．疫苗：猪支原体肺炎（168株）活疫苗冻干粉，由南京天邦生物科技有限公司提供，每头份含猪肺炎支原体168株活菌10⁷CCU。

二、实验方法

1. 疫苗配制：

按实施例3所述方法制备猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂。用猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂直接溶解猪支原体肺炎（168株）活疫苗冻干粉，按猪用头份计算，用1ml稀释剂溶解1头份活疫苗。同样用磷酸盐缓冲液代替专用稀释剂溶解活疫苗冻干粉，作为普通活疫苗对照。

2. 小鼠免疫：

将小鼠随机分组，共分3组，每组10只，分别为G1对照组、G2普通活疫苗组、G3专用稀释剂活疫苗组。其中G2普通活疫苗组动物免疫用磷酸盐缓冲液溶解的活疫苗，G3专用稀释剂活疫苗组动物免疫用专用稀释剂溶解的活疫苗，G1对照组动物免疫等体积磷酸盐缓冲液。每只小鼠后腿肌肉注射免疫100μl，其中活疫苗含量为10⁶CCU。共免疫两次，间隔2周。

3. 血清抗体检测：

从第二次免疫后7天起开始每周采血，检测血清中猪肺炎支原体全菌抗原特异性IgG抗体水平及猪肺炎支原体P97R1抗原特异性IgG抗体水平。免疫后以猪肺炎支原体168株全菌蛋白或表达纯化的P97R1蛋白为包被抗原检测血清抗体的产生情况。将抗原蛋白溶解于0.05 mM pH 9.6 的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中，调整浓度为10 μg/mL，得到包被抗原溶液。向96孔酶标板中每孔加入100 μL包被抗原，4℃包被过夜。弃去包被液，加入磷酸盐缓冲液配制的3% 牛血清白蛋白（BSA）封闭液200 μL，37 ℃封闭1 h。弃去封闭液，加入用磷酸盐缓冲液配制的1% BSA稀释剂稀释的血清样本100 μL（稀释比1：100），37 ℃孵育1 h。弃去血清，用洗涤液即含0.05% Tween-20的磷酸盐缓冲液洗涤5次，每次5分钟。洗涤后，每孔加入用磷酸盐缓冲液配制的1% BSA稀释剂稀释的羊抗小鼠酶标二抗100 μL（稀释比1：10000），37 ℃孵育1 h。弃去二抗，同上洗涤。洗涤后，每孔加入100 μL底物液（底物A：3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)200 mg，无水乙醇100 mL，加双蒸水至1000 mL。底物B：在6.4 mL 0.75%过氧化氢尿素溶液中加入0.1 M柠檬酸-0.2 M磷酸二氢钠缓冲液直至1000 mL，调节pH至5.0。将底物A和B等体积混合即得），37 ℃反应30 min后，加入50 μL 2M H₂SO₄终止反应，用酶标仪在450nm波长测定每孔的光密度值OD_450nm。

三、实验结果

检测结果结果如图2和图3所示，图中的白柱为G1对照组、黑柱为G2普通活疫苗组，灰柱为G3专用稀释剂活疫苗组，图2为猪肺炎支原体全菌蛋白抗体水平检测，图3为猪肺炎支原体P97R1蛋白抗体水平检测。

结果表明，第二次免疫后一周可在两个免疫组动物血清中检测到明显的猪肺炎支原体全菌蛋白抗体，专用稀释剂活疫苗组的血清抗体水平显著高于普通活疫苗组动物的血清抗体，并在所监测的四周时间范围内维持该优势不变，说明使用本发明的猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂可显著提高活疫苗的免疫刺激能力。同时，第二次免疫后一周开始在专用稀释剂活疫苗组动物血清中可检测到明显的P97R1蛋白抗体，而在普通活疫苗组及对照组动物血清中无此抗体，说明使用本发明的猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂可刺激机体产生对猪肺炎支原体P97R1抗原的免疫应答，补充疫苗抗原谱，提高免疫力。

实施例5 使用猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂的灭活疫苗的免疫原性评价

一、实验材料：

2．疫苗：猪支原体肺炎灭活疫苗（NJ株），由江苏省农业科学院兽医研究所自制，每头份含猪肺炎支原体NJ株灭活菌体10⁹CCU。

二、实验方法

1. 疫苗配制：

按实施例3所述方法制备猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂。用猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂直接稀释猪支原体肺炎灭活疫苗（NJ株）。

用常规油苗制备方法制备猪支原体肺炎灭活疫苗，作为普通灭活疫苗对照，具体制备方法为：取白油94份，加入6份Span-80，混合均匀，灭菌备用，此为油相；向96份猪支原体肺炎灭活抗原溶液中加入4份Tween-80，充分振摇致完全溶解，此为水相。取适量油相，开动乳化剂缓慢乳化，然后将油相1/3体积的水相缓慢加入油相中，乳化4-6分钟，即得。

2. 小鼠免疫：

将小鼠随机分组，共分3组，每组10只，分别为G1对照组、G2普通灭活疫苗组、G3专用稀释剂灭活疫苗组。其中G2普通灭活疫苗组动物免疫用白油佐剂制备的常规灭活疫苗，G3专用稀释剂活疫苗组动物免疫用专用稀释剂稀释的灭活疫苗，G1对照组动物免疫等体积磷酸盐缓冲液。每只小鼠后腿肌肉注射免疫100μl，其中灭活疫苗含量为10⁸CCU。共免疫两次，间隔2周。

3. 血清抗体检测：

三、实验结果

检测结果如图4和图5所示，图中的图中的白柱为G1对照组、黑柱为G2普通活疫苗组，灰柱为G3专用稀释剂活疫苗组，图4为猪肺炎支原体全菌蛋白抗体水平检测，图5为猪肺炎支原体P97R1蛋白抗体水平检测。

结果表明，第二次免疫后一周开始可在两个免疫组动物血清中检测到明显的猪肺炎支原体全菌蛋白抗体，说明使用本发明的猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂可显著提高灭活疫苗的免疫刺激能力，效果与普通白油佐剂基本相当。

同时第二次免疫后一周开始在专用稀释剂活疫苗组动物血清中可检测到明显的P97R1蛋白抗体，而在普通白油佐剂的灭疫苗组及对照组动物血清中无此抗体，说明使用本发明的猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂可刺激机体产生对猪肺炎支原体P97R1抗原的免疫应答，补充疫苗抗原谱，提高免疫力。

实施例6 使用猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂的活疫苗及灭活疫苗攻毒保护效力评价

一、实验材料

1. 动物：5-10日龄苏钟猪，购自六合竹镇畜禽养殖科技示范园；

2. 疫苗：猪支原体肺炎（168株）活疫苗冻干粉，由南京天邦生物科技有限公司提供，每头份含猪肺炎支原体168株活菌10⁷CCU；猪支原体肺炎灭活疫苗（NJ株），由江苏省农业科学院兽医研究所自制，每头份含猪肺炎支原体NJ株灭活菌体10⁹CCU；

3. 攻毒用强毒：猪肺炎支原体JS株及其组织毒，由南京天邦生物科技有限公司提供。

二、实验方法

1. 疫苗配制

按实施例3所述方法制备得到猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂。用专用稀释剂直接溶解猪支原体肺炎（168株）活疫苗冻干粉配制活疫苗；用专用稀释剂稀释猪支原体肺炎灭活疫苗（NJ株）抗原配制灭活疫苗。

2. 免疫

采用5-10日龄猪肺炎支原体血清抗体阴性猪，随机分组，每组5头，首先设置一组为G1健康对照组，即不免疫不攻毒，另设一组为G6攻毒对照组，即不免疫只攻毒，其余组分别免疫普通活疫苗（168株）(G2组)、专用稀释剂活疫苗（168株）（G3组）、普通油包水灭活疫苗（NJ株）（G4组）、专用稀释剂灭活疫苗（NJ株）（G5组），均攻毒。采用颈部肌肉注射方式免疫。共免疫2次，间隔2周。

3. 攻毒

于动物两月龄时气管内注射猪肺炎支原体强毒攻毒。强毒配制方法：用3 ml生理盐水溶解冻干组织毒，加入1 ml新鲜培养毒，共注射4 ml/头。

4. 剖检评分

攻毒后25天处死动物，参照MADEC和KOBISCH（1982）报道的方法对实验猪肺部的损伤进行评分。整个肺脏分左心叶（LCL）、左尖叶（LAL）、左膈叶（LDL）、右心叶（RCL）、右尖叶（RAL）、右膈叶（RDL）和副叶（IL），共7个肺叶。每个肺脏的损伤分数为上述7个肺叶的背侧面和腹侧面损伤得分之和，总分为28分。每个肺叶按照损伤的面积分别打0-4分，其中无损伤为0分，1-25%面积损伤为1分，26-50%面积损伤为2分，51-75%面积损伤为3分，76-100%面积损伤为4分。

三、实验结果

1. 安全检验

免疫前及免疫后3天，连续3天测定肛温，普通油包水灭活疫苗组动物体温在第1、2天时稍有升高（1℃以内），其他组动物无明显体温变化；

攻毒后25天剖杀动物，取肌肉注射部位组织病理切片检查，发现普通油包水灭活疫苗组动物有3头动物发现灶性肉芽肿，其余组动物无明显病理变化。

试验结果说明使用本稀释剂的疫苗通过肌肉注射免疫无明显的全身及局部不良反应，对实验猪安全。

2. 攻毒保护

攻毒后25天剖杀动物，对肺部支原体肺炎病变程度进行评分，结果见图6。

结果表明，用普通活疫苗直接进行肌肉注射免疫，无法提供明显的攻毒保护效力，说明此商品化的肺内注射疫苗无法直接用于肌肉注射免疫动物（G2组）；当活疫苗使用专用的疫苗稀释剂后肌肉注射免疫呈现出显著的抗攻毒保护能力，说明该专用稀释剂能显著增加活疫苗的免疫刺激能力，从而在肌肉注射条件能够下为动物提供有效攻毒保护（G3组）。在应用于灭活疫苗时，该专用稀释剂依然能够提供较好的免疫增强能力（G5组），其免疫效果与使用油包水佐剂的灭活疫苗（G4组）相当。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂及其制备方法

<130> 刘茂军,邵国青,张映,聂向庭.

猪肺炎支原体P97基因抗原决定簇R1区的克隆与表达.江苏农业学报.2005,2

1(3):207-211

<140> 无

<141> 2013-01-05

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工构建

<400> 1

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120

ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360

catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420

ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480

gctgatatcg gatccgaatt cttacctcag ccgccagcag ctaaacctga agcagcaaaa 540

ccagtagcag ctaaacctga agcagcaaaa ccagtagcag ctaaacctga agcagcaaaa 600

ccagtagcag ctaaacctga agcagcaaaa ccagtagcgg ctaaacctga agcagctaaa 660

ccagtagcag ctaaaccagt tgctactaat actaatacta atactggctt ttcacttaca 720

aataaaccaa aagaagacta tttcccaatg gcttaa 756

<210> 2

<211> 251

<212> PRT

<213> 大肠杆菌表达

<400> 2

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Claims

1.一种猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂，其特征在于疫苗专用稀释剂中含有以重组猪肺炎支原体P97R1抗原制备的免疫刺激复合物ISCOM-P97R1，具体为每ml猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂中含有：Quil A 0.1-1毫克、胆固醇0.02-0.2毫克、磷脂酰胆碱0.02-0.2毫克、P97R1抗原0.4-4毫克。

2.权利要求1的猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂的制备方法，其特征在于先按以下比例配制高浓度母液，再用磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度即得疫苗专用稀释剂，具体步骤包括：A）取磷酸盐缓冲液溶解得到的10 mg/ml的P97R1溶液3 ml，向其中加入Mega-10粉末,使Mega-10浓度为2%,于37℃下放置12 h；然后向其中加入含10 mg/ml磷脂酰胆碱和10 mg/ml胆固醇的20% Mega-10溶液的脂类混合物储备液150μl，再加入含5.56mg/ml QuilA的磷酸盐缓冲液的QuilA 溶液1350μl，混匀后于室温下放置2 h；B）冰浴超声处理30min，再于室温放置2h， C）然后转移至透析袋中以磷酸盐缓冲液为外液于4 ℃透析72 h，0.22μm滤膜过滤除菌即得到Quil A浓度为1.67mg/ml的ISCOM-P97R1母液；D）取ISCOM-P97R1母液适量，用适量磷酸盐缓冲液进行稀释，即得到每ml溶液中Quil A含量为0.1-1毫克的ISCOM-P97R1的疫苗专用稀释液。

3.如权利要求1所述的猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂，其特征在于还含有左旋咪唑、或/和黄芪多糖、或/和卡波姆水性疫苗佐剂，其中，每ml疫苗专用稀释液的溶液中还含有水性疫苗佐剂成分的含量为：左旋咪唑2-20毫克、或/和黄芪多糖20-100毫克、或/和卡波姆3-10毫克。

4.权利要求3的猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂的制备方法，其特征在于先分别配制ISCOM-P97R1母液、左旋咪唑母液、黄芪多糖母液、卡波姆母液，再用磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度即得疫苗专用稀释剂，具体步骤如下：

（5）猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂的制备：

以100ml稀释剂为例进行配制时，取Quil A浓度为1.67mg/ml的ISCOM-P97R1母液适量，同时取200mg/ml的左旋咪唑母液、或/和250mg/ml的黄芪多糖母液、或/和15mg/ml的卡波姆母液中的一种或多种各适量，用磷酸盐缓冲液进行一定稀释，即得到每ml溶液中含有Quil A 0.1-1毫克的ISCOM-P97R1、左旋咪唑2-20毫克、或/和黄芪多糖20-100毫克、或/和卡波姆3-10毫克的猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂。