JP2015518047A - Ｂ．ブロンキセプチカ（Ｂ．Ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）感染から保護するためのイヌ呼吸器コロナウイルスでのワクチン接種 - Google Patents

Abstract

動物における、ボルデテラブロンキセプチカのような二次病原体に関連する呼吸器感染の治療または防止において効果的である、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）を含む組成物、組み合わせ、および方法を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、免疫学の分野に関し、特に免疫原性組成物およびワクチン組成物の分野に関する。より具体的には、本開示は、イヌにおける特に細菌感染症を含む多因子疾患の治療または予防のためのイヌ呼吸器コロナウイルス（Ｃａｎｉｎｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）（ＣＲＣｏＶ）調製物を含む組成物に関する。

ＣＲＣｏＶは非常に伝染性の強い呼吸器感染症であり、イヌとイヌとの直接接触、気道分泌物のエアロゾール、および汚染環境またはヒトとの接触によって伝播される。咳、くしゃみ、鼻汁から成る症状を伴う中度の疾患を有するイヌがいる一方で、臨床徴候を伴わない不顕性感染を有し、それでも他のイヌを感染させ得るウイルスを与えるイヌもいる。ＣＲＣｏＶに感染したイヌは、特に他の呼吸器病原体に同時感染した場合、肺炎に進行し得る。

複数の呼吸器病原体、特にウイルス性および細菌性病原体の両方に感染したイヌは、イヌ感染性呼吸器疾患複合体（ＣＩＲＤＣ）に罹患し得、保護センターおよび寄宿または訓練犬舎のような込み入った条件で収容されたイヌに一般的である、非常に伝染性の強い多因子疾患である。ＣＩＲＤに感染したイヌにおいて見られる呼吸器病原体は、細菌ボルデテラブロンキセプチカ（Ｂｅｍｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．，２９：４８−５２，１９７７）、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）（Ｅｒｌｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３１０（２）：２１６−２２３、２００３）、イヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）（Ｃｒａｗｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１０（５７４７）：４８２−４８５，２００５）、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）（Ｂｉｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１２６：１４０−１４５、１９６７）、マイコプラズマサイノス（Ｃｈａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５０：３４９１−３４９７、２００４）、およびイヌアデノウイルス血清型２（ＣＡＶ−２）（Ｄｉｔｃｈｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎ．Ｖｅｔ．Ｊ．，３：２３８−２４７，１９６２）を含む。現在までに、上述した病原体の全てまたは多数に対するワクチンは現れていない。

ＣＩＲＤＣおよび他の複数病原体疾患からの保護は伝統的に、潜在的病原体のそれぞれを標的とする免疫原を含むワクチンの組み合わせの投与に焦点を当ててきた。

本発明は、驚くべきことに、これまで多価生成物において求められた物をわずか１つの抗原の投与によって達成する。具体的には、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）を投与することにより、候補者は非ＣＲＣｏＶ病原体、すなわちボルデテラブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ Ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）に関連する疾患状態の減衰を示した。わずか１つの一価組成物での複雑で多面的な疾患状態の減衰および／または多価組成物における、細菌性病原体に対する免疫原性ならびに有効性の増強の両者を可能にする。

したがって、本発明の１つの態様は、イヌに、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）を含む組成物を投与することを含む、イヌにおける細菌性疾患の治療の方法を提供する。より具体的な実施形態においては、細菌性疾患は、ボルデテラブロンキセプチカ、マイコプラズマサイノス（Ｍ．サイノス）およびストレプトコッカスエクイ、選択的に亜種ズーエピデミクスのうち少なくとも１つによって引き起こされる。別の実施形態においては、本組成物は薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む。

別の実施形態において、本組成物は１つ以上の追加の免疫原をさらに含む。より具体的には、１つ以上の追加の免疫原は、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）、イヌアデノウイルス−２（ＣＡＶ−２）、およびイヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）から成る群から選択される。別の実施形態において、１つ以上の追加の免疫原は、イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、腸内イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、イヌアデノウイルス、レプトスピラ血清型、特に、イヌレプトスピラ、レプトスピラグリポチフォサ、黄疸出血性レプトスピラ、レプトスピラポモナ、およびレプトスピラブラチスラバ、イヌヘルペスウイルス、イヌニューモウイルス、リーシュマニア生物体、ボレリア種（ｓｐｐ．）、マイコプラズマ種、狂犬病、エーリキアカニス、ボルデテラブロンキセプチカおよびそのあらゆる組み合わせから成る群から選択される。別の実施形態において、本組成物は本質的にＣＲＣｏＶから成り追加的免疫原を有さない。

別の実施形態において、本組成物は細菌性疾患に対する有効性を、少なくとも３ヶ月、または少なくとも６ヶ月、または少なくとも１２ヶ月という期間にわたり有する。

本発明の別の実施形態は、イヌにおける細菌性感染によって引き起こされるイヌ呼吸器疾患から保護する、イヌへのイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）の投与を含む方法を提供する。

本発明の別の実施形態は、イヌにおけるウイルス性および細菌性の混合感染によって引き起こされる多因子イヌ呼吸器疾患から保護する、イヌへのイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）の投与を含む方法を提供する。

本発明の別の実施形態は、イヌにおけるボルデテラブロンキセプチカによって引き起こされる疾患を治療する、イヌへのイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）を含む組成物の投与を含む方法を提供する。

本発明の別の実施形態は、イヌにおける細菌性抗原を含む組成物の有効性を増強させる、イヌへのイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）の同時投与を含む方法を提供する。本発明の別の実施形態は、イヌにおける細菌性抗原を含む組成物の免疫原性を増加させる、イヌへのイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）の同時投与を含む方法を提供する。上述のあらゆるもののより具体的な実施形態においては、細菌性抗原はボルデテラブロンキセプチカ由来のものである。

本発明の別の実施形態は、イヌ感染性呼吸器疾患複合体（ＣＩＲＤＣ）の治療または防止のための上述の実施形態のいずれかの免疫原性組成物の方法又は用法を提供し、組成物は複数のイヌ呼吸器病原体への感染を治療または予防する。別の実施形態は、本明細書に記載してあるように非経口的に免疫原性組成物を投与する用法または方法を提供する。

別の実施形態は、イヌにおけるイヌ呼吸器病原体への感染の治療または防止のための免疫原性組成物を含む薬物の製造を提供する。

本発明のこれらおよび他の実施形態、特徴、および利点は、本明細書の以下で述べられる詳細な記述および添付の請求項から明らかになるだろう。前述および後述のそれぞれの実施形態は１つの実施形態にまとめられ得るということが理解される。

以下の定義は本開示に適用される。それらは参照によって本明細書に組み込まれるそれぞれの個々の参考文献に含まれる矛盾する定義のあらゆるものに取って代わる。定義されない語は、当業者に一般的に用いられる意味を有する。さらに、文脈によって別の方法が要求されない限り、単数形の用語は複数形を、複数形の用語は単数形を含む。

「約」または「およそ」は、測定可能な数字で表した変数との関連で用いられるとき、変数の示された値、および、示された値の実験誤差内（例えば平均のための９５％の信頼区間内）、または示された値の１０％内の内大きい方いずれかの変数の全ての値を指す。「約」が週間の時間間隔への言及に用いられるとき、「約３週間」は１７から２５日間であり、「約２から約４週間」は１０から４０日間である。

「アジュバント」は、本明細書に用いられる場合、免疫反応の非特異的刺激因子としての役割を果たすいずれかの物質を指す。アジュバントの更なる記述には以下を参照されたい。

用語「動物」は、本明細書に用いられる場合、ＣＲＣｏＶおよび／またはイヌ呼吸器疾患複合体への感染に感受性のある、家畜および野生の両方の哺乳類を含む、あらゆる動物を含む。好適には、本明細書で用いられる動物はイヌまたはヒトを指す。

「抗体」は、本明細書に用いられる場合、発生源、精製方法または他の特徴に関係なく、抗原結合部位を含むあらゆるポリペプチドである。免疫グロブリン分子またはその抗原への免疫反応の結果として特異的に抗原に結合するそのフラグメントを指す。免疫グロブリンは、血清タンパク質であり、「定常」または「可変」部を有する「軽」および「重」ポリペプチド鎖から成り、定常部の組成物に基づきクラス（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）に分けられる。所与の抗原に「特異的な」抗体は、抗体の可変部が特異的な抗原を排他的に認識しそれに結合することを示す。本用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、ヒト化抗体、４量体抗体、４価抗体、多重特異性抗体、単鎖抗体、領域特定抗体、単一領域抗体、領域欠失抗体、融合タンパク質、ＳｃＦｃ融合タンパク質、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、およびＣＤＲ移植抗体を含むがこれらに限られない。抗体は、天然ソースまたは組換ソースから誘導された完全免疫グロブリン、または完全免疫グロブリンの免疫反応部であり得る。「抗体」は抗原結合タンパク質に転換され得、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ
）フラグメント、Ｆｄフラグメント、ｄＡｂフラグメント、二重特異性抗体、ＣＤＲ３ペプチド、拘束性ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチド、ナノボディ、２価ナノボディ、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、およびミニボディならびに上述のフラグメントおよびそれらの化学的または遺伝的に操作された対応物を、抗原結合機能を維持する他の抗体フラグメントと同様に含むがこれらに限られない抗体フラグメントを含むがこれらに限られない。典型的に上記のフラグメントは抗原結合領域を含み得る。当業者に認識されるように、上記の分子のいずれもが、その免疫原性を減衰するため、その親和性を増加させるため、その特異性を変更するため、または他の目的で操作され得る（例えば「生殖細胞を作られる」）。

「抗原」または「免疫原」は、本明細書で用いられる場合、対象への露出の際にその抗原に特異的な免疫反応を誘発する１つ以上のエピトープ（直鎖状、高次構造的または両方）を含む分子を指す。エピトープは抗原の特異部位であり、Ｔ細胞受容体または特異抗体に結合し、典型的に約３のアミノ酸残基から約２０のアミノ酸残基を含む。用語、抗原は、サブユニット抗原（その抗原が自然状態で関連している生物体の全体から分離した別々の抗原）、死滅、弱減または不活性化した細菌、ウイルス、菌、寄生虫または他の微生物と同様に指す。用語、抗原はまた、抗体、例えば抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメント、および抗原または抗原決定基（エピトープ）を模倣することができる合成ペプチドミモトープを指す。用語、抗原はさらに、生体内で、例えばＤＮＡ免疫化適用において、抗原または抗原決定基を発現する、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。

「抗原性」は、本明細書で用いられる場合、タンパク質またはポリペプチドが、そのタンパク質またはポリペプチドに対して産生された抗体に免疫特異的に結合する能力を指す。

用語「ボルデテラブロンキセプチカ」または「Ｂ．ブロンキセプチカ」は、ボルデテラブロンキセプチカの生弱減細菌、ボルデテラブロンキセプチカの死滅全細胞抽出液（バクテリン）またはボルデテラブロンキセプチカの細胞細菌抽出物を指す。

用語「細菌性疾患」または「細菌性感染」は、特定の細菌（例えばＢ．ブロンキセプチカ）に直接的に起因する、または多因子疾患状態における細菌性病原体の結果として悪化する疾患の両方を指す。

「緩衝液」は、別の化学物質の濃度における変化を防止する化学系を意味する。プロトン供与体および受容体系は緩衝液の役割を果たし、水素イオン濃度（ｐＨ）における著しい変化を防止する。緩衝液の更なる例は、弱酸とその塩（共役塩基）または弱塩基とその塩（共役酸）の混合物を含む溶液である。

「イヌ（Ｃａｎｉｎｅ）」は、本明細書で用いられる場合、一般的にイヌ（ｄｏｇ）と呼ばれるものを含むが、イヌ科の他の種も含む。

用語「細胞株」または「宿主細胞」は、本明細書で用いられる場合、内部でウイルスが複製または維持されることが可能な原核または真核細胞を意味する。

用語、同時投与は、別々の、逐次の、または同時の投与を指す。同時投与される抗原または薬剤は、多価組み合わせワクチンまたは異なる投薬形態を含む別個の組成物のように、同じ組成物内に存在し得る。

用語「培養」は、本明細書で用いられる場合、他の種または型の不在において増殖する細胞または微生物の群集を意味する。

「投与量」は、対象に与えられるワクチンまたは免疫原性組成物を指す。「第１の投与量」または「初回刺激投与量」は０日目に与えられる上記の組成物の投与量を指す。「第２の投与量」または「第３の投与量」または「年間投与量」は第１の投与量に続いて与えられる上記の組成物の量を指し、第１の投与量と同じワクチンまたは免疫原性組成物であってもよいが同じであることは要求されない。

「エピトープ」は、抗原の特異部位であり、Ｔ細胞受容体または特異抗体に結合し、典型的に約３のアミノ酸残基から約２０のアミノ酸残基を含む。

「賦形剤」は、本明細書で用いられる場合、抗原ではない、ワクチンまたは免疫原性組成物の非反応性の担体成分を指す。好適な賦形剤は非経口注射の当業者に公知のものである。

「フラグメント」はタンパク質または遺伝子の切断された部分を指す。「機能的フラグメント」および「生物活性フラグメント」は全長タンパク質または遺伝子の生物学的特性を維持するフラグメントを指す。

「相同性」または「パーセント相同性」は、最大パーセント配列相同性を達成するために、必要であれば、配列を整列させ、ギャップを導入し、さらに配列相同性の一部としてあらゆる保守的置換を考慮した後の、比較配列における残基と同一または類似する、候補配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを指す。

「相同体」または「種相同体」は、かなりのポリヌクレオチド配列相同性を有し、同じまたは類似の生物学的機能および／または特性を有する、２つ以上の異なる種において見られる遺伝子を含む。好適には、種相同体を代表するポリヌクレオチド配列は、本明細書に実施例で記載されるように、中度の緊縮条件下でハイブリダイズし、同じまたは類似の生物学的活性および／または特性を有する。別の態様では、種相同体を代表するポリヌクレオチドは、約６０％より高い配列相同性、約７０％より高い配列相同性、約８０％より高い配列相同性、約９０％より高い配列相同性、約９５％より高い配列相同性、約９６％より高い配列相同性、約９７％より高い配列相同性、約９８より高い配列相同性、約９９％より高い配列相同性を共有する。

「同一性」または「パーセント同一性」は、候補配列における、最大パーセント配列同一性を達成するために、必要であれば、両方の配列を整列させ、ギャップを導入した後の、配列同一性の一部としていかなる保守的置換も考慮しない、比較配列における残基と同一なヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを指す。

対象における「免疫反応」は、本明細書で用いられる場合、抗原への体液性免疫反応、細胞免疫反応、または体液性および細胞免疫反応の発達を指す。「体液性免疫反応」は少なくとも一部が抗体によって媒介されるものを指す。「細胞免疫反応」は、Ｔリンパ球または他の白血球または両方によって媒介されるものであり、活性Ｔ細胞、白血球または両方によって生成されるサイトカイン、ケモカインおよび類似の分子の生成を含む。免疫反応は当業者に公知である、標準免疫測定法および中和測定法を用いて決定される。

「免疫原性」は、本明細書で用いられる場合、タンパク質またはポリヌクレオチドが、同定された疾患を引き起こす細菌またはウイルスに対し特異的に向けられる免疫反応を誘発する能力を指す。

「免疫原性組成物」は免疫原を含む調製物であり、例えばタンパク質、ペプチド、細胞全体、不活性化、サブユニットまたは弱減ウイルス、または多糖類、またはその組み合わせを含み、免疫原性組成物内における１つ以上の抗原への受取人の体液性または細胞免疫系を刺激するために投与される。「免疫化」は、免疫原性組成物を投与し、宿主における抗原への免疫または免疫原性反応を刺激する過程である。好適な宿主は、イヌのような哺乳類である。好適には、免疫原性組成物はワクチンである。

「免疫学的に保護的な量」は、本明細書で用いられる場合、受取人における免疫原性反応を誘発することに効果的な抗原の量であり、身体に有害な影響またはその合併症を含む、疾患の兆候または症状を防止または改善することに十分な量である。体液性免疫または細胞媒介免疫または両方のいずれもが誘発され得る。組成物への動物の免疫原性反応は、例えば、間接的に抗体価の測定、リンパ球増殖検定法によって、または直接的に野生型株の抗原投与後の兆候および症状の監視によって評価され得る。組成物またはワクチンによって与えられる保護的免疫は、例えば、攻撃生物体の排出の減少、死亡率、罹患率、体温、および対象の全体的な身体状態、健康および能力のような臨床的兆候における減少、生体組織における病理、肉眼的および病理組織における減少を測定することによって評価され得る。免疫反応は、無制限に、細胞および／または体液性免疫の誘発を含むことができる。治療上効果的な組成物またはワクチンの量は、用いられる特定の生物体、または治療もしくはワクチン接種を受ける動物の状態次第で変化し得、獣医によって決定され得る。

「鼻腔内」投与は、本明細書で用いられる場合、ワクチンまたは他の組成物のような物質の、対象の体内への鼻を通してのまたは経由しての導入を指し、主に鼻粘膜を通しての物質の輸送を含む。

用語「分離」は実質上純粋な形態、例えば約９５％より高い純度の実質上純粋な形態であるか、または自然環境から何らかの方法で純化または濃縮された物質を指す。用語「分離」は、他の薬剤／希釈剤／賦形剤／アジュバント／タンパク質を有する溶剤である免疫原を含む。

「薬用薬剤」は医学的状態の予防、治療または改善、もしくは生理的状態または事象の予防において有益なあらゆる薬剤を指す。

「モノクローナル抗体」は、本明細書で用いられる場合、ハイブリドーマ細胞の１つの株によって生成された抗体を指し、全てが特定の高原状の１つのエピトープを対象とする。モノクローナル抗体を作るために用いられる抗体は病原体の分離タンパク質または病原体全体として供給され得る。「ハイブリドーマ」は、骨髄腫細胞と特異的な抗体生成細胞の融合によって形成されるハイブリッド細胞から成るクローン細胞系である。一般的には、モノクローナル抗体はマウス由来のものである。しかしながら、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイ技術、またはファージディスプレイに匹敵する方法、または非マウス由来のハイブリッド細胞によって生成された、抗原の特定のエピトープに対して作られた抗体のクローンの群集も指す。

「経口（Ｏｒａｌ）」または「経口（ｐｅｒｏｒａｌ）」投与は、本明細書で用いられる場合、ワクチンまたは他の組成物のような物質の、対象の体内への口を通してのまたは経由しての導入を指し、飲み込むことまたは口粘膜を通しての輸送（例えば、舌下または頬側の吸収）または両方を含む。気管支内もまた経口（Ｏｒａｌ）または経口（ｐｅｒｏｒａｌ）投与の手段である。

「口腔鼻」投与は、本明細書で用いられる場合、組成物またはワクチンのような物質の、対象の体内への鼻および口を通してのまたは経由しての、例えば、起こり得るものとしては、鼻に１滴以上の液滴を置くことによる導入を指す。口腔鼻投与は経口および鼻腔内投与に関連する輸送過程を含む。

「非経口投与」は、本明細書で用いられる場合、組成物またはワクチンのような物質の、対象の体内への消化管を含まない経路を通してのまたは経由しての導入を指す。非経口投与は、皮下、筋肉内、動脈内、および静脈内投与含む。本開示の目的では、非経口投与は、主に口、鼻、気管および肺の粘膜組織を通した物質の輸送を含む投与経路を除外する。

用語「病原体」または「病原微生物」は、本明細書で用いられる場合、例えばＣＰＩＶ、ＣＡＶ−２、ＣＲＣｏＶ、マイコプラズマサイノス、ＣＩＶ、またはボルデテラブロンキセプチカを意味し、宿主動物において疾患、病気、または状態異常、好適にはＣＩＲＤＣのような呼吸器疾患を引き起こすことができる。

「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応等を伴わず、対象の組織との接触における使用に適切であり、妥当な損益比に相応し、およびその意図する用法に効果的である物質を指す。

「ポリクローナル抗体」は、本明細書で用いられる場合、特定の病原体または抗原に対して作られる抗体の混合群集を指す。一般的に、当該群集は、それぞれの群が病原体または抗原の特定のエピトープに向けられた、様々な抗体群を含む。ポリクローナル抗体を作るために、全体病原体または分離抗原が、播種または感染により宿主に導入され、宿主がその病原体または抗原に対する抗体を作ることを誘発する。

用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で用いられる場合、鎖において共有結合的に結合されたヌクレオチド単量体で構成される有機高分子を意味する。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）は明確な生物学的機能を伴うポリヌクレオチドの例である。

用語「ポリペプチド」は、本明細書で用いられる場合、鎖において結合される２つ以上のアミノ酸で構成される有機高分子を意味する。

「呼吸」投与は、本明細書で用いられる場合、ワクチンまたは他の組成物のような物質の、対象の体内への噴霧（微粒化）物質の吸入を通してのまたは経由しての導入を指す。呼吸投与において、主要な輸送メカニズムは、気管、気管支、および肺における粘膜を通しての微粒化物質の吸収を含み、したがって鼻腔内または経口投与とは異なる。

用語「特異的結合」、「特異的に結合する」等は、生理的または検定条件下で測定可能な複合体を形成する、選択的な２つ以上の分子と定義される。抗体または他の阻害物質は、適切に選択された条件下で、同時に非特異的結合が阻害される一方で、結合が実質的に阻害されない場合、タンパク質に「特異的に結合する」と言われる。特異的結合は高い親和性を特徴とし、化合物またはタンパク質に選択的である。非特異的結合はたいてい低い親和性を有する。例えば、ＩｇＧ抗体における結合は、一般的に少なくとも約１０^-7Ｍ以上の親和性を特徴とし、例えば、少なくとも約１０^-8Ｍ以上、または少なくとも約１０^-9Ｍ以上、または少なくとも約１０^-10以上、または少なくとも約１０^-11以上、または少なくとも約１０^-12Ｍ以上である。当該用語は、例えば、抗原結合領域が、多くの抗原によって運搬されない特定のエピトープに特異的である場合にも適用可能であり、この場合抗原結合領域を運搬する抗体は一般的に他の抗原を結合しない。

「特異的免疫原性フラグメント」は、本明細書で用いられる場合、その配列に特異的な抗体またはＴ細胞によって認識可能な配列の一部を指す。

「対象」は、本明細書で用いられる場合、免疫系を有する、イヌのような哺乳類を含むあらゆる動物を指す。

「実質的に同一」は、本明細書で用いられる場合、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性の程度を指す。

「サブユニットワクチン」および「サブユニット組成物」は、本明細書で用いられる場合、ウイルス、細菌、寄生虫または菌のような、対象の病原体からの抗原から誘導された、またはそれに相同する抗原（全ての抗原ではないが）を含む、ワクチンまたは組成物の型を指す。そのような組成物またはワクチンは、完全病原体細胞または病原粒子、またはそのような細胞または粒子の可溶化液を実質的に有さない。したがって、サブユニットワクチンまたはサブユニット組成物は、少なくとも部分的に純化された、または実質的に純化された、当該病原体またはその類似体からの免疫原性ポリペプチドから調製されることができる。サブユニットワクチンまたはサブユニット組成物における抗原を得る方法は、標準純化技術、組換生成、または化学合成を含む。「サブユニットワクチン」または「サブユニット組成物」は、したがって、定義された抗原成分またはウイルス、細菌、もしくは他の免疫原の成分から成るワクチンまたは組成物を指す。

「ＴＣＩＤ₅₀」は「組織培養感染量」を指し、播種された細胞培養の所与の処理単位の５０％を感染させるために要求されるウイルスの希釈と定義される。本明細書において活用されるＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法を含む、様々な方法がＴＣＩＤ₅₀を計算するために用いられ得る。Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ方法の説明には、Ｂ．Ｗ．Ｍａｈｙ＆Ｈ．Ｏ．Ｋａｎｇｒｏ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ ２５−４６（１９９６）を参照されたい。

「治療薬」は、本明細書で用いられる場合、ウイルス性、細菌性、寄生虫性または菌性の感染、疾患またはそれによって引き起こされる状態の治療において補助する、あらゆる分子、化合物、ウイルスまたは治療、好適には弱減または死滅ウイルス、またはサブユニットまたは化合物を指す。

「治療的に効果的な量」は、本明細書で用いられる場合、ウイルス、細菌、寄生虫または菌のような病原体との感染によって引き起こされる、身体に有害な効果またはその複合を含む、疾患の兆候または症状を防止するまたは改善することに十分な抗原またはワクチンもしくは組成物を受け取ることで、対象（例えばイヌ）における免疫反応を誘発する、抗原またはワクチンもしくは組成物の量を指す。体液性免疫または細胞媒介免疫、もしくは体液性および細胞媒介免疫の両方が誘発され得る。動物の抗原、ワクチン、または組成物に対する免疫原性反応は、間接的に抗体力価の測定、リンパ球増殖検定法によって、または直接的に、野生型株の抗原投与後の兆候および症状の監視によって評価され得る。ワクチンまたは組成物によって与えられる防御免疫は、攻撃生物体の排出の減少、および／または死亡率、罹患率、体温、および対象の全体的な健康状態、健康および能力のような臨床的兆候における減少を測定することによって評価され得る。治療的に効果的なワクチンまたは組成物の量は、使用される特定の免疫原または対象の状態次第で変化し得、当業者によって決定され得る。

患者における疾患を「治療すること」または「治療」は、疾患を阻害することまたはその進行を抑止すること；疾患から保護することまたは、罹患したあるいはまだ疾患の症状を示していない患者において疾患の発症を防止すること；または疾患を改善することまたは後退させること、を指す。同様に、用語「保護する」「保護すること」「保護」等は、疾患の臨床徴候の縮小または除去を意味する。当該用語はさらに疾患の原因因子の削減または除去を意味し得る。

「ワクチン」または「ワクチン組成物」は、本明細書で用いられる場合、修飾生、弱減、死滅のいずれかのウイルスまたは細菌、またはサブユニットワクチン、または上述のもののあらゆる組み合わせから選択される、免疫原性組成物を指す。ワクチンの対象への投与は免疫反応をもたらす。ワクチンは、対象内に、非経口、経口等を含む、あらゆる公知の投与経路によって導入され得る。当該用語は、感染を防止または減衰させる、または感染の兆候または症状の１つ以上を防止または減衰させる組成物を意味する。病原体に対するワクチン組成物の保護的効果は、普通、対象に免疫反応を誘発することによって達成される。一般的に、消滅または減少した感染の発生率、兆候または症状の改善、または感染対象からの微生物の加速した除去は、ワクチン組成物の保護的効果を示唆するものである。本発明のワクチン組成物は、イヌ呼吸器疾患病原体によって引き起こされる感染に対する保護的効果を提供する。

「獣医学的に許容できる」は、本明細書で用いられる場合、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応等を伴わず、獣医学的対象の組織との接触における使用に適切であり、妥当な損益比に相応し、その意図する用法に効果的である物質を指す。

「獣医学的に許容できる担体」は、本明細書で用いられる場合、有効成分の生物学的活性の効果性に干渉せず、それが投与される獣医学的対象に有毒でない担体媒体を指す。

抗原、免疫原性組成物、およびワクチン
本発明は、１つ以上のウイルス、特にＣＲＣｏＶおよび選択的にＣＩＲＤＣのような疾患に対する治療のためのイヌへの投与に適切な細菌またはサブユニットを含む、免疫原性組成物およびワクチンを提供する。本発明に含まれるイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）は感染性呼吸器疾患を有するイヌの気道に存在するコロナウイルスを特徴とし得る。ＣＲＣｏＶは統計的にウシコロナウイルス（ＢＣｏＶ）、ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）株ＯＣ４３およびブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ＨＥＶ）に最も密接に関係し、腸内イヌコロナウイルス（ＣＣｏＶ）はＣＲＣｏＶとの関係が薄い。

好適な実施形態において、ＣＲＣｏＶは米国特許公開第２００７−００９８７３９号に記載されたものと同じであり、その内容は、特にそこに記載されたＣＲＣｏＶ株および抗原に関して、参照によって本明細書に組み込まれる。ＣＲＣｏＶの適切な免疫原性フラグメントは国際公開第ＷＯ２００４／０１１６５１号（Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ）に記載される。ＣＲＣｏＶの適切な免疫原性フラグメントは、Ｓｐｉｋｅ（Ｓ）およびヘマグルチニンエステラーゼ（ＨＥ）表面タンパク質、膜糖タンパク質（Ｍ）、およびヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、またはその免疫原性部を含む。国際公開第ＷＯ２００４／０１１６５１号に記載されるＣＲＣｏＶ類似ＳｐｉｋｅおよびＨＥタンパク質もまた、ＣＲＣＶに対する免疫反応を起こす作用剤として適切であり得る。ウシコロナウイルスおよびヒトコロナウイルスのような、密接に関連するコロナウイルス、およびそれらの免疫原性フラグメントもまたＣＲＣＶに対する免疫反応を起こす作用剤として適切であり得る。ＣＲＣＶに対するワクチン成分として用いられ得る作用剤に関する国際公開第ＷＯ２００４／０１１６５１号の全体の開示は参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における使用に適切なＣＲＣｏＶの別の例は、ＣＲＣｏＶ株４１８２と同定された株を含む（Ｅｒｌｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，１２４：７８−８７，２００７）。

本明細書に含まれるインフルエンザウイルス抗原は、あらゆる鳥類または哺乳類由来の、あらゆる同定されたインフルエンザウイルス株であり得、サブタイプＨ３ヘマグルチニンおよびサブタイプＮ８ノイラミニダーゼ、または、より一般的にはＨ３Ｎ８ウイルスとして言及される、Ｈ３Ｎ８サブタイプを含むがこれらに限られない。当該インフルエンザは哺乳類または鳥類由来であり得、ブタ、ウマまたはイヌ由来を含むが、これらに限られない。ある実施形態において、イヌインフルエンザ抗原が使用される。ある実施形態において、ウマインフルエンザ抗原が使用される。Ｈ３またはＮ８に指定されたサブタイプ糖タンパク質を有する株が使用される。ある実施形態において、サブタイプＨ３およびＮ８糖タンパク質の両方を有する株が使用される。

本発明に含まれるインフルエンザ抗原は、家畜および野生の両方の、イヌ、ウマ、ブタ、およびニワトリから分離され得る。試料採取に選択される動物は、中程度または重度の呼吸器症候群および発熱を含み得る、急性および／または亜急性の臨床症候群を示すはずである。動物はさらに、食欲不振および嗜眠の兆候も示し得る。ウイルス分離の方法は、当業者に周知であり、哺乳類または鳥類の細胞培養に播種する工程、胚発育卵に臨床検体からの鼻または咽頭粘液試料を播種する工程を含み、臨床検体は、鼻道または咽喉のスワッブによる採取、または脾臓、肺、扁桃腺および肝臓のような組織の採取および肺洗浄によって得られる。ウイルスの細胞変性効果は細胞培養において観察され得る。尿膜腔液または細胞可溶化液はヒト、ニワトリ、シチメンチョウまたはモルモットの赤血球を凝集させる能力を試験され得、これはインフルエンザウイルスの存在の推定証拠である。

本発明の使用に適切なイヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）株の代表例は、Ａ／イヌ／アイオワ／９Ａ１／Ｂ５／０８／Ｄ１２として確認された株を含み、これはＰＴＡ−７６９４として、２００６年６月２９日にアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に寄託された。ＣＩＶ抗原の代表的な株は、商用ワクチンにおけるＣＩＶウイルス株である、Ｖａｎｇｕａｒｄ（登録商標）ＣＩＶ（Ｐｆｉｚｅｒ）である。本発明はさらにウマインフルエンザ株Ａ／ウマ／２／マイアミ／１／６３として確認された株を含むワクチンも含む。この株は受託番号ＶＲ３１７でＡＴＴＣに寄託される。本発明における使用のためのインフルエンザウイルスの追加の例は、Ａ／イヌ／アイオワ／１３６２８／２００５、Ａ／ウマ／ケンタッキー／１９９８、Ａ／ウマ／ケンタッキー／１５／２００２、Ａ／ウマ／オハイオ／１／２００３、Ａ／ウマ／ケンタッキー／１／１９９４、Ａ／ウマ／マサチューセッツ／２１３／２００３、Ａ／ウマ／ウィスコンシン／２００３、Ａ／ウマ／ニューヨーク／１９９９、およびＡ／ウマ／ニューマーケット／Ａ２／１９９３である。他の好適な株および／またはＣＩＶの分離株は、米国特許第７，９５９，９２９号（特にジャクソンビル／２００５、マイアミ／２００５、ＦＬ／２４２／０３およびフロリダ／４３／０４としてそこで確認された株およびＨＡ配列）、同第７，３８４，６４２号、同第７，５７２，６２０号および同第７，４６８，１８７号において開示されるものを含み、全ての配列、特にＨＡ配列、および株を含む、それらの内容は参照によって、全てが説明されるかのように本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書における使用に適切なＣＩＶ株はＢａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，２４（６），１５２４−１５２７（２０１０）に記載される、受託番号ＡＤＷ４１７８４を有するＣｏｌｏｒａｄｏ ＣＩＶ分離株を含む。

本発明に含まれるイヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）は、ケンネルコフに関連する原因因子であるとして知られるウイルスの１つとして特徴付けられ得る。ＣＰＩＶ抗原の代表的な株は、商用ワクチン、Ｖａｎｇｕａｒｄ（登録商標）Ｐｌｕｓ５（Ｐｆｉｚｅｒ）における弱減ＣＰＩウイルス株である。別のＣＰＩＶ抗原の代表的な株は、「ＮＬ−ＣＰＩ−５」の名称を有する弱減ＣＰＩウイルス株である（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）。

本発明に含まれるイヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）は、ケンネルコフに関連する原因因子であるとして知られるウイルスの１つとして特徴付けられ得る。ＣＡＶ−２抗原の代表的な株は、商用ワクチン、Ｖａｎｇｕａｒｄ（登録商標）Ｐｌｕｓ５（Ｐｆｉｚｅｒ）における弱減ＣＡＶ−２ウイルス株である。ＣＡＶ−２抗原の代表的な株は「マンハッタン」と命名された弱減ＣＡＶ−２株である（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）。

本発明に含まれるマイコプラズマサイノス（Ｍ．サイノス）はＣｈａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５０：３４９１−３４９７，２００４に記載され、呼吸器疾患に一般的に関連するマイコプラズマの唯一の種である。Ｍ．サイノスに対する免疫原性組成物は米国特許公開第２００７／００９８７３９号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に組み込まれるボルデテラブロンキセプチカ成分は、ケンネルコフに関連する細菌性原因因子として特徴付けられ得る。本発明に含まれる免疫原性組成物およびワクチンは、生弱減ボルデテラブロンキセプチカ、ボルデテラブロンキセプチカバクテリン、または細菌抽出物の１つ以上であり得る。さらに、当該組成物は、好適に、ボルデテラブロンキセプチカの分離サブユニット抗原も含む。

ある実施形態において、ボルデテラブロンキセプチカは、カラムクロマトグラフィーによって純化された全体細胞超音波処理物として、１９８４年１０月１２日に出願された仏国特許出願第ＦＲ２５７１６１８号において記載されるように調製される。ボルデテラブロンキセプチカの別の代表例は、細菌抽出物Ｂｒｏｎｃｈｉｃｉｎｅ（商標）ＣＡｅ（Ｐｆｉｚｅｒ）であり、ボルデテラブロンキセプチカ細胞から抽出される抗原物質から調製される。ボルデテラブロンキセプチカの別の例は、Ｎｏｂｉｖａｃ（登録商標）に存在する生弱減ブロンキセプチカ株Ｂ−Ｃ２および／またはＩｎｔｒａ−Ｔｒａｃ（登録商標）、Ｂｒｏｎｃｈｉ−Ｓｈｉｅｌｄ（登録商標）、Ｎａｒａｍｕｎｅ（商標）、Ｒｅｃｏｍｂｉｔｅｋ（登録商標）、Ｕｎｉｖａｃ、および／またはＫｅｎｎｅｌ−Ｊｅｃ（商標）からの生ブロンキセプチカ株である。

さらに、サブユニットもまたボルデテラブロンキセプチカ成分との組み合わせにおいて存在し得る（すなわち補足される）。サブユニットの代表例は、分離パータクチン抗原、好適にはボルデテラブロンキセプチカｐ６８抗原、特に、ｐ６８特異性モノクローナル抗体Ｂｏｒｄ２〜７（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７３６，６５８号に記載される）によって認識される、組換ボルデテラブロンキセプチカｐ６８抗原であり、ある好適な実施形態において、米国特許第７，７３６，６５８号に記載される、またはそれに相同性を有するアミノ酸配列を有する。

本発明に含まれるウイルスは、細胞、細胞株および宿主細胞において増殖され得る。当該細胞、細胞株または宿主細胞は、例えば、哺乳類細胞および昆虫および植物細胞を含む非哺乳類細胞であり得るがこれらに限られない。本発明に含まれるウイルスがそこで増殖され得る細胞、細胞株、および宿主細胞は、当業者によって容易に知られ、利用可能である。

本発明に含まれる細菌は、当業者に周知の様々な培地を使用して培養および増殖され得、ブロス（液体）および寒天（固体、半固体）培地の両方を含む。いくつかの細菌はさらに哺乳類細胞または非哺乳類細胞においても培養および増殖され得る。

本発明に含まれるウイルスおよび細菌は、免疫原性組成物またはワクチンにおける使用の前に弱減または不活性化され得る。弱減および不活性化の方法は当業者に周知である。弱減のための方法は、細胞培養における適切な細胞株上での連続継代（ウイルスおよびいくつかの細菌）、ブロス培養における連続継代（細菌）、紫外線放射（ウイルスおよび細菌）、および化学的突然変異生成（ウイルスおよび細菌）を含むがこれらに限られない。ウイルス及び細菌の不活性化のための方法は、ホルマリン、ベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）またはバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）での処理または当業者に公知の他の方法を含むがこれらに限られない。

ホルマリンによる不活性化は、微生物を含有する懸濁液を３７％のホルムアルデヒドと混合し、最終的に０．５％のホルムアルデヒド濃度にすることにより実施される。当該微生物とホルムアルデヒドの混合物は、およそ２４時間にわたる室温での一定の撹拌により混合される。当該不活性化微生物混合物は、その後適切な細胞株又はブロス培地上での生育を測定することにより残留生生物体を試験される。

いくつかの抗原には、ＢＥＩによる不活性化は、本発明の微生物を含有する懸濁液を０．１ＭのＢＥＩ（０．１７５Ｎ ＮａＯＨにおける２−ブロモエチルアラミン）と混合し、最終的に１ｍＭのＢＥＩ濃度にすることにより実施され得る。他の抗原には、最終的なＢＥＩ濃度は２ｍＭである。当業者は使用に適切な濃度を理解するだろう。当該ウイルスとＢＥＩの混合物は、およそ４８時間にわたる室温での一定の撹拌により混合され、その後１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウムが加えられ、０．１ｍＭの最終的な濃度になるまで撹拌される。混合はさらに２時間にわたり続けられる。不活性化微生物を含有する混合物は、適切な細胞株又はブロス培地上での生育を測定することにより残留生微生物を試験される。

本発明に含まれる免疫原性組成物およびワクチンは、１つ以上の獣医学的に許容できる担体を含み得る。本明細書で用いられる場合、「獣医学的に許容できる担体」は、溶剤、分散剤、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存料、抗菌および抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤等のいずれかおよび全てを含む。希釈剤は、水、生理食塩水、ブドウ糖、エタノール、グリセリン等を含み得る。等張剤は塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを、当業者に周知の他の物からとりわけ含み得る。安定化剤は、当業者に周知の他の物からとりわけアルブミンを含む。保存料は、当業者に周知の他の物からとりわけマーサイアレートを含む。

当該アジュバントは代謝可能であり得、標的種によって代謝されることが可能な成分から成る、植物油系アジュバントのようなアジュバントを指す。代謝可能なアジュバントは代謝可能な油であり得る。代謝可能な油は、植物および動物において典型的に生じる脂肪および油であり、大抵大部分がトリグリセリドまたは中性脂肪としても知られるトリアシルグリセロールの混合物から成る。これらの無極性、水不溶性物質は、グリセリンの脂肪酸トリエステルである。トリアシルグリセロールは、その３つの脂肪酸残基または側鎖の同一性および配置によって異なる。

当該アジュバントは非代謝可能でもあり得、乳剤が投与された対象の動物の体によって代謝され得ない成分から成るアジュバントを指す。本発明の組成物における使用に適切な非代謝可能な油は、アルカン、アルケン、アルキン、およびそれらに対応する酸およびアルコール、そのエーテルおよびエステル、およびその混合物を含む。好適には、当該油の個々の化合物は形質炭化水素化合物であり、すなわち上記の成分は６から３０の炭素原子を有する。当該油は石油製品から合成的に調製または純化され得る。本明細書に記載される組成物における使用に適切である好適な非代謝可能な油は、例えば、鉱油、パラフィン油、およびシクロパラフィンを含む。用語「鉱油」は、ワセリンから蒸留技術によって得られる液化炭化水素の混合物である非代謝可能なアジュバント油を指す。当該用語は「液体パラフィン」、「液体ワセリン」および「白色鉱油」と同義である。当該用語はさらに「軽油」、すなわちワセリンの蒸留によって同様に得られるが、白色鉱油に比べわずかに低い比重を有する油を含むことを意図する。鉱油は様々な商用の供給源、例えばＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＰＡ）、ＵＳＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から得られ得る。軽油はＤＲＡＫＥＯＬ（登録商標）の名前の下で商業的に入手可能である。

アジュバントは、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎアジュバント系（ＭＶＰ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｒａｌｓｔｏｎ，ＮＥ）、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲル、例えば完全および不完全フロイントアジュバントのような水中油型乳剤、油中水型乳剤、ブロック共重合体（ＣｙｔＲｘ；Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ；Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａ，ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）または他のサポニン画分、モノホスホリルリピドＡ、Ａｖｒｉｄｉｎｅリピド−アミンアジュバント、大腸菌からの易熱性毒素（組換または別様）、コレラ毒素、ムラミルジペプチド、スクアレン／プルロニックブロック共重合体／界面活性剤（ＳＰ−ｏｉｌ）、スルホリポベータシクロデクストリン（ＳＬ−ＣＤ）、免疫調節物質を含有するリポソーム（例えばＣｐＧまたはｐｏｌｙＩ：Ｃ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、イスコマトリクス（ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ）（Ｑｕｉｌ Ａ／ホスファチジルクロリン）、ＣｐＧ／ＤＥＡＥ−デクストラン／鉱油（ＴＸＯ）、ＣｐＧ、トリテルペノイド（例えばＱｕｉｌ Ａまたは別の純化もしくは部分的に純化されたサポニン調製物）、ステロール（例えばコレステロール）、免疫調節剤（例えば、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド−ＤＤＡ）、重合体（例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）のようなポリアクリル酸）、およびＴｈ２刺激物質（例えばＢａｙ Ｒ１００５（登録商標）のような糖脂質）、およびその組み合わせを、当業者に公知の多くの他のアジュバントからとりわけ含むが、これらに限られない。

使用され得る様々な組み合わせの非制限的な例は、トリテルペノイドとステロール（例えばＱＡＣとしても知られるＱｕｉｌ Ａ／コレステロール）、トリテルペノイドとステロール、免疫調節剤、および重合体（例えばＱＣＤＣとしても知られるＱｕｉｌ Ａ／コレステロール／ＤＤＡ／ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標））、およびトリテルペノイドとステロール、免疫調節剤、重合体およびＴｈ２刺激物質（例えばＱＣＤＣＲとしても知られるＱｕｉｌ Ａ／コレステロール／ＤＤＡ／ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）、およびＢａｙ Ｒ１００５（登録商標））を含む。

本発明の文脈において有益なアジュバントおよび添加剤の量および濃度は当業者によって容易に決定され得る。ある実施形態において、本発明は約２０μｇから約２０００μｇのアジュバントを含む免疫原性組成物およびワクチンを想定する。別の実施形態において、アジュバントは、約１００μｇから約１５００μｇ、または約２５０μｇから約１０００μｇ、または約３５０μｇから約７５０μｇの量で含まれる。別の実施形態において、アジュバントは、免疫原性組成物またはワクチンの２ｍｌの投与量につき約５００μｇの量で含まれる。

当該免疫原性組成物およびワクチンはさらに抗生物質を含み得る。そのような抗生物質は、アミノグリコシド、カルバペネム、セファロスポリン、糖ペプチド、マクロライド、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、スルホンアミド、およびテトラサイクリンのクラスのものを含むがこれらに限られない。一実施形態において、本発明は約１μｇ／ｍｌから約６０μｇ／ｍｌの抗生物質を含む免疫原性組成物およびワクチンを想定する。別の実施形態において、当該免疫原性組成物およびワクチンは、約５μｇ／ｍｌから約５５μｇ／ｍｌの抗生物質、または約１０μｇ／ｍｌから約５０μｇ／ｍｌの抗生物質、または約１５μｇ／ｍｌから約４５μｇ／ｍｌの抗生物質、または約２０μｇ／ｍｌから約４０μｇ／ｍｌの抗生物質、または約２５μｇ／ｍｌから約３５μｇ／ｍｌの抗生物質を含む。さらに別の実施形態において、当該免疫原性組成物およびワクチンは約３０μｇ／ｍｌより少ない抗生物質を含む。

本発明に含まれる免疫原性組成物およびワクチンは、ウイルスまたは細菌、またはウイルス性または細菌性タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含み得る。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子が免疫原性組成物およびワクチンにおいて使用され得る。当該ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、他の作用剤を伴わず投与され得、または細胞取り込みを容易にする作用剤と共に投与され得る（例えば、リポソームまたは陽イオン性脂質）。当該免疫原性組成物またはワクチンにおけるポリヌクレオチドの総量は一般的に約０．１μｇ／ｍｌから約５．０ｍｇ／ｍｌの間である。別の実施形態において、当該免疫原性組成物またはワクチンにおけるポリヌクレオチドの総量は約１μｇ／ｍｌから約４．０ｍｇ／ｍｌの間、または約１０μｇ／ｍｌから約３．０ｍｇ／ｍｌの間、または約１００μｇ／ｍｌから約２．０ｍｇ／ｍｌの間である。核酸（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を活用するワクチンおよびワクチン接種の手順は、当業者によって詳細に記載され、例えば、米国特許第５，７０３，０５５号、米国特許第５，５８０，８５９号、米国特許第５，５８９，４６６号であり、これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる。

上述のウイルスまたは細菌に加え、本明細書に含まれる免疫原性組成物およびワクチンは他の追加的な抗原を含み得る。抗原は、微生物の不活性化された全体または部分的調製物の形態において、または遺伝子組換技術または化学合成によって得られる抗原分子の形態において存在し得る。本発明に従う使用に適切な他の抗原は、イヌジステンパーウイルス、イヌヘルペスウイルス、イヌインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルスのような病原ウイルス、レプトスピラブラチスラバ、イヌレプトスピラ、レプトスピラグリポチフォサ、黄疸出血性レプトスピラ、レプトスピラポモナ、レプトスピラハードジョボビス、ポルフィロモナス属種、バクテロイデス属種、ボレリア属種、ストレプトコッカスエクイ亜種ズーエピデミカスを含むストレプトコッカス属種、エーリキア属種、マイコプラズマサイノスを含むマイコプラズマ属種、およびミクロスポルムカニスのような病原細菌から誘導されたものを含むが、これらに限られない。抗原はさらに、カンジダのような病原真菌、クリプトスポリジウムパルバム，ネオスポラカニナム，トキソプラズマゴンディ，エイメリア属種、バベシア属種、ジアルジア属種、リーシュマニア属種のような原虫、または、サナダムシ、ウサギヒフバエ、エキノコックス、およびパラゴニムス属種のような蠕虫からも誘導され得る。
投与の形態、投薬、経路
本発明に含まれる免疫原性組成物およびワクチンは、ＣＲＣｏＶおよびＢ．ブロンキセプチカのような別の病原体に伴う多病原性疾患状態に対する効果的な免疫反応を誘発するために動物に投与され得る。したがって、本発明は、本明細書に記載される免疫原性組成物またはワクチンの治療的に効果的な量を動物に投与することにより、効果的な免疫反応を刺激する方法を提供する。

本明細書に記載される免疫原性組成物およびワクチンは、動物対象にＣＩＲＤＣに対してワクチン接種するために、動物に投与され得る。当該免疫原性組成物およびワクチンは動物においてＣＩＲＤＣを防止するまたは治療するために動物に投与され得る。したがって、本明細書に記載されるのは、ＣＩＲＤＣに対して動物にワクチン接種する方法、およびＣＩＲＤＣを防止または治療する方法であり、本明細書に記載される免疫原性組成物またはワクチンの治療的に効果的な量を動物に投与する工程を含む。

本発明に含まれる免疫原性組成物およびワクチンは、投与経路次第で、様々な形態で作られ得る。例えば、当該免疫原性組成物およびワクチンは、無菌水溶液または注射可能な使用に適切な撒布の形態で作られ得、または凍結乾燥技術を使用して凍結乾燥形態で作られ得る。凍結乾燥した免疫原性組成物およびワクチンは、典型的に約４°Ｃで維持され、安定化溶液、例えば、アジュバントを伴うかまたは伴わない、生理食塩水またはＨＥＰＥＳにおいて再構成され得る。免疫原性組成物およびワクチンは、さらに懸濁液または乳濁剤の形態でも作られ得る。

本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、１つ以上の上述の微生物の、治療的に効果的な量を含む。純化されたウイルスおよび／または細菌は、直接的に免疫原性組成物またはワクチンにおいて使用され得、またはさらに弱減もしくは不活性化され得る。典型的に、免疫原性組成物またはワクチンは、約１×１０²から約１×１０¹²の間のウイルス性または細菌性の粒子、または約１×１０³から約１×１０¹¹の間の粒子、または約１×１０⁴から約１×１０¹⁰の間の粒子、または約１×１０⁵から約１×１０⁹の間の粒子、または約１×１０⁶から約１×１０⁸の間の粒子を含有する。防護的効果を提供することに効果的な、免疫原性組成物またはワクチンにおける微生物の正確な量は、当業者によって決定され得る。

当該免疫原性組成物およびワクチンは一般的に、獣医学的に許容できる担体を約０．５ｍｌから約５ｍｌの間の量で含む。別の実施形態において、担体の量は、約１ｍｌから約４ｍｌの間、または約２ｍｌから約３ｍｌの間である。別の実施形態において、担体の量は約１ｍｌ、または約２ｍｌ、もしくは約５ｍｌである。免疫原性組成物およびワクチンにおける使用に適切な、獣医学的に許容できる担体は、本明細書に上述したもののいずれでもあり得る。

当業者は、ウイルスまたは細菌が投与前に弱減または不活性化される必要があるかどうかを容易に決定することができる。本発明の別の実施形態において、ウイルスまたは細菌は追加的な弱減を伴わず動物に直接投与され得る。治療的に効果のある微生物の量は、使用される特定の微生物、動物の状態および／または感染の程度次第で変化し得、当業者によって決定され得る。

本発明の方法に従い、単一の投与量が動物に投与され得るか、または、代替手段で、２つ以上の播種が約２から約１０週間の間隔を伴い行われる。追加免疫投与計画が要求され得、投薬計画は最適免疫化を提供するように調整され得る。当業者は容易に最適投与計画を決定することができる。

免疫原性組成物およびワクチンは、血流内、筋肉内、内臓内、または皮膚下に直接投与され得る。非経口投与に適切な手段は、静脈内、動脈内、筋肉内、および皮下投与を含む。非経口投与に適切な装置は、針（マイクロニードルを含む）注射器および無針注射器を含む。

非経口製剤は典型的に、塩、炭化水素、タンパク質のような賦形剤、および緩衝剤（好適にはｐＨが、約３から約９、または約４から約８、または約５から約７．５、または約６から約７．５、または約７から約７．５である）を含有し得る水溶液であるが、いくつかの用途では、これらは無菌非水溶液または乾燥形態としてより適切に製剤され得、無菌で発熱物質を含まない水または生理食塩水のような、適切な溶媒と合わせて使用され得る。

無菌条件下、例えば凍結乾燥での非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準製薬技術を使用して容易に達成され得る。

注射液の調製において使用される物質の溶解性は、当業者に周知の、緩衝液、塩、界面活性剤、リポソーム、シクロデクストリン等を含む、溶解性促進剤の取り込みのような適切な製剤技術の使用によって増加され得る。

非経口投与のための組成物は、即時または調節放出になるよう製剤され得る。調節放出は、遅延、持続、脈動、制御、標的およびプログラム放出を含む。したがって、免疫原性組成物およびワクチンは、移植持効性製剤としての投与のために、固体、半固体、または揺変性液として製剤され得、免疫原性組成物およびワクチンの調節放出を提供する。

免疫原性組成物またはワクチン投与の他の手段は、マイクロニードルまたは無針（例えばＰｏｗｄｅｒｊｅｃｔ（商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔ（商標）等）注射による送達を含む。

皮下または筋肉内注射が使用される場合、等張性製剤が好適である。一般的に、等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デクストリン、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含み得る。具体的な場合において、リン酸緩衝食塩水のような等張溶液が使用される。製剤はさらにゼラチンおよびアルブミンのような安定剤を含み得る。いくつかの実施形態において、血管収縮性の作用剤が製剤に加えられる。本発明に従う製薬調製物は一般的に無菌で発熱物質を含まない状態で提供される。しかしながら、製薬的に許容される担体の製剤は、米国農務省、または、カナダもしくはメキシコあるいは欧州国のいずれかのような外国の同等な政府機関によって公布される、イヌワクチン、ポリペプチド（抗原）サブユニット免疫原性組成物およびワクチン、組換ウイルスベクターワクチン、およびＤＮＡワクチンに関する規制において承認される製薬的担体である、ということは当業者に周知である。したがって、免疫原性組成物またはワクチンの商用製品のための製薬的に許容される担体は、米国または外国の適切な政府機関によって既に承認された、または承認される見込みの担体である。当該免疫原性組成物およびワクチンはさらに薬学的に許容されるアジュバントと撹拌され得る。免疫原性組成物およびワクチンの特定の製剤において、当該免疫原性組成物またはワクチンは他のイヌ免疫原性組成物またはワクチンと組み合わされ、他のイヌ病原体によって引き起こされる幅広い種類の疾患からイヌを保護し得る多価生成物を生成する。
検出及び診断方法
動物において誘発される免疫反応の範囲および性質は様々な技術を使用して評価され得る。例えば、血清が播種された動物から採取され得、免疫原に特異的な抗体の存在または不在を試験され得る。細胞免疫反応誘発を示唆する、リンパ組織における反応細胞毒性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）の検出は、Ｔ細胞増殖のような検定法により達成され得る。関連する技術は技術分野において詳細に記載される。
キット
追加的な組成物または化合物と組み合わせて免疫原性組成物またはワクチンを投与するのが望まれる限りは（例えば特定の疾患または症状を治療する目的のために）免疫原性組成物またはワクチンを、組成物の投与または同時投与に適切なキットの形態に好都合に含み得ること、または組み合わせ得ることは、本発明の範囲内である。

したがって、本発明に含まれるキットは、１つ以上の別々の医薬組成物、少なくとも１つの本発明に従う免疫原性組成物またはワクチン、および、容器、分かれたボトル、または分かれたホイルの箱のような、当該組成物を別々に維持するための手段を備える。そのようなキットの例は、シリンジおよび針等である。本発明のキットは特に異なる投薬形態による投与、例えば、経口または非経口により、別々の組成物を異なる投薬間隔で投与したり、または別々の組成物を互いに対して滴定したりすることに適切である。本発明に含まれる組成物の投与を補助するために、当該キットは典型的に投与の説明書を備える。

本発明に含まれる別のキットは、感染動物の検出に有益な１つ以上の試薬を備え得る。当該キットは全体微生物、ポリペプチド、エピトープまたはポリヌクレオチド配列の存在の試料の分析をするための試薬を含み得る。ウイルス、細菌、ポリペプチド、またはポリヌクレオチド配列の存在は、抗体、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、および当業者に周知の他の検出方法によって決定され得る。

本発明に含まれる別のキットは、特定のエピトープに対する抗体の検出のための試薬を提供し得る。そのような試薬は抗体の存在の試料を分析することに有益であり、当業者に容易に知られ得、入手可能である。抗体の存在は、当業者に公知の標準検出方法を使用して決定され得る。

ある特定の実施形態において、当該キットは、印刷された説明書のセット、または当該キットが感染動物の検出に有益であることを示唆するラベルを含み得る。
抗体
抗体は単クローン、多クローン、または組換えのいずれかであり得る。当該抗体は免疫原またはその一部に対して調製され得る。例えば、免疫原のアミノ酸配列を基とする、またはクローン技術により組換調製された合成ペプチド、もしくは自然遺伝子生成物および／またはその一部は、分離され、免疫原として使用され得る。免疫原は、当業者に周知の標準抗体生成技術によって、抗体を生成することに使用され得る。抗体フラグメントはさらに、当該抗体から当業者に周知の方法により調製され得、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、お
よびＦｖフラグメントを含む。

抗体の生成において、望ましい抗体のスクリーニングは、免疫学における、当業者に周知の標準方法によって達成され得る。一般的に、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット法は免疫測定法の好適な型である。両方の検定法は当業者に周知である。多クローンおよび単クローン抗体の両方が当該検定法において使用される。当該抗体は、固体支持基質に結合され、検出可能な成分に抱合され、または当業者に周知のように結合および抱合の両方がなされ得る。固体支持基質への抗体の結合もまた当業者に周知である。本発明における使用に想定される検出可能な成分は、ビオチン、金、フェリチン、アルカリホスファターゼ、ｂ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、フルオレセイン、ローダミン、トリチウム、¹⁴Ｃ、およびヨウ素化などの、蛍光性、金属性、酵素性および放射性マーカーを含むがこれらに限定されない。

本発明はさらに以下の実施例によって説明されるが、これらに限定されることを意味するものではない。

実施例
実施例１ 鼻腔内エアロゾール化を使用したＣＲＣＶへのイヌの実験的な感染
間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）によって決定された、一般健康状態が良く、０日目の前にイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）に対する抗体が陰性であると決定された５０匹のイヌが本研究に含まれる。また、動物は、口咽頭スワッブウイルス分離によって０日目にＣＲＣｏＶを有さないことも確認された。

最大に指定されたＣＲＣｏＶ分離株は、抗原投与物質として使用され、ＨＲＴ１８Ｇ細胞上での１回の継代の後に得られた。当該抗原投与物質はＨＲＴ１８Ｇ細胞上で滴定され、１０^7.1ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬの感染性投与量を有すると決定された。ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７に指定されたＣＲＣｏＶ分離株もまた抗原投与物質として使用され、ＨＲＴ１８Ｇ細胞上での２回の継代の後に得られた。当該抗原投与物質はＨＲＴ１８Ｇ細胞上で滴定され、１０^6.5ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬの感染性投与量を有すると決定された。

動物は到着から−３日目まで１日１回観察された。体重は−１日目に決定された。血液試料はそれぞれの動物から０日目の抗原投与前に採取された。耳内温度は抗原投与前に、−２日目、−１日目、０日目に決定された。口咽頭スワッブの２つのセットがそれぞれのイヌから、０日目の抗原投与前に採取された。スワッブの１つのセットは、ＣＲＣｏＶウイルス分離のためにＶＴＭ（ウイルス輸送培地）管に採取され、もう１つのセットはＡｍｉｅｓ培地に採取された（細菌性分離）。鼻スワッブの２つのセットは０日目の抗原投与前に、１つはＣＲＣｏＶウイルス分離のためにＶＴＭ管に、もう１つは細菌性分離のためにＡｍｉｅｓ培地に採取された。動物は抗原投与前に、−２日目、−１日目、および０日目に１日１回、呼吸器疾患の臨床徴候を観察された。

ＣＲＣｏＶ抗原投与ウイルス系統は解凍され、期待抗原投与量（１０^6.0ＴＣＩＤ₅₀／イヌ）に適切に希釈された。５×１０^6.0ＴＣＩＤ₅₀を含有する抗原投与をイヌにつき１×１０＾６ＴＣＩＤ５０の標的抗原投与量にエアロゾール化することにより、５匹のイヌが同時に抗原投与された。抗原投与物質は、抗原投与接種まで氷上に保存された。治療群Ｔ０１およびＴ０２のイヌは生理食塩水をエアロゾール化によりプレキシガラスの房において計３０分間０日目に投与された。これらの群はまず相互汚染を回避するために抗原投与された。治療群Ｔ０３およびＴ０４のイヌは、ＣＲＣｏＶ最大分離株をエアロゾール化によりプレキシガラスの房において計３０分間０日目に投与された。治療群Ｔ０５およびＴ０６のイヌは、ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７をエアロゾール化によりプレキシガラスの房において計３０分間０日目に投与された。抗原投与後のＣＲＣｏＶ（最大）の滴定平均は１０^5.2ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬであり、抗原投与後のＣＲＣｏＶ（ＮＰ７８７）の滴定平均は１０^4.7ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬであった。

耳内温度は、抗原投与後に０日目から１４日目まで毎日決定された。臨床観察は毎日およそ３０分間にわたり０日目から１４日目まで実施された。鼻スワッブはそれぞれのイヌから、ＣＲＣｏＶウイルス分離株のためにＶＴＭ管に、０日目から１０日目まで採取された。口咽頭スワッブはそれぞれのイヌからＶＴＭ管に２日目、３日目および４日目に採取された。血清学のための血液試料はそれぞれの動物から４日目および１４日目に採取された。

剖検は、治療群Ｔ０１、Ｔ０３、ならびにＴ０５に抗原投与後４日目で、および治療群Ｔ０２、Ｔ０４、ならびにＴ０６に抗原投与後１４日目で実施された。動物はバルビツール酸ナトリウムの過量投与によって安楽死させた。剖検にて完全肺が無菌的に除去され無菌ドレープ上に置かれた。肺硬化の総量を決定するため、それぞれの肺葉は別々に硬化を点数化された。気管は横切開され、管腔は肉眼病変を評価された。全ての組織は、委員会認可の獣医病理学者によって評価および点数化された。

肺が点数化された後、右尾側肺葉は、腕神経叢を経由し、およそ３０．０ｍＬのＶＴＭ（抗生物質または抗真菌物質を有さない）を流すことで洗浄された。ＶＴＭ培地は肺組織を段階的にマッサージしている間にゆっくりとシリンジに吸引された。洗浄された液体は一定分量に分けられ、細菌学、およびＣＲＣｏＶウイルス分離株を試験された。

組織試料は、気管、鼻腔（繊毛部を含む）、および右頭側葉から採取された。２つの組織試料のセットが気管及び鼻腔から採取された。１つのセットはＣＲＣｏＶウイルス分離を試験され、もう１つは病理組織のために調製された。３つの組織試料のセットが右頭側肺葉から採取され、第１のセットは細菌学を試験され、第２のセットはＣＲＣｏＶウイルス分離を試験され、第３のセットは病理組織のために調製された。

鼻および口咽頭のスワッブ、組織試料、および肺洗浄は、ＨＲＴ１８Ｇ細胞を使用し、ＣＲＣｏＶウイルス分離を試験された。簡潔に言えば、試料は処理され、ＨＲＴ１８Ｇ細胞の単層を含有するフラスコに播種された。播種されたフラスコは２週間にわたり加湿ＣＯ₂インキュベータにおいて３５〜３７℃でインキュベートされた。インキュベートされたフラスコは播種後１週間および２週間で採取され、試料はＨＲＴ１８Ｇ細胞で播種された９６穴プレートの４つの穴に播種された。播種されたプレートは加湿ＣＯ₂インキュベータにおいて５〜７日間にわたり３５〜３７℃でインキュベートされた。インキュベーション期間の最後に、９６穴プレートにおける細胞単層がアセトン系溶液で固定され、水で洗浄された。存在は、ＣＲＣｏＶは、ＣＲＣｏＶ特異性ＦＩＴＣ抱合抗体を用いることで染色している蛍光性抗体によって決定され、落射蛍光顕微鏡下で観察された。

血清試料はＩＦＡによりＣＲＣｏＶ抗体を試験された。簡潔に言えば、ＨＲＴ１８Ｇ細胞は９６穴プレートに播種され、穴につき５０〜２００の感染細胞を達成するためのウイルス希釈でＣＲＣｏＶに感染させた。感染プレートはアセトン系溶液で固定され、すすがれた。かん試験血清試料はＣＲＣｏＶ固定プレート内へ直接２倍に希釈された。プレートは４０〜６０分間にわたりインキュベートされた。プレートはすすがれ、ウサギ抗イヌＩｇＧ ＦＩＴＣ抱合抗体が加えられた。プレートは４０〜６０分間にわたりインキュベートされた。インキュベーション後、プレートはすすがれ、落射蛍光顕微鏡下で調査された。抗体力価は、典型的な（＋１）以上の蛍光強度を示す最抗血清希釈の逆数として決定された。

血清試料は、血清中和によりＣＲＣｏＶ血清中和抗体を試験された。簡潔に言えば、ＨＲＴ１８Ｇ細胞は９６穴組織培養プレートに、適切な密度で播種され、３〜５日間にわたり、３５〜３７℃で、加湿ＣＯ₂インキュベータにおいてインキュベートされた。細胞単層が１００％の培養密度に到達すると、穴は培地ですすがれ、トリプシンを補足された培地で１時間にわたりインキュベータ内で前処理された。それぞれの試験血清の２倍希釈液が調製され、５０〜３００のＴＣＩＤ₅₀ＣＲＣｏＶで４０〜６０分間にわたり室温でインキュベートされた。それぞれの血清希釈からのウイルス血清混合物は４つの穴に播種された。プレートは５〜７日間にわたり３５〜３７℃で加湿ＣＯ₂インキュベータにおいてインキュベートされた。インキュベーション後、培地は廃棄され、細胞単層はアセトン系溶液で固定された。固定液は廃棄され、プレートはすすがれた。ＣＲＣｏＶの存在は、免疫蛍光により、ＣＲＣｏＶ特異性ＦＩＴＣ抱合抗体を使用し、落射蛍光顕微鏡下で決定された。血清中和抗体力価は、穴の５０％においてウイルスを中和した最高血清希釈の逆数として決定された。

主要有効性変数は、グレード＞１（気管の病理組織）で点数化された損傷気管繊毛上皮の存在／不在、およびウイルス分離である。仮説試験は行われなかった。気管、鼻腔、および頭側肺葉の病理組織点数（重症度、分布、過程および繊毛）の度数分布は、それぞれの治療群に対して計算された。さらに、気管繊毛上皮は正常（０および１）または異常（２、３、および４）としてその上分類された。この変数の度数分布はそれぞれの治療に対して計算された。鼻および口咽頭スワッブからのＣＲＣｏＶウイルス分離の存在または不在の度数分布は、それぞれの治療群および時点に対して計算された。抗原投与後の鼻スワッブにおいて検出された、動物がＣＲＣｏＶウイルスを有した日数［（ウイルスが検出された最後の日−ウイルスが検出された最初の日）＋１ウイルスが検出されなかった場合を除く］は、それぞれの動物に対して計算された。鼻スワッブから検出されたウイルスを有した日数は、平均値、中央値、標準偏差、最小値および最大値を含む記述統計と共に、それぞれの治療群に対してまとめられた。洗浄からのウイルス分離の存在／不在の度数分布および組織データは、それぞれの治療群に対して計算された。幾何平均、最小値および最大値を含む抗体力価の記述統計（ＩＦＡおよびＳＮ）はそれぞれの治療および時点に対して計算された。それぞれの臨床観察の度数分布（鼻汁、咳、くしゃみ眼漏、結膜炎、および鬱状態）が、それぞれの治療群および時点に対して計算された。記述統計は、平均値、標準偏差、最小値および最高値を含む体温について、それぞれの治療および時点に対して計算された。さらに、体温は、＜３７．０℃、３７．０〜３９．５℃、３９．６〜４０．０℃、４０．１〜４１．０℃、および４１．１〜４２．０℃に分類された。度数分布は、この新しい変数について、それぞれの治療および時点に対して計算された。それぞれの試験の存在／不在の度数分布はそれぞれの治療および時間に対して計算された。

結果．全てのイヌが、０日目（抗原投与前）に採取された鼻および口咽頭スワッブ試料からＣＲＣｏＶウイルス分離に陰性と試験された。全てのイヌが、０日目（抗原投与前）に採取された血清試料から、間接蛍光法によりＣＲＣｏＶ抗体に陰性（＜４０ＩＦＡ力価）であり、血清中和法によりＣＲＣｏＶ抗体に陰性（３ＳＮ力価）であると試験された。全てのイヌが、０日目に採取された鼻および口咽頭のスワッブから、ボルデテラブロンキセプチカおよびパスツレラｓｐに陰性であると試験されたが、マイコプラズマｓｐ、スタフィロコッカスインターメディウスおよびストレプトコッカスカニスは、鼻および口咽頭のスワッブから異なるレベルで０日目に分離された。しかしながら、健康なイヌは、気道上部における通常の細菌叢の一部としてこれらの微生物を含み得る。

ＣＲＣｏＶ最大分離株（治療群Ｔ０３およびＴ０４）およびＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株（治療群Ｔ０５およびＴ０６）を投与された動物の抗原投与後の臨床徴候の大部分は、軽度から中程度であり、鼻汁、咳、くしゃみおよび眼漏を含んだ。結膜炎は観察されず、１匹の犬が鬱状態を示した。治療群Ｔ０３およびＴ０４（ＣＲＣｏＶ最大分離株で抗原投与された）、ならびに治療群Ｔ０５およびＴ０６（ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株で抗原投与された）に観察された臨床徴候の病原性に関する２つの抗原投与分離株（ＣＲＣｏＶ最大およびＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７）の間に主要な差異はないようであった。

治療群Ｔ０１およびＴ０２において偽薬（生理食塩水）を投与された数匹のイヌが、本研究の抗原投与段階の間、軽度および中程度の眼漏を示した。しかしながら、これらのイヌの全ては、０日目の抗原投与前に既に軽度の眼漏を示していた。抗原投与後の耳内温度は、ＣＲＣｏＶ最大分離株で抗原投与された全てのイヌ（治療群Ｔ０３およびＴ０４）、およびＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株で抗原投与された全てのイヌ（治療群Ｔ０５およびＴ０６）について通常（≦３９．４℃）であった。治療群Ｔ０１およびＴ０２において当該偽薬を投与された数匹のイヌは、本研究の抗原投与段階の間のある時点で高体温（≧３９．５℃）を示した。しかしながら、これらのイヌの全ては完全に通常かつ健康であり、治療群Ｔ０１およびＴ０２に使用された耳内温度計は高値を示していたということが後になり分かった。

要約すると、ＣＲＣｏＶの臨床徴候の強度が軽度であること、および抗原投与イヌ（ＣＲＣｏＶ最大分離株およびＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株）における高体温が不在であることにより、これら２つの評価基準は、実験室条件下で疾患の強度を特徴付けたり、測定したりするために十分ではないと考えられる。

治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶ最大分離株、４日目の剖検）の鼻スワッブからのＣＲＣｏＶウイルス分離の平均日数は４であり、治療群Ｔ０４（ＣＲＣｏＶ最大分離株、１４日目の剖検）では６であった。治療群Ｔ０５（ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株、４日目の剖検）の鼻スワッブからのＣＲＣｏＶウイルス分離の平均日数は２であり、治療群Ｔ０６（ＣＲＣｏＶＮＰ７８７分離株、１４日目の剖検）では５であった。偽薬（生理食塩水）を投与された治療群Ｔ０２からの４匹のイヌは、抗原投与後約６日目、７日目、８日目で鼻スワッブからＣＲＣｏＶウイルス分離に陽性であった。これらの動物の全てが抗原投与後段階の間、ＣＲＣｏＶ感染を示唆する臨床徴候を示さなかった。抗原投与後１４日目の剖検で、Ｔ０２の３匹のイヌが全体的に軽度な肺の点数を有した。繊毛評価はこれらすべての動物に関して通常であるとされた。これら全ての動物に関して、ＣＲＣｏＶ分離は、肺、肺洗浄、鼻腔および気管から得られず、この理由から、野生型ＣＲＣｏＶ分離株が偽薬（生理食塩水）動物室内に相互汚染されたとは考えられにくい。さらに、当該陽性ＣＲＣｏＶウイルス分離結果は、ＨＲＴ１８Ｇ細胞における第２の継代にてのみ見られた。１つの可能性は、実験室試験段階で当該試料が相互汚染されたということである。

治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶ最大分離株、４日目の剖検）の口咽頭スワッブからのＣＲＣｏＶウイルス分離の平均日数は２であり、治療群Ｔ０４（ＣＲＣｏＶ最大分離株、１４日目の剖検）では２であった。治療群Ｔ０５（ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株、４日目の剖検）の口咽頭スワッブからのＣＲＣｏＶウイルスの平均日数は０であり、治療群Ｔ０６（ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株、１４日目の剖検）では１であった。ＣＲＣｏＶ分離の数的に最高の平均日数は、ＣＲＣｏＶ最大分離株を攻撃生物体として使用し鼻腔から採取されたスワッブから得られた（治療群Ｔ０３およびＴ０４）。結論として、感染の初期段階の間に採取された鼻スワッブは、ＣＲＣｏＶ最大分離株で抗原投与されたイヌからの陽性ＣＲＣｏＶウイルス分離をもたらす可能性がより高いと思われた。

偽薬（生理食塩水）が抗原投与されたイヌから採取された肺組織からＣＲＣｏＶウイルス分離は観察されなかった。肺組織からの陽性ＣＲＣｏＶウイルス分離は、治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶ最大分離株）に関して１０匹中１０匹（１００％）において４日目の剖検で観察された。肺組織からの陽性ＣＲＣｏＶウイルス分離は、治療群Ｔ０５（ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株）に関して１０匹中７匹（７０％）において４日目の剖検で観察された。ＣＲＣｏＶウイルス分離は、治療群Ｔ０４（ＣＲＣｏＶ最大分離株）または治療群Ｔ０６（ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株）に関して、１４日目の剖検に採取された肺組織から得られなかった。

偽薬（生理食塩水）が抗原投与されたイヌから採取された肺洗浄からＣＲＣｏＶウイルス分離は観察されなかった。肺洗浄からの陽性ＣＲＣｏＶウイルス分離は、治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶ最大分離株）および治療群Ｔ０５（ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株）に関して１０匹中１０匹（１００％）において４日目の剖検で観察された。ＣＲＣｏＶウイルス分離は、治療群Ｔ０４（ＣＲＣｏＶ最大分離株）または治療群Ｔ０６（ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株）に関して、１４日目の剖検にて採取された肺洗浄から得られなかった。
偽薬（生理食塩水）を抗原投与されたイヌから採取された鼻腔からＣＲＣｏＶウイルス分離は観察されなかった。鼻腔からの陽性ＣＲＣｏＶウイルス分離は、治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶ最大分離株）および治療群Ｔ０５（ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株）に関して１０匹中１０匹（１００％）において４日目の剖検で観察された。ＣＲＣｏＶウイルス分離は、治療群Ｔ０４（ＣＲＣｏＶ最大分離株）または治療群Ｔ０６（ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株）に関して、１４日目の剖検にて採取された鼻腔から得られなかった。

偽薬（生理食塩水）が抗原投与されたイヌから採取された気管からＣＲＣｏＶウイルス分離は観察されなかった。気管からの陽性ＣＲＣｏＶウイルス分離は、治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶ最大分離株）または治療群Ｔ０５（ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株）に関して１０匹中１０匹（１００％）において４日目の剖検で観察された。ＣＲＣｏＶウイルス分離は、治療群Ｔ０４（ＣＲＣｏＶ最大分離株）および治療群Ｔ０６（ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株）に関して、１４日目の剖検にて採取された気管から得られなかった。

両方の抗原投与分離株（ＣＲＣｏＶ最大およびＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７）は、４日目の剖検に採取された肺、肺洗浄、鼻腔および気管から、成功的に分離された。ＣＲＣｏＶウイルス分離は、１４日目の剖検に採取された肺、肺洗浄、鼻腔および気管から、両方の抗原投与分離株（ＣＲＣｏＶ最大およびＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７）に関して、得られなかった。結論として、感染の初期段階の間に採取された肺、肺洗浄、鼻腔および機関は、陽性ＣＲＣｏＶウイルス分離をもたらす可能性がより高いと思われた。

臨床的に有意な病理変化は、肺組織の繊毛上皮において観察されなかった。全ての治療群におけるイヌの大半はグレード０を得た。治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶ最大分離株）の１匹のイヌが４日目の剖検でグレード１を得た。

臨床的に有意な病理変化は、鼻腔の繊毛上皮において、治療群Ｔ０１およびＴ０２（生理食塩水）に関して、それぞれ４日目および１４日目の剖検で観察されなかった。治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶ最大分離株）に関して、４日目の剖検で、１０匹のイヌ全てが病理グレード２以上を示した。治療群Ｔ０４（ＣＲＣｏＶ最大分離株）に関して、１４日目の剖検で、１０匹中６匹のイヌ（６０％）が病理グレード２以上を示した。治療群Ｔ０５（ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株）に関して、４日目の剖検で、１０匹中９匹のイヌ（９０％）が病理グレード２以上を示した。治療群Ｔ０６（ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株）に関して、１４日目の剖検で、１０匹中７匹のイヌ（７０％）が病理グレード２を示した。

臨床的に有意な病理変化は、気管の繊毛上皮において、治療群Ｔ０１およびＴ０２（生理食塩水）に関して、それぞれ４日目および１４日目の剖検で観察されなかった。治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶ最大分離株）に関して、４日目の剖検で、１０匹中７匹のイヌ（７０％）が病理グレード２以上を示した。治療群Ｔ０４（ＣＲＣｏＶ最大分離株）に関して、１４日目の剖検で、１０匹のイヌ全て（１００％）が病理グレード１を示した。治療群Ｔ０５（ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株）に関して、４日目の剖検で、１０匹のイヌ全て（１００％）が病理グレード２以上を示した。治療群Ｔ０６（ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株）に関して、１４日目の剖検で、１０匹のイヌ全て（１００％）が病理グレード１を示した。グレード２以上の病理変化は、両方の抗原投与分離株（ＣＲＣｏＶ最大およびＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７）で抗原投与された動物の肺において観察されなかった。鼻腔および気管の繊毛上皮におけるグレード２以上の病理変化は、両方の抗原投与分離株（ＣＲＣｏＶ最大およびＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７）で抗原投与された動物において観察された。鼻腔および気管における病理変化（グレード２以上）の大半は４日目の剖検で観察された。結論として、繊毛上皮損傷は、両方の分離株（ＣＲＣｏＶ最大およびＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７）で抗原投与された動物の鼻腔および気管において観察され、これらの病理的発見は、感染の最初期段階の間（４日目の剖検）により顕著であると考えられる。

最も顕著な病理組織的発見は、異なるグレードでの肺、鼻腔および気管の多巣性炎症である。

全てのイヌが４日目に採取された血清試料から間接蛍光法によりＣＲＣｏＶ抗体に陰性（＜４０ＩＦＡ）であると試験された。全ての偽薬（生理食塩水）抗原投与のイヌが１４日目に採取された血清試料から間接蛍光法により、ＣＲＣｏＶ抗体に陰性（＜４０ＩＦＡ）であると試験された。治療群Ｔ０４（ＣＲＣｏＶ最大分離株）のイヌは、１４日目の剖検で採取された血清試料から１０４０の幾何平均ＩＦＡ抗体力価を有した。治療群Ｔ０６（ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株）のイヌは、１４日目の剖検で採取された血清試料から１６８９の幾何平均ＩＦＡ抗体力価を有した。

全てのイヌが、４日目に採取された血清試料から血清中和アッセイにより、ＣＲＣｏＶ中和抗体に陰性（３ＳＮ力価）であると試験された。全ての偽薬（生理食塩水）抗原投与のイヌが、１４日目に採取された血清試料から血清中和アッセイにより、ＣＲＣｏＶ中和抗体に陰性（３ＳＮ力価）であると試験された。治療群Ｔ０４（ＣＲＣｏＶ最大分離株）のイヌは、１４日目の剖検で採取された血清試料から１００の幾何平均ＳＮ抗体力価を有した。治療群Ｔ０６（ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株）のイヌは、１４日目の剖検で採取された血清試料から３４の幾何平均ＳＮ抗体力価を有した。

全てのイヌが、４日目または１４日目の剖検のいずれかにおいて採取された肺洗浄および肺組織から、ボルデテラブロンキセプチカ、パスツレラ属種、スタフィロコッカスインターメディウスおよびストレプトコッカスカニスに陰性であると試験された。マイコプラズマ属種は、偽薬生理食塩水を抗原投与された２匹のイヌ（治療群Ｔ０１およびＴ０２）からの肺洗浄から分離された。マイコプラズマ属種は、ＣＲＣｏＶ最大分離株を投与された３匹のイヌ（治療群Ｔ０３）からの肺洗浄から分離された。マイコプラズマｓｐはさらにＣＲＣｏＶ最大分離株を投与された１匹のイヌ（治療群Ｔ０３）からの肺組織からも分離された。これらのイヌは剖検で細菌性肺炎の徴候を有さなかった。全てのイヌが、０日目（抗原投与前）に採取された鼻および口咽頭のスワッブからＣＲＣｏＶウイルス分離に陰性であると試験された。全てのイヌが、０日目（抗原投与前）に採取された血清試料からＣＲＣｏＶ抗体（ＩＦＡおよびＳＮ）に陰性であると試験された。全てのイヌが、０日目（抗原投与前）に採取された鼻および口咽頭のスワッブからボルデテラブロンキセプチカに陰性であると試験された。したがって、本研究の包含評価基準は満たされた。

結論．ＣＲＣｏＶ最大分離株で抗原投与された全てのイヌが、抗原投与後の段階の間、鼻スワッブおよび口咽頭スワッブからウイルス分離に陽性であると試験された。ＣＲＣｏＶＮＰ７８７分離株で抗原投与された全てのイヌが、抗原投与後の段階の間、鼻スワッブからウイルス分離に陽性であると試験され、４０〜５０％のイヌが口咽頭スワッブからウイルス分離に陽性であると試験された。したがって、本研究は妥当な抗原投与を有した。

ＣＲＣｏＶ最大分離株で抗原投与された全てのイヌが、４日目の剖検で、肺、肺洗浄、鼻腔および気管からウイルス分離に陽性であると試験された。ＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株で抗原投与された全てのイヌが、４日目の剖検で、肺洗浄、鼻腔および気管からウイルス分離に陽性であると試験され、７０％のイヌが肺からウイルス分離に陽性であると試験された。これは本研究が妥当な抗原投与を有したことを再度確認する。

ＣＲＣｏＶ最大分離株（治療群Ｔ０３およびＴ０４）およびＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７分離株（治療群Ｔ０５およびＴ０６）を投与された動物の抗原投与後の臨床徴候の大半が、軽度から中程度であり、鼻汁、咳、くしゃみおよび眼漏を含んだ。結膜炎および高体温（≧３９．５℃）は観察されず、１匹のイヌは鬱状態を示した。臨床徴候および耳内温度は、実験室条件下でＣＲＣｏＶ誘発疾患の強度を特徴付けたり、測定したりするために十分ではないと考えられる。

ＣＲＣｏＶ分離の数的に最高の平均日数は、ＣＲＣｏＶ最大分離株を使用して鼻腔から採取されたスワッブから得られた。感染の最初期段階の間に採取された鼻スワッブは、陽性ＣＲＣｏＶウイルス分離をもたらす可能性がより高いと思われた。

両方の抗原投与分離株（ＣＲＣｏＶ最大およびＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７）は、４日目の剖検で採取された、肺、肺洗浄、鼻腔および気管から、成功裏に分離された。ＣＲＣｏＶウイルス分離は、１４日目の剖検で採取された、肺、肺洗浄、鼻腔および気管から、両方の抗原投与分離株（ＣＲＣｏＶ最大およびＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７）に関して得られなかった。結論として、感染の最初期段階の間に採取された、肺、肺洗浄、鼻腔および気管試料は、陽性ＣＲＣｏＶウイルス分離をもたらす可能性がより高いと思われた。

グレード２以上の病理変化は、両方の抗原投与分離株（ＣＲＣｏＶ最大およびＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７）で抗原投与された動物の肺において観察されなかった。鼻腔および気管の繊毛上皮におけるグレード２以上の病理変化は抗原投与分離株（ＣＲＣｏＶ最大およびＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７）のいずれかで抗原投与された動物において観察された。鼻腔および気管における病理変化（グレード２以上）の大半は、４日目の剖検で観察された。結論として、繊毛上皮損傷は、分離株（ＣＲＣｏＶ最大およびＣＲＣｏＶ ＮＰ７８７）で抗原投与された動物の鼻腔および気管において観察され、これらの病理的発見は、感染の最初期段階の間（４日目の剖検）により顕著であると考えられる。

全てのイヌが、４日目または１４日目の剖検のいずれかで採取された肺洗浄および肺組織から、ボルデテラブロンキセプチカ、パスツレラ属種、スタフィロコッカスインターメディウスおよびストレプトコッカスカニスに陰性であると試験された。マイコプラズマ属種は６匹のイヌの肺（洗浄または組織）から分離されたが、しかしながら、剖検で細菌性肺炎は観察されなかった。総合的に、ＣＲＣｏＶは気管から分離された唯一の病原体であり、観察された臨床徴候および病理組織の原因であると考えられる。

結論として、エアロゾール化により投与されたＣＲＣｏＶ最大分離株またはＣＲＣｏＶ
ＮＰ７８７分離株は、自然宿主におけるウイルス感染およびウイルス複製をもたらす。ＣＲＣｏＶは、抗原投与されたイヌの鼻スワッブ、口咽頭スワッブ、肺、肺洗浄、鼻腔および気管から分離された。臨床徴候の大半が軽度であり、疾患の特徴化とは関連しなかった。しかしながら、気管および鼻腔の繊毛上皮における損傷は、実験室条件下で疾患を特徴付けることに使用される、一貫性のあるパラメータであると考えられる。ＣＲＣｏＶ抗原投与モデルおよび抗原投与分離株は、ＣＲＣｏＶ画分のワクチン有効性研究における使用に適切である
。

実施例２ イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）、ボルデテラブロンキセプチカ混合感染モデルの開発
全て一般健康状態の良い、３０匹のイヌが本研究に含まれた。全ての動物が、ＣＲＣｏＶ抗原投与前（０日目）に、免疫蛍光抗体法（ＩＦＡ）によって決定された通り、＜４０ＩＦＡ力価で、ＣＲＣｏＶへの抗体に陰性であり、ＣＲＣｏＶへの血清中和抗体に陰性（３ＳＮ力価）であった。全てのイヌが、ＣＲＣｏＶ抗原投与前（０日目）に、鼻スワッブからＣＲＣｏＶ分離に陰性でもあった。全ての動物が、ボルデテラ抗原投与前（３日目）に、ボルデテラに対してワクチン接種されておらず、ミクロ凝集試験（ＭＡＴ）に決定された通り、ボルデテラに低い抗体力価（＜１６ＭＡＴ力価）を有した。さらに全てはＣＲＣｏＶ抗原投与前（０日目）に、細菌性鼻スワッブ分離試験によって決定された通り、ボルデテラを有さなかった。

最大に指定されたＣＲＣｏＶ分離株が抗原投与物質として使用された。当該ウイルスはＨＲＴ−１８Ｇ細胞上で増殖および滴定され、１０^7.1ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬの力価を有すると決定された。ボルデテラブロンキセプチカのＢｉｈｒ ｃａｔ株は抗原投与物質として使用された。

動物は到着から−３日目まで少なくとも１日１回観察された。血液試料は、０日目のＣＲＣｏＶ抗原投与前に、および３日目のボルデテラ抗原投与前に採取された。耳内温度は−２日目、−１日目、および０日目に決定された。鼻スワッブの３つの型がそれぞれのイヌから０日目の抗原投与前に採取された。１つはＣＲＣｏＶウイルス分離のためにウイルス輸送培地（ＶＴＭ）管に採取され、２つ目は細菌検査のためにＡｍｉｅｓ培地に採取され、３つ目はボルデテラ分離のためにトリプトースリン酸ブロス（ＴＰＢ）に採取された。追加的なセットが、ボルデテラ分離のために、３日目のボルデテラ抗原投与前に採取された。イヌは−２日目、−１日目、および０日目（抗原投与前）に１日２回、基線値を確立するために呼吸器疾患の臨床徴候を観察された。

０日目に、治療群Ｔ０１のイヌは、無菌生理食塩水を、エアロアゾール化により、プレキシガラスの房においておよそ３０分間にわたり投与された。また０日目に、治療群Ｔ０３のイヌはＣＲＣｏＶをエアロアゾール化によりプレキシガラスの房においておよそ３０分間にわたり投与された。３日目に、治療群Ｔ０２およびＴ０３のイヌは、ボルデテラでエアロアゾール化によりプレキシガラスの房において３０分間にわたり抗原投与された。

臨床観察（およそ３０分間）は０日目に１回、その後１日２回（それぞれのセッションはおよそ３０分間）、１日目から２３日目まで実施された。３日目に、ボルデテラ抗原投与の前後に観察が実施された。２４日目に、１回の観察が実施された。耳内温度は、ＣＲＣｏＶ抗原投与後に０日目から２４日目まで決定された。鼻スワッブの２つの型が、それぞれのイヌから抗原投与後に採取された。１つはＣＲＣｏＶウイルス分離のために、ＶＴＭ管に１日目から１０日目までに採取され、２つ目はボルデテラ分離のためにトリプトースリン酸ブロス（ＴＰＢ）に、６日目から始め、３週間にわたり週に２回分離し、その後２４日目に採取された。スワッブ試料の別のセットは、細菌検査のために、２４日目の剖検前に、チャコールのないＡｍｉｅｓ培地において、採取された。血清学のための血液試料（およそ６ｍＬ）は、ＳＳＴ管に、３日目のボルデテラ抗原投与前に、および２４日目に採取された。

剖検は抗原投与後２４日目に実施された。イヌはバルビツール酸ナトリウムの過量投与で安楽死させた。剖検で、完全肺は無菌的に除去され無菌ドレープ上に置かれた。肺硬化の総量を決定するため、それぞれの肺葉は別々に硬化を点数化された。気管は横切開され、管腔は肉眼病変を評価した。全ての組織は、委員会認可の獣医病理学者によって評価および点数化された。肺が点数化された後、右尾側肺葉は腕神経叢を経由し、およそ３０．０ｍＬのＶＴＭ（抗生物質または抗真菌物質を有さない）を流すことで洗浄された。ＶＴＭ培地は肺組織を段階的にマッサージしている間にゆっくりとシリンジに吸引された。洗浄された液体は一定分量に分けられ、ＣＲＣｏＶウイルス分離株と同様に細菌学を試験された。組織試料は、気管、鼻腔（繊毛部分を含む）、および右頭側葉から採取された。組織試料の２つのセットが気管および鼻腔から採取された。１つのセットはＣＲＣｏＶウイルス分離を試験され、もう１つのセットは病理組織のために調製された。組織試料の２つのセットが右頭側肺葉から採取された。第１のセットは細菌学を試験され、第２のセットはＣＲＣｏＶウイルス分離を試験された。左中央肺葉組織から採取された試料の１つのセットは、病理組織のために調製された。

ボルデテラの分離のための鼻スワッブは０日目のＣＲＣｏＶ抗原投与前に、３日目のボルデテラ抗原投与前に、６日目から始め３週間にわたり週に２回分離しその後２４日目に採取された。１匹のイヌにつき２つのカルギス織物スワッブが、それぞれの鼻孔に１つずつ使用された。血清学のための血液（ＩＦＡによりＣＲＣｏＶ／ＳＮ、およびＭＡＴによりボルデテラ）は、ＣＲＣｏＶ抗原投与前（０日目）、ボルデテラ抗原投与前（３日目）、および研究の最後（２４日目）に採取された。およそ６ｍＬの血液が、それぞれのイヌからそれぞれの時点で採取された。血清は全体血液から分離され、２つのクライオバイアルに上清を移された。無菌ダクロンスワッブはウイルス分離のための鼻スワッブ採取に使用された。スワッブは、０日目のＣＲＣｏＶ抗原投与前、３日目のボルデテラ抗原投与前、および１日目から１０日目に採取された。スワッブはそれぞれの鼻孔にゆっくりと挿入され（１匹のイヌにつき１つのスワッブ）、その後、およそ３ｍＬのウイルス輸送培地（抗生物質が補足されたＶＴＭ）を含有する無菌採取管に配置された。鼻スワッブはそれぞれのイヌから０日目（抗原投与前）および２４日目（剖検前）に採取された。スワッブはチャコールの無いＡｍｉｅｓ輸送培地に置かれた。

ボルデテラ抗体アッセイのために、ボルデテラに対する凝集性抗体は、微粒子抗原（ミクロ）凝集試験（ＭＡＴ）によって決定された。簡潔に言えば、試験血清、既知の陽性血清、陰性血清の２倍段階希釈は、Ｖ底マイクロタイタープレートを用い、０．０５％のツイーン２０を含有する通常生理食塩水を希釈剤として用いて調製された。血清試料は穴につき５０μＬ加えられた。５０μＬのボルデテラ抗原がそれぞれの穴に加えられ、６０秒間にわたりマイクロタイタープレートミキサーで撹拌された。当該プレートは３７±２℃で２時間にわたり、その後２０〜４８時間にわたり２〜８℃でインキュベートされた。当該プレートは鏡台上で視覚的に読み取られた。力価は、完全凝集を示す最高希釈の逆数として表された。

ＣＲＣｏＶ間接蛍光抗体法のために、血清試料は抗ＣＲＣｏＶ抗体をＩＦＡにより滴定された。ＨＲＴ−１８Ｇ細胞は９６穴プレートに播種され、穴につき５０〜２００の感染細胞を得るために、ＣＲＣｏＶの最適量で感染させた。感染プレートはアセトン系の固定液で固定され、すすがれ、保管された。試験血清試料は、直接抗原固定プレートにおいて段階的に２倍希釈され、４０〜６０分間にわたりインキュベートされた。当該血清は廃棄され、プレートはすすがれ、ウサギ抗イヌＩｇＧ ＦＡ抱合体が加えられ、４０〜６０分間にわたりインキュベートされた。穴はその後すすがれ、プレートは顕微鏡下で傾向を検査された。抗体力価は、典型（＋１）以上の強い蛍光を示す最高血清希釈の逆数として決定された。

ＣＲＣｏＶ血清中和アッセイのために、ＣＲＣｏＶ血清中和抗体力価がＨＲＴ−１８Ｇ細胞上で決定された。簡潔に言えば、ＨＲＴ−１８Ｇ細胞は９６穴組織培養プレートに適切な密度で播種され、ＣＯ₂インキュベータにおいて３６℃±１で３〜５日間にわたりインキュベートされた。穴における細胞単層が１００％の培養密度になると、穴は培地ですすがれ、トリプシンを補足された培地で１時間にわたりインキュベータ内で前処理された。それぞれの試験血清の２倍希釈液が調製され、５０〜４２２ＴＣＩＤ₅₀ＣＲＣｏＶとともに４０〜６０分間にわたり室温でインキュベートされた。それぞれの血清希釈液からのウイルス血清混合物は２つの穴に播種された。プレートは加湿ＣＯ₂インキュベータ（３〜５％ＣＯ₂）において３５〜３７℃で５〜７日間にわたりインキュベートされた。インキュベーションが完了すると、プレートは固定され、ＣＲＣｏＶ特異性ＦＩＴＣ抱合抗体で染色され、落射蛍光顕微鏡下で検査された。血清中和抗体力価は、穴の５０％においてウイルスを中和した最高血清希釈の逆数として決定された。

ＣＲＣｏＶ分離には、鼻スワッブ、組織、および肺洗浄試料が、ＨＲＴ−１８Ｇ細胞上のＣＲＣｏＶの存在を検定された。簡潔に言えば、試料は処理されＨＲＴ−１８Ｇ細胞が播種されたフラスコ内へ播種された。鼻の試料はＴ−２５フラスコに播種された。組織及び肺洗浄試料は、Ｔ−１５０フラスコに播種された。播種されたフラスコは一晩ＣＯ₂インキュベータにおいて３６℃±１でインキュベートされた。その後、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）がそれぞれのフラスコ（Ｔ−２５フラスコにつき８０μＬまたはＴ−１５０フラスコにつき５００μＬ）に加えられた。Ｔフラスコはおよそ７日間にわたりＣＯ₂インキュベータにおいて３６℃±１でインキュベートされた。その後試料が採取され、９６穴プレートにおけるＨＲＴ細胞内へ播種された。プレートの４つの穴は１２０μｌ／穴で播種され、追加的な４つの穴が３０μＬ／穴で播種された。当該９６穴プレートは５から７日間にわたりＣＯ₂インキュベータにおいて３６℃±１でインキュベートされ、アセトン系固定液で固定され、その後ＣＲＣｏＶ ＦＡ染色で染色された（全ての穴）。試料におけるウイルスの存在は、典型的な蛍光（ＣＲＣｏＶ ＦＡ陽性細胞）が顕微鏡下で観察された場合に宣言された。

ＣＲＣｏＶ抗原投与ウイルス滴定には、抗原投与物質の力価がＨＲＴ−１８Ｇ細胞上で決定された。簡潔に言えば、ＨＲＴ−１８Ｇ細胞は９６穴組織培養プレートに適切な密度で播種され、ＣＯ₂インキュベータにおいて３６℃±１で３〜５日間にわたりインキュベートされた。細胞単層が１００％の培養密度になると、穴は培地ですすがれ、トリプシンが捕捉された培地で１時間にわたりＣＯ₂インキュベータにおいて前処理された。１０倍に段階希釈された試験試料が、希釈につき６つの複写物において穴へと播種された。プレートは加湿ＣＯ₂インキュベータ（３〜５％ＣＯ₂）において５〜７日間にわたり３５〜３７℃でインキュベートされた。インキュベーション後、培地は廃棄され、細胞は２０〜４０分間にわたりアセトン系固定液を用いて室温でインキュベートされた。固定液は廃棄され、プレートは水で２回すすがれた。ＣＲＣｏＶ ＦＩＴＣ抱合抗体は穴に加えられ、４０〜６０分間にわたり室温でインキュベートされた。インキュベーションが完了すると、プレートが落射蛍光顕微鏡下でＣＲＣｏＶ感染細胞の存在を観察される前に、穴は水で２回すすがれた。感染の５０％終了点は、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法を使用して計算され、ウイルス力価はｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬと表された。

鼻スワッブ、肺組織および洗浄試料は、ボルデテラブロンキセプチカ、マイコプラズマ属種、ストレプトコッカスカニス、スタフィロコッカスインターメディウス、およびパスツレラｓｐの存在に関して標準の手順に従い評価された。

鼻腔、肺、および気管組織のスライドが準備され、委員会認可の病理学者により、病理組織的病変を評価された。

妥当な試験のための評価基準は、研究におけるすべての動物が（ｉ）０日目のウイルス分離によりＣＲＣｏＶを有さない、（ｉｉ）０日目にＣＲＣｏＶに血清陰性である、（ｉｉｉ）鼻スワッブからの細菌分離により０日目および３日目（ボルデテラ抗原投与前）にボルデテラを有しない、および（ｉｖ）ＭＡＴによって決定されるように抗体力価が０日目に≦１６を維持しており抗原投与前にボルデテラに感染し易い、という条件を満たさなければならない。

咳を含む呼吸器臨床徴候は、疾患の程度を判断するために使用される主要な評価基準であった。最近分離は補助的な第２の変数であった。

臨床観察（鼻汁、咳、くしゃみ、眼漏、吐き気、鬱状態および呼吸）の度数分布は、それぞれの時点および治療に対して計算された。動物が特定の臨床徴候（鼻汁、咳、くしゃみ、眼漏、鬱状態、吐き気および呼吸）を有した抗原投与後の観察期間のパーセンテージ、および、特定の臨床徴候（鼻汁、咳、くしゃみ、眼漏、鬱状態、吐き気および呼吸）を伴う抗原投与後の日数は、それぞれの動物に対して計算された。臨床徴候を伴った期間のパーセント、および、平均値、中央値、標準偏差、最小値および最大値を含むそれぞれの臨床徴候の期間の記述統計は、それぞれの治療に対して計算された。動物は、熱を有する（≧３９．５℃）または熱を有しない（＜３９．５℃）にそれぞれの日に分類された。熱あり／熱なしの度数分布は、それぞれの治療および時点に対し計算された。鼻スワッブからのＣＲＣｏＶ分離の存在または不在の度数分布は、それぞれの治療群および時点に対して計算された。動物が抗原投与後の鼻スワッブにおいて検出されたＣＲＣｏＶを有した日数（ウイルスが検出された第１日目からウイルスが検出された最終日まで）は、それぞれの動物に対して計算された。治療平均値、中央値、標準偏差、最小値および最大値が計算された。肺洗浄、肺、鼻腔および気管からのウイルス分離の存在／不在の度数分布はそれぞれの治療群に対して計算された。細菌分離（陽性／陰性）の度数分布はそれぞれの治療群および時点に対して計算された。それぞれの動物が、抗原投与後に最近分離を有したかどうかがさらに決定され、その度数分布がそれぞれの治療に対して計算された。気管、鼻腔、および左中央肺葉の病理組織点数のそれぞれの型の度数分布がそれぞれの治療群に対して計算された。その上、気管繊毛評価が、標準／組織学的に無関係（０および１）、または異常／組織学的に関係（２、３および４）にさらに分類され、この度数分布がそれぞれの治療群に対して計算された。

びまん性、離散性、および総肺病変が以下の式で計算された。

病変パーセント＝０．５３［（０．３５×右頭側葉）＋（０．１５×右中央葉）＋（０．４０×右尾側葉）＋（０．１０×附属葉）］＋０．４７［（０．３０×左頭側葉）＋（０．２５×左中央葉）＋（０．４５×左尾側葉）］

平均値、中央値、標準誤差、最小値および最大値を含む記述統計が、それぞれの治療および肺病変の型に対して計算された。肉眼的病変、変色および分泌の増加の存在の度数分布が、それぞれの治療群に対して計算された。治療幾何平均値、抗体力価の最小値および最大値は、それぞれの時点に対して計算された。ボルデテラの存在／不在の度数分布は、それぞれの治療群および時点に対して計算された。

結果．全てのイヌが、０日目（抗原投与前）に採取された血清試料から、間接蛍光法によりＣＲＣｏＶ抗体に陰性（＜４０ＩＦＡ力価）であり、血清中和アッセイによりＣＲＣｏＶ抗体に陰性（３ＳＮ力価）であると試験された。全てのイヌが０日目（抗原投与前）に採取された鼻スワッブからのウイルス分離により、ＣＲＣｏＶに陰性であると試験された。全てのイヌが、−２１日目および０日目（抗原投与前）に採取された血清試料からの微小凝集により、ボルデテラ抗体に陰性（＜１６）であると試験された。全てのイヌが、抗原投与前（０日目）に採取された鼻スワッブからボルデテラおよびパスツレラｓｐに陰性であると試験された。マイコプラズマ属種、スタフィロコッカスシュードインターメディウスおよびストレプトコッカスカニスは鼻スワッブから異なるレベルで０日目に分離された。（これらは０〜８０％の間で多様であり、Ｓ．シュードインターメディウスのパーセンテージは最高で５０〜８０％であった。）しかしながら、健康なイヌはしばしば気道上部における通常の細菌叢の一部としてこれらの微生物を含む。したがって、包含評価基準は満たされた。

抗原投与の間に採取されたＣＲＣｏＶ抗原投与試料上で実施された滴定は、室におけるイヌにつき１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀がエアロゾール化されたことを確認した。抗原投与播種の始めおよび終わりに実施されたプレートカウントは、室におけるイヌにつき、平均で５×１０⁸ＣＦＵボルデテラがエアロゾール化されたことを確認した。

Ｔ抗原投与後の耳内温度は、全ての治療群で通常（≦３９．４℃）であった。平均値、標準偏差、中央値、最小値および最大値は、それぞれの個々の臨床徴候（鼻汁、咳、くしゃみ、眼漏、吐き気、鬱状態および呼吸）に対して、治療群Ｔ０２（ボルデテラ）と治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶおよびボルデテラ）との間に差異があるかを決定するために計算された。治療群Ｔ０２のイヌ（ボルデテラ、平均値＝７．２）に比べ、治療群Ｔ０３のイヌの鼻汁を伴った期間のパーセントに増加があった（ＣＲＣｏＶおよびボルデテラ，平均値＝３８．３）。治療群Ｔ０２のイヌ（ボルデテラ、平均値＝９．６）に比べ、治療群Ｔ０３のイヌの眼漏を伴った期間のパーセントにも増加があった（ＣＲＣｏＶおよびボルデテラ、平均値＝２５．１）。

治療群Ｔ０１（偽薬、生理食塩水）、治療群Ｔ０２（ボルデテラ）、および治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶおよびボルデテラ）の全てのイヌが、３日目に採取された血清試料から、間接蛍光法によりＣＲＣｏＶ抗体に陰性（＜４０ＩＦＡ力価）であり、血清中和アッセイによりＣＲＣｏＶ抗体に陰性（３ＳＮ力価）であると試験された。治療群Ｔ０１（偽薬、生理食塩水）および治療群Ｔ０２（ボルデテラ）の全てのイヌが、２４日目に採取された血清試料から、間接蛍光法によりＣＲＣｏＶ抗体に陰性（＜４０ＩＦＡ力価）であり、血清中和アッセイによりＣＲＣｏＶ抗体に陰性（３ＳＮ力価）であると試験された。治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶおよびボルデテラ）の全てのイヌが、２４日目に採取された血清試料から、間接蛍光法によりＣＲＣｏＶ抗体に陽性（幾何平均ＩＦＡ力価＝３１５１．７）であり、血清中和アッセイによりＣＲＣｏＶ抗体に陽性（幾何平均ＳＮ力価＝３６１．８）であると試験された。

治療群Ｔ０１（偽薬、生理食塩水）、治療群Ｔ０２（ボルデテラ）、および治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶおよびボルデテラ）の全てのイヌが、３日目に採取された血清試料から、ＭＡＴによりボルデテラ抗体に陰性（≦８）であると試験された。治療群Ｔ０１（偽薬、生理食塩水）の全てのイヌが、２４日目に採取された血清試料から、ＭＡＴによりボルデテラ抗体に陰性（８）であると試験された。治療群Ｔ０２（ボルデテラ）のほとんどのイヌ（１０匹中８匹）、および治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶおよびボルデテラ）の全てのイヌが、２４日目に採取された血清試料から、ＭＡＴにより、ボルデテラ抗体（１６）を有した（Ｔ０２およびＴ０３の幾何平均ＭＡＴ力価＝１３．９）。

鼻スワッブからのＣＲＣｏＶウイルス分離の平均日数は、治療群Ｔ０１（偽薬、生理食塩水）で０、治療群Ｔ０２（ボルデテラ）で０、および、治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶおよびボルデテラ）で６であった。ＣＲＣｏＶは、２４日目の剖検で、肺洗浄、肺組織、鼻腔または気管から、いずれの治療群からも分離されなかった。

ボルデテラは、６、９、１３、１６、２０、２３および２４日目に治療群Ｔ０２（ボルデテラ）および治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶおよびボルデテラ）から採取された鼻スワッブから分離された。治療群Ｔ０１（偽薬、生理食塩水）の全てのイヌが、２４日目に採取された肺洗浄および肺組織から、ボルデテラ分離に陰性であると試験された。治療群Ｔ０２（ボルデテラ）および治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶおよびボルデテラ）の全てのイヌが、２４日目に採取された肺洗浄および肺組織から、ボルデテラに陽性であると試験された。マイコプラズマ属種、スタフィロコッカスシュードインターメディウスおよびストレプトコッカスカニスは、鼻スワッブから異なるレベルで２４日目に採取された。治療群Ｔ０１（偽薬、生理食塩水）、治療群Ｔ０２（ボルデテラ）および治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶおよびボルデテラ）の全てのイヌが、２４日目にパスツレラｓｐに陰性であると試験された。治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶおよびボルデテラ）の１匹のイヌが、肺洗浄から分離されたマイコプラズマ属種を有した。治療群Ｔ０１（偽薬、生理食塩水）、治療群Ｔ０２（ボルデテラ）、および治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶおよびボルデテラ）の全てのイヌが、２４日目の剖検で、肺洗浄および肺組織からパスツレラ属種，スタフィロコッカスシュードインターメディウス，およびストレプトコッカスカニスに陰性であると試験された。

ＣＲＣｏＶおよびボルデテラで抗原投与された動物（治療群Ｔ０３）は、ボルデテラのみで抗原投与された動物（治療群Ｔ０２）および生理食塩水（偽薬）動物（治療群Ｔ０１）に比べ、巨視的および微視的な肺病変におけるより高い発症率および重症度を有した。微視的な気管および鼻の病変は治療群Ｔ０２およびＴ０３において、類似する有病率および重症度を有した。２つの抗原投与を受けた動物において観察された肺病変の発生率および重症度は、ＣＲＣｏＶへの感染は犬がボルデテラ感染後に肺炎になる素因となるということを示唆した。しかしながら、これらのデータは、感染動物における臨床徴候の提示に対してと同様に、細菌およびウイルス分析に対しても関連付けられる必要がある。

結論．（ｉ）全てのイヌが健康でありボルデテラワクチン接種を受けていない、（ｉｉ）全てのイヌが抗原投与前にＣＲＣｏＶに対する抗体に陰性（＜４０ＩＦＡ力価）でＣＲＣｏＶに対する血清中和抗体に陰性（３ＳＮ力価）であり、（ｉｉｉ）全てのイヌが抗原投与前に鼻スワッブからＣＲＣｏＶ分離に陰性であり、（ｉｖ）全てのイヌが抗原投与前に鼻スワッブからボルデテラに対して低抗体力価（≦８ＭＡＴ力価）を有しボルデテラ分離を有さない、という点で、包含評価基準は満たされた。

（ｉ）ＣＲＣｏＶで抗原投与された全てのイヌが鼻スワッブ（２４日目）からＣＲＣｏＶウイルス分離に陽性であり、（ｉｉ）ボルデテラで抗原投与された全てのイヌが鼻スワッブ（９日目）から細菌の分離に陽性であったため、抗原投与は満足であると考えられた。

抗原投与後の耳内温度は、Ｔ０１（偽薬、生理食塩水）、Ｔ０２（ボルデテラ）およびＴ０３（ＣＲＣｏＶおよびボルデテラ）に関して通常（≦３９．４℃）であった。抗原投与後段階で評価された臨床徴候（鼻汁、咳、くしゃみ、眼漏、吐き気、鬱状態および呼吸）に関しては、鼻汁を伴った期間のパーセントについて、治療群Ｔ０２のイヌ（ボルデテラ、平均＝７．２）に比べ治療群Ｔ０３のイヌに（ＣＲＣｏＶおよびボルデテラ、平均＝３８．３）における増加が観察され、眼漏を伴った期間のパーセントについて、治療群Ｔ０２のイヌ（ボルデテラ、平均＝９．６）に比べ治療群Ｔ０３のイヌに（ＣＲＣｏＶおよびボルデテラ、平均＝２５．１）おける増加が観察された。他の臨床徴候（咳、くしゃみ、吐き気、鬱状態および呼吸）は、治療群Ｔ０２（ボルデテラ）を治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶおよびボルデテラ）に比べたとき差異があるようには見られなかった。

治療群Ｔ０２（ボルデテラ）およびＴ０３（ＣＲＣｏＶおよびボルデテラ）の全てのイヌが、本研究の最後（２４日目）に採取された肺洗浄および肺組織からボルデテラに陽性であると試験された。ＣＲＣｏＶは、本研究の最後（２４日目）に採取された治療群Ｔ０３（ＣＲＣｏＶおよびボルデテラ）の肺洗浄、肺組織、鼻腔または気管試料から分離されなかった。以前のインハウス研究は、ＣＲＣｏＶが抗原投与後の第１週目において肺洗浄および肺組織からより容易に分離されるということを実証した。治療群Ｔ０１（偽薬、生理食塩水）、Ｔ０２（ボルデテラ）およびＴ０３（ＣＲＣｏＶおよびボルデテラ）の全てのイヌが、本研究の最後（２４日目）に採取された肺洗浄および肺組織から、パスツレラ属種、スタフィロコッカスシュードインターメディウス、マイコプラズマ属種（治療群Ｔ０３の１匹のイヌを除く）およびストレプトコッカスカニスに陰性であると試験された。びまん性、離散性、および総肺硬化平均は、ＣＲＣｏＶおよびボルデテラで抗原投与された動物（治療群Ｔ０３）においてより高かった。これらの動物において観察された肺病変の発生率および重症度は、ＣＲＣｏＶへの感染はイヌがボルデテラ感染後に肺炎になる素因となるということを示唆する。

総合的に、鼻／眼漏および剖検のデータは、ＣＲＣｏＶへのイヌの前感染がボルデテラによる第２の感染において呼吸器疾患の発症率および重症度を増加することを示唆すると考えられる。

実施例３ ＣＲＣｏＶおよびボルデテラブロンキセプチカでの二重抗原投与に対するＣＲＣｏＶワクチンの有効性
全て一般健康状態が良い、６０匹のイヌが本研究に含まれる。全てのイヌがボルデテラワクチン接種を受けておらず、微小凝集試験（ＭＡＴ）によって決定された通り、ワクチン接種前（０日目）に、ボルデテラブロンキセプチカに対する低レベル抗体，（≦８ＭＡＴ力価）を有した。全ての動物はまた、ワクチン接種前（０日目）に細菌鼻スワッブ分離試験によって決定された通り、Ｂ．ブロンキセプチカを有しなかった。全てのイヌはさらに免疫蛍光抗体法（ＩＦＡ）によって決定された通り＜４０ＩＦＡ力価で、血清中和（ＳＮ力価≦１１）によって決定された通りと同様、０日目のワクチン接種前に、ＣＲＣｏＶに対する抗体に陰性であった。全てのイヌは、０日目のワクチン接種の前に鼻スワッブによりＣＲＣｏＶを有しないと確認された。

最大値に指定されたＣＲＣｏＶ分離株は本研究における抗原投与物質として使用された。ウイルス系統は、１０^7.1ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬの力価を有するＨＲＴ−１８Ｇ細胞株における第１の継代にて生成された。ボルデテラブロンキセプチカＢｉｈｒ ｃａｔ株もまた本研究における抗原投与物質として使用された。

動物は、一般健康状態を１日１回、到着から抗原投与まで（−７日目から４２日目）観察された。ワクチン接種の日（０日目および２１日目）に、動物は２回観察された（ワクチン接種の前後）。血清学のための血液試料は、研究上の全ての動物から０日目および２１日目（ワクチン接種前）、４２日目（抗原投与前）、および６５日目に採取された。鼻スワッブの３つの型がそれぞれのイヌから採取された。鼻スワッブが、ウイルス輸送培地（ＶＴＭ）管に、ＣＲＣｏＶウイルス分離のために、ワクチン接種前の０日目、抗原投与前の４２日目、および１日１回４３日目から５２日目に採取された。鼻スワッブはトリプトースリン酸ブロス（ＴＰＢ）を含有する管にボルデテラ分離のために採取された。スワッブは、ワクチン接種前の０日目、抗原投与前の４５日目、および抗原投与後に３週間にわたって週に２回、ならびに６５日目に採取された。鼻スワッブは、チャコールの無いＡｍｉｅｓ培地において細菌学検査のために抗原投与前の４２日目に採取された。耳内温度は、−１日目から始めて、０日目および２１日目、１日目から７日目、および２２日目から２８日目の、ワクチン接種前、ならびにワクチン接種の３〜６時間後に採取された。耳内温度は１日１回４０日目から６５日目に採取された。抗原投与の日（４２日目および４５日目）に、抗原投与前および抗原投与３〜６時間後の２つの採取が作られた。

注射部位領域に既存の病変がないことを確認するために、動物は０日目および２１日目のワクチン接種前に適切な肩の領域を触診された。動物は適切なワクチンを０日目および２１日目に表３に示した研究構想に従い投与された。ワクチンはそれぞれのイヌに、第１のワクチン接種は右肩領域に、第２のワクチン接種は左肩領域に、皮下投与された。ＣＲＣｏＶワクチンの効力は、ワクチン接種前にＥＬＩＳＡ試験によって決定された。動物はおよそ５時間にわたり０日目および２１日目のワクチン接種後、および１日１回１日目から７日目ならびに２２日目から２８日目に観察された。

４２日目に、ＣＲＣｏＶ抗原投与ウイルス系統は、イヌにつき１×１０⁶の標的抗原投与量を送達するためのウイルス懸濁液を調製するために、解凍され、適切に希釈された。抗原投与物質は抗原投与播種まで氷上に保持された。４５日目に、Ｂ．ブロンキセプチカＢｉｈｒ ｃａｔ株系統が抗原投与物質を調製するために使用された。抗原投与懸濁液調製の最終段階で、生物体濃度は、イヌ（Ｔ０１／Ｔ０２）につき１０³ＣＦＵ、イヌ（Ｔ０３／Ｔ０４）につき１０⁵ＣＦＵ、イヌ（Ｔ０５／Ｔ０６）につき１０⁷ＣＦＵの標的抗原投与量を提供するように調節された。抗原投与物質は抗原投与播種まで氷上に保持された。

４２日目に、全ての治療群のイヌはウイルスをエアロゾール化によってプレキシガラスの房において投与された。４５日目に、適切な治療群のイヌが指定されたレベルのＢ．ブロンキセプチカで、エアロゾール化により、プレキシガラスの房において抗原投与された。Ｔ０４抗原投与群に関して、１匹の動物が抗原投与前に研究から除外された。

動物は１日２回（午前および午後）、それぞれのセッションはおよそ３０分間で、４０、４１、および４２日目の抗原投与前に、呼吸器疾患の臨床徴候を観察された。臨床観察は１日２回（午前および午後）、それぞれのセッションはおよそ３０分間で、４２日目から６４日目まで実施された。４２日目および４５日目に、抗原投与前および抗原投与の３〜６時間後に観察が行われた。６５日目に１回のみ（午前）の観察が実施された。剖検が全ての動物において、６５日目に、研究評価の一部として実施された。剖検にて、完全肺は無菌的に除去され無菌ドレープ上に置かれた。肺葉は肉眼的に評価され、罹患肺の量のパーセンテージの推定が評価された。組織評価はＡＣＶＰ委員会認可の病理学者により実施された。罹患肺の量のパーセンテージを決定するために、それぞれの肺葉は、変色（色における変化）、虚脱の失敗、テクスチャの変化（堅固／硬変、弾力／弾性、硬質、捻髪音）を含むがこれらに限られない、肉眼変化による罹患組織のパーセンテージを点数化された。びまん性または離散性病変による病変のパーセンテージが推定された。気管が横切開され、管腔は肉眼病変を評価した。２つの型の組織試料（断片）が、気管及び鼻腔から、１つはウイルス分離のために、もう１つの断片は病理組織のために採取された。右頭側肺葉は、１つはウイルス分離に、１つは細菌試料に使用するために、２つの断片に分割された。全体左中央肺葉は腕神経叢にて無菌的に重症化され、病理組織のために採取された。全ての他の試料（ウイルス分離および細菌）が採取された後、葉は、ホルマリンの容器に入れられる前におよそ２０〜３０ｍＬの１０％緩衝ホルマリンで膨張させられた。

血清試料は、標準手順に従い、動物スクリーニングのためにＩＦＡによってＣＲＣｏＶ特異性抗体を、血清中和（ＳＮ）によって他の全ての試料（０、２１、４２、および６５日目）を滴定された。

スクリーニング血清試料はＩＦＡによりＣＲＣｏＶ抗体を滴定された。簡潔に言えば、ＨＲＴ−１８Ｇ細胞が９６穴プレートに播種され、穴につき５０〜２００の感染細胞を得るために最適量のＣＲＣｏＶに感染させた。感染プレートはアセトン系固定液で固定され、すすがれ、保管された。血清試料は直接抗原固定プレートにおいて２倍に段階希釈され、４０〜６０分間にわたりインキュベートされた。試験血清は廃棄され、プレートはすすがれ、ウサギ抗イヌＩｇＧ ＦＡ抱合が加えられ、４０〜６０分間にわたりインキュベートされた。穴はその後すすがれ、プレートは顕微鏡下で蛍光を検査された。抗体力価は、典型（＋１）以上の強い傾向を示す最高血清希釈の逆数として決定された。

ＣＲＣｏＶ血清中和抗体力価は、ＨＲＴ−１８Ｇ細胞上で決定された。簡潔に言えば、ＨＲＴ−１８Ｇ細胞は、９６穴組織培養プレートに適切な密度で播種され、ＣＯ₂インキュベータにおいて３６℃±１で３〜５日間にわたりインキュベートされた。穴における細胞単層が培養密度１００％になると、穴は培地ですすがれ、トリプシンが補足された培地で少なくとも１時間インキュベータにおいて前処理された。それぞれの試験血清の２倍希釈液が調製され、５０〜４２２ＴＣＩＤ₅₀ＣＲＣｏＶと４０〜６０分間にわたり室温でインキュベートされた。それぞれの血清希釈液からのウイルス血清混合物は２つの穴に播種された。プレートは加湿ＣＯ₂インキュベータ（３〜５％ＣＯ₂）において、３５〜３７℃で５〜７日間にわたりインキュベートされた。インキュベーションが完了すると、プレートは固定され、ＣＲＣｏＶ特異性ＦＩＴＣ抱合抗体で着色され、落射蛍光顕微鏡下で検査された。血清中和抗体力価は、穴の５０％においてウイルスを中和した最高血清希釈の逆数として決定された。Ｂ．ブロンキセプチカに対する凝集性抗体は、微粒子抗原（ミクロ）凝集試験（ＭＡＴ）によって、標準手順に従い決定された。簡潔に言えば、試験血清の２倍段階希釈、既知の陽性血清および陰性血清は、Ｖ底マイクロタイタープレートにおいて、０．０５％のツイーン２０を含有する通常生理食塩水を希釈剤として用いて作られた。血清試料は穴につき５０μＬで加えられた。５０μＬの量のＢ．ブロンキセプチカ抗原がそれぞれの穴に加えられ、６０秒間にわたりマイクロタイタープレートミキサーで撹拌された。当該プレートは３７±２℃で２時間にわたりインキュベートされ、その後プレートは２０〜４８時間にわたり２〜８℃で保管された。プレートは鏡台上で視覚的に読み取られた。力価は完全凝集を示す最高希釈の逆数として表された。鼻スワッブおよび組織はＨＲＴ−１８Ｇ細胞上のＣＲＣｏＶの存在を決定された。簡潔に言えば、試料は処理され、ＨＲＴ−１８Ｇ細胞で播種されたフラスコ内へ播種された。鼻の試料はＴ−２５フラスコに播種された。組織および肺洗浄試料はＴ−１５０フラスコに播種された。播種されたフラスコは一晩ＣＯ₂インキュベータにおいて３６℃±１でインキュベートされた。その後、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）がそれぞれのフラスコに加えられた（Ｔ−２５フラスコにつき８０μＬまたはＴ−１５０フラスコにつき５００μＬ）。フラスコはおよそ７日間にわたりＣＯ₂インキュベータにおいて３６℃±１でインキュベートされた。試料はその後採取され、９６穴プレートにおけるＨＲＴ細胞へ播種された。プレートの４つの穴は１２０μｌ／穴で播種され、追加的な４つの穴が３０μＬ／穴で播種された。９６穴プレートは５から７日間にわたり、ＣＯ₂インキュベータにおいて３６℃±１でインキュベートされ、アセトン系固定液で固定され、その後ＣＲＣｏＶ ＦＡ染色剤で染色された（全ての穴）。試料におけるウイルスの存在は、顕微鏡下で典型蛍光（ＣＲＣｏＶ ＦＡ陽性細胞）が観察された場合に言明された。

抗原投与物質の力価は、ＨＲＴ−１８Ｇ上で決定された。簡潔に言えば、ＨＲＴ−１８Ｇ細胞は９６穴組織培養プレートに適切な密度で播種され、ＣＯ₂インキュベータにおいて３６℃±１で３〜５日間にわたりインキュベートされた。細胞単層が１００％の培養密度になると、穴は培地ですすがれ、トリプシンが補足された培地で１時間にわたりＣＯ₂インキュベータにおいて前処理された。１０倍段階希釈された試験試料は穴に、希釈液につき６つの複製で播種された。プレートは５〜７日間にわたり、３５〜３７℃での加湿ＣＯ₂インキュベータ（３〜５％ＣＯ₂）でインキュベートされた。インキュベーション後、培地は廃棄され、細胞は２０〜４０分間にわたりアセトン系の固定液を用いて室温でインキュベートされた。固定液は廃棄され、プレートは水で２回すすがれた。ＣＲＣｏＶ ＦＩＴＣ抱合抗体は穴に加えられ、４０〜６０分間にわたり室温でインキュベートされた。インキュベーションが完了すると、プレートが落射蛍光顕微鏡下でＣＲＣｏＶ感染細胞の存在を観察される前に、穴は水で２回すすがれた。感染の５０％終了点は、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法を使用して計算され、ウイルス力価はｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬと表された。

鼻スワッブからのボルデテラブロンキセプチカ分離は標準手順に従い実施された。それぞれの試料はＢ．ブロンキセプチカを質的に（存在または不在）試験された。鼻スワッブおよび肺組織試料は、Ｂ．ブロンキセプチカ、マイコプラズマ属種、ストレプトコッカスカニス、スタフィロコッカスインターメディウス、およびパスツレラ属種の存在に関して、標準手順に従い評価された。鼻腔、肺および気管組織のスライドが準備され、病理組織的病変に関してＡＣＶＰ委員会認可の病理学者によって評価された。

動物が咳をし、鼻汁を有した抗原投与後の観察期間のパーセンテージは、咳および鼻汁を伴った抗原投与後の日数の持続期間と共に、それぞれの動物に対して計算された。観察期間および持続期間のアークサイン平方根変換パーセンテージは一般線形混合モデルで、それぞれの抗原投与量に対して別々に分析された（Ｔ０１対Ｔ０２，Ｔ０３対Ｔ０４，およびＴ０５対Ｔ０６）。モデルにおける母数効果は治療であり、変量効果は阻止および残留物であった。最小二自乗平均、標準誤差、および９０％信頼限界に加え、治療最小値および最大値が計算された。当該最小自乗平均、標準誤差および信頼限界は適切に逆変換された。鼻スワッブからのＣＲＣｏＶウイルス分離の存在または不在の度数分布はそれぞれの治療群および時点に対して計算された。動物が、抗原投与後の鼻スワッブにおいて検出されたＣＲＣｏＶウイルスを有する日数（ウイルス検出の１日目からウイルス検出の最終日まで）は、それぞれの動物に対して計算された。組織データからのウイルス分離の存在／不在の度数分布は、それぞれの治療群に対して計算された。スワッブからのＢ．ブロンキセプチカ分離の度数分布はそれぞれの治療に対して計算された。鼻スワッブからのＢ．ブロンキセプチカの度数分布はそれぞれの治療および時点に対して計算された。動物が抗原投与後の鼻スワッブにおいて検出された細菌を有する日数（ウイルス検出の１日目からウイルス検出の最終日まで）はそれぞれの動物に対して計算された。平均値、標準偏差、最小値および最大値を含む数の記述統計はそれぞれの治療に対して計算された。臨床観察（くしゃみ、眼漏、吐き気、鬱状態および呼吸）の度数分布はそれぞれの時点および治療に対して計算された。動物は、熱を有する（≧３９．５℃）または熱を有さない（＜３９．５℃）にそれぞれの日に分類された。熱あり／熱なしの度数分布はそれぞれの治療および時点に対して計算された。

びまん性、離散性および総肺病変が以下の式で計算された。

パーセント病変＝０．５３（（０．３５×右頭側葉）＋（０．１５×右中央葉）＋（０．４０×右尾側葉）＋（０．１０×附属葉））＋０．４７（（０．３０×左頭側葉）＋（０．２５×左中央葉）＋（０．４５×左尾側葉））
アークサイン平方根変換パーセンテージ病変は一般線形混合モデルで、それぞれの抗原投与量に対して別々に分析された（Ｔ０１対Ｔ０２，Ｔ０３対Ｔ０４、およびＴ０５対Ｔ０６）。モデルにおける母数効果は治療で、変量効果は阻止および残留物であった。最小二自乗平均、標準誤差、および９０％信頼限界に加え、治療最小値および最大値も計算された。最小二乗平均、標準誤差および信頼限界は逆変換された。肉眼的病変、変色および分泌増加の存在の度数分布は、それぞれの治療群に対して計算された。注射部位の観察（腫れおよび痛み）の度数分布はそれぞれの時点および治療に対して計算された。幾何平均、抗体力価の最小値および最大値を含む記述統計はそれぞれの治療群および時点に対して計算される。

結果．ワクチン接種後の痛みまたは熱（≧３９．５℃）はいずれのイヌにおいても報告されなかった。ワクチン接種群の大半（Ｔ０２、Ｔ０４、Ｔ０６）は、ワクチン接種の時点でひっかき傷を有したと報告された。注射による腫れがワクチン接種群のほとんどにおいて報告されたが、この腫れはイヌの大半において３日以内に解決した。３匹のイヌが第２のワクチン接種観察後の３〜６時間における過敏症反応を報告された。そのうち２匹のイヌが症状を逆行させるためにジフェンヒドラミンで治療された。

ＣＲＣｏＶワクチンはワクチン接種を受けたイヌにおいて第１の投与後に血清中和抗体反応を誘発し、活性免疫化を示唆した。幾何平均血清中和（ＳＮ）反応は第２のワクチン接種後に、生理食塩水対照群（Ｔ０１、Ｔ０３、Ｔ０４）における＜４に比べて、ワクチン接種群（Ｔ０２、Ｔ０４、Ｔ０６）においてＧＭＴ≧９５５に増加し、ワクチンの追加免疫効果を示唆した。生理食塩水対照（ＧＭＴ≦４４６）に比べ強い既往性のＳＮ反応（ＧＭＴ≧１１１４６）がワクチン接種群において抗原投与後（６５日目）に達成され、効果的な免疫記憶反応を示唆した。

ＣＲＣｏＶワクチンの有効性は二重抗原投与滴定に対して評価された。ＣＲＣｏＶ抗原投与量レベル（１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀／イヌで確認）は一定に保たれ、一方でＢ．ブロンキセプチカ抗原投与量は、Ｔ０１およびＴ０２群に対してはイヌにつき１０³ＣＦＵ（５．４×１０³で確認）の低い標的で、Ｔ０３およびＴ０４群に対しては中位標的で（４．２×１０⁵で確認）、およびＴ０４およびＴ０５群に対しては高い標的で（４．３×１０⁷で確認）、与えられ、最適臨床疾患の誘発を保証した。抗原投与後のＣＲＣｏＶおよびボルデテラ生物体分離データは、感染は３つの投与量レベルにて播種されたイヌにおいて達成されたことを示唆した。しかしながら、後述のように、イヌにおいて誘発された臨床疾患のレベルに基づくと、より少ないボルデテラ抗原投与量がワクチン有効性を評価する最適投与量と決定された。生理食塩水対照のイヌ（Ｔ０１、Ｔ０３、およびＴ０５）は、咳を含む、幅広い呼吸器臨床徴候を示した。ワクチン接種群（Ｔ０２）は、低投与量抗原投与群における対照（Ｔ０１）と比べると、咳を伴う持続期間及びパーセント期間における著しい減少を有した（それぞれｐ値０．０４７０および０．００３３）。対照群（Ｔ０１）における、持続期間の最小自乗（ＬＳ）平均および咳を伴うパーセント期間の逆変換ＬＳ平均は、ワクチン接種群（Ｔ０２）の５．３および２．４に比べ、それぞれ１０．８および１４．７であった。咳における減少は、ワクチン接種群と対照群との間で、抗原投与量が増えるに従い縮小し、過剰抗原投与によるものであると考えられる。咳のデータは、ＣＲＣｏＶワクチンが、最適抗原投与量群における二重抗原投与によって誘発された咳を減衰するために十分な免疫を誘発することができたということを明確に示唆した。鼻汁のデータは、低投与量抗原投与群におけるｐ値０．０２９９で、ワクチン接種群（Ｔ０２）が対照群（平均１７．４）と比べて著しく減少した鼻汁を伴ったパーセント期間（平均４．６）を有したことを示した。咳に関して上述のように、ワクチン接種群と対照群との間の鼻汁における減少は、過剰抗原投与量が達成されるに従い縮小された。鼻汁のデータは、最適抗原投与量群における、鼻汁に対するワクチンの有効性を明確に示唆する。生理食塩水対照群から４匹、ワクチン接種群から１匹（Ｔ０２、４４日目）で計５匹のイヌが、抗原投与後期間において≧３９．５℃の熱をそれぞれ１日有したと報告された。データが、低投与量の対照群と比べてワクチン接種群における熱を有する動物が少ないことを示す一方で、熱はＣＲＣｏＶ、ボルデテラまたは二重抗原投与の一貫した評価基準であるとは知られていない。したがって、ワクチンの有効性の判断には使用されない。

呼吸気管の肉眼剖検評価が、ＡＣＶＰ委員会認可の病理学者により、６５日目に実施された。検査は、主な剖検の発見が肺硬化であることを明らかにした。これは以前の二重抗原投与研究の発見と一貫するものである。したがって、肺硬化はワクチンの有効性を判断する評価基準として使用された。離散性（平均パーセント０．９対４．０２）および総（平均パーセント１．４４対７．７）肺硬化における著しい減少が低投与量抗原投与群における対照群と比較したとき、それぞれｐ値０．０４５７および０．０９３で、ワクチン接種群において観察された。臨床徴候と一貫して、ワクチンによってもたらされた減少は、抗原投与量が増加し、過剰抗原投与が達成されるに従い、縮小した。細菌学的検査結果によって確認されたように、肺組織における他の呼吸器病原体による病変は無かったということ、すなわち、報告された肺病変は特異的に二重抗原投与の結果によるものであるということに注目すべきである。データは、ウイルスへの先行感染が自然免疫防御に衝撃を与えることでイヌを罹患し易い状態にし、より侵襲的なウイルス性感染をもたらすということを示唆する。イヌ呼吸器疾患複合体（ＣＩＲＤ）を患うイヌ、またはウシ呼吸器疾患複合体（ＢＲＤＣ）を患うウシ、およびおそらく他の動物種における肺炎の発達をもたらす分野において頻発するウイルス細菌感染の典型的な型。本研究において得られたデータは、当該ワクチンが、最適抗原投与量の対照群に比べ、ワクチン接種を受けたイヌにおける二重抗原投与によって引き起こされる気管支肺炎の発症を減少することによって、イヌを保護することができるということを示す。

巨視的および微視的病理学的分析に基づき、ＣＲＣｏＶでのワクチン接種は、１０³ＣＦＵのＢ．ブロンキセプチカおよび１０⁶ＴＣＩＤ₅₀のＣＲＣｏＶでの制御二重鼻腔内抗原投与によって引き起こされた気管支肺炎の発症率および重症度を減少させることにより、明らかにイヌを保護した。Ｂ．ブロンキセプチカでの抗原投与量が１０⁵ＣＦＵ以上に増加すると、恐らく自然および適応免疫反応の圧倒により、保護効果が減少する。さらに、呼吸器臨床徴候における減少と深く関係した病理学的発見が、ワクチン接種を受けたイヌにおいて報告された。

予想された通り、ウイルス感染の急速なヒットエンドランの性質により、６５日目（ＣＲＣｏＶ抗原投与２３日後）に組織から分離されたウイルスは無かった。ワクチンは、生理食塩水対照群（Ｔ０１）と比べ、ワクチン接種群（Ｔ０２）における鼻汁の持続期間を減少することによってイヌを保護し、ワクチンが最適抗原投与量群において感染を減少する能力を示した。

要約すると、本研究から得られた臨床徴候（咳、鼻汁）および肺病変（硬化、病理組織）データは、二重ＣＲＣｏＶ−Ｂ．ブロンキセプチカ抗原投与に対して、単価ＣＲＣｏＶワクチンから与えられる保護を明解に実証する。これらのデータは、単価ＣＲＣｏＶワクチンが、二重ＣＲＣｏＶ−Ｂ．ブロンキセプチカ抗原投与によって引き起こされる呼吸器疾患（咳、鼻汁）および肺炎（肺硬化）を減少させるという結果をもたらし、ワクチン接種を受けたイヌにおける防御免疫を誘発することができたことを総合的に示す。したがって、データは、ＣＲＣｏＶ初期感染、およびそれに続く細菌性感染後のイヌの呼吸器疾患の減少におけるＣＲＣｏＶワクチンの有用性の証拠を提供する。

Claims (12)

1. イヌにおける細菌性疾患を治療する方法であって、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）を含む組成物を前記イヌに投与することを含む、方法。
2. 前記細菌性疾患がボルデテラブロンキセプチカによって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
3. 前記組成物が、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
4. 前記組成物が１つ以上の追加的免疫原をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記１つ以上の追加的免疫原が、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）、イヌアデノウイルス−２（ＣＡＶ−２）、およびイヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）から成る群から選択される、請求項４に記載の方法。
6. 前記１つ以上の追加的免疫原が、イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、腸内イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、イヌアデノウイルス、レプトスピラ血清型、特に、イヌレプトスピラ、レプトスピラグリポチフォサ、黄疸出血性レプトスピラ、レプトスピラポモナ、およびレプトスピラブラチスラバ、イヌヘルペスウイルス、イヌニューモウイルス、リーシュマニア生物体、ボレリア種（ｓｐｐ．）、マイコプラズマ種、狂犬病、エーリキアカニス、ボルデテラブロンキセプチカ、およびそれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択される、請求項４に記載の方法。
7. 前記組成物が本質的にＣＲＣｏＶから成り、かつ追加的免疫原を有さない、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記組成物が少なくとも６ヶ月の細菌性疾患に対する有効性の持続期間を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 細菌性感染によって引き起こされるイヌにおけるイヌ呼吸器疾患から保護する方法であって、前記イヌにイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）を投与することを含む、方法。
10. 混合ウイルス性および細菌性感染によって引き起こされるイヌにおける多因子イヌ呼吸器疾患から保護する方法であって、前記イヌにイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）を投与することを含む、方法。
11. イヌにおける細菌性抗原を含む組成物の免疫原性を増加させる方法であって、前記イヌにイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）を同時投与することを含む、方法。
12. 前記細菌性抗原がボルデテラブロンキセプチカ由来のものである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。