CN101954079B

CN101954079B - 猪支原体肺炎活疫苗的疫苗佐剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101954079B
Application number: CN2010102880258A
Authority: CN
Inventors: 熊祺琰; 邵国青; 张道华; 冯志新; 刘茂军
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-09-21
Filing date: 2010-09-21
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2030-09-21
Also published as: CN101954079A

Abstract

本发明的猪支原体肺炎活疫苗的疫苗佐剂，主要由ISCOM基质、左旋咪唑、中草药多糖以及磷酸盐缓冲液配制而成，所述佐剂的每ml溶液中含有：ISCOM基质中的Quil A为0.1～2mg、左旋咪唑为2～10mg、中草药多糖为20～100mg、其余为磷酸盐缓冲液。由于将上述3种物质配合使用，能更好的发挥各自特长，取长补短，使佐剂更能增强猪支原体肺炎活疫苗的免疫刺激能力，加强疫苗免疫效果。还具有制备方法简单方便，佐剂性能稳定，便于量产等优点。应用时，只需将适当比例的猪支原体肺炎活疫苗与本发明的佐剂混合后即可进行肌肉注射免疫，实现猪支原体肺炎活疫苗的肌肉注射免疫，克服了现行肺内注射免疫的缺点。

Description

猪支原体肺炎活疫苗的疫苗佐剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种疫苗佐剂，特别是一种对猪支原体肺炎活疫苗没有毒性的、并能特异性增强其免疫刺激能力的疫苗佐剂。

背景技术

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是猪地方流行性肺炎、猪气喘病的主要病原。单纯由猪肺炎支原体引起的疾病称为猪支原体肺炎(Mycoplasma Pneumoniae ofSwine，MPS)，主要症状为咳嗽和气喘。该病主要引起猪的饲料转化率下降和生长受阻，发病率高、死亡率低。猪支原体肺炎在世界范围内广泛流行，给现代养猪业造成重大经济损失。

猪支原体肺炎是一种顽固性慢性传染病，药物治疗效果不够理想，停药后容易复发，该病一旦在猪场流行，就很难根除。因此，预防、控制和净化猪支原体肺炎须采取早期诊断、及时隔离、抗生素治疗或淘汰病猪、疫苗预防、全进全出、严格消毒等综合性措施，其中疫苗预防在控制猪支原体肺炎中起着关键性的作用。

目前，国内外对于该病的防治主要依靠国外进口灭活疫苗，其中以美国辉瑞动物保健品公司采用Amphigen佐剂制备的“瑞倍适”灭活疫苗应用最为广泛。但灭活疫苗的保护效力不足、需要多次免疫且成本较高，并不能完全满足实际的需要。减毒活疫苗能在体内短暂增殖，具有接种剂量小、接种次数少、免疫效果强而持久的优势。国内研究者在猪支原体肺炎活疫苗的开发上做了大量而有价值的工作，已研制的活疫苗(如江苏省农业科学院兽医研究所研制申报的猪支原体肺炎(168株)活疫苗[证号：(2007)新兽药证字10号])免疫效力优于灭活疫苗，而成本相对较低，具有很强的市场竞争力。但由于现有活疫苗采用的是肺内注射的免疫途径，一定程度上影响了疫苗的广泛推广，因此，开发新的方便的免疫途径成为进一步研究的迫切需要。肺内免疫的优势在于活疫苗可直接到达肺部起效，而当采用其他的免疫途径时作用较为间接，同等剂量下的免疫效力势必较弱，因此，如何增强疫苗的免疫刺激能力是开发该疫苗非肺内注射免疫途径的技术关键。向疫苗中添加佐剂是增强疫苗免疫效力的主要手段。佐剂(adjuvant)，是指一类预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强性物质。最常见的佐剂为油类佐剂，例如弗氏佐剂、白油佐剂、MF-59、SAF等。这类佐剂通常具有良好的免疫增强作用，但是由于油类物质对细胞膜的破坏性，对于减毒活疫苗而言，油包水类佐剂不适用，而即便是水包油类佐剂对其稳定性和制备工艺的要求也很高。

发明内容

本发明的主要目的在于公开一种对猪支原体肺炎活疫苗没有毒性的、不显著影响活疫苗活力的、并能增强其免疫刺激能力的适用于猪支原体肺炎活疫苗的疫苗佐剂。

本发明的另一个目的是为上述疫苗佐剂提供一种操作简单方便的制备方法。

本发明的再一个目的是公开该佐剂在猪支原体肺炎活疫苗免疫中的应用。

本发明的目的通过以下措施即可实现：

本发明的猪支原体肺炎活疫苗的疫苗佐剂，该佐剂溶液中含有ISCOM基质、左旋咪唑、中草药多糖以及磷酸盐缓冲液，所述佐剂的每ml溶液中含有：ISCOM基质中的QuilA为0.1～2mg、左旋咪唑为2～10mg、中草药多糖为20～100mg、其余为磷酸盐缓冲液。

上述中草药多糖选用香菇多糖或黄芪多糖或枸杞多糖或女贞子多糖。

本发明所述疫苗佐剂的制备方法，包括：先配制高浓度母液，再配制低浓度佐剂溶液，最后用磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度，过滤除菌后即得，其具体步骤如下：

A)先配制高浓度母液：

1)、ISCOM基质母液：取适量10mg/ml的脂类混合物贮备液加入无菌磷酸盐缓冲液中，然后加入适量20mg/ml Quil A贮备液，使终浓度为Quil A 5mg/ml、磷脂酰胆碱1mg/ml、胆固醇1mg/ml，充分混匀后冰浴超声处理，室温放置1.5h后，转移至透析袋中，以磷酸盐缓冲液为外液室温透析三天，过0.22μm滤膜除菌后于4℃保存，得Quil A浓度为5mg/ml的ISCOM基质母液；

2)、左旋咪唑母液：用市售的左旋咪唑含量为50mg/ml的兽用盐酸左旋咪唑注射液为50mg/ml的左旋咪唑母液；

3)、中草药多糖母液：将适量的香菇多糖或黄芪多糖或枸杞多糖或女贞子多糖粉末溶解于磷酸盐缓冲液中配制得到500mg/ml的中草药多糖母液；

B)配制低浓度佐剂溶液：

以100ml佐剂为例进行配制时，分别取Quil A浓度为5mg/ml的ISCOM基质母液2～40ml、50mg/ml的左旋咪唑母液4～20ml、500mg/ml的中草药多糖母液4～20ml、与其余为磷酸盐缓冲液稀释混合均匀过滤除菌后，即为每ml溶液中含有Quil A为0.1～2mg的ISCOM基质、左旋咪唑为2～10mg、中草药多糖为20～100mg的疫苗佐剂。

上述10mg/ml的脂类混合物贮备液配制时，先将适量的Mega-10干粉溶于蒸馏水中，使浓度为20％，稍加热使之溶解得20％的Mega-10贮备液，再取适量磷脂酰胆碱和胆固醇投入20％Mega-10贮备液中，使磷脂酰胆碱和胆固醇浓度都为10mg/ml，稍加热溶解，得10mg/ml的脂类混合物贮备液，存放于-20℃备用，使用时放到37℃温箱中融化；所述20mg/ml Quil A贮备液配制时，将适量的Quil A溶于磷酸盐缓冲液中，使浓度为20mg/ml，得20mg/ml QuilA贮备液。

本发明的疫苗佐剂在猪支原体肺炎活疫苗中应用时，将猪支原体肺炎活疫苗与疫苗佐剂按体积比为1∶1～1∶5，优选体积比为1∶2～1∶3，混合后为含佐剂的猪支原体肺炎活疫苗，即可将猪支原体肺炎活疫苗由肺内注射免疫改进为肌肉注射免疫。

ISCOM(immunostimulating complex)基质是一种不含有抗原成分的免疫刺激复合物，称为免疫刺激复合物基质，由QuilA(皂苷活性成分)、胆固醇和磷脂酰胆碱制备得到，其特点在于能有效地活化辅助型T细胞和细胞毒性T细胞，促进细胞免疫应答，尤其是Th1型细胞免疫应答，其次，ISCOM基质为纳米级别的颗粒，容易被免疫细胞识别，能更有效地激活免疫。左旋咪唑是一种广谱驱虫药，同时研究发现其具有明显的免疫调节作用。枸杞多糖、香菇多糖、黄芪多糖、女贞子多糖等多种中草药多糖对免疫系统都有重要的调节功能，包括激活免疫细胞、诱导细胞因子、活化补体、还能有效增强体内细胞免疫。本发明将上述3种物质配合使用，能更好的发挥各自特长，取长补短，使佐剂更能增强猪支原体肺炎活疫苗的免疫刺激能力，加强疫苗免疫效果。还具有制备方法简单方便，佐剂性能稳定，便于量产等优点。应用时，只需将适当比例的猪支原体肺炎活疫苗与本发明佐剂混合后即可进行肌肉注射免疫，实现猪支原体肺炎活疫苗的肌肉注射免疫，克服了现行肺内注射猪支原体肺炎活疫苗免疫的缺点。

附图说明

图1是本发明佐剂中的有效成分分别对猪支原体肺炎活疫苗的毒性检测图；

图2是本发明佐剂不同剂量的攻毒保护效力图。图中误差线表示的是样本的标准偏差；*表示与攻毒对照组在统计学上有显著差异(p＜0.05)。

具体实施方式

结合具体实施例对本发明进行进一步描述和论证，但是本发明所包括的内容并不局限于此。

为了验证本发明的佐剂对猪支原体肺炎活疫苗既没有毒性、又能增强猪支原体肺炎活疫苗的免疫刺激能力，特做以下实验和制备。

实施例1不同佐剂成分对猪支原体肺炎活疫苗的毒性检测

一、实验材料

1、疫苗：猪支原体肺炎(168株)活疫苗，由南京天邦生物科技有限公司提供；

2、佐剂成分：黄芪多糖(购自陕西锦泰生物工程有限公司)；盐酸左旋咪唑注射液(购自江苏华东贝尔生物药业有限公司)；ISCOM基质(实验室自制)。

二、实验方法：

将各种不同佐剂成分分别用磷酸盐缓冲液配制成一定的浓度的溶液，各种佐剂成分的浓度如下：

黄芪多糖：200mg/ml

左旋咪唑：25mg/ml

ISCOM基质：5mg/ml(所含Quil A成分浓度)

上述三种佐剂溶液分别与猪支原体肺炎168株活疫苗溶液按体积比5∶1混合，20分钟后取样，测定CCU(color change unit，颜色改变单位)；同时以磷酸盐缓冲液作为对照，比较两者CCU的差异，判断佐剂对活疫苗的毒性。

三、实验结果：

结果显示当体外共同孵育20分钟时，与磷酸盐缓冲液相比，几种佐剂成分在各自特定的浓度下都不会影响支原体肺炎活疫苗的活力，CCU测定结果无变化(图1)。说明这几种佐剂成分在小于或等于该特定浓度时都可作为猪支原体肺炎活疫苗的佐剂使用。

实施例2适用于猪支原体肺炎活疫苗的佐剂及其制备

本发明的猪支原体肺炎活疫苗的疫苗佐剂，其特征在于该佐剂溶液中含有ISCOM基质、左旋咪唑、中草药多糖以及磷酸盐缓冲液，所述佐剂的每ml溶液中含有：ISCOM基质中的QuilA为0.1～2mg、左旋咪唑为2～10mg、中草药多糖为20～100mg、其余为磷酸盐缓冲液。

本发明所述疫苗佐剂的制备方法，包括：先配制高浓度母液，再配制低浓度佐剂溶液，最后用磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度，过滤除菌后即得，其特征在于具体步骤如下：

A)先配制高浓度母液：

1)、ISCOM基质母液：取适量10mg/ml的脂类混合物贮备液加入无菌磷酸盐缓冲液中，然后加入适量20mg/ml Quil A贮备液，使终浓度为Quil A 5mg/ml、磷脂酰胆碱1mg/ml、胆固醇1mg/ml，充分混匀后冰浴超声处理，室温放置1.5h后，转移至透析袋中，以磷酸盐缓冲液为外液室温透析三天，过0.22μm滤膜除菌后于4℃保存，得Quil A浓度为5mg/ml的ISCOM基质母液。

B)配制低浓度佐剂溶液：

以100ml佐剂为例进行配制时，分别取下述各例剂量的上述母液均可制得合格的疫苗佐剂：

1)分别取Quil A浓度为5mg/ml的ISCOM基质母液2ml、50mg/ml的左旋咪唑母液4ml、500mg/ml的中草药多糖母液4ml、与磷酸盐缓冲液90ml稀释混合均匀过滤除菌后，即为每ml溶液中含有Quil A为0.1mg的ISCOM基质、左旋咪唑为2mg、中草药多糖为20mg的疫苗佐剂。

2)分别取Quil A浓度为5mg/ml的ISCOM基质母液2ml、50mg/ml的左旋咪唑母液4ml、500mg/ml的中草药多糖母液20ml、与磷酸盐缓冲液74ml稀释混合均匀过滤除菌后，即为每ml溶液中含有QuilA为0.1mg的ISCOM基质、左旋咪唑为2mg、中草药多糖为100mg的疫苗佐剂。

3)分别取Quil A浓度为5mg/ml的ISCOM基质母液2ml、50mg/ml的左旋咪唑母液10ml、500mg/ml的中草药多糖母液20ml、与磷酸盐缓冲液68ml稀释混合均匀过滤除菌后，即为每ml溶液中含有QuilA为0.1mg的ISCOM基质、左旋咪唑为5mg、中草药多糖为100mg的疫苗佐剂。

4)分别取Quil A浓度为5mg/ml的ISCOM基质母液2ml、50mg/ml的左旋咪唑母液20ml、500mg/ml的中草药多糖母液20ml、与磷酸盐缓冲液58ml稀释混合均匀过滤除菌后，即为每ml溶液中含有QuilA为0.1mg的ISCOM基质、左旋咪唑为10mg、中草药多糖为100mg的疫苗佐剂。

5)分别取QuilA浓度为5mg/ml的ISCOM基质母液20ml、50mg/ml的左旋咪唑母液4ml、500mg/ml的中草药多糖母液4ml、与磷酸盐缓冲液72ml稀释混合均匀过滤除菌后，即为每ml溶液中含有Quil A为1mg的ISCOM基质、左旋咪唑为2mg、中草药多糖为20mg的疫苗佐剂。

6)分别取Quil A浓度为5mg/ml的ISCOM基质母液20ml、50mg/ml的左旋咪唑母液10ml、500mg/ml的中草药多糖母液10ml、与磷酸盐缓冲液60ml稀释混合均匀过滤除菌后，即为每ml溶液中含有QuilA为1mg的ISCOM基质、左旋咪唑为5mg、中草药多糖为50mg的疫苗佐剂。

7)分别取QuilA浓度为5mg/ml的ISCOM基质母液20ml、50mg/ml的左旋咪唑母液20ml、500mg/ml的中草药多糖母液20ml、与磷酸盐缓冲液40ml稀释混合均匀过滤除菌后，即为每ml溶液中含有Quil A为1mg的ISCOM基质、左旋咪唑为10mg、中草药多糖为100mg的疫苗佐剂。

8)分别取QuilA浓度为5mg/ml的ISCOM基质母液40ml、50mg/ml的左旋咪唑母液4ml、500mg/ml的中草药多糖母液4ml、与磷酸盐缓冲液52ml稀释混合均匀过滤除菌后，即为每ml溶液中含有QuilA为2mg的ISCOM基质、左旋咪唑为2mg、中草药多糖为20mg的疫苗佐剂。

9)分别取QuilA浓度为5mg/ml的ISCOM基质母液40ml、50mg/ml的左旋咪唑母液10ml、500mg/ml的中草药多糖母液10ml、与磷酸盐缓冲液40ml稀释混合均匀过滤除菌后，即为每ml溶液中含有QuilA为2mg的ISCOM基质、左旋咪唑为5mg、中草药多糖为50mg的疫苗佐剂。

10)分别取Quil A浓度为5mg/ml的ISCOM基质母液40ml、50mg/ml的左旋咪唑母液20ml、500mg/ml的中草药多糖母液20ml、与磷酸盐缓冲液20ml稀释混合均匀过滤除菌后，即为每ml溶液中含有QuilA为2mg的ISCOM基质、左旋咪唑为10mg、中草药多糖为100mg的疫苗佐剂。

总之，以100ml佐剂为例进行配制时，分别取QuilA浓度为5mg/ml的ISCOM基质母液2～40ml、50mg/ml的左旋咪唑母液4～20ml、500mg/ml的中草药多糖母液4～20ml、与其余为磷酸盐缓冲液稀释混合均匀过滤除菌后，均可配制出合格的每ml溶液中含有QuilA为0.1～2mg的ISCOM基质、左旋咪唑为2～10mg、中草药多糖为20～100mg的疫苗佐剂。

配制过程中，如母液的浓度较高，可以少用点；如母液的浓度较低，可以多用点，所配制的佐剂中的几种成分的含量在上述范围内均可正常使用。

在上述的配制ISCOM(Immunostimulating complex的缩写，意即免疫刺激复合物)基质母液时，使用的10mg/ml的脂类混合物贮备液的配制方法是：先将Mega-10(又名：N-癸酰基-N-甲基葡糖胺)干粉溶于蒸馏水中，使浓度为20％，稍加热使之溶解得20％的Mega-10贮备液，再取适量磷脂酰胆碱和胆固醇投入20％Mega-10贮备液中，使磷脂酰胆碱和胆固醇浓度都为10mg/ml，稍加热溶解，得10mg/ml的脂类混合物贮备液，存放于-20℃备用，使用时放到37℃温箱中融化。所述20mg/ml Quil A贮备液配制时，将适量的Quil A(皂苷活性成分)溶于磷酸盐缓冲液中，使浓度为20mg/ml，得20mg/ml Quil A贮备液。

实施例3含佐剂的猪支原体肺炎活疫苗的制备

按实施例2中所述方法完成制备的疫苗佐剂，按猪支原体肺炎活疫苗与疫苗佐剂的体积比为1∶1～1∶5的比例配制混匀后即为含佐剂的猪支原体肺炎活疫苗。所述猪支原体肺炎活疫苗与疫苗佐剂的优选体积比为1∶2～1∶3。混合后为含佐剂的猪支原体肺炎活疫苗，即可将猪支原体肺炎活疫苗由肺内注射免疫改进为肌肉注射免疫。

实施例4含佐剂的猪支原体肺炎活疫苗肌肉注射免疫途径及免疫效力研究

一、实验材料

1.动物：5-10日龄苏钟猪，购自六合竹镇畜禽养殖科技示范园；

2.疫苗：猪支原体肺炎(168株)活疫苗，由南京天邦生物科技有限公司提供；

3.攻毒用强毒：猪肺炎支原体JS株及其组织毒，由南京天邦生物科技有限公司提供。

二、实验方法

1.佐剂溶液配制

按实施例2所述方法制备得到佐剂。

2.免疫

采用5-10日龄猪肺炎支原体血清抗体阴性猪，随机分组，每组5头，首先设置一组为健康对照组，即不免疫不攻毒，其余组分别为攻毒对照组、无佐剂对照组、低剂量佐剂组、高剂量佐剂组，分别免疫磷酸盐缓冲液、不含佐剂的猪支原体肺炎活疫苗、添加等体积佐剂的活疫苗，添加5倍体积佐剂的活疫苗，这四组皆于两月龄时用强毒攻毒。

免疫时如实施例3所述配制含佐剂活疫苗，配好后立即采用颈部肌肉多点注射方式免疫。

3.攻毒

免疫后8周，动物气管内注射猪肺炎支原体强毒攻毒。强毒配制方法：用3ml生理盐水溶解冻干组织毒，加入1ml新鲜培养毒，共注射4ml/头。

4.剖检评分

攻毒后25天处死动物，参照MADEC和KOBISCH(1982)报道的方法对实验猪肺部的损伤进行评分。整个肺脏分左心叶(LCL)、左尖叶(LAL)、左膈叶(LDL)、右心叶(RCL)、右尖叶(RAL)、右膈叶(RDL)和副叶(IL)，共7个肺叶。每个肺脏的损伤分数为上述7个肺叶的背侧面和腹侧面损伤得分之和，总分为28分。每个肺叶按照损伤的面积分别打0-4分，其中无损伤为0分，1-25％面积损伤为1分，26-50％面积损伤为2分，51-75％面积损伤为3分，76-100％面积损伤为4分。

三、实验结果

1.安全检验

免疫前及免疫后3天，连续3天测定肛温，各组动物均无明显发热现象；肌肉注射部位局部无明显红肿，说明添加上述佐剂的猪支原体肺炎活疫苗在所用剂量下对实验猪安全。

2.疫苗保护力比较

攻毒后25天剖杀动物，对肺部支原体肺炎病变程度进行评分，结果见图2。图中误差线表示的是样本的标准偏差；*表示与攻毒对照组在统计学上有显著差异(p＜0.05)。

结果表明，不添加佐剂时，肌肉注射活疫苗无法提供攻毒保护力，而添加佐剂后免疫，动物肺脏病变程度较攻毒对照组明显减轻，添加1倍体积佐剂的低剂量佐剂组和添加5倍体积佐剂的高剂量佐剂组都具有显著差异(p＜0.05)。

实验证明，该佐剂能有效辅助疫苗刺激动物产生免疫应答。在实施例中该佐剂与猪支原体肺炎168株活疫苗联用，可对后续强毒攻毒起到保护。

Claims

1.一种猪支原体肺炎活疫苗的疫苗佐剂，其特征在于该佐剂溶液中含有ISCOM基质、左旋咪唑、中草药多糖以及磷酸盐缓冲液，所述佐剂的每ml溶液中含有：ISCOM基质中的Quil A为0.1～2mg、左旋咪唑为2～10mg、中草药多糖为20～100mg、其余为磷酸盐缓冲液。

2.根据权利要求1所述的猪支原体肺炎活疫苗的疫苗佐剂，其特征在于所述中草药多糖选用香菇多糖或黄芪多糖或枸杞多糖或女贞子多糖。

3.权利要求1或2的疫苗佐剂的制备方法，包括：先配制高浓度母液，再配制低浓度佐剂溶液，最后用磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度，过滤除菌后即得，其特征在于具体步骤如下：

A)先配制高浓度母液：

B)配制低浓度佐剂溶液：

4.根据权利要求3所述疫苗佐剂的制备方法，其特征在于所述10mg/ml的脂类混合物贮备液配制时，先将Mega-10干粉溶于蒸馏水中，使浓度为20％，稍加热使之溶解得20％的Mega-10贮备液，再取适量磷脂酰胆碱和胆固醇投入20％Mega-10贮备液中，使磷脂酰胆碱和胆固醇浓度都为10mg/ml，稍加热溶解，得10mg/ml的脂类混合物贮备液，存放于-20℃备用，使用时放到37℃温箱中融化；所述20mg/ml Quil A贮备液配制时，将适量的Quil A溶于磷酸盐缓冲液中，使浓度为20mg/ml，得20mg/ml Quil A贮备液。