EA032284B1 - Вакцинация респираторным коронавирусом собак для защиты от инфекций в. bronchiseptica - Google Patents

Abstract

Изобретение касается применения композиции, содержащей респираторный коронавирус собак (CRCoV), в качестве вакцины против бактериального заболевания, вызванного Bordetella bronchiseptica.

Description

Данное изобретение относится к области иммунологии, в частности к области иммуногенных и вакцинных композиций. Более конкретно, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим препарат респираторного коронавируса собак (СВСоУ) для лечения или профилактики полифакторных заболеваний у собак, в частности, включающих инфекции В. ЬгопсББерОса.

Уровень техники

СВСоУ является весьма заразной респираторной инфекцией, которая передается при прямом контакте собак, через аэрозольные респираторные выделения, и при контакте с загрязненной средой или зараженными людьми. Некоторые собаки проявляют незначительные симптомы, а именно кашель, чихание и выделения из носа, в то время как другие собаки имеют субклинические инфекции без каких-либо клинических признаков, но они являются носителями вируса и могут заразить других собак. У собак, зараженных СВСоУ, заболевание может прогрессировать до пневмонии, особенно в случае сочетания инфекции с другими респираторными патогенами.

Собаки, зараженные несколькими респираторными патогенами, в частности, как вирусными, так и бактериальными патогенами, могут заразиться комплексом инфекционных респираторных заболеваний собак (СБВЭС), который является очень заразным полифакторным заболеванием, встречающимся у собак, размещенных в стесненных условиях, например, центрах временного размещения и интернатах или питомниках для обучения.

Респираторные патогены, обнаруженные у собак, инфицированных С1ВЭ. включают бактерию Вогбс1с11а ЬгопсББерОса (ВетБ с1 а1., ЬаЬ. Атт. 8с1., 29:48-52, 1977), респираторный коронавирус собак (СВСоУ) (Ег1е§ е1 а1., У1го1оду, 310(2):216-223, 2003), вирус гриппа собак (ОУ) (СгаМогй е1 а1., 8с1еисе, 310(5747):482-485, 2005), вирус парагриппа собак (СР1У) (Вши е1 а1., Ехр. Вю1. Мей., 126:140-145, 1967), Мусор1а§та супок (Сйа1кег е1 а1., МюгоЬю1о§у, 150:3491 -3497, 2004), и аденовирус собак серотипа 2 (САУ-2) (ОйсЬТеШ е1 а1., Сап. Уе1. 1., 3:238-247, 1962). На сегодняшний день не появилась ни одна вакцина против всех или большинства вышеупомянутых патогенных микроорганизмов. Защита от СБВЭС и других заболеваний нескольких патогенов традиционно сосредоточена на введении комбинированной вакцины, содержащей иммуногены, направленные против каждого из потенциальных патогенов.

Краткое описание изобретения

В данном изобретении неожиданным образом было получено то, что ранее искали в поливалентном продукте путем введения только одного антигена. В частности, благодаря введению респираторного коронавируса собак (СВСоУ) заявители выявили ослабление болезненного состояния, связанного с неСВСоУ патогенами, а именно Вогбе1е11а ЬгопсББерОса. Это позволяет не только ослабить сложное многогранное болезненное состояние с помощью только одной одновалентной композиции и/или увеличения иммуногенности и усиления эффективности борьбы против бактериальных патогенов в поливалентной композиции.

Соответственно, один из аспектов данного изобретения обеспечивает способ лечения бактериального заболевания у собаки, включающий введение собаке композиции, содержащей респираторный коронавирус собак (СВСоУ), где бактериальное заболевание вызвано Вогбе1е11а ЬгопсББерОса. В одном варианте воплощения данного изобретения, композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.

В другом варианте воплощения данного изобретения композиция дополнительно содержит один или более дополнительных иммуногенов. Более конкретно, один или более дополнительных иммуногенов выбирают из группы, состоящей из вируса парагриппа собак (СР1У), аденовируса-2 собак (САУ-2) и собачьего гриппа (С1У). В другом варианте воплощения данного изобретения один или более дополнительных иммуногенов выбирают из группы, состоящей из вируса собачьей чумы (СЭУ), парвовируса собак (СРУ), кишечного коронавируса собак (ССУ), аденовируса собак, БерЮвриа вегоуатк, в частности БерЮвриа сатсо1а, БерЮвриа дпрро1ур1ю5а, БерЮвриа 1с1егойаетоггйа§1ае, БерЮвриа ротопа и БерЮвриа ВгайДауа, вируса герпеса собак, пневмовируса собак, организмов БеББташа, видов Воггейа (крр.), видов Мусор1а§та, бешенства, ЕйгйсЫа саищ и любой их комбинации. В другом варианте воплощения данного изобретения композиция состоит по существу из СВСоУ и не содержит дополнительных иммуногенов. В другом варианте воплощения данного изобретения композиция имеет продолжительную эффективность в отношении бактериального заболевания на срок не менее 3 месяцев, или по меньшей мере 6 месяцев, или по меньшей мере 12 месяцев.

Другой вариант воплощения данного изобретения обеспечивает способ защиты от респираторных заболеваний у собаки, вызванных инфекцией В. ЬгоисЫкерйса, включающий введение собаке респираторного коронавируса собак (СВСоУ).

Другой вариант воплощения данного изобретения обеспечивает способ защиты от полифакторного респираторного заболевания собак у собаки, вызванного смешанными вирусными и бактериальными инфекциями, включающий введение собаке респираторного коронавируса собак (СВСоУ), где бактериальная инфекция вызвана В. ЬгопсББерОса.

Другой вариант воплощения данного изобретения обеспечивает способ лечения заболевания, вызываемого Вогбе1е11а ЬгопсББерОса у собаки, включающий введение собаке композиции, содержащей рес

- 1 032284 пираторный коронавирус собак (СВСоУ).

Другой вариант воплощения данного изобретения обеспечивает способ применения иммуногенной композиции в соответствии с любыми из приведенных выше вариантов воплощения изобретения для лечения или профилактики комплекса инфекционных респираторных заболеваний у собак (С1ВЭС), где композиция применяется для лечения или предотвращения инфекции от множества дыхательных патогенных микроорганизмов собак. Другой вариант воплощения данного изобретения относится к применению или способу парентерального введения иммуногенной композиции, как описано в данном изобретении.

Другой вариант воплощения данного изобретения включает производство медикамента, содержащего иммуногенную композицию, для лечения или профилактики у собак респираторной патогенной инфекции.

Эти и другие варианты воплощения, характеристики и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из подробного описания и прилагаемой формулы изобретения, изложенных в данном изобретении ниже. Понятно, что каждый из указанных выше и ниже вариантов воплощения изобретения могут быть объединены в одном варианте воплощения изобретения.

Подробное описание изобретения

Следующие определения применяются к настоящему описанию. Они заменяют любые противоречивые определения, содержащиеся в каждой отдельной ссылке, включенной в данное изобретение в качестве ссылки. Слова, которые не определены, имеют значение, обычно используемое специалистом в данной области. Кроме того, если иное не предусмотрено контекстом, формы единственного числа должны включать формы множественного числа и формы множественного числа должны включать формы единственного.

Приблизительно, при использовании в связи с измеримой числовой переменной, относится к указанному значению переменной и ко всем значениям переменной, которые включают экспериментальную погрешность указанного значения (например, в пределах 95% доверительного интервала для среднего значения), или в пределах 10 процентов от указанной величины, в зависимости от того, что больше. Если приблизительно используют в отношении временных интервалов длиной в несколько недель приблизительно 3 недели составляет от 17 до 25 дней, а от приблизительно 2 до приблизительно 4 недель составляет от 10 до 40 дней.

Вспомогательное вещество, при использовании в данном изобретении, относится к любому веществу, которое служит в качестве неспецифического стимулятора иммунного ответа. Смотрите ниже более подробное описание вспомогательных веществ.

Термин животное, при использовании в данном изобретении, включает любое животное, которое восприимчиво к инфекции СВСоУ и/или комплексу респираторных заболеваний собак, включая млекопитающих, как домашних, так и диких. Предпочтительно животным, используемым в данном изобретении, является собака или человек.

Антитело, при использовании в данном изобретении, представляет собой любой полипептид, содержащий участок связывания антигена независимо от источника, способа производства или других характеристик. Это относится к молекуле иммуноглобулина или ее фрагменту, которая специфически связывается с антигеном в результате иммунного ответа к этому антигену. Иммуноглобулины представляют собой сывороточные белки, состоящие из легких и тяжелых полипептидных цепей, имеющих постоянные и вариабельные участки, и они делятся на классы (например, 1дА, Ι§ϋ, 1дЕ, 1дС и 1дМ) на основе состава постоянного участка. Антитело, которое является специфичным для данного антигена указывает на то, что вариабельные участки антитела распознают и связывают исключительно специфический антиген. Термин включает, без ограничений, поликлональное антитело, моноклональное антитело, моноспецифическое антитело, полиспецифическое антитело, гуманизированное антитело, тетрамерное антитело, четырехвалентное антитело, полиспецифическое антитело, одноцепочечное антитело, доменспецифическое антитело, однодоменное антитело, доменно-удаленное антитело, слитый белок, слитый белок 8сРс. одноцепочечное антитело, химерное антитело, синтетическое антитело, рекомбинантное антитело, гибридное антитело, мутантное антитело и СЭВ-привитые антитела. Антитела могут быть интактными иммуноглобулинами, полученными из природных источников или из рекомбинантных источников, или могут быть иммунореактивными частями интактных иммуноглобулинов. Антитело может быть преобразовано в антигенсвязывающий белок, который включает, без ограничений, фрагменты антител, включающие, без ограничений, следующие: ЕаЬ, Е(аЬ')₂, ЕаЬ' фрагмент, Εν фрагмент, одноцепочечный Εν(δοΕν) фрагмент, Гб фрагмент, 6АЬ фрагмент, диатела, пептид СЭВ3, ограниченный ГВ3СЭВ3- ГВ4 пептид, нанотело, двухвалентное нанотело, небольшое модульное иммунофармацевтическое (δΜΙΡδ) и мини-тела и любой из указанных выше фрагментов и их химически или генетически измененных аналогов, а также другие фрагменты антител, которые сохраняют антигенсвязывающую функцию. Как правило, такие фрагменты будут содержать антигенсвязывающий домен. Как будет понятно специалистам в данной области, любая из таких молекул может быть сконструирована (например, зародышевой линией), чтобы уменьшить ее иммуногенность, увеличить ее аффинность, изменить специфичность, или для других целей.

- 2 032284

Антиген или иммуноген, при использовании в данном изобретении, относится к молекуле, которая содержит один или несколько эпитопов (линейных, конформационных или обоих вместе), что при воздействии субъекту будет индуцировать иммунный ответ, который является специфичным для данного антигена. Эпитоп является специфичным сайтом антигена, который связывается с Т-клеточным рецептором или специфичным антителом, и, как правило, содержит от приблизительно 3 аминокислотных остатков до приблизительно 20 аминокислотных остатков. Термин антиген относится к субъединице антиген антигенов отдельно и дискретно от целого организма, в котором антиген связан по своей природе, а также убитые, ослабленные или инактивированные бактерии, вирусы, грибы, паразиты и другие микроорганизмы. Термин антиген также относится к антителам, таким как антиидиотипические антитела или их фрагменты, а также синтетические пептиды мимеотопы, которые могут имитировать антиген или антигенную детерминанту (эпитоп). Термин антиген также относится к олигонуклеотиду или полинуклеотиду, который экспрессирует антиген или антигенную детерминанту в естественных условиях, например, в применениях ДНК иммунизации.

Антигенность, при использовании в данном изобретении, относится к способности белка или полипептида иммуноспецифично связываться антителом, выработанным против белка или полипептида. Термин Вогбе1е11а ЬгоисЫкербса или В. ЬгоисЫкербса относится к: живой аттенюированной бактерии Вогбе1е11а ЬгоисЫкерйса, убитому экстракту целой клетки (бактерин) Вогбе1е11а Ьгоисйщербса или клеточному бактериальному экстракту Вогбе1е11а ЬгоисЫкерйса.

Термин бактериальное заболевание или бактериальная инфекция относится к заболеванию, либо вызванному непосредственно конкретной бактерий (например, В. Ьгоисйщербса), либо усугубленному в результате действия бактериального патогена в полифакторном болезненном состоянии.

Буфер означает химическую систему, которая предотвращает изменение концентрации другого химического вещества. Протонные донорные и акцепторные системы служат в качестве буферов, предотвращая отмеченные изменения концентрации водородных ионов (рН). Еще одним примером является буферный раствор, содержащий смесь слабой кислоты и ее соли (конъюгат основания), или слабого основания его соли (конъюгат кислоты).

Собачий, при использовании в данном изобретении, включает тех животных, которых обычно называют собака, но включает других членов семейства Сашбае.

Термин клеточная линия или клетка-хозяин, при использовании в данном изобретении, означает прокариотическую или эукариотическую клетки, в которых вирус может размножаться или сохраняться.

Термин совместное введение относится к раздельному, последовательному или одновременному введению. Совместное введение антигенов или агентов может быть в той же композиции, такой как поливалентная комбинированная вакцина или отдельные композиции, содержащие различные лекарственные формы.

Термин культура, при использовании в данном изобретении, означает популяцию клеток или микроорганизмов, растущих в отсутствие других видов или типов.

Доза относится к вакцине или иммуногенной композиции, которые дают субъекту. Первая доза или усиленная начальная доза относится к дозе такой композиции данной в день 0. Вторая доза или третья доза или годовая доза относится к количеству такой композиции, данному после первой дозы, которое может быть, но не обязательно, такой же вакциной или иммуногенной композицией, как и первая доза.

Эпитоп является специфичным сайтом антигена, который связывается с Т-клеточным рецептором или специфичным антителом, и, как правило, включает от приблизительно 3 аминокислотных остатков до приблизительно 20 аминокислотных остатков.

Эксципиент, при использовании в данном изобретении, относится к нереакционноспособному носителю-компоненту вакцины или иммуногенной композиции, который не является антигеном. Предпочтительными эксципиентами являются те, которые известны в данной области для парентерального введения. Фрагмент относится к усеченной части белка или гена. Функциональный фрагмент и биологически активный фрагмент относятся к фрагменту, который сохраняет биологические свойства полноразмерного белка или гена.

Гомология или процент гомологии относится к проценту нуклеотидных или аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны или подобны остаткам в компараторной последовательности после выравнивания последовательностей и введения гэпов, если это необходимо, для достижения максимального процента гомологии последовательности, а также с учетом любых консервативных замещений как части гомологии последовательности.

Гомологи или виды гомологов включают гены, найденные в двух или более различных видах, которые обладают значительной полинуклеотидной гомологией последовательности и обладают теми же или подобными биологическими функциями и/или свойствами. Предпочтительными являются полинуклеотидные последовательности, которые представляют видов гомологов, которые гибридизуются в умеренно жестких условиях, как описано в данном изобретении в Примерах, и обладают таким же или похожим биологическими активностями и/или свойствами. В другом аспекте, полинуклеотиды, представляющие гомологичные виды, имеют более чем приблизительно 60% гомологии последовательности, бо

- 3 032284 лее чем приблизительно 70% гомологии последовательности, более чем приблизительно 80% гомологии последовательности, более чем приблизительно 90% гомологии последовательности, более чем приблизительно 95% гомологии последовательности, более чем приблизительно 96% гомологии последовательности, более чем приблизительно 97% гомологии последовательности, более чем приблизительно 98% гомологии последовательности, или более чем приблизительно 99% гомологии последовательности.

Идентичность или процент идентичности относится к проценту нуклеотидов или аминокислот в кандидатной последовательности, которые идентичны остаткам в компараторной последовательности после выравнивания обеих последовательностей и введения гэпов, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и без учета любых консервативных замещений как части идентичности последовательности.

Иммунный ответ, при использовании в данном изобретении, у субъекта относится к развитию гуморального иммунного ответа, клеточного иммунного ответа, или гуморального и клеточного иммунного ответа на антиген. Гуморальный иммунный ответ относится к ответу, по меньшей мере, частично, опосредованному антителами. Клеточный иммунный ответ является опосредованным Т-лимфоцитами или другими лейкоцитами или обоими видами, и включает выработку цитокинов, хемокинов и других подобных молекул, продуцированными активированными Т-клетками, лейкоцитами, или обоими. Иммунные ответы могут быть определены с помощью стандартных иммунологических и нейтрализационных анализов, которые известны в данной области. Иммуногенность, при использовании в данном изобретении, относится к способности белка или полипептида вызывать иммунный ответ, направленный непосредственно против бактерии или вируса, который вызывает определенную болезнь.

Иммуногенная композиция является препаратом, содержащим иммуноген, включая, например, белок, пептид, цельную клетку, инактивированный, субъединицу или ослабленный вирус, или полисахарид, или их комбинацию, введенный чтобы стимулировать гуморальные и клеточные иммунные системы реципиента на один или более антигенов, присутствующих в иммуногенной композиции. Иммунизация является процессом введения иммуногенной композиции и стимуляции иммунного или иммунногенного ответа на антиген у хозяина. Предпочтительные хозяевами являются млекопитающие, такие как собаки. Предпочтительно иммуногенная композиция представляет собой вакцину.

Иммуногенно защитное количество, при использовании в данном изобретении, является количеством антигена, эффективным для индукции иммунного ответа у реципиента, адекватного для предотвращения или ослабления признаков или симптомов заболевания, в том числе неблагоприятных последствий для здоровья или их осложнений. Гуморальный иммунитет или клеточный иммунитет или оба могут быть вызваны. Иммуногенный ответ у животного в композиции может быть оценен, например, с помощью косвенного измерения титров антител, анализов пролиферации лимфоцитов, либо непосредственно путем мониторинга признаков и симптомов после заражения штаммом дикого типа. Защитный иммунитет, обеспеченный композицией или вакциной, может быть оценен посредством измерения, например, уменьшения распространения тестовых микроорганизмов, снижения клинических признаков, таких как смертность, заболеваемость, температура и общее физическое состояние, здоровье и производительность субъекта, уменьшение патологии, общее количество и гистология жизненно важных тканей. Иммунный ответ может включать, без ограничения, индукцию клеточного и/или гуморального иммунитета. Количество композиции или вакцины, являющегося терапевтически эффективным, может варьироваться, в зависимости от конкретного используемого организма, или состояния у животного, которое лечат или вакцинируют, и может быть определено ветеринарным врачом.

Интраназальное введение, при использовании в данном изобретении, относится к введению вещества, такого как вакцина или другая композиция, в тело субъекта через нос или посредством введения в нос, и включает перенос вещества, прежде всего, через слизистую оболочку носа. Термин выделенный относится к веществу, которое находится в чистой или существенно чистой форме, например, более чем приблизительно 95% чистоты; или очищенным или обогащенным каким-либо образом из его природного окружения. Термин изолированный охватывает иммуногены, которые находятся в растворе с другими агентами/разбавителями/эксципиентами/вспомогательными веществами/белками. Лекарственное средство относится к любому агенту, который полезен при профилактике, лечении или улучшении состояния здоровья или профилактике какого-либо физиологического состояния или проявления.

Моноклональное антитело, при использовании в данном изобретении, относится к антителам, вырабатываемым одной линией гибридомных клеток, которые все направлены к одной эпитопоме на конкретном антигене. Антиген, который используется, чтобы получить моноклональное антитело, может быть предоставлен в качестве изолированного белка патогена или цельного патогена. Г ибридома является клональной клеточной линией, которая состоит из гибридных клеток, образованных путем слияния миеломной клетки и специфичной антитело-продуцирующей клетки. В общем, это моноклональные антитела мышиного происхождения. Тем не менее, термин моноклональные антитела, также относится к популяции клонов антитела, полученного против конкретного эпитопа антигена, полученного с помощью технологии фагового дисплея, или способа, который эквиваленен фаговому дисплею, или гибридных клеток не мышиного происхождения.

Пероральное введение, при использовании в данном изобретении, относится к введению вещест

- 4 032284 ва, такого как вакцины или другие композиции, в тело субъекта через полость рта или посредством введения в полость рта, и включает глотание или транспорт через пероральные слизистые оболочки (например, сублингвальное или буккальное поглощение) или то и другое. Интратрахеальный также означает пероральное введение.

Ороназальное введение, при использовании в данном изобретении, относится к введению вещества, такого как композиции или вакцины, в тело субъекта через нос и рот или посредством введения в нос и рот, как будет происходить, например, путем размещения одной или нескольких капель в нос. Ороназальное введение включает процессы транспорта, связанные с пероральным и интраназальным введением.

Парентеральное введение, при использовании в данном изобретении, относится к введению вещества, такого как композиции или вакцины, в организм субъекта через или с помощью маршрута, который не включает пищеварительный тракт. Парентеральное введение включает подкожное, внутримышечное, внутриартериальное и внутривенное введение. Для целей раскрытия сущности данного изобретения, парентеральное введение включает маршруты введения, которые в первую очередь включают транспорт вещества через слизистую ткань в полости рта, носа, трахеи и легких.

Термин патоген или патогенный микроорганизм, при использовании в данном изобретении, означает микроорганизм, - например, СР1У, СЛУ-2, СВСоУ, Мусор1а8ша суиок, С1У, или Вог4с1с11а Ьгоисйщерйса - который способен индуцировать или вызывать заболевание, болезнь или ненормальное состояние у животного-хозяина, предпочтительно респираторное заболевание, такое как СГКПС.

Фармацевтически приемлемый относится к веществам, которые, в рамках обоснованного медицинского заключения, подходят для применения в контакте с тканями субъектов без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.п., соответствуют отношению разумного риска и полезного эффекта, эффективны для целевого использования.

Поликлональное антитело, при использовании в данном изобретении, относится к смешанной популяции антител, полученных против конкретного патогена или антигена. В общем, популяция содержит множество групп антител, причем каждая группа направлена против конкретного эпитопа патогена или антигена. Чтобы получить поликлональные антитела, цельный патогенный микроорганизм или изолированный антиген, вводят путем прививки или инфекции в хозяина, это побуждает хозяина продуцировать антитела против патогена или антигена.

Термин полинуклеотид, при использовании в данном изобретении, означает органическую полимерную молекулу, состоящую из нуклеотидных мономеров, ковалентно связанных в цепочку. ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) и РНК (рибонуклеиновая кислота), являются примерами полинуклеотидов с различимой биологической функцией.

Термин полипептид, при использовании в данном изобретении, означает органическую полимерную молекулу, состоящую из двух или более аминокислот, соединенных в цепь.

Респираторное введение, при использовании в данном изобретении, относится к введению вещества, такого как вакцина или другая композиция, в тело субъекта путем ингаляции через распыленное при помощи небулайзера (распыленного) вещества. В респираторных введениях основной транспортный механизм включает поглощение распыленного вещества через слизистую оболочку в трахее, бронхах и легких и, следовательно, отличается от интраназального или перорального введения.

Термины специфическое связывание, специфически связывается, и т.п., определяются как связывание двух или более молекул, образующих комплекс, который поддается измерению в физиологических условиях или условиях анализа и является селективным. Антитело или другой ингибитор, как говорят, специфически связываются с белком, если, в соответствии с выбранными условиями, такое связывание по существу не ингибируется, в то же время неспецифическое связывание ингибируется. Специфическое связывание характеризуется высоким сродством и является селективным для соединения или белка. Неспецифическое связывание обычно имеет низкое сродство. Связывание в 1дС антителах, например, как правило, характеризуется сродством по меньшей мере приблизительно 10^-7 М и выше, например по меньшей мере приблизительно 10^-8 М или выше, или по меньшей мере приблизительно 10^-9 М или выше, или по меньшей мере приблизительно 10^-10 М или выше, или по меньшей мере приблизительно 10^-11 М или выше, или по меньшей мере приблизительно 10^-12 М или выше. Термин также применим, когда, например, антигенсвязывающий домен является специфичным для конкретного эпитопа, который не переносится с помощью многочисленных антигенов, и в этом случае антитело, несущее антигенсвязывающий домен, обычно не связывает другие антигены.

Специфичный иммуногенный фрагмент, при использовании в данном изобретении, относится к части последовательности, узнаваемой антителом или Т-клеткой, специфичной для этой последовательности.

Субъект, при использовании в данном изобретении, относится к любому животному, имеющему иммунную систему, и включает млекопитающих, таких как собаки.

По существу идентичный, при использовании в данном изобретении, относится к степени идентичности последовательности по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере

- 5 032284 приблизительно 98%, или по меньшей мере приблизительно 99%.

Субъединица вакцины и субъединица композиции, при использовании в данном изобретении, относится к типу вакцины или композиции, которая включает антигены - но не все антигены - которые получены из или гомологичны антигенам из рассматриваемого патогена, например вируса, бактерии, гриба или паразита. Такая композиция или вакцина по существу не содержит интактных клеток патогенных или патогенных частиц или лизат таких клеток или частиц. Таким образом, субъединица вакцины или субъединица композиции могут быть получены из, по меньшей мере, частично очищенных, или, по существу, очищенных иммуногенных полипептидов из патогена или их аналогов. Методы получения антигена или антигенов в субъединицах вакцины или субъединицах композиции включают стандартные методы рекомбинантной очистки, рекомбинантного получения, или химического синтеза. Субъединица вакцины или субъединица композиции, таким образом, относится к вакцине или композиции, состоящей из определенного антигенного компонента или компонентов вируса, бактерии или другого иммуногена.

ТСГО₅₀ относится к инфекционной дозе культуры ткани и определяется как разведение вируса, необходимое для инфицирования 50% данной партии инокулированных клеточных культур. Различные способы могут быть использованы для расчета ТСГО₅₀, в том числе метод Спирмен-Карбера, который используется в данном изобретении. Для описания способа Спирмен-Карбера см. Β.ν. Майу & Н.О. Капдго, У1то1оду Ме1йоб§ Мапиа1 25-46 (1996).

Терапевтический агент, при использовании в данном изобретении, относится к любой молекуле, соединению, вирусу или лекарству, предпочтительно ослабленному или убитому вирусу, или субъдинице, или соединению, которое помогает в лечении вирусной, бактериальной, паразитарной или грибковой инфекции, заболевания или состояния, вызванного этим.

Терапевтически эффективное количество, при использовании в данном изобретении, относится к количеству антигена или вакцины или композиции, которые индуцируют иммунный ответ у субъекта (например, собаки), получающего антиген или вакцину или композицию, которые достаточны для предотвращения или ослабления признаков и симптомов заболевания, в том числе неблагоприятных последствий для здоровья или его осложнений, вызванных инфекцией патогеном, например, таким как вирус, бактерии, паразиты или грибки. Гуморальный иммунитет или клеточный иммунитет, или как гуморальный, так и клеточно-опосредованный иммунитет, можно индуцировать. Иммуногенный ответ у животного на антиген, вакцину, или композицию, могут быть оценены косвенно через измерение титров антител, анализы пролиферацию лимфоцитов, либо непосредственно через мониторинг признаков и симптомов после заражения штаммом дикого типа. Защитный иммунитет, обеспеченный вакциной или композицией, может быть оценен путем измерения снижения заражения организма и/или снижения клинических признаков, таких как смертность, заболеваемость, температура и общее физическое состояние, здоровье и характеристики субъекта. Количество вакцины или композиции, которое является терапевтически эффективным, может варьироваться, в зависимости от конкретного используемого иммуногена, или состояния субъекта, и может быть определено специалистом в данной области.

Лечение заболевания у пациента относится к ингибированию заболевания или прекращению его развития; защите против заболевания или предотвращения заболевания у пациента, который предрасположен или пока не проявляет симптомов заболевания; или облегчению или регрессии заболевания. Кроме того, термины защитить, защищая, защита и т.п. означает уменьшение или ликвидацию клинических признаков заболевания. Это также может означать снижение или устранение причинного агента(ов) заболевания.

Вакцина или вакцинная композиция, при использовании в данном изобретении, относится к иммуногенной композиции, выбранной из вируса или бактерий, либо модифицированной живой, аттенуированной, или убитой, или субъединицей вакцины, или любой комбинацией указанных выше. Введение вакцины в организм пациента приводит к иммунному ответу. Вакцина может быть введена непосредственно данному субъекту любым известным способом введения, в том числе парентерально, перорально, и тому подобное. Термин означает композиции, которые предотвращают или ослабляют действие инфекции, или которые предотвращают или ослабляют один или несколько признаков или симптомов инфекции. Защитные эффекты вакцинной композиции против патогена, как правило, достигаются за счет индукции у субъекта иммунного ответа. В общем случае, ликвидированные или уменьшенные случаи заражения, улучшения признаков или симптомов, или ускоренного устранения микроорганизма из инфицированных субъектов являются показателями защитных эффектов композиции вакцины. Композиции вакцин в соответствии с данным изобретением обеспечивают защитный эффект против инфекций, вызванных патогенами респираторных заболеваний собак.

Ветеринарно-приемлемый, при использовании в данном изобретении, относится к веществам, которые, в пределах погрешности медицинской оценки, подходят для применения в контакте с тканями ветеринарных субъектов без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции и тому подобного, с разумным отношением полезного эффекта и риска, и эффективны для их целевого использования.

Ветеринарно-приемлемый носитель, при использовании в данном изобретении, относится к среде

- 6 032284 носителя, не мешает эффективности биологической активности активного ингредиента и не является токсичным для ветеринарного субъекта, которому его вводят.

Антигены, иммуногенные композиции и вакцины

Данное изобретение представляет иммуногенные композиции и вакцины, содержащие один или несколько вирусов, в частности СКСоУ и, возможно, бактерии или субъединицы, которые подходят для введения собакам для лечения заболевания, такого как С1КЭС, вызванного В. ЬтопсЫкерйса. Респираторный коронавирус собак (СКСоУ), охваченный данным изобретением, может быть охарактеризован как коронавирус, присутствующий в дыхательных путях у собак с инфекционным респираторным заболеванием. СКСоУ филогенетически наиболее тесно связан с бычьим коронавирусом (ВСоУ), человеческим коронавирусным (НСоУ) штаммом ОС43 и вирусом гемагглютинирующего энцефаломиелита (НЕУ); кишечный коронавирус собак (ССоУ) только отдаленно связан с СКСоУ.

В предпочтительном варианте воплощения изобретения СКСоУ является таким же, как описано в патенте США 2007-0098739, содержание которого включено в данное изобретение в качестве ссылки, в частности, по отношению к штаммам СКСоУ и антигенам, описанным в ней. Подходящие иммуногенные фрагменты СКСоУ описаны в \УО 2004/011651 (Тйе Коуа1 Уе!еттату Со11еде). Подходящие иммуногенные фрагменты СКСоУ включают 8р1ке (8) и гемагглютинин-эстеразные (НЕ) поверхностные белки, мембранный гликопротеин (М) и нуклеокапсидный белок (Ν), или их иммуногенные части. СКСоУподобные 8р1ке и НЕ белки, описанные в \УО 2004/011651 также могут быть пригодными в качестве агентов, повышающих иммунный ответ против СКСУ. Близкие коронавирусы, такие как бычий коронавирус и человеческий коронавирус, и их иммуногенные фрагменты, могут быть также пригодны в качестве агентов, повышающих иммунный ответ против СКСУ. Полное раскрытие \УО 2004/011651, относящееся к агентам, которые могут быть использованы в качестве компонента вакцины против СКСУ, включено в данное изобретение в качестве ссылки. Другой пример СКСоУ, подходящий для применения в данном изобретении, включает штамм, идентифицированный как СКСоУ штамм 4182 (Ег1ек е! а1., У1тик Кек., 124:78-87, 2007).

Антигены вируса гриппа, охватываемые данным изобретением, могут быть любыми идентифицированными штаммами вируса гриппа всех птиц или млекопитающих, в том числе, но не ограничиваясь приведенным, вируса гриппа, имеющего подтип Н3 гемагглютинина и подтип Ν8 нейраминидазы или подтип №N8, более известный как вирус №N8. Гриппа может происходить от млекопитающих или птиц, включая, но не ограничиваясь приведенным, свиней, лошадей или собак. В одном варианте воплощения изобретения собак антиген гриппа используется. В одном варианте воплощения изобретения используется антиген гриппа лошадей. В другом варианте воплощения изобретения используется штамм, имеющий подтип гликопротеинов, обозначенный Н3 или N8. В одном варианте воплощения изобретения используется штамм, содержащий как подтип Н3, так и N8 гликопротеины.

Антигены гриппа, охватываемые данным изобретением, могут быть выделены у собак, лошадей, свиней, и птиц, как домашних, так и диких. Животные, выбранные для отбора проб, должны проявлять острые и/или подострые клинические синдромы, которые могут включать легкие и тяжелые респираторные симптомы и лихорадку. Животные могут также проявлять признаки анорексии и летаргии. Методы выделения вируса хорошо известны специалистам в данной области, в том числе: прививки клеточных культур млекопитающих или птиц, инокуляции куриных эмбрионов носовой или глоточной слизью образцов из клинических проб, сбор мазков из носового прохода или горла, или путем сбора тканей, таких как селезенка, легкие, миндалины и печень, и орошения легких. Цитопатический эффект вируса можно наблюдать в клеточной культуре. Аллантоисные жидкости или клеточные лизаты могут быть проверены на предмет их способности агглютинировать красные кровяные клетки человека, курицы, индейки или морской свинки, что является веским доказательством наличия вируса гриппа. Типичный пример собачьего гриппа штамма (С1У), который подходит для применения в данном изобретении включает в штамм, идентифицированный как Л/сапте/1о\\'а/9Л1/В5/08/О12. который был депонирован как РТА-7694 29 июня 2006 г. в Американской коллекции типовых культур (АТСС), 10801 ИшуеткИу Вои1еуатб, Мапаккак, УА 201 10-2209. Репрезентативный штамм антигена С1У представляет собой штамм вируса С1У в коммерческой вакцине, Уаидиатб® С1У (РПхег). Данное изобретение также охватывает вакцины, содержащие штамм, идентифицированный как штамм лошадиного гриппа А/Ес.|шпе/2/М|а1ш/1/63. Данный штамм депонирован в АТСС с инвентарным номером УК 317. Дополнительные примеры вирусов гриппа для применения в данном изобретеним представляют собой А/сашпе/1о'та/13628/2005, А/Едшпе/Кеп!иску/1998, А/Едшпе/Кеп!иску/15/2002, А/Едшпе/ОЫо/1/2003, А/Едшпе/Кеп!иску/1/1994, А/Едшпе/Маккасйике!!к/213/2003, А/Ес.|и^ηе/\V^ксоηк^η/2003. А/Ес.|шпе/№\\'Уогк/1999 и

А/Ес.|шпе/№\утагке1/А2/1993. Другие предпочтительные штаммы и/или изоляты С1У включают те, которые раскрыты в патентах США №№ 7,959,929 (в частности, штаммы и последовательности НА, определенные в нем как 1асккопуй1е/2005, М1ат1/2005, ЕЬ/242/03 апб Е1опба/43/04), 7,384,642, 7,572,620 и 7,468,187, содержание которых, включая все последовательности, в частности последовательности НА, и штаммы, включены в данное изобретение в качестве ссылки, как если бы были полностью изложены в данном изобретении. Дополнительно, штамм С1У, который подходит для применения в данном изобретении, включает Со1отабо С1У изолят, описанный в Вагге11 е! а1., 1. Уе!. 1п1етп. Меб., 24 (6), 1524-1527

- 7 032284 (2010), имеющий номер доступа ΆΌ^41784.

Вирус собачьего парагриппа (СР1У), включенный в данное изобретение, можно охарактеризовать как один из вирусов, известных как возбудитель, связанный с кашлем псарен. Репрезентативный штамм СРГУ антигена представляет собой штамм ослабленного вируса СР1 в коммерческой вакцине, Уапдиатб® Р1ик 5 (РПхсг). Еще один репрезентативный штамм СР1У антигена представляет собой штамм ослабленного вируса СР1, имеющий обозначение ИЕ-СР1-5 (Ναΐίοηαΐ Уе1ет1пагу 8сту1сс ЬаЬога1огу, Атск, ΙΑ).

Собачий аденовирус типа 2 (САУ-2), включенный в данное изобретение, можно охарактеризовать как один из вирусов, известный как возбудитель, связанный с кашлем псарен. Репрезентативный штамм САУ-2 антигена представляет собой штамм ослабленного САУ-2 вируса в коммерческой вакцине, Уапдиатб® Р1ик 5 (РПхсг). Репрезентативный штамм САУ-2 антигена представляет собой штамм ослабленного САУ-2, обозначенный как штамм Манхэттен (№1Попа1 Ус1сппагу 8сту1сс ЬаЬога1огу, Атск, ΙΑ).

Мусор1акта Супок (М. супок), охваченный данным изобретением, описан в Сйа1кст с! а1., М1сгоЬю1оду, 150:3491 -3497, 2004, является единственным видом микоплазмы и обычно ассоциируется с респираторными заболеваниями. Иммуногенные композиции против М. супок описаны в И8 2007/0098739, включенном в данное изобретение в качестве ссылки.

Вирусы, охватываемые данным изобретением, могут распространяться в клетках, клеточных линиях и клетках-хозяевах. Указанные клетки, клеточные линии или клетки-хозяева могут быть, например, без ограничений, клетками млекопитающих и клетками не млекопитающих, в том числе клетками насекомых и растений. Клетки, клеточные линии, и клетки-хозяева, вирусы которых охвачены данным изобретением, могут быть распространены и известны, а также доступны специалистам в данной области

Бактерии, охватываемые данным изобретением, могут быть культивированы и размножены с использованием различных культуральных сред, как известно специалистам в данной области, включая как бульон (жидкий) и агар (твердый, полу-твердый) носители культивирования. Некоторые бактерии также могут быть культивированы и размножены в клетках млекопитающих или в клетках не млекопитающих.

Вирусы и бактерии, охватываемые данным изобретением, могут быть ослаблены или инактивированы перед использованием в иммуногенной композиции или вакцине.

Методы ослабления и инактивации хорошо известны специалистам в данной области.

Методы ослабления включают, не ограничиваясь приведенным, серийный проход в культуре клеток на подходящей клеточной линии (вирусы и некоторые бактерии), серийный проход в бульонной культуре (бактерии), ультрафиолетовое облучение (вирусы и бактерии), и химический мутагенез (вирусы и бактерии). Методы вирусной или бактериальной инактивации включают, не ограничиваясь приведенным, обработку формалином, бетапроприолактоном (ВРЬ) или бинароным этиленимином (ΒΕΙ), или другие способы, известные специалистам в данной области.

Инактивация формалином может быть выполнены путем смешивания суспензии, содержащей микроорганизм с 37% формальдегида в конечной концентрации формальдегида 0,5%. Микроорганизмформальдегидную смесь перемешивают постоянно в течение приблизительно 24 часов при комнатной температуре. Инактивированную смесь микроорганизмов затем испытывают на остаточные живые организмы путем анализа роста на подходящей клеточной линии или бульонной среде.

Для некоторых антигенов инактивация ΒΕΙ может быть выполнена путем смешивания суспензии, содержащей микроорганизм в соответствии с данным изобретением с 0,1 М ΒΕΙ (2-бром-этиламин в 0,175 Ν ΝηΟΗ) до конечной концентрации ΒΕΙ 1 мМ. Для других антигенов, конечная концентрация ΒΕΙ составляет 2 мМ. Специалисту в данной области известна соответствующая концентрация, чтобы ее использовать. Смесь вирус-ΒΕΙ смешивают при постоянном перемешивании в течение приблизительно 48 ч при комнатной температуре, с последующим добавлением 1,0 М тиосульфата натрия до конечной концентрации 0,1 мМ. Перемешивание продолжают в течение еще 2 ч. Смесь, содержащую инактивированный микроорганизм, испытывали на остаточный живой вирус путем анализа роста на подходящей клеточной линии или бульонной среде.

Иммуногенные композиции и вакцины, которые охватываются данным изобретением, могут содержать один или более ветеринарно-приемлемых носителей. При использовании в данном изобретении, ветеринарно-приемлемый носитель включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, вспомогательные вещества, стабилизирующие агенты, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты, задерживающие поглощение агенты, и тому подобное. Разбавители могут включать воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобное. Изотонические агенты могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит, лактозу, среди других, известных специалисту в данной области. Стабилизаторы включают альбумин, среди других известных специалисту в данной области. Консерванты включают мертиолат, среди других известных специалисту в данной области.

Вспомогательное вещество может быть метаболизируемым, ссылаясь на вспомогательные вещества, состоящие из компонентов, которые способны метаболизировать целевые виды, такие как вспомогательные вещества на основе растительного масла. Метаболизируемое вспомогательное вещество может быть метаболизируемым маслом. Метаболизируемые масла представляют собой жиры и масла, которые обычно встречаются в растениях и животных, и, как правило, состоят в основном из смеси триацилгли

- 8 032284 церинов, также известных как триглицериды или нейтральные жиры. Эти неполярные, нерастворимые в воде вещества представляют собой триэфиры жирных кислот и глицерина.

Триацилглицерины отличаются в зависимости от идентичности и размещения их трех остатков жирных кислот или боковых цепей.

Вспомогательное вещество также может быть неметаболизируемым, со ссылкой на вспомогательные вещества, состоящим из компонентов, не могущих быть метаболизироваными в организме животного, которому вводили эмульсию. Неметаболизируемые масла пригодны для применения в композициях в соответствии с данным изобретением и включают алканы, алкены, алкины и соответствующие им кислоты и спирты, простые эфиры и сложные эфиры и их смеси. Предпочтительно индивидуальные соединения масла представляют собой легкие углеводородные соединения, например, такие компоненты имеют от 6 до 30 атомов углерода. Масло может быть синтетически получено или очищено из нефтепродуктов. Предпочтительные неметаболизируемого масла для применения в композициях, описанных в данном изобретении, включают, например, минеральное масло, парафиновое масло и циклопарафины. Термин минеральное масло относится к неметаболизируемому вспомогательному маслу, которое представляет собой смесь жидких углеводородов, полученных из вазелина с помощью метода перегонки. Термин является синонимом сжиженного парафина, жидкого вазелина и белого минерального масла. Термин также предназначен для включения легкого минерального масла, т.е. масла, которое аналогично получаемому путем перегонки вазелина, но который имеет несколько меньший удельный вес, чем белое минеральное масло. Минеральные масла могут быть получены из различных коммерческих источников, например, ТТ. Вакег (РЫШркЬигд, РА), И8В Согрогайои (С1сус1апб. ОН). Легкое минеральное масло является коммерчески доступным под названием ОКАКЕОЬ®.

Вспомогательные вещества включают, не ограничиваясь приведенным, ЕишЫдеп систему вспомогательных веществ (МУР ЬаЬогаЮпек; КаЫои, ΝΕ), ШВ1 систему вспомогательных веществ (К1Ь1 1пс.; НашШои, МТ), квасцы, гель алюминия гидроксида, эмульсии типа масло-в-воде, вода-в-масле, такие как, например, полные и неполные вспомогательные вещества Фройнда, блок-сополимер (Су1Кх; А11аи1а, ОА), 8АР-М (СЫгои; ЕшегууШе, СА), ΑΜΡΗΙΟΕΝ® вспомогательное вещество, сапонин, 0ш1 А, 08-21 (СашЬпбде Вю1есй 1ис.; СашЬпбде, МА), 6ΡΙ-0100 (Оа1ешса РйагшасеийсаН, 1ис.; В1гшшдйаш, АЬ) или другие сапониновые фракции, монофосфориллипид, авридин липид-аминное вспомогательное вещество, термолабильный энтеротоксин из Е. сой (рекомбинантный или иной), холерный токсин, мурамилдипептид, сквален/плюрониевый блок-сополимер/поверхностно-активное вещество (8Ь-СО), сульфолипобетациклодекстрин (8Ь-СО), липосомы, содержащие иммуномодулятор (например, СрО или поли 1:С), мурамилдипептид (МЭР), искоматрикс (0ш1 фосфотидил холин), СрО/ОЕАЕ-декстран/минеральное масло (ТХО), СрО, тритерпеноиды (например, 0ш1 или другой очищенный или частично очищенный препарат сапонина), стерины (например, холестерин), иммуномодулирующие агенты (например, диметил диоктадецил бромид - ЭВА), полимеры (например, полиакриловой кислоты, такие как САКВОРОЬ®) и стимуляторы Т112 (например, гликолипиды, такие как Вау К1005®), а также их комбинации, среди многих других вспомогательных веществ, известных специалистам в данной области.

Неограничивающие примеры различных комбинаций, которые могут быть использованы, включают тритерпеноид плюс стерин (например, 0ш1 А/холестерин, также известный как ОАС), тритерпеноид плюс стерин, иммуномодулирующее средство, и полимер (например, 0ш1

А/холестерин/ПЭА/САКВОРОЬ®, также известный как ОСЭС), а также тритерпеноид плюс стерин, иммуномодулирующее средство, полимер, и стимулятор Т112 (например, 0ш1 А/холестерин/ПЭА/САКВОРОЬ® и Вау К1005®, также известный как ОСЭСР).

Количества и концентрации вспомогательных веществ и добавок, полезных в контексте данного изобретения, могут быть легко определены специалистом в данной области. В одном варианте воплощения изобретения данное изобретение охватывает иммуногенные композиции и вакцины, содержащие от приблизительно 20 до приблизительно 2000 мкг вспомогательного вещества. В другом варианте воплощения данного изобретения вспомогательное вещество включено в количестве от приблизительно 100 до приблизительно 1500 мкг, или от приблизительно 250 до приблизительно 1000 мкг, или от приблизительно 350 до приблизительно 750 мкг. В другом варианте воплощения данного изобретения, вспомогательное вещество включено в количестве приблизительно 500 мкг/2 мл доза иммуногенной композиции или вакцины.

Иммуногенные композиции и вакцины могут также содержать антибиотики. Такие антибиотики включают, не ограничиваясь приведенным, антибиотики классов аминогликозидов, карбапенемов, цефалоспоринов, гликопептидов, макролидов, пенициллинов, полипептидов, хинолонов, сульфонамидов и тетрациклинов. В одном варианте воплощения изобретения данное изобретение охватывает иммуногенные композиции и вакцины, содержащие от приблизительно 1 до приблизительно 60 мкг/мл антибиотика. В другом варианте воплощения данного изобретения иммуногенные композиции и вакцины содержат от приблизительно 5 до приблизительно 55 мкг/мл антибиотика, или от приблизительно 10 до приблизительно 50 мкг/мл антибиотика, или от приблизительно 15 до приблизительно 45 мкг/мл антибиотика, или от приблизительно 20 до приблизительно 40 мкг/мл антибиотика, или от приблизительно 25 до приблизительно 35 мкг/мл антибиотика. В еще одном варианте воплощения данного изобретения иммуногенные

- 9 032284 композиции и вакцины содержат менее чем приблизительно 30 мкг/мл антибиотика.

Иммуногенные композиции и вакцины, которые охватываются данным изобретением, могут содержать одну или несколько молекул полинуклеотидов, кодирующих вирус или бактерии или вирусный или бактериальный белок. ДНК или РНК молекулы могут быть использованы в иммуногенных композициях или вакцинах. ДНК или РНК молекулы могут быть введены при отсутствии других агентов, или их можно вводить вместе с агентом, облегчающим клеточное поглощение (например, липосомы или катионные липиды). Весь полинуклеотид в иммуногенной композиции или вакцине, как правило, составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 5,0 мг/мл. В другом варианте воплощения данного изобретения, весь полинуклеотид в иммуногенной композиции или вакцины будет составлять от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 4,0 мг/мл, или от приблизительно 10 мкг/мл до приблизительно 3,0 мг/мл, или от приблизительно 100 мкг/мл до приблизительно 2,0 мг/мл. Вакцины и процедуры вакцинации, которые используют нуклеиновые кислоты (ДНК или мРНК) были хорошо описаны в данной области, например, в патенте США № 5703055, патенте США № 5580859, патенте США № 5589466, все из которых являются включенными в данное изобретение в качестве ссылки.

В дополнение к вирусам или бактериям, описанных выше, иммуногенные композиции и вакцины, охватываемые данным изобретением, могут содержать другие дополнительные антигены. Антигены могут быть в виде инактивированного полного или частичного микроорганизма, или в форме антигенных молекул, полученных методами генной инженерии или химическим синтезом. Другие антигены, необходимые для применения в соответствии с данным изобретением, включают, не ограничиваясь приведенным, полученные из патогенных вирусов, таких как собачий вирус помрачения, собачий вирус герпеса, вирус собачьего гриппа, вирус бешенства, патогенные бактерии, такие как Ьер1окр1га Ьгайк1ауа, Ьер1окр1га сашсо1а, ЬерФкрта дпрро1урйока, й-ерЮкрйа 1с1егойаетоггйад1ае, Ьер1окр1га ротопа, Ьер1окр1га Нагй)оЬоу15. Рогрйуготопак крр., Вас1епойек крр., Воггейа крр., 81гер1ососсик крр., включая 81герЮсоссик ес.|ш киЬкреаек /ооерИеткик, ЕйгйсЫа крр., Мусор1акта крр., включая Мусор1акта супок, и Мюгокрогит сашк. Антигены также могут быть получены из патогенных грибов, таких как СгурФкропйшт рагуит, Ыеокрога сашпит, Тохор1акта допйи, Еипепа крр., ВаЬек1а крр., С1агй1а крр., ЬеЕйташа крр., или гельминтов, таких как Таеша, Си1егеЬга, Есйшососсик, и Рагадоштик крр.

Формы дозировки, пути введения

Иммуногенные композиции и вакцины, охватываемые данным изобретением, могут быть введены животным, чтобы индуцировать эффективный иммунный ответ против полипатогенных болезненных состояний, связанных с СЯСоУ и другим патогеном, например, В. Ьгопсйщерйса. Соответственно, данное изобретение относится к способам стимуляции эффективного иммунного ответа при введении в организм животного терапевтически эффективного количества иммуногенной композиции или вакцины, описанные в данном изобретении.

Иммуногенные композиции и вакцины, описанные в данном изобретении, могут быть введены животному для вакцинации субъекта животного от СШИС. Иммуногенные композиции и вакцины можно вводить животному для профилактики или лечения СШИС у животного. Соответственно, описанные в данном изобретении методы вакцинации животного против СШИС и профилактики или лечения СШИС, включающие введение животному терапевтически эффективного количества иммуногенной композиции или вакцины, описанной в данном изобретении.

Иммуногенные композиции и вакцины, охватываемые данным изобретением, могут быть выполнены в различных формах, в зависимости от маршрута введения. Например, иммуногенные композиции и вакцины могут быть выполнены в форме стерильных водных растворов или дисперсий, пригодных для применения в виде инъекций, или сделанных в лиофилизированных формах с использованием методов лиофильной сушки. Лиофилизированные иммуногенные композиции и вакцины, как правило, поддерживают на уровне приблизительно 4°С, и могут быть восстановлены в стабилизирующем растворе, например, солевом растворе или НЕРЕ8, с или без вспомогательное вещество. Иммуногенные композиции и вакцины могут также быть выполнены в виде суспензий или эмульсий.

Иммуногенные композиции и вакцины в соответствии с данным изобретением содержат терапевтически эффективное количество одного или более из описанных выше микроорганизмов. Очищенные вирусы и/или бактерии могут быть использованы непосредственно в иммуногенной композиции или вакцине, или могут быть дополнительно ослаблены или инактивированы. Как правило, иммуногенная композиция или вакцина содержит между приблизительно 1х10² и приблизительно 1х10¹² вирусных или бактериальных частиц, или от приблизительно 1 х 10³ до приблизительно 1x10^й частиц, или от приблизительно 1х10⁴ до приблизительно 1х10¹⁰ частиц, или от приблизительно 1х10⁵ до приблизительно 1х10⁹ частиц, или от приблизительно 1х 10⁶ до приблизительно 1х 10⁸ частиц. Точное количество микроорганизма в иммуногенной композиции или вакцины, эффективное для обеспечения защитного эффекта, может быть определено специалистом в данной области.

Иммуногенные композиции и вакцины обычно содержат ветеринарно-приемлемый носитель, в объеме между приблизительно 0,5 и приблизительно 5 мл. В другом варианте воплощения данного изобретения объем носителя находится между приблизительно 1 и приблизительно 4 мл или от приблизительно

- 10 032284 и приблизительно 3 мл. В другом варианте воплощения данного изобретения объем носителя составляет приблизительно 1 мл, или приблизительно 2 мл, или приблизительно 5 мл. Ветеринарно-приемлемые носители, которые пригодны для применения в иммуногенных композициях и вакцинах, могут быть любыми из описанных выше.

Специалист в данной области может легко определить, нуждается ли вирус или бактерии в ослаблении или инактивации до введения. В другом варианте воплощения данного изобретения вирус или бактерия могут быть введены непосредственно животному без дополнительного ослабления. Количество микроорганизмов, которое является терапевтически эффективным, может варьироваться, в зависимости от конкретного используемого микроорганизма, состояния животного и/или степени инфекции, и может быть определено специалистом в данной области.

В соответствии с методами данного изобретения одна доза может быть введена животным, или, альтернативно, две или более прививки могут иметь место с интервалами от приблизительно двух до приблизительно десяти недель. Схемы усиления могут быть необходимы, и режим дозировки может быть скорректирован, чтобы обеспечить оптимальную иммунизацию. Специалисты в данной области может легко определить оптимальную схему введения.

Иммуногенные композиции и вакцины можно вводить непосредственно в кровоток, в мышцу, во внутренний орган, или под кожу. Подходящие способы парентерального введения включает внутривенное, внутриартериальное, внутримышечное, и подкожное введение. Подходящие устройства для парентерального введения включают игольчатые (в том числе микроиглы) форсунки и безыгольные форсунки.

Парентеральные композиции обычно представляют собой водные растворы, которые могут содержать эксципиенты, такие как соли, углеводы, белки и буферные агенты (предпочтительно рН от приблизительно 3 до приблизительно 9, или от приблизительно 4 до приблизительно 8, или от приблизительно 5 до приблизительно 7,5, или от приблизительно 6 до приблизительно 7,5, или от приблизительно 7 до приблизительно 7,5), но для некоторых применений, они могут быть более удобно приготовлены в виде стерильного неводного раствора или в виде сухой формы, которые будут использоваться в сочетании с подходящим носителем, таким стерильная, апирогенная вода или физиологический раствор. Получение парентеральных композиций в стерильных условиях, например, путем лиофилизации, может быть легко осуществлено с использованием стандартных фармацевтических методов, хорошо известных специалистам в данной области.

Растворимость материалов, используемых в приготовлении парентеральных растворов, может быть увеличена путем использования соответствующих методов составления рецептур, известных специалисту в данной области, таких как включение агентов, увеличивающих растворимость, в том числе буферов, солей, поверхностно-активных веществ, липосом, циклодекстринов и т.п.

Композиции для парентерального введения могут быть приготовлены для немедленного или модифицированного высвобождения. Препараты с модифицированным высвобождением включают замедленное, устойчивое, импульсное, контролируемое, направленное и программируемое высвобождение. Таким образом, иммуногенные композиции и вакцины могут быть сформулированы в виде твердого вещества, полутвердого вещества или тиксотропной жидкости для введения в виде имплантируемого депо, обеспечивающего модифицированное высвобождение иммуногенных композиций и вакцин.

Другие средства введения иммуногенной композиции или вакцины включают введение микроиглой или инъекций без иглы (например, Ро\\'бсг|се1'^|Л|. Вкдес!™ и т.д.).

В тех случаях, когда используется подкожная или внутримышечная инъекция, предпочтительно, изотонический препарат. Как правило, добавки для изотоничности могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. В отдельных случаях используются изотонические растворы, такие как фосфатно-солевой буфер. Препараты могут дополнительно содержать стабилизаторы, такие как желатин и альбумин. В некоторых вариантах воплощения изобретения, сосудисто-сужающий агент добавляют к композиции. Фармацевтические препараты в соответствии с данным изобретением, как правило, обеспечены стерильными и апирогенными. Тем не менее, специалистам в данной области хорошо известно, что составами для фармацевтически приемлемых носителей являются те фармацевтические носители, которые утверждены в постановлениях, принятых Департаментом США по вопросам сельского хозяйства (Ипйеб §1а1е8 Эераг1теп1 о£ АдпсиИиге), или аналогичном правительственном агентстве в зарубежной стране, такой как Канада и Мексика, или любой из европейских стран, для любой собачьей вакцины, полипептида (антигена) субъединицы иммуногенной композиции и вакцины, рекомбинантных вирусов векторных вакцин, и ДНК-вакцин. Таким образом, фармацевтически приемлемый носитель для коммерческого производства иммуногенных композиций или вакцин является носителем, который уже утвержден или будет утвержден соответствующим государственным органом в Соединенных Штатах Америки или за границей. Иммуногенные композиции и вакцины могут быть дополнительно смешаны со вспомогательным веществом, которое фармацевтически приемлемо. В некоторых составах иммуногенных композиций и вакцин, иммуногенная композиция или вакцина в сочетании с другими собачьими иммуногенными композициями или вакцинами используется для получения поливалентного продукта, который может защитить собаку от широкого спектра заболеваний, вызванных другими патогенными микроорганизмами собак.

- 11 032284

Примеры

Пример 1. Экспериментальное заражение собак СКСУ с использованием интраназальной аэрозолизации.

Пятьдесят собак, определенных как имеющие хорошее общее состояние здоровья, и негативные на антитела против респираторного коронавируса собак (СКСоУ) до дня 0, как это определено косвенным флуоресцентным анализом антител (ΙΡΑ), были включены в исследование. Было также подтверждено, что животные не содержат СКСоУ, как определено методом выделения вируса из мазка ротоглотки в день 0.

Таблица 1

План исследования

Группа	N	Заражение	Аутопсия День
Материал заражения	Метод	День	Целевая доза
Т01	5	Физиологический раствор	Аэросолизация	0	ΝΑ	4
Т02	5	Физиологический раствор	14
Т03	10	СКСоУ Макс. изолят	106·0 ТСГО5о	4
Т04	10	СКСоУ Макс. изолят	14
Т05	10	СКСоУ ΝΡ787 изолят	4
Т06	10	СКСоУ ΝΡ787 изолят	14

ΝΑ = Не применимо.

СКСоУ изолят, обозначенный Макс., был использован в качестве материала заражения, и был получен после одного прохода по НКТ18О клеткам. Материал заражения титровали на НКТ18О клетках, и определяли, чтобы иметь инфекционную дозу 10⁷'¹ ТСШ50/мл. СКСоУ изолят, обозначенный СКСоУ ΝΡ787, был также использован в качестве материала заражения, и был получен после двух проходов на НКТ18О клетках. Материал заражения титровали на НКТ18О клетках, и определяли, чтобы иметь инфекционную дозу 10⁶'⁵ ТСШ50/мл.

Животных исследовали один раз в день с момента прибытия в день 3. Массу тела определяли в день 1. Образец крови собирали у каждого животного в день 0 до заражения. Тимпанальные температуры были определены в день 2, день 1, день 0 до заражения. Два набора ротоглоточных мазков были собраны у каждой собаки перед заражением в день 0. Один набор мазков собирали в УТМ (вирусная транспортная среда) пробирках для выделения вируса СКСоУ, а другой набор был собран в Αιηίοδ среде (бактериальные изоляты). Два комплекта носовых выделений были собраны у каждой собаки до заражения в день 0, один в УТМ пробирку для выделения вируса СКСоУ, и другой в Αιηίοδ среде для бактерий изолята. Животных наблюдали ежедневно один раз в день 2, день 1 и день 0 до заражения, на предмет клинических признаков респираторного заболевания.

Зараженные вирусом СКСоУ исходные растворы были разморожены, и соответствующим образом разбавлены до ожидаемой дозы заражения (106.0 ТСШ₅₀/собака). Пять собак заражали, в то же время, путем аэрозолизации заражения, содержащего 106.0 ТСШ₅₀, в целевую дозу заражения 106.0 ТСШ₅₀ на собаку. Материал заражения выдерживали на льду до инокуляции заражения. Собакам из группы лечения Т01 и Т02 вводили физиологический раствор в виде аэрозоля, в камере из плексигласа в общей сложности 30 мин в день 0. Эти группы заражали первыми, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Собакам из группы лечения Т03 и Т04 был введен СКСоУ Макс. изолят в виде аэрозоля, в камере из плексигласа в общей сложности 30 мин в день 0. Собакам из группы лечения Т05 и Т06 вводили СКСоУ ΝΡ787 в виде аэрозоля в камере из плексигласа в общей сложности 30 мин в день 0. После заражения среднее титрования по СКСоУ (Макс.) составляло 105.2 ТСШ₅₀/мл, и после заражения среднее титрования по СКСоУ (ΝΡ787) составляло 104.7 ТСШ₅₀/мл.

Тимпанальные температуры были определены ежедневно после заражения со дня 0 до дня 14. Клинические наблюдения выполняли один раз в день в течение приблизительно 30 мин со дня 0 до дня 14. Носовые мазки были собраны у каждой собаки в УТМ пробирки для выделения вируса СКСоУ с дня 0 до дня 10. Ротоглоточные мазки были собраны у каждой собаки в УТМ пробирки день 2, день 3 и день 4. Образец крови для серологии собирали от каждого животного в день 4 и в день 14 после заражения.

Вскрытие проводили на группах лечения Т01, Т03 и Т05 в день 4 после заражения, а на группах лечения Т02, Т04, и Т06 в день 14 после заражения.

Животные были подвергнуты эвтаназии с передозировкой барбитурата натрия. При аутопсии все легкое асептически извлекали и помещали на стерильную драпировку. Чтобы определить общее количество консолидации легких, каждую долю легкого оценивали для консолидации отдельно. Трахеи рассекали и просвет оценивали на предмет серьезной патологии. Все ткани были оценены и баллы были присвоены сертифицированным ветеринарным патологоанатомом.

После того, как легкие были оценены, правую хвостовую долю легкого орошали струей приблизительно 30,0 мл УТМ (без антибиотика или противогрибкового средства) через бронхиальное сплетение. УТМ среду отсасывали медленно обратно в шприц, осторожно массажируя легочную ткань. Лаважные жидкости отбирали как аликвоты и тестировали на бактериологию, и для выделения вируса СКСоУ.

- 12 032284

Образцы тканей были собраны из трахеи, носовой полости (в том числе реснитчатой секции), и правой черепной доли. Два набора образцов ткани были собраны из трахеи и носовой полости. Один набор был протестирован для выделения вируса СКСоУ, и другой набор подготовлен для гистологии. Три набора образцов ткани были получены из правой краниальной доли легкого, первый набор был испытан на бактериологию, второй набор был протестирован на выделение вируса СКСоУ, и третий набор готов к гистологии.

Мазки из носовых полостей и гортани, образцы тканей и орошения легких были испытаны на выделение вируса СКСоУ с использованием НКТ18О клеток. Вкратце, образцы были обработаны и инокулированы в колбы, содержащие монослои клеток НКТ18О. Инокулированные колбы инкубировали в течение двух недель в увлажненном СО₂ инкубаторе при 35-37°С. Инокулированные колбы отбирали через одну и две недели после прививки, а образцы вносили в 4 лунки 96-луночного планшета с затравкой НКТ18О клеток. Инокулированные планшеты инкубировали в увлажненном СО₂ инкубаторе в течение 5-7 дней при 35-37°С. В конце инкубационного периода, клеточные монослои в 96-луночных планшетах фиксировали раствором на основе ацетона, и промывали водой. Присутствие СКСоУ определяли путем окрашивания флуоресцирующих антител с использованием СКСоУ-специфичного Р1ТСконъюгированного антитела, и наблюдали под эпифлуоресцентным микроскопом. Пробы сыворотки были исследованы на СКСоУ антитела при помощи ΙΡΆ. Вкратце, НКТ18О клетки высевали в 96-луночные планшеты, и инфицировали СКСоУ с разбавлением вируса до достижения 50-200 инфицированных клеток на лунку. Зараженные планшеты фиксировали раствором на основе ацетона и промывали. Пробы сыворотки разводили в 2 раза непосредственно в СКСоУ-фиксированных планшетах. Планшеты инкубировали в течение 40-60 мин. Планшеты промывали и добавляли антисобачье 1дО Р1ТС-конъюгированное антитело кролика. Планшеты инкубировали в течение 40-60 мин. После инкубации планшеты промывали и исследовали под эпифлуоресцентным микроскопом. Титр антител определяли как обратную величину наивысшего разведения сыворотки, обладающего типичной (+1) или большей интенсивностью флуоресценции.

Пробы сыворотки были исследованы на СКСоУ нейтрализующие сыворотку антитела путем нейтрализации сыворотки. Вкратце, НКТ18О клетки высевали в культуры ткани 96-луночных планшет при соответствующей плотности и инкубировали в течение 3-5 дней при 35-37°С в увлажненном СО2 инкубаторе. Когда монослой клеток достигал 100% конфлюентности, лунки промывали средой и предварительно обрабатывали трипсином с добавкой сред в течение 1 ч в инкубаторе. Двукратные разведения каждой испытуемой сыворотки были подготовлены, и инкубирована при 50-300 ТСГО₅₀ СКСоУ в течение 40-60 мин при комнатной температуре. Вирус-сывороточные смеси из каждого разведения сыворотки инокулировали в четыре лунки. Планшеты инкубировали в течение 5-7 дней при 35-37°С в увлажненном СО2 инкубаторе. После инкубации среду отбрасывали и клеточные монослои фиксировали раствором на основе ацетона. Фиксатор сливали и планшеты были промыты. Наличие СКСоУ определяли методом иммунофлуоресценции с использованием СКСоУ-специфичного Р1ТС-конъюгированного антитела, под эпифлуоресцентным микроскопом. Титр нейтрализующих сыворотку антител определяли как обратную величину наивысшего разведения сыворотки, которая нейтрализует вирус в 50% лунок.

Основными переменными эффективности были наличие/отсутствие поврежденного трахеального реснитчатого эпителия оцененного баллом >1 (гистология трахеи) и выделение вируса. Не проводились проверки гипотез. Частотные распределения баллов гистологии (тяжесть, распределение, обработка и реснички) трахеи, носовой полости, и головной доли легкого, были рассчитаны для каждой группы лечения. Кроме того, трахеальный реснитчатый эпителий был дополнительно классифицирован как обычный (0 и 1) или аномальный (2, 3, и 4). Частотные распределения этой переменной были рассчитаны для каждой обработки. Частотные распределения в присутствии или в отсутствие выделения вируса СКСоУ из носовых мазков, и ротоглотки были рассчитаны для каждой группы лечения и момента времени. Количество дней, в течение которых вирус СКСоУ был обнаруженных в носовых смывах животного после заражения [(последний день обнаружения вируса - первый день обнаружения вируса) +1, если ни один вирус не был обнаружен] рассчитывали для каждого животного. Количество дней с обнаруженным вирусом из носовых мазков приведено для каждого лечения, с описательной статистикой, которая включала среднее, срединное, стандартное отклонение, минимум и максимум. Частотные распределения наличия/отсутствия выделения вируса из данных промывных вод и тканей были рассчитаны для каждой группы лечения. Описательная статистика титров антител (ΙΡΆ и 8Ν), в том числе среднее геометрическое, минимальное и максимальное были рассчитаны для каждого лечения и момент времени. Частотные распределения каждого из клинических наблюдений (носовые выделения, кашель, чихание, глазные выделения, конъюнктивит, и депрессии) были рассчитаны для каждой группы лечения и момента времени. Описательные статистические данные были рассчитаны для температуры, в том числе среднее значение, стандартное отклонение, минимум и максимум для каждого лечения и момента времени. Кроме того, температуры были классифицированы как <37,0, 37,0-39,5, 39,6-40,0, 40,1-41,0 и 41,1-42,0°С. Частотные распределения были вычислены для каждого лечения и времени этой новой переменной.

Частотные распределения наличия/отсутствия каждого теста были вычислены для каждого лечения и времени. Результаты. Все собаки оказались негативными для выделения вируса СКСоУ из мазков носа

- 13 032284 и ротоглотки, собранных в день 0 (перед заражением). Все собаки дали негативный результат (<40 ΙΡΆ титр) для СКСоУ антител по косвенному флуоресцентному анализу, и негативный результат (3 8Ν титр) для СКСоУ антител в анализе нейтрализации сыворотки проб сыворотки крови, взятых в день 0 (перед заражением). Все собаки оказались негативными для Вогбе1е11а ЬтоисЫкербса и Ра51еиге11а §р мазков носа и ротоглотки, собранных в день 0, но Мусор1а§та §р, 81арйу1ососси5 тГеттебшк и 81герЮсосси5 саищ были выделены из мазков носа и ротоглотки на различных уровнях в день 0. Здоровые собаки, тем не менее, часто являются носителями данных микроорганизмов как части их нормальной флоры верхних дыхательных путей.

Большинство клинических признаков для животных после заражения, которым вводили СКСоУ Макс изолят (группы лечения Т03 и Т04) и СКСоУ ΝΡ787 изолят (группы лечения Т05 и Т06), были от легких до умеренных, и включали выделения из носа, кашель, чихание и выделения из глаз. Конъюнктивит никогда не наблюдался, и одна собака представляла депрессию. Казалось, не должно быть никаких существенных различий между двумя изолятами заражения (СКСоУ Макс и СКСоУ ΝΡ787), связанных с патогенностью клинических признаков, наблюдаемых для групп лечения Т03 и Т04 (зараженных СКСоУ Макс изолятом), так и для групп лечения Т05 и Т06 (заражение СКСоУ ΝΡ787 изолятом).

Некоторые собаки, которым вводили плацебо (Физиологический раствор) в группах лечения Т01 и Т02, проявляли незначительные и умеренные выделения из глаз на этапе заражения исследования. Тем не менее, все эти собаки уже проявляли незначительные выделения из глаз до заражения в день 0. После заражения тимпанальные температуры были в норме (<39,4°С) для всех собак, зараженных СКСоУ Макс изолятом (группы лечения Т03 и Т04), и всех собак, зараженных СКСоУ ΝΡ787 изолятом (группы лечения Т05 и Т06). Некоторым собакам вводили плацебо в группах лечения Т01 и Т02 и они представляли гипертермию (>39,5°С) в какой-то момент во время этапа заражения исследования. Тем не менее, все эти собаки были совершенно нормальными и здоровыми, и было позже установлено, что ушной термометр использовали для лечебных групп Т01 и Т02 показывал высокие значения.

Таким образом, благодаря средней интенсивности СКСоУ клинических признаков, и из-за отсутствия гипертермии при заражении собак (СКСоУ Макс изолят и СКСоУ ΝΡ787 изолят), эти два критерия не являются достаточными, чтобы характеризовать и измерить интенсивность заболевания в лабораторных условиях.

Среднее число дней выделения вируса СКСоУ из носовых мазков для группы лечения Т03 (СКСоУ Макс изолят, день аутопсии 4) составляло 4, и для группы лечения Т04 (СКСоУ Макс изолят, день аутопсии 14) составляло 6. Среднее число дней выделения вируса СКСоУ из носовых мазков для группы лечения Т05 (СКСоУ ΝΡ787 изолят, день аутопсии 4) составляло 2, и для группы лечения Т06 (СКСоУ ΝΡ787 изолят, день аутопсии 14) составляло 5. Четыре собаки, которым вводили плацебо (физиологический раствор) для группы лечения Т02, были позитивными для вирусного изолята СКСоУ из носовых мазков в день 6, день 7 и день 8 после заражения. Ни одно из этих животных не проявило никаких клинических признаков, указывающих на СКСоУ инфекцию во время этапа после заражения. При аутопсии на 14 день после заражения три собаки Т02 имели в целом умеренные оценки легких. Оценка ресничек считалась нормальной для всех этих животных. Отсутствие выделений СКСоУ было получено из легких, легочного промывания, полости носа и трахеи для всех этих животных, и по этой причине, вряд ли дикого типа СКСоУ изолят был перекрестно загрязнен в плацебо (физиологический раствор) виварии. Кроме того, позитивные результаты СКСоУ выделения вируса были обнаружены только на втором проходе в НКТ18О клетках. Одна возможность состоит в том, что образцы были перекрестно загрязнены на этапе лабораторных исследований.

Среднее число дней выделения вируса СКСоУ из мазков ротоглотки для группы лечения Т03 (СКСоУ Макс изолят, день аутопсии 4) составляло 2, и для группы лечения Т04 (СКСоУ Макс изолят, день аутопсии 14) составляло 2. Среднее число дней выделения вируса СКСоУ из мазков ротоглотки для группы лечения Т05 (СКСоУ ΝΡ787 изолировать, день аутопсии 4) составляло 0, и для группы лечения Т06 (СКСоУ ΝΡ787 изолировать, день аутопсии 14) составляло 1. Численно наивысшие средние значения дней выделения СКСоУ были получены из мазков, собранных из полости носа с помощью СКСоУ Макс изолята как заражения организма (группы лечения Т03 и Т04). В заключение, носовые мазки, собранные в ходе первого этапа инфицирования, более вероятно, приведут к положительным выделениям вируса СКСоУ от собак, зараженных СКСоУ Макс изолятом. Отсутствие выделений вируса СКСоУ не наблюдалось из ткани легкого, полученной от плацебо (физиологический раствор) зараженных собак. Позитивное выделение вируса СКСоУ из ткани легкого наблюдалась у 10 из 10 собак (100%) при аутопсии в день 4 для группы лечения Т03 (СКСоУ Макс изолят). Позитивное выделение вируса СКСоУ из ткани легкого наблюдалась у 7 из 10 собак (70%) при аутопсии в день 4 для группы лечения Т05 (СКСоУ ΝΡ787 изолят). Отсутствие выделений вируса СКСоУ было получено из ткани легкого, собранной при аутопсии в день 14 для группы лечения Т04 (СКСоУ Макс изолят) или для группы лечения Т06 (СКСоУ ΝΡ787 изолят).

Отсутствие выделений вируса СКСоУ наблюдалось из промывания легкого, полученного от плацебо (физиологический раствор) зараженных собак. Позитивное выделение вируса СКСоУ из промывания легких наблюдалось у 10 из 10 собак (100%) при аутопсии в день 4 для группы лечения Т03 (СКСоУ

- 14 032284

Макс изолят) и группы лечения Т05 (СКСоУ ΝΡ787 изолят). Отсутствие выделений вируса СКСоУ было получено от промывания легких, собранного при аутопсии в день 14 для группы лечения Т04 (СКСоУ Макс изолят) или группы лечения Т06 (СКСоУ ΝΡ787 изолят). Отсутствие выделений вируса СКСоУ наблюдалось из полости носа, полученной от плацебо (физиологический раствор) зараженных собак. Позитивное выделение вируса СКСоУ из полости носа наблюдается у 10 из 10 собак (100%) при аутопсии в день 4 для группы лечения Т03 (СКСоУ Макс изолят) и группы лечения Т05 (СКСоУ ΝΡ787 изолят). Отсутствие выделений вируса СКСоУ было получено из носовых мазков, собранных при аутопсии в день 14 для группы лечения Т04 (СКСоУ Макс изолят) или группы лечения Т06 (СКСоУ ΝΡ787 изолят).

Отсутствие выделений вируса СКСоУ наблюдалось для трахеи, полученной от плацебо (физиологический раствор) зараженных собак. Позитивное выделение вируса СКСоУ из трахеи наблюдалось у 10 из 10 собак (100%) при аутопсии в день 4 для группы лечения Т03 (СКСоУ Макс изолят) или группы лечения Т05 (СКСоУ ΝΡ787 изолят). Отсутствие выделений вируса СКСоУ было получено из трахеи, собранной при аутопсии в день 14 для группы лечения Т04 (СКСоУ Макс изолят) и для группы лечения Т06 (СКСоУ ΝΡ787 изолят).

Оба изолята заражения (СКСоУ Макс и СКСоУ ΝΡ787) были успешно выделены из легких, смыва легких, носовой полости и трахеи и собраны при аутопсии в день 4 выделения вируса. Не было получено СКСоУ из легких, смыва легких, носовой полости и трахеи, собранных при аутопсии в день 14 для обоих изолятов заражения (СКСоУ Макс и СКСоУ ΝΡ787). В заключение легкие, смывы легких, носовой полости и трахеи, собранные в ходе первого этапа инфицирования, более вероятно, выявят позитивное выделение вируса СКСоУ. Клинически существенных патологических изменений не наблюдалось в реснитчатом эпителии в легочной ткани. Большинство собак во всех группах лечения имели балл 0. Одна собака в группе лечения Т03 (СКСоУ Макс изолят) при аутопсии в день 4 имела балл 1.

Клинически значимых патологических изменений не наблюдалось в реснитчатом эпителии носовой полости для групп лечения Т01 и Т02 (физиологический раствор) при аутопсии в день 4 и 14 соответственно. Для группы лечения Т03 (СКСоУ Макс изолят) при аутопсии в день 4, все 10 собак проявили патологию на балл 2 или выше. Для группы лечения Т04 (СКСоУ Макс изолят) при аутопсии в день 14, 6 из 10 собак (60%) проявили патологию на балл 22 или выше. Для группы лечения Т05 (СКСоУ ΝΡ787 изолята) при аутопсии в день 4, 9 из 10 собак (90%) проявили патологию на балл 2 или выше. Для группы лечения Т06 (СКСоУ ΝΡ787 изолят) при аутопсии в день 14, 7 из 10 собак (70%) проявили патологию на балл 2.

Клинически существенных патологических изменений не наблюдалось в реснитчатом эпителии трахеи для групп лечения Т01 и Т02 (физиологический раствор) при аутопсии в день 4 и 14 соответственно. Для группы лечения Т03 (СКСоУ Макс изолят) при аутопсии в день 4, 7 из 10 собак (70%) проявили патологию на балл 2 или выше. Для группы лечения Т04 (СКСоУ Макс изолят) при аутопсии в день 14, все 10 собак (100%), проявили патологию на балл 1. Для группы лечения Т05 (СКСоУ ΝΡ787 изолировать) при аутопсии в день 4, все 10 собак (100%) проявили патологию на балл 2 или выше. Для группы лечения Т06 (СКСоУ ΝΡ787 изолята) при аутопсии в день 14, все 10 собак (100%) проявили патологию на балл 1. Патологических изменений на балл 2 или выше не наблюдалось в легких животных, зараженных изолятами (СКСоУ Макс и СКСоУ ΝΡ787). 2 Патологических изменений на балл 2 или выше не наблюдалось в реснитчатом эпителии носовой полости и трахеи у животных, зараженных изолятами (СКСоУ Макс и СКСоУ ΝΡ787). Большинство патологических изменений (балл 2 или выше) в носовой полости, и в трахее наблюдались при аутопсии в день 4. В заключение, повреждение ресничного эпителия наблюдалось в носовой полости, и в трахее животных, зараженных обоими штаммами ( СКСоУ Макс и СКСоУ ΝΡ787), и эти патологические изменения оказались более выраженным во время первого этапа инфицирования (аутопсия на день 4).

Наиболее выраженные гистологические явления представляли собой полифокальное воспаление легких, носовой полости и трахеи, разных стадий.

Все собаки дали негативный результат (<40 ΙΡΆ) для СКСоУ антител при помощи непрямого флуоресцентного исследования проб сыворотки крови, взятых в день 4. Все плацебо (физиологический раствор) зараженные собаки оказались негативными (<40 ΙΡΆ) для СКСоУ антител по результатам непрямого флуоресцентного исследования проб сыворотки крови, взятых в день 14. Собаки в группе лечения Т04 (СКСоУ Макс изолят), при аутопсии в день 14, имели 1040 геометрические средние титры антител ΙΡΆ взятых проб сыворотки крови. Собаки в группе лечения Т06 (СКСоУ ΝΡ787 изолят) при аутопсии в день 14, имели 1689 геометрические средние титры антител ΙΡΆ взятых проб сыворотки крови.

Все собаки имели негативные результаты (3 8Ν титр) для СКСоУ нейтрализующих антител при анализе нейтрализации сыворотки проб сыворотки крови, взятых в день 4. Все собаки, для которых применялось плацебо (физиологический раствор), оказались негативными (3 8Ν титр) для СКСоУ нейтрализующих антител при анализе нейтрализации сыворотки проб сыворотки крови, взятых в день 14. Собаки в группе лечения Т04 (СКСоУ Макс изолят), при аутопсии в день 14, имели 100 среднее геометрическое 8Ν титров антител взятых проб сыворотки крови. Собаки в группе лечения Т06 (СКСоУ ΝΡ787 изолята) при аутопсии в день 14, имели 34 средние геометрические 8Ν титры антител взятых проб сыворотки

- 15 032284 крови.

Все собаки оказались негативными в отношении Вог4е1е11а ЬгоисЫкерБса, РайеигеИа §р, 81арйу1ососси5 т!егтейш8 аиб 81гер1ососси5 сапщ для смывов легких и легочной ткани, собранных в день 4 или день 14 после аутопсии. Мусор1а§та §р был выделен из промывания легких 2 собак, которым вводили плацебо - физиологический раствор (группы лечения Т01 и Т02). Мусор1а§та §р был выделен из смыва легких от 3 собак, которым вводили СВСоУ Макс изолят (группа лечения Т03). Мусор1а§та §р также был выделен из ткани легкого от 1 собаки, которой вводили СВСоУ Макс изолят (группа лечения Т03). Эти собаки не имели никаких признаков бактериальной пневмонии при аутопсии. Все собаки оказались негативными для выделения вируса СВСоУ по результатам мазков из носа и из ротоглотки, собранных в день 0 (перед заражением). Все собаки оказались негативными для СВСоУ антител (ΙΡΆ и 8Ν) проб сыворотки крови, взятых в день 0 (перед заражением). Все собаки оказались негативными для Вог4е1е11а ЬгопсЬЕерйса по результатам мазков из носа и ротоглотки, собранных в день 0 (перед заражением). Таким образом, были соблюдены критерии включения для исследования.

Выводы.

Все собаки, зараженные СВСоУ Макс изолятом, дали позитивный результат выделения вируса из носовых мазков и мазков ротоглотки во время этапа после заражения. Все собаки, зараженные СВСоУ ΝΡ787 изолятом, дали позитивный результат выделения вируса из носовых мазков, и 40-50% собак дали позитивный результат выделения вируса из мазков ротоглотки во время этапа после заражения. Таким образом, в данном исследовании представлено валидное заражение. Все собаки, зараженные СВСоУ Макс изолятом, дали позитивный результат выделения вируса из легких, смыва легких, носовой полости и трахеи при аутопсии в день 4. Все собаки, зараженные СВСоУ ΝΡ787 изолятом, дали позитивный результат выделения вируса из смыва легких, носовой полости, трахеи, и 70% собак дали позитивный результат выделения вируса из легких при аутопсии в день 4. Опять же, это подтверждает, что в данном исследовании представлено валидное заражение. Большинство клинических признаков после заражения для животных, которым вводили СВСоУ Макс изолят (группы лечения Т03 и Т04) и СВСоУ ΝΡ787 изолят (группы лечения Т05 и Т06), были от легких до умеренных, и включали выделения из носа, кашель, чихание и выделения из глаз. Конъюнктивит и гипертермия (>39,5°С) никогда не наблюдались, и лишь одна собака проявляла депрессию. Клинические признаки и тимпанальные температуры не являются достаточными, чтобы характеризовать и измерить интенсивность СВСоУ-индуцированного заболевания в лабораторных условиях.

Численно наивысшее среднее количество дней выделения СВСоУ было получено из мазков, собранных из носовой полости с использованием СВСоУ Макс изолята. Носовые мазки, собранные в ходе первого этапа инфицирования, более вероятно, приводят к позитивным выделениям вируса СВСоУ. Оба изолята заражения (СВСоУ Макс и СВСоУ ΝΡ787) были успешно выделены из легких, смыва легких, носовой полости и трахеи, собранной при аутопсии в день 4. Отсутствие выделения вируса СВСоУ было получено из легких, смыва легких, носовой полости и трахеи, собранных при аутопсии в день 14 для обоих изолятов заражения (СВСоУ Макс и СВСоУ ΝΡ787). В заключение, пробы легких, смыва легких, пробы полости носа и трахеи, собранные во время первого этапа инфицирования, вероятно, чаще приводят к позитивным выделениям вируса СВСоУ.

Отсутствие патологических изменений балла 2 или выше не наблюдалось в легких животных, зараженных обоими изолятами (СВСоУ Макс и СВСоУ ΝΡ787). Патологические изменения балла 2 или выше в реснитчатом эпителии носовой полости и трахеи наблюдали у животных, зараженных любыми из изолятов (СВСоУ Макс и СВСоУ ΝΡ787). Большинство патологических изменений (балл 2 или выше) в носовой полости, и в трахее, наблюдались при аутопсии в день 4. В заключение, повреждение ресничного эпителия наблюдалось в носовой полости, и в трахее животных, зараженных изолятами (СВСоУ Макс и СВСоУ ΝΡ787), и эти патологические изменения оказались более выраженным во время первого этапа инфицирования (аутопсия на день 4). Все собаки оказались негативными для Вог4е1е11а ЬгопсЬЕерБса, РайеигеПа §р, 81арНу1ососси5 йИегтеШщ аиб ЕНгерЮсоссщ саищ из смывов легких и легочной ткани, собранных в день 4 или в день 14 после аутопсии. Мусор1а§та §р был выделен из легких (смыва или ткани) от 6 собак; однако, бактериальной пневмонии не наблюдалось при аутопсии. В целом СВСоУ был единственным патогеном, выделенным из дыхательных путей, и, вероятно, он является ответственным за наблюдаемые клинические признаки и гистологию.

В заключение, СВСоУ Макс изолят или СВСоУ ΝΡ787 изолят, введенные путем аэрозолизации, приводили в результате к вирусной инфекции и репликации вируса в природном хозяине. СВСоУ был выделен из носовых мазков, мазков из ротоглотки, легких, промывания легких, полости носа и трахеи зараженных собак. Большинство клинических признаков были умеренными, и не имели отношения к характеристике заболевания. Тем не менее, повреждение ресничного эпителия трахеи и носовой полости не соответствовало параметрам, используемым для описания заболевания в лабораторных условиях. СВСоУ модель заражения и изоляты заражения подходят для применения в исследованиях эффективности вакцин для фракции СВСоУ.

Пример 2. Модель двойного инфицирования развития респираторного коронавируса собак (СВСоУ), Вог4е1е11а ЬгоисЫкерБса.

- 16 032284

Тридцать собак, все в хорошем общем состоянии здоровья, были включены в исследование. Все животные были негативными к антителам к СКСоУ, как определено иммунофлуоресцентным анализом антител ЦЕА) при <40 ГЕА титре в предварительном скрининге, и негативными (3 8Ν титр) к сывороточным нейтрализующим антителам к СКСоУ до СКСоУ заражения (день 0). Все собаки также были негативными для выделения СКСоУ из носовых мазков до СКСоУ заражения (день 0). Все животные были вакцинированы против Βо^άсΐс11а, и имели низкие титры антител (<16 МАТ титр) к Βо^άсΐс11а, как это определено в тесте микроагглютинирования (МАТ) до Βо^άсΐс11а заражения (день 3). Все они также не содержали Βо^άсΐс11а, как определено тестом выделений из носовых мазков, до СКСоУ заражения (день 0).

Таблица 2

План исследования

Группа лечения	Заражение	N	Целевая доза/собака	День исследования	Путь
Т01	Физиологический раствор	10	ЦА	0	Интраназальная аэрозолизация через камеру
Т02	Βо^άсΐс11а (ΒιΗγ са!) (051397-85Β-2)	10	109·0 СЕИ	3
Т03	СКСоУ (Мах р1) СМ (ΝΒ120586-123)	10	106·0 ТСШ50	0
Βо^άсΐс11а (ΒιΗγ са!) (051397-85Β-2)	109·0 сей	3

СКСоУ изолят, обозначенный Макс, был использован в качестве материала заражения. Вирус распространялся и его титровали на НКТ-18С клетках, и определи как имеющий титр 10⁷'¹ ТСШ₅₀/мл. ΒιΗγ кошачий штамм Βо^άсΐс11а ЬгопсЫксрйса был использован в качестве материала заражения.

Животных наблюдали по меньшей мере один раз в день с момента прибытия в день 3. Пробы крови собирали в день 0 до СКСоУ заражения, а также в день 3, перед Βо^άсΐс11а заражением. Тимпанальные температуры были определены в день -2, день-1 и день 0. Три типа носовых мазков собирали от каждой собаки перед заражением в день 0: один собирали в виале с транспортной средой (УТМ) для выделения вируса СКСоУ; второй собраны в Аш1ск среде для исследования бактерий; и третий собирали в триптозном фосфатном бульоне (ΤΓΒ) для выделения Βо^άсΐс11а. Дополнительные наборы были собраны в день 3 до Βо^άсΐс11а заражения, для выделения Βо^άсΐс11а. Собак наблюдали дважды в день -2, в день -1, и в день 0 (перед заражением), для клинических признаков респираторных заболеваний для определения исходных значений. В день 0 собакам в группе лечения Т01 вводили стерильный физиологический раствор путем аэрозолирования, в камере из плексигласа в течение приблизительно 30 мин. Кроме того, в день 0 собакам в группе лечения Т03 вводили СКСоУ путем аэрозолирования в камере из плексигласа в течение приблизительно 30 мин. В день 3 собаки в группах лечения Т02 и Т03 были заражены Βо^άсΐс11а путем аэрозолирования, в камере из плексигласа в течение 30 мин.

Клинические наблюдения (приблизительно 30 мин) проводили только раз в день 0, а затем дважды в день (приблизительно 30 мин каждая сессия) от дня 1 до дня 23. В день 3 наблюдения проводили до и после заражения Βо^άсΐс11а. В день 24 проводили одно наблюдение. Тимпанальные температуры были определены ежедневно после СКСоУ заражения, со дня 0 до дня 24. Два типа носовых мазков были собраны от каждой собаки после заражения: один собирали в УТМ пробирке для выделения вируса СКСоУ с дня 1 до дня 10; и второй собирали в триптозно-фосфатном бульоне (ΤРΒ) для выделения Βо^άсΐс11а, начиная с дня 6, выделяя дважды в неделю в течение трех недель, а затем в день 24. Еще один набор мазков был собран до аутопсии в день 24 в Атюк среде без древесного угля, для бактериального исследования. Пробы крови (приблизительно 6 мл) для серологии были собраны в 88Т пробирках в день 3, перед Βо^άсΐс11а заражения, и в день 24.

Аутопсию проводили в день 24 после заражения. Собаки были подвергнуты эвтаназии с передозировкой барбитуратом натрия. При аутопсии все легкое асептически извлекали и помещали на стерильную драпировку. Чтобы определить общее количество консолидации легких, каждую долю легких оценивали отдельно. Трахеи были рассечены, и просвет оценивали на предмет общей патологии. Все ткани были оценены сертифицированным ветеринарным патологоанатомом. После того, как легкие были оценены, правую хвостовую долю легкого промывали струей приблизительно 30,0 мл УТМ (без антибиотика или противогрибкового средства) через бронхиальное сплетение. УТМ среду отсасывали медленно обратно в шприц, осторожно массажируя легочную ткань. Промывные жидкости отбирали на аликвоты и тестировали на бактериологию, а также для выделения вируса СКСоУ. Пробы тканей были собраны из трахеи, носовой полости (в том числе реснитчатой секции), и правой черепной доли. Два набора проб тканей были собраны из трахеи и носовой полости. Один набор был протестирован для выделения вируса СКСоУ, и другой набор подготовлен для гистологии. Два набора проб ткани были получены из правой краниальной доли легкого. Первый набор был испытан на бактериологию, и второй набор был протестирован для выделения вируса СКСоУ. Один набор проб ткани, собранный из левой средней доли легкого,

- 17 032284 был подготовлен для гистологии.

Носовые мазки для выделения Вогйе1е11а, были собраны в день 0 до СВСоУ заражения, в день 3 до Вогйе1е11а заражения, начиная с дня 6 выделялись дважды в неделю в течение трех недель, и в день 24. Два тампона Са1§18^аЬ были использованы на одну собаку, один тампон в каждую ноздрю. Кровь для серологических исследований (СВСоУ ΙΡΑ/8Ν, Вогйе1е11а МАТ) собирали до СВСоУ заражения (день 0), до Вогйе1е11а заражения (день 3), и в конце исследования (день 24). Приблизительно 6 мл крови отбирали у каждой собаки в каждый момент времени. Сыворотка была отделена от цельной крови и декантирована в две криопробирки. Стерильные тампоны Эасгоп были использованы для сбора назальных мазков для выделения вируса. Мазки были собраны в день 0, до СВСоУ заражения, в день 3, перед заражением Вогйе1е11а, и от дня 1 до дня 10. Тампон осторожно вставляли в каждую ноздрю (один тампон на собаку), а затем помещали в стерильные пробирки для сбора содержащие приблизительно 3 мл вирусной транспортной среды (УТМ с добавлением антибиотиков). Назальные мазки собирали от каждой собаки в день 0 (перед заражением) и в день 24 (до аутопсии). Тампоны помещали в Аннев транспортную среду без древесного угля.

Для анализа антител Вогйе1е11а, агглютинативные антитела к Вогйе1е11а были определены при помощи теста частиц антигена (микро) агглютинации (МАТ). Вкратце, двукратные серийные разведения исследуемой сыворотки, известной позитивной сыворотки, негативной сыворотки были получены с использованием планшеты с ν-образным дном, с использованием физиологического раствора, содержащего 0,05% Т\тееп 20 в качестве разбавителя. Пробы сыворотки были добавлены по 50 мкл на лунку. 50 мкл Вогйе1е11а антигена добавляли в каждую лунку и перемешивали в течение 60 с в смесителе микротитрационных планшет. Планшеты инкубировали при 37±2°С в течение 2 ч, а затем в течение 20-48 ч при температуре 2-8°С. Планшеты считывали визуально на зеркальной стойке. Титры экспрессировали как обратные максимальному разведению, показывая полное склеивание. Для косвенного флуоресцентного анализа антител СВСоУ, образцы сыворотки титровали на анти-СВСоУ антителах при помощи ΙΡΑ. Если коротко, то НВТ-18С клетки высевали в 96-луночные планшеты и инфицировали оптимальным количеством СВСоУ, чтобы получить от 50-200 инфицированных клеток на лунку. Зараженные пластины фиксировали смесью ацетон основе фиксатора, промывали и хранили. Пробы сыворотки серийно разводили в 2 раза непосредственно в антиген-неподвижных планшетах, и инкубировали в течение 40-60 мин. Отбрасывали тестовые сыворотки, планшеты промывали и добавляли антисобачьи кроличьи 1д0-с ΡΑ-конъюгированные антитела и инкубировали в течение 40-60 мин. Затем лунки промывали, и планшеты были исследованы на флуоресценцию под микроскопом. Титр антител определяли как обратную величину наивысшего разведения сыворотки, обладающего типичной (+1) или более интенсивной флуоресценцией. Для СВСоУ анализа нейтрализации сыворотки, СВСоУ титры сыворотка-нейтрализующих антител были определены на НВТ-180 клетках. Вкратце, НВТ-180 клетки высевали в 96-луночных планшетах тканевых культур при соответствующей плотности и инкубировали в СО₂ инкубаторе при 36°С±1 в течение 3-5 дней. Когда клеточные монослои в лунках были 100% конфлюентны, лунки промывали средой, и предварительно обрабатывали трипсином с добавкой сред по меньшей мере 1 ч в инкубаторе. Двукратные разведения каждой испытуемой сыворотки были подготовлены, и инкубированы при 50-422 ТСГО₅₀ СВСоУ в течение 40-60 мин при комнатной температуре. Вирус-сывороточные смеси из каждого разведения сыворотки инокулировали в двух лунках. Планшеты инкубировали в увлажненном СО₂ инкубаторе (3-5% СО₂) при 35-37°С в течение 5-7 дней. Когда инкубация была завершена, планшеты были зафиксированы, окрашены СВСоУ специфичными-Р1ТС конъюгированными антителами, и исследованы под эпифлуоресцентным микроскопом. Титр сыворотка-нейтрализующих антител определяли как обратную величину наивысшего разведения сыворотки, которое нейтрализует вирус в 50% лунок.

Для выделения СВСоУ носовые мазки, ткани и образцы смывов легких анализировали на присутствие СВСоУ на НВТ-180 клетках. Вкратце, образцы были обработаны и инокулированы в колбы, засеянные НВТ-180 клетками. Назальные пробы были привиты в Т-25 колбах. Ткани и пробы промывания легких инокулировали в Т-150 колбах. Инокулированные колбы инкубировали в течение ночи в СО₂ инкубаторе при 36°С±1.

Затем фетальную бычью сыворотку (РВ8) добавляли в каждую колбу (80 мкл в Т-25 колбу или 500 мкл в Т-150 колбу). Колбы инкубировали в течение приблизительно 7 дней в СО₂ инкубаторе при 36°С±1. Пробы затем были собраны, и инокулированы в НВТ клетках в 96-луночных планшетах. Четыре лунки планшета инокулировали 120 мкл на лунку и дополнительные 4 лунки засевали 30 мкл на лунку. 96-луночные планшеты инкубировали в течение 5 до 7 дней в СО₂ инкубаторе при 36°С±1, а затем фиксировали фиксатором на основе ацетона, а затем окрашивали красителем СВСоУ РА (все лунки). Наличие вируса в пробе было признано, если типичная флуоресценция (СВСоУ РА-позитивные клетки) наблюдалась под микроскопом.

Для титрования СВСоУ заражения вирусом, титр материала заражения был определен на НВТ-180. Коротко, НВТ-180 клетки высевали в 96-луночных планшетах тканевой культуры при соответствующей плотности и инкубировали в СО₂ инкубаторе при 36°С±1 в течение 3-5 дней. Когда клеточный монослой был 100% конфлюентным, лунки промывали средой, и предварительно обрабатывали трипсином с до

- 18 032284 бавкой сред в течение 1 ч в в СО₂ инкубаторе. Десятикратно серийно разведенный тестовый образец инокулировали в лунки в 6 репликатах на разведение. Планшеты инкубировали в увлажненном в СО₂ инкубаторе (3-5% СО₂) в течение 5-7 дней при 35-37°С. После инкубации среду удаляли, и клетки инкубировали в течение 20-40 мин с фиксатора на основе ацетоном при комнатной температуре. Фиксатор отбрасывали, и планшеты промывали дважды водой. СКСоУ НТС-конъюгированное антитело добавляли в лунки, и инкубировали в течение 40-60 мин при комнатной температуре. Когда инкубация была завершена, лунки дважды промывали водой до того, как планшеты наблюдали под эпифлуоресцентным микроскопом на наличие СКСоУ-инфицированных клеток. 50% конечная точка для инфекционности была рассчитана с использованием метода Спирмена-Карбера, и титр вируса был выражен в журнале как 1од10ТСШ₅₀/мл.

Назальные мазки, легочные ткани и образцы смывов были оценены на присутствие Вогбе!е11а Ьгопсйкербса, Мусор1акта кр., 8!гер!ососсик сашк, 81арйу1ососсик ш!егтебшк, и Рак!еиге11а кр. в соответствии со стандартными процедурами.

Слайды для носовой полости, тканей легких и трахеи были подготовлены, и оценены на предмет гистологических поражений сертифицированным советом патологоанатомов.

Критериями для валидного анализа является то, что все животные в исследовании должны: (1) не содержать СКСоУ путем выделения вируса в день 0; (и) серонегативными к СКСоУ в день 0; (ш) не содержать Вогбе!е11а в день 0 и 3 (до Вогбе!е11а заражения) путем бактериального выделения из носовых мазков; и (ίν) чувствительны к Вогбе!е11а до заражения, как определено титром МАТ антител оставшихся <16 в день 0. Респираторные клинические признаки, в том числе кашель, были основными критериями, используемыми для оценки степени заболевания. Бактериальное выделение было вспомогательной вторичной переменной.

Частотные распределения клинических наблюдений (выделения из носа, кашель, чихание, выделения из глаз, рвота, депрессия и дыхание) были рассчитаны для каждой временной точки и лечения. Количество дней после заражения с определенным процентом клинического признака периода наблюдений после заражения, в течение которого животное имело особые клинических признаки (выделения из носа, кашель, чихание, выделения из глаз, депрессии, рвота и дыхания) и количество дней после заражения с конкретным клиническим признаком (выделения из носа, кашель, чихание, выделения из глаз, депрессия, рвота и дыхание), были рассчитаны для каждого животного. Описательная статистика для периодов процентов с клиническими признаками, и продолжительность каждого клинического признака, в том числе среднее, срединное, стандартное отклонение, минимумы и максимумы, были рассчитаны для каждого лечения и временного момента. Животные были классифицированы как имеющие лихорадку (>39,5°С) или не имеющие лихорадки (<39,5°С) на каждый день. Частотные распределения лихорадки/отсутствия лихорадки были вычислены для каждого лечения и момента времени. Частотные распределения в присутствии или в отсутствие выделения СКСоУ из носовых мазков были рассчитаны для каждой группы лечения и момента времени. Количество дней, в течение которых животное обнаруживало СКСоУ в носовых смывах после заражения (первый день обнаружения вируса - последний день обнаружения вируса) были рассчитаны для каждого животного. Были рассчитаны средние значения, срединные, стандартные отклонения, минимумы и максимумы. Частотные распределения наличия/отсутствия выделения вируса из смыва легких, легких, полости носа и трахеи были рассчитаны для каждой группы лечения. Частотные распределения бактериовыделения (позитивное/негативное) были рассчитаны для каждого лечения и момента времени. Кроме того, было определено для каждого животного, имело ли оно когда-либо бактерии, выделенные после заражения, и частотное распределение, которое было вычислено для каждого лечения. Частотные распределения каждого типа патоморфологического балла для трахеи, носовой полости, и левой средней доли легкого были рассчитаны для каждой группы лечения. Кроме того, оценка трахеальной реснички было дополнительно классифицирована как нормальная/гистологически не релевантная (0 и 1), или ненормальная/гистологически релевантная (2, 3, и 4), и частоты этого распределения рассчитывали для каждого лечения. Диффузное, дискретное и полное легочные поражения были рассчитаны по следующей формуле:

Процент поражения=0,53 [(0,35хправой краниальной доли)+(0,15хправой средней доли)+ (0,40хправой хвостовой доли)+(0,10хвспомогательная доля)]+0,47 [(0,30х левая краниальная доля)+(0,25хлевая средняя доля)+(0,45хлевая хвостовая доля)].

Описательные статистические данные, включая среднее значение, срединное, стандартное отклонение, минимум и максимум, рассчитывали для каждого лечения и типа поражения легких.

Частотные распределения присутствия грубых поражений, изменения цвета и увеличения секреции были рассчитаны для каждой группы лечения. Геометрические средние значения для лечения, минимумы и максимумы титров антител были рассчитаны для каждой временной точки. Частотные распределения присутствия/отсутствия Вогбе!е11а были рассчитаны для каждой группы лечения и момента времени.

Результаты.

Все собаки показали негативный результат (<40 1ЕА титр) для СКСоУ антител при помощи косвенного флуоресцентного анализа, и негативный результат (3 8N титр) для СКСоУ антител при помощи

- 19 032284 анализа нейтрализации сыворотки проб сыворотки крови, взятых в день 0 (перед заражением). Определено, что все собаки оказались негативными для СВСоУ, путем выделения вируса из носовых мазков, собранных в день 0 (до заражения). Все собаки были негативными для Вогбе!е11а антител (<16) теста микроагглютинации проб сыворотки, собранных в день -21, и в день 0 (до заражения). Все собаки оказались негативными для Вогбе!е11а и РаДеигеИа 8р. согласно результатам назальных мазков, собранных до заражения (день 0). Мусор1а§та §р., 81арйу1ососси5 ркеиЛйегтебшк апб 81гер1ососси5 сапй были выделены из назальных мазков на разных уровнях в день 0 (они варьировались между 0-80%, при этом проценты для 8. р8еибт1егтебш8 были наибольшими, при 50-80%). Однако здоровые собаки часто являются носителями этих микроорганизмов как части их нормальной флоры верхних дыхательных путей. Таким образом, были соблюдены критерии включения.

Титрование, проведенные на СВСоУ пробах заражения, собранных во время заражения, подтвердили, что 10⁴'⁵ ТСШ₅₀ были аэрозольно нанесены на собаку в камере. Подсчет на планшетах выполняли в начале и в конце инокуляции заражения, что подтвердило, что в среднем 5х10⁸ КОЕ Вогбе!е11а было аэрозольно нанесено на собаку в камере.

Тимпанальные температуры после заражения были в норме (<39,4°С) для всех групп лечения. Среднее значение, стандартное отклонение, среднее значение, минимум и максимум были рассчитаны для каждого отдельного клинического признака (выделения из носа, кашель, чихание, выделения из глаз, рвота, депрессия и дыхание), чтобы определить, есть ли разница между группой лечения Т02 (Вогбе!е11а) и группой лечения Т03 (СВСоУ и Вогбе!е11а). Было увеличение процентов периодов времени с выделениями из носа для собак в группе лечения Т03 (СВСоУ и Вогбе!е11а, среднее = 38,3) по сравнению с собаками в лечебной группе Т02 (Вогбе!е11а, среднее = 7,2). Было также увеличение сроков и процентов касательно выделений из глаз для собак в группе лечения Т03 (СВСоУ и Вогбе!е11а, среднее = 25,1) по сравнению с собаками в лечебной группе Т02 (Вогбе!е11а, среднее = 9,6).

Все собаки в группе лечения Т01 (плацебо, физиологический раствор), группе лечения Т02 (Вогбе!е11а), и группе лечения Т03 (СВСоУ и Вогбе!е11а) дали негативный результат (<40 1ГА титр) для СВСоУ антител в непрямом флуоресцентном анализе, и негативный результат (3 8Ν титр) для СВСоУ антител в анализе нейтрализации сыворотке проб сыворотки крови, взятых в день 3. Все собаки в группе лечения Т01 (плацебо, физиологический раствор) и группы лечения Т02 (Вогбе!е11а) дали негативный результат (<40 1БА титр) для СВСоУ антител в непрямом люминесцентном анализе и негативный результат (3 8Ν титр) для СВСоУ антител в анализе нейтрализации сыворотки проб сыворотки крови, взятых в день 24. Все собаки в группе лечения Т03 (СВСоУ и Вогбе!е11а) дали позитивный результат для СВСоУ антител в непрямом флуоресцентном исследовании (среднее геометрическое 1БА титр = 31510,7), и позитивный результат для СВСоУ антител в анализе сыворотке нейтрализации (среднее геометрическое 8Ν титра = 361,8) проб сыворотки крови, взятых в день 24. Все собаки в группе лечения Т01 (плацебо, физиологический раствор), группе лечения Т02 (Вогбе!е11а), и группе лечения Т03 (СВСоУ и Вогбе!е11а) дали негативный результат на Вогбе!е11а антитела (<8) при помощи МАТ проб сыворотки крови, взятых в день 3. Все собаки в группе лечения Т01 (плацебо, физиологический раствор) дали негативный результат на Вогбе!е11а антитела (8) при помощи МАТ проб сыворотки, полученных в день 24. Большинство собак (8 из 10) в группе лечения Т02 (Вогбе!е11а), и все собаки в группе лечения Т03 (СВСоУ и Вогбе!е11а), имели Вогбе!е11а антитела (16) при помощи МАТ (среднее геометрическое МАТ титра для Т02 и Т03 = 13,9) проб сыворотки крови, взятых в день 24.

Среднее число дней выделения вируса СВСоУ из носовых мазков составляло 0 для группы лечения Т01 (плацебо, физиологический раствор), 0 для группы лечения Т02 (Вогбе!е11а), и 6 для группы лечения Т03 (СВСоУ и Вогбе!е11а). СВСоУ не был выделен из смыва легких, легочной ткани, полости носа или трахеи при аутопсии в день 24 для какой-либо из групп лечения. Вогбе!е11а был выделен из носовых мазков, собранных в Дни 6, 9, 13, 16, 20, 23 и 24 группы лечения Т02 (Вогбе!е11а) и группы лечения Т03 (СВСоУ и Вогбе!е11а). Все собаки в группе лечения Т01 (плацебо, физиологический раствор) дали негативный результат выделения Вогбе!е11а из смыва легких и легочной ткани, собранной в день 24. Все собаки в группе лечения Т02 (Вогбе!е11а) и в группе лечения Т03 (СВСоУ и Вогбе!е11а) дали позитивный результат на Вогбе!е11а из смыва легких и легочной ткани, собранной в день 24. Мусор1а§та §р., 81арйу1ососси5 ркеиЛШегтебшк и 81герЮсосси5 сапй были выделены из назальных мазков на различных уровнях в день 24. Все собаки в группе лечения Т01 (плацебо, физиологический раствор), группе лечения Т02 (Вогбе!е11а) и группе лечения Т03 (СВСоУ и Вогбе!е11а) дали негативный результат на РаДеигеИа §р. в день 24. Одна собака в группе лечения Т03 (СВСоУ и Вогбе!е11а) имела Мусор1а§та §р., выделенный из смыва легких. Все собаки в группе лечения Т01 (плацебо, физиологический раствор), группе лечения Т02 (Вогбе!е11а), и группе лечения Т03 (СВСоУ и Вогбе!е11а) дали негативный результат на РаДеигеИа зр., 81ар11у1ососси5 ркеиЛШегтебшк и 81герЮсосси5 собаки из смыва легких и из ткани легкого при аутопсии в день 24.

Животные, зараженные СВСоУ и Вогбе!е11а (группа лечения Т03), имели более высокую частоту и тяжесть макро- и микроскопических поражений легких, чем у животных, зараженных только Вогбе!е11а (группа лечения Т02) и физиологическим раствором (плацебо) (группа лечения Т01). Микроскопические трахеальные и назальные поражения имели подобные распространенность и тяжесть в группах лечения

- 20 032284

Т02 и Т03. Частота и тяжесть поражений легких наблюдается у животных с двойным заражением, что предполагает, что инфекция СКСоУ предрасполагает собак к развитию пневмонии после заражения Вогбе1е11а. Тем не менее, эти данные должны быть соотнесены с бактериальными и вирусными анализами, а также при представлении клинических признаков у инфицированных животных.

Выводы. Критерии включения были выполнены, в том, что (ί) все собаки были здоровы и не получали никаких прививок Вогбе1е11а; (и) все собаки были негативными для антител к СКСоУ (<40 ΙΡΑ титр), и негативными (3 8Ν титр) для сыворотка-нейтрализующих антител к СКСоУ до заражения; (ш) все собаки были негативными для выделения СКСоУ из назальных мазков до заражения; и (ίν) все собаки имели низкие титры антител (<8 МАТ титр) к Вогбе1е11а. и не имели до заражения выделений Вогбе1е11а из носовых мазков.

Заражения рассматривали как удовлетворительные, так как (ί) все собаки, зараженные СКСоУ, были позитивными для выделения вируса СКСоУ из назальных мазков (день 24); и (ίί) все собаки, зараженные Вогбе1е11а, были положительными для выделения бактерий из назальных мазков (день 9).

Тимпанальные температуры после заражения были нормальными (<39,4°С) для групп лечения Т01 (плацебо, физиологический раствор), Т02 (Вогбе!е11а) и Т03 (СКСоУ и Вогбе1е11а).

Касательно клинических признаков, которые были оценены на этапе после заражения (выделения из носа, кашель, чихание, выделения из глаз, рвота, депрессия и дыхание), увеличение наблюдалось в периоды процентов с выделениями из носа для собак в группе лечения Т03 (СКСоУ и Вогбе1е11а, среднее значение = 38,3) по сравнению с собаками в группе лечения Т02 (Вогбе1е11а, среднее значение = 7,2), и в периоды времени процентов с выделениями из глаз для собак в группе лечения Т03 (СКСоУ и Вогбе1е11а, среднее значение = 25,1) по сравнению с собаками в группе лечения Т02 (Вогбе1е11а, среднее значение = 9,6). Другие клинические признаки (кашель, чихание, рвота, депрессия и дыхание) не различались при сравнении группы лечения Т02 (Вогбе1е11а) и группы лечения Т03 (СКСоУ и Вогбе1е11а).

Все собаки в группах лечения Т02 (Вогбе1е11а) и Т03 (СКСоУ и Вогбе1е11а) дали позитивный результат на Вогбе1е11а для промывания легких, и из легочной ткани, собранной в конце исследования (день 24). СКСоУ не был выделен из группы лечения Т03 (СКСоУ и Вогбе1е11а) смывах легких, легочной ткани, полости носа или проб трахеи, собранных в конце исследования (день 24). Предыдущие местные исследования показали, что СКСоУ легче выделять из промывания легких и из легочной ткани в течение первой недели после заражения. Все собаки в группах лечения Т01 (плацебо, физиологический раствор), Т02 (Вотбе1е11а) и Т03 (СКСоУ и Вогбе1е11а) дали негативный результат для РайеитеПа §р §1арйу1ососси8 ркеиФШегтебшк, Мусор1а§та §р. (за исключением одной собаки из группы лечения Т03) и 81гер1ососси5 саи18 из промывания легких и легочной ткани, собранной в конце исследования (день 24). Диффузные, дискретные и цельные средства консолидации легких были выше у животных, зараженных СКСоУ и Вогбе1е11а (группа лечения Т03). Частота и тяжесть поражений легких, наблюдаемых у этих животных, позволяют предположить, что инфекция СКСоУ предрасполагает собак к развитию пневмонии после заражения Вогбе1е11а.

В целом носовые/глазные выделения из глаз и данные аутопсии показывают, что предварительное заражения собак с СКСоУ увеличивает частоту и тяжесть респираторных заболеваний после вторичной инфекции Вогбе1е11а.

Пример 3. Эффективность СКСоУ вакцины против двойного заражения СКСоУ и Вогбе1е11а ЬтоисЫкерйса.

Шестьдесят собаки, все в хорошем общем состоянии здоровья, были включены в исследование. Все животные не получали никаких прививок Вогбе1е11а, и, как определяется тестом микроагглютинации (МАТ), обнаружены антитела на низком уровне (<8 титр МАТ), к Вогбе1е11а ЬгоисЫкерйса до вакцинации (день 0). Все также не содержали В. ЬгоисЫкерйса, как определено тестом бактериального выделения из назальных мазков до вакцинации (день 0). Все собаки были также негативными для антител против СКСоУ, как определено с помощью иммунофлуоресцентного анализа антител (ΙΡΑ) при <40 ΙΡΑ титре, а также определено в сыворотке нейтрализации (8Ν титр <11) до вакцинации в день 0. Все собаки были подтверждены как не содержащие СКСоУ путем выделения вируса из назального мазка перед вакцинацией в день 0.

- 21 032284

Таблица 3 План исследования

Группа	1УР/СР1	N	Вакцинация	Заражение
Объем (мл)	Дни исследования	Путь	Дни исследования	Целевая доза/Собака
СКСоУ	Вотбе1е11а
Т01	Физиологический раствор	10	1,0	0,21	8С2	42,45	10Л6	10Л3
Т02	СКСоУ Вакцина	10
Т03	Физиологический раствор	10	10л6	10Л5
Т04	СКСоУ Вакцина	9
Т05	Физиологический раствор	10	10Л6	10Л7
Т06	СКСоУ Вакцина	10

- исследуемый ветеринарный продукт (1УР) или контрольный продукт (СР) - вместе называются 1УР.

- подкожно.

СКСоУ изолят, обозначенный Макс, был использован в качестве материала заражения в этом исследовании. Вирусный бульон был произведен при первом прохождении в НКТ-18С клеточной линии с титром 10⁷'¹ ТСГО₅₀/мл. Штамм Вотбе1е11а ЬтопсйЕерйса В1йг кошек также используется в качестве материала заражения в данном исследовании.

Животных наблюдали на предмет общего здоровья раз в день, с момента прибытия до заражения (дни от -7 до +42). В дни вакцинации (дни 0 и 21) животных исследовали дважды (до и после вакцинации). Пробы крови для серологических исследований были собраны от всех животных на исследования в дни 0 и 21 (до вакцинации), день 42 (до заражения) и день 65. Три типа назальных мазков собирали от каждой собаки. Назальные мазки были собраны в пробирки с вирусной транспортной средой (УТМ) для выделения СКСоУ вируса на день 0 до вакцинации, день 42 до заражения, и один раз в день в дни от 43 до 52.

Назальные мазки были собраны в пробирки, содержащие триптозный фосфатный бульон (ТРВ) для выделения Вотбе1е11а. Эти мазки были собраны в день 0 до вакцинации, день 45 до заражения, и дважды в неделю в течение 3 недель после заражения, и в день 65. Назальные мазки были собраны в Лш1е8 среде без древесного угля, для бактериологического исследования до заражения на день 42. Тимпанальные температуры были собраны, начиная с дня -1; до и через 3-6 ч после вакцинации в дни 0 и 21, дни 1-7 и дни 22-28. Тимпанальные температуры были собраны один раз в день в дни 40-65. В дни заражения (день 42 и 45) выполняли два сбора, предварительное заражение и через 3-6 ч после заражения.

Животные были пальпированы в соответствующей плечевой области в день 0 и 21 до вакцинации, чтобы гарантировать, что не было уже существующих поражений на месте инъекции. Животным были введены соответствующие вакцины в дни 0 и 21, в соответствии с планом исследования, представленным в табл. 3. Вакцины вводили подкожно каждой собаке в правую плечевую область для первой вакцинации, и в левую плечевой область для второй вакцинации. Активность вакцины СКСоУ определяли с помощью теста ЕЬ18А до вакцинации. Животных наблюдали приблизительно 5 часов после вакцинации в дни 0 и 21, и один раз в день в дни с 1 по 7 и с 22 по 28.

На 42 день СКСоУ заражения вирусные бульоны были разморожены, и соответствующим образом разбавлены, чтобы подготовить вирусные суспензии для введения целевой дозы заражения 1х 10⁶ собаке.

Материалы заражения сохраняли во льду до инокуляции заражения. На 45 день бульон В. ЬтопсйЕерЕса ВПп кошачьего штамма были использован для подготовки материала заражения. На завершающем этапе подготовки суспензии заражения, концентрацию организма регулировали, чтобы обеспечить целевую дозу заражения 10³ КОЕ на собаку (Т01/Т02), 10⁵ КОЕ на собаку (Т03/Т04) и 10⁷ КОЕ на собаку (Т05/Т06). Материалы заражения сохраняли во льду до инокуляции заражения.

На день 4 собакам из всех групп лечения вводили вирус путем аэрозолизации в камере из плексигласа. В день 45 собаки из соответствующих групп лечения были заражены В. ВтопсйЕерЕса заданного уровня, в виде аэрозоля, в плексигласовой камере. Для Т04 группы заражения одно животное было удалено из исследования до заражения.

Животных исследовали дважды в день (утром и вечером), в течение приблизительно 30 мин каждой сессии, в дни 40, 41 и 42, до заражения, на предмет клинических признаков респираторного заболевания. Клинические наблюдения проводились дважды в день (утром и вечером), приблизительно в течение 30 мин каждой сессии, со дня 42 и до дня 64. В дни 42 и 45 наблюдения имели место до заражения и через

- 22 032284

3-6 ч после заражения. В день 65 было выполнено только одно наблюдение (утром).

Вскрытие проводили для всех животных в день 65 как часть оценки исследования. При аутопсии все легкое асептически извлекали и помещали на стерильную драпировку. Доли легких оценивали грубо, была выполнена оценка в процентах от объема затронутых легких. Оценка тканей была выполнена с помощью АСУР сертифицированного советом патологоанатома. Чтобы определить процент объема затронутых легких, каждую долю легкого оценивали на процент тканей, затронутыми грубыми изменениями, которые могут включать, не ограничиваясь приведенным, обесцвечивание (изменение цвета), невозможность сжатия, или изменения в структуре (жесткий/консолидированный, эластичный/резиноподобный, твердый, или издающий треск). Процент дискретных или диффузных поражений был оценен. Трахеи рассекали, и просвет оценивали по общей патологии. Пробы двух типов тканей (секций) были собраны из трахеи и носовой полости - одна для выделения вируса, и другая как участок для гистологии. Правая черепная доля легкого была разделена на две части: одна для выделения вируса и одна для пробы бактериологии. Вся левая доля среднего легкого асептически разъединена на бронхиальном сплетении и собрана для гистологии. После сбора всех других проб (выделение вируса и бактериологические исследования); доля была надута приблизительно 20-30 мл 10% забуференного формалина перед тем, как поместить ее в контейнер с формалином.

Пробы сыворотки титровали на предмет СКСоУ-специфических антител при помощи ΙΡΑ для скрининга животных, и путем нейтрализации сыворотки (8Ν) для всех других проб (дни 0, 21, 42 и 65), в соответствии со стандартными процедурами.

Пробы сыворотки для скрининга титровали на СКСоУ антитела при помощи ΙΡΑ. Вкратце, НКТ180 клетки высевали в 96-луночные планшеты, и инфицировали оптимальным количеством СКСоУ для получения 50-200 инфицированных клеток на лунку. Зараженные пластины фиксировали фиксатором на основе ацетона, промывали и хранили. Пробы тестовой сыворотки в 2 раза последовательно разводили непосредственно в антиген-фиксированных планшетах, и инкубировали в течение 40-60 мин. Тестовые сыворотки отбрасывали, планшеты промывали и добавляли кроличьи антисобачьи Ι§0- ΡΑконъюгированные антитела и инкубировали в течение 40-60 мин. Затем лунки промывали, и планшеты были исследованы на флуоресценцию под микроскопом. Титр антител определяли как обратную величину наивысшего разведения сыворотки, обладающего типичной (+1) или более интенсивной флуоресценцией.

СКСоУ титры сыворотка-нейтрализующих антител были определены на НКТ-18О клетках. Вкратце, НКТ-18О клетки высевали в 96-луночных планшетах тканевой культуры при соответствующей плотности и инкубировали в СО₂ инкубаторе при 36°С±1 в течение 3-5 дней. Когда клеточные монослои в лунках имели 100% конфлюентность, лунки промывали средой и предварительно обрабатывали трипсином с добавкой сред по меньшей мере 1 ч в инкубаторе. Двукратные разведения каждой испытуемой сыворотки были подготовлены и их инкубировали с 50-422 ТСШ₅₀ СКСоУ в течение 40-60 мин при комнатной температуре. Вирусно-сыворотковые смеси каждого разведения сыворотки инокулировали в две лунки. Планшеты инкубировали в увлажненном СО₂ инкубаторе (3-5% СО₂) при 35-37°С в течение 5-7 дней. Когда инкубация была завершена, планшеты были зафиксированы, окрашены СКСоУ специфичными-ИТС конъюгированными антителами, и исследованы под эпифлуоресцентным микроскопом. Титр сыворотка-нейтрализующих антител определяли как обратную величину наивысшего разведения сыворотки, которое нейтрализует вирус в 50% лунок.

Агглютинирующие антитела к В. ЬгопсНЕерРса были определены при помощи теста (микро) агглютиации антигена на основе частиц ^ΑΨ), в соответствии со стандартной процедурой. Вкратце, двукратные серийные разведения исследуемой сыворотки, известной позитивной сыворотки и негативной сыворотки были выполнены в микротитрационных планшетах с ν-образным дном, с использованием физиологического раствора, содержащего 0,05% Т\гееп 20 в качестве разбавителя. Пробы сыворотки были добавлены в 50 мкл на лунку. 50 мкл объем антигена В. ЬгопсНЕерРса добавляли в каждую лунку, и смешивали в течение 60 с в смесителе микротитрационных планшет. Планшеты инкубировали при 37±2°С в течение 2 ч, а затем планшеты хранили в течение 20-48 ч при температуре 2-8°С. Планшеты считывали визуально на зеркальной стойке. Титр выражается в виде обратной величины наибольшего разведения, проявляющего полное склеивание. Назальные мазки и ткани анализировали на присутствие СКСоУ на НКТ-18О клетках. Вкратце, пробы были обработаны и их инокулировали в колбах, которые засевали НКТ-18О клетками. Назальные пробы были привиты в Т-25 колбах. Ткани и пробы промывания легких инокулировали в Т-150 колбах. Инокулированные колбы инкубировали в течение ночи в СО₂ инкубаторе при 36°С±1. Затем фетальную бычью сыворотку (РВ8) добавляли в каждую колбу (80 мкл в Т-25 колбу или 500 мкл в Т-150 колбу). Колбы инкубировали в течение приблизительно 7 дней в СО2 инкубаторе при 36°С±1. Пробы затем были взяты и их инокулировали в НКТ клетках в 96-луночных планшетах. Четыре лунки планшета засевали 120 мкл/лунка, и 4 дополнительных лунки были привиты 30 мкл/лунка. 96-луночные планшеты инкубировали в течение от 5 до 7 дней в СО₂ инкубаторе при 36°С±1, фиксировали с помощью фиксатора на основе ацетона, а затем окрашивали СКСоУ ΡΑ красителем (все лунки). Наличие вируса в пробе признавали, когда типичная флуоресценция (СКСоУ ΡΑ позитивные клетки) наблюдалась под микроскопом.

- 23 032284

Титр материала заражения был определен на НКТ-18О. Вкратце, НКТ- 18О клетки высевали в 96луночных планшетах тканевой культуре при соответствующей плотности и инкубировали в СО₂ инкубаторе при 36°С±1 в течение 3-5 дней. Когда клеточный монослой имел 100% конфлюентность, лунки промывали средой, и предварительно обрабатывали трипсин дополненной средой в течение 1 ч в СО₂ инкубаторе. Десятикратно серийно разведенный тестовый образец инокулировали в лунки, в 6 репликатах на разведение. Планшеты инкубировали во влажном СО₂ инкубаторе (3-5% СО₂) в течение 5-7 дней при 35-37°С. После инкубации среду удаляли и клетки инкубировали в течение 20-40 мин фиксатором на основе ацетоном при комнатной температуре. Фиксатор отбрасывали, и планшеты промывали дважды водой. СРСоУ МТС-конъюгированное антитело добавляли в лунки, и инкубировали в течение 40-60 мин при комнатной температуре. Когда инкубации была завершена, лунки дважды промывали водой до того, как планшету были исследованы под эпифлуоресцентным микроскопом на наличие СЯСоУинфицированных клеток. 50% конечная точка для инфекционности была рассчитана с использованием метода Спирмена-Карбера, и титр вируса был выражен как Ьод0ТС1П₅₀/мл.

Выделение Вогбе1е11а ЬгоисЫкербса из носовых мазков проводили по стандартным процедурам. Каждая проба была испытана качественно (наличие или отсутствие) на предмет В. ЬгоисЫкербса. Назальные мазки и образцы тканей легких оценивали на наличие В. ЬгоисЫкерйса, Мусор1а§та зр., 81гер1ососси5 саш5, 81арйу1ососси5 т1егтебш8, и РайеигеИа кр.в соответствии со стандартными процедурами. Слайды для носовой полости, тканей легких и трахеи были подготовлены, и оценены на гистологические поражения с помощью сертифицированного АСУР советом патологоанатома.

Процент периода наблюдения после заражения, в течение которого животное кашляло и имело выделения из носа, а также длительность дней после заражения при кашле и носа, были рассчитаны для каждого животного. Арксинус корень квадратный преобразованный процент периодов наблюдений и продолжительность были проанализированы при помощи линейной смешанной модели отдельно для каждой дозы заражения (Т01 по сравнению с Т02, Т03 по сравнению с Т04, Т05 по сравнению с Т06). Фиксированным эффектом в модели было лечение и случайные эффекты были блоками и остаточными. В дополнение к средним значениям по методу наименьших квадратов, стандартным ошибкам и 90% доверительным интервалам были рассчитаны минимумы и максимумы лечения. Средние значения по методу наименьших квадратов, стандартные ошибки и доверительные интервалы были преобразованы обратно, если необходимо. Частотные распределения в присутствии или в отсутствие выделения вируса СРСоУ из носовых мазков были рассчитаны для каждой группы лечения и момента времени. Для каждого животного было рассчитано количество дней, в течение которых у животного детектировали вирус СРСоУ, обнаруженный в назальных мазках после стимуляции (первый день обнаружения вируса - последний день обнаружения вируса). Частотные распределения наличия/отсутствия выделения вируса из данных тканей были рассчитаны для каждой группы лечения. Частотные распределения выделения В. ЬгоисЫкерйса из мазков были рассчитаны для каждого лечения. Частотные распределения выделения В. ЬгоисЫкерДса из носовых мазков были рассчитаны для каждого лечения и момента времени. Количество дней, в течение которых у животных детектировали бактерии в назальных мазках после заражения (первый день обнаружения вируса последний день обнаружения вируса) было рассчитано для каждого животного. Описательные статистические данные о количестве дней, включая среднее значение, стандартное отклонение, минимум и максимум, рассчитывали для каждого лечения. Частотные распределения клинических наблюдений (чихание, выделения из глаз, рвота, депрессия и дыхание) были рассчитаны для каждой временной точки и лечения. Животные были классифицированы как имеющие лихорадку (>39,5°С) или не имеющие лихорадки (<39,5°С) на каждый день. Частотные распределения лихорадки/отсутствия лихорадки была рассчитана для каждого лечения и момента времени.

Диффузное, дискретное и полное поражения легких были рассчитаны по следующей формуле: Процент поражения=0,53((0,35хправой краниальной доли)+(0,15хправой средней доли)+(0,40хправой хвостовой доли)+(0,10хвспомогательной доли))+0,47((0,30хлевой краниальной доли)+(0,25хлевой средней доли)+(0,45хлевой хвостовой доли)).

Арксинус квадратный корень, преобразованный в проценты поражения, анализировали с помощью линейной смешанной модели отдельно для каждой дозы заражения (Т01 по сравнению с Т02, Т03 по сравнению с Т04 и Т05 по сравнению с Т06). Фиксированным эффектом в модели было лечение и случайными эффектами были блоки и остатки. В дополнение к средним значениям по методу наименьших квадратов, стандартным ошибкам и 90% доверительных интервалов были вычислены минимумы и максимумы лечения. Средние значения по методу наименьших квадратов, стандартные ошибки и доверительные интервалы были обратно преобразованы. Частотные распределения наличия грубых поражений, обесцвечивания и увеличения секреции были рассчитаны для каждой группы лечения. Частотные распределения наблюдений в месте инъекции (боль и припухлость) были рассчитаны для каждого момента времени и лечения. Описательная статистика, в том числе среднее геометрическое значение, минимальное и максимальное значение титров антител, будет рассчитываться для каждой группы лечения и момента времени.

Результаты. Отсутствовали боль или лихорадка (>39,5°С) сообщенные для любой из собак после

- 24 032284 вакцинации. Большинство вакцинированных (Т02, Т04, Т06), как сообщалось, имели царапины во время вакцинации. Инъекционные опухоли были зарегистрированы у большинства вакцинированных, но эти опухоли рассосались для большинства собак за 3 дня или менее. У трех собак сообщали про реакции гиперчувствительности в течение 3-6 ч после 2 наблюдения вакцинации. Две из собак лечили дифенилгидрамином для обращения симптомов. Вакцина СКСоУ индуцировала сыворотка-нейтрализованные реакции антител у вакцинированных собак после первой дозы, что указывало на активную иммунизацию. Среднее геометрическое значение ответа сывороточной нейтрализации (8Ν) возросло после второй вакцинации до СМТ>955 в вакцинированных группах (Т02, Т04, Т06) по сравнению с <4 в контрольной группе физиологического раствора (Т01, Т03, Т04), что указывает на бустерный эффект вакцины. Надежный анамнестический 8Ν ответ (СМТ> 1 1 146) был достигнут у вакцинированных по сравнению с контрольными физиологическими растворами (СМТ<446) после заражения (день 65), что указывает на эффективный ответ иммунной памяти.

Эффективность вакцины СКСоУ оценивали по сравнению с титрованием двойной дозы заражения. Уровень дозы заражения СКСоУ (подтвержден при 10⁵⁵ ТСШ₅₀/собака) поддерживали постоянным, в то время как В. ЬгоисЫкерБса доза заражения была введена при низкой цели 10³ КОЕ на собаку (подтверждено на уровне 5,4х10³ для групп Т01 и Т02, средней цели 10⁵ (подтверждено при 4,2х10⁵) для групп Т03 и Т04 и высокой цели 10⁷ (подтверждено 4,3х10⁷) для группы Т05 и Т06, чтобы обеспечить индукцию оптимального клинического заболевания. Данные выделений из организма после заражения СКСоУ и Вогбе1е11а показали, что инфицирование было достигнуто у привитых собак при трех уровнях дозы. Тем не менее, в зависимости от уровня клинического заболевания, индуцированного у собак, как описано ниже, низкая доза заражения Вогбе1е11а была определена как оптимальная доза для оценки эффективности вакцины. Контрольные собаки, получавшие солевой раствор (Т01, Т03 и Т05) проявляли широкий спектр дыхательных клинических признаков, в том числе кашель. Вакцинированные (Т02) имели существенное снижение продолжительности и периоды процентов с кашлем (р-значения 0,0470 и 0,0033, соответственно), по сравнению с контрольной группой (Т01) в группе с низкой дозой заражения. Средние значения по методу наименьших квадратов (Ь8) для продолжительности и обратных преобразований Ь8 средних значений для периодов процентов с кашлем в контрольной группе (Т01) составляли 10,8 и 14,7, по сравнению с 5,3 и 2,4 у вакцинированных (Т02) соответственно. Ослабление кашля наблюдалось между вакцинированными и контрольными по мере увеличения дозы заражения, вероятно, из-за сверхзаражения. Данные по кашлю ясно показывают, что вакцина СКСоУ способна вызывать иммунитет, достаточный, чтобы уменьшить кашель, вызванный двойным заражением в группе оптимальной дозы заражения. Данные назальных выделений показали, что у вакцинированных (Т02) значительно снижается процентный период выделений из носа (среднее значение 4,6) по сравнению с контрольной группой (среднее значение 17,4), с р-значением 0,0299 в группе с низкой дозой заражения. Как обсуждалось для кашля, ослабление выделений из носа между вакцинированными и контрольными уменьшается при достижении дозы сверхзаражения. Данные выделений из носа явно указывают на эффективность вакцины по сравнению с выделениями из носа в группе оптимальной дозы заражения. В общей сложности 5 собак, как сообщалось, имеют температуру >39,5°С в течение одного дня в течение каждого периода после стимуляции - четыре из контрольных групп физиологического раствора, и одно из группы вакцинации (Т02; день 44). В то время как данные показывают меньшее количество животных с высокой температурой у вакцинированных по сравнению с контролем при низкой дозе, лихорадка не известна как последовательный критерий СКСоУ, Вогбе1е11а или двойное заражение. Таким образом, они не были использованы, чтобы судить об эффективности вакцины.

Общая оценка аутопсии органов дыхания проводилась с помощью сертифицированного АСУР советом патологоанатом в день 65. Исследование показало, что основным результатом вскрытия была консолидация легких. Это согласуется с предыдущими результатами исследования двойного заражения. Таким образом, консолидация легких была использована в качестве критерия для оценки эффективности вакцины. Значительное снижение дискретной (средний процент 0,9 по сравнению с 4,02) и общей (средний процент 1,44 по сравнению с 7,7) консолидации легких наблюдалось у вакцинированных по сравнению с контролем в группе низкой дозы заражения, р-значения 0,0457, и 0,093 соответственно. В соответствии с клиническими признаками, уменьшение, достигнутое с помощью вакцины, ослабляется по мере увеличения дозы заражения и достижения сверхзаражения. Важно отметить, что не было никакого участия других респираторных патогенов в тканях легких, что подтверждается бактериологическими результатами исследования, т.е. о поражении легких было сообщено в частности, как о результате двойного заражения. Эти данные предполагают, что предварительна инфекция вируса предрасполагает собак путем влияния на их врожденную иммунную защиту, что приводит к более инвазивной бактериальной инфекции. Типичный образец вирусной бактериальной инфекции, который часто имеет место в данной области, приводит к развитию пневмонии у собак в комплексе респираторных заболеваний собак (С1КО), или у крупного рогатого скота в комплексе бычьих респираторных заболеваний (ВКЭС), а также, возможно, и у других видов животных. Полученные в этом исследовании данные свидетельствуют о том, что вакцина была способна защитить собак, уменьшая возникновение бронхопневмонии, вызванной

- 25 032284 двойным заражением, у вакцинированных собак, по сравнению с контрольной группой при оптимальной дозе заражения.

На основании макроскопических и микроскопических патологических анализов, вакцинация СЕСоУ очевидно защищала собак, уменьшая частоту и тяжесть бронхопневмонии, вызванной контролируемым двойным интраназальным заражением 10³ КОЕ В. ЬгопсЫкерйса и 10⁶ ТСГО₅₀ СЕСоУ. Защитный эффект уменьшается, когда доза заражения В. ЬгопсЫкерйса увеличивается при 10⁵ КОЕ или выше, возможно, из-за подавляющего врожденного и адаптивного иммунного ответа. Кроме того, патологические обнаружения хорошо коррелируют с уменьшением дыхательных клинических признаков, представленных у вакцинированных собак.

Отсутствовал вирус, выделенный из тканей в день 65 (23 дня после заражения СЕСоУ), как и ожидалось, из-за природы быстрого наступления и хода вирусной инфекции. У защищенной вакциной собаки уменьшается продолжительность назального заселения у вакцинированных (Т02) по сравнению с контрольными данными физиологического раствора (Т01), что указывает на способность вакцины снижать инфекции в группе оптимальной дозы заражения.

Таким образом, клинические признаки (кашель, выделения из носа) и данные о повреждениях легких (консолидации, гистология), полученные в данном исследовании, однозначно демонстрируют защиту, обеспечиваемую одновалентной вакциной по сравнению с СЕСоУ двойным заражением СЕСоУ-8. ЬгопсЫкерйса. Эти данные в совокупности показывают, что моновалентная вакцина СЕСоУ способна вызывать защитный иммунитет у вакцинированных собак, что привело к снижению респираторных заболеваний (кашель, выделения из носа) и пневмонии (консолидации легких), вызванных двойным заражением СЕСоУ-8. ЬгопсЫкерйса. Таким образом, данные подтверждают полезность вакцины СЕСоУ при снижении частоты респираторных заболеваний у собак после первоначальной СЕСоУ инфекции и последующей бактериальной инфекции.

Claims (9)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение композиции, содержащей респираторный коронавирус собак (СЕСоУ) в качестве вакцины против бактериального заболевания у собак, вызванного Вогйе1е11а ЬгопсЫкерйса.
2. 2. Применение по п.1, где композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.
3. 3. Применение по любому из предыдущих пунктов, где композиция дополнительно содержит один или более дополнительных иммуногенов.
4. 4. Применение по п.3, где один или более дополнительных иммуногенов выбирают из группы, состоящей из вируса собачьего парагриппа (СР1У), собачьего аденовируса-2 (САУ-2) и вируса собачьего гриппа (С1У).
5. 5. Применение по п.3, где один или несколько дополнительных иммуногенов выбирают из группы, состоящей из вируса собачьей чумы (СИУ), парвовируса собак (СРУ), кишечного коронавируса собак (ССУ), аденовируса собак, ЬерФкрпа кегоуагк, в частности ЬерФкрпа сашсо1а, ЬерФкрпа дпрроКрйока, ЬерФкрпа 1с1егойаетоггйад1ае, Ьер1окр1га ротопа и ЬерФкрпа Вгайк1ауа, вируса герпеса собак, пневмовируса собак, организмов ЬеЫйтаЫа, видов Воггейа (крр.), видов Мусор1акта, бешенства, ЕЫЕсЫа сашк, Вогйе1е11а ЬгопсЫкерйса и любой их комбинации.
6. 6. Применение композиции, содержащей антигенный компонент в качестве вакцины против бактериального заболевания у собак, вызванного Вогйе1е11а ЬгопсЫкерйса, где антигенный компонент указанной композиции является антигеном СЕСоУ.
7. 7. Применение по любому из предыдущих пунктов, где эффективность композиции против указанного бактериального заболевания проявляется в течение по меньшей мере 6 месяцев.
8. 8. Применение респираторного коронавируса собак (СЕСоУ) в качестве вакцины для предупреждения полифакториального респираторного заболевания у собак, вызванного смешанными вирусными и бактериальными инфекциями, вызванными Вогйе1е11а ЬгопсЫкерйса.
9. 9. Применение респираторного коронавируса собак (СЕСоУ) для увеличения иммуногенности содержащей бактериальный антиген композиции, используемой в качестве вакцины против бактериального заболевания у собак, вызванного Вогйе1е11а ЬгопсЫкерйса.