JP2003528925A - 低温適応型ウマインフルエンザウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、実験的に生成された低温適応型ウマインフルエンザウイルス、およびこのようなウマインフルエンザウイルスの少なくとも１つのゲノムセグメントを含む再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルスを提供する（ここで、このウマインフルエンザウイルスゲノムセグメントは、低温適応型ウマインフルエンザウイルスの少なくとも１つの同定された表現型（例えば、低温適応、温度感受性、優性干渉、または弱毒化）を与える）。このようなウイルスは治療組成物中に処方されてインフルエンザＡ型ウイルスにより引き起こされる疾患から動物を防御し、特に、ウマインフルエンザウイルスからウマを防御する。本発明はまた、特許請求の範囲に記載の治療組成物を用いてインフルエンザＡ型ウイルスまたは他の感染因子により引き起こされる疾患から動物を防御する方法を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、実験的に作製された低温適応型ウマインフルエンザに関し、そして
、特に、弱毒化、優性干渉（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）ま
たは温度感受性のようなさらなる表現型を有する低温適応型ウマインフルエンザ
に関する。本発明はまた、このようなウマインフルエンザウイルスからの少なく
とも１個のゲノムセグメントを含む再組合わせインフルエンザＡ型ウイルスを包
含し、その結果、この再組み合わせウイルスは、供与体であるウマインフルエン
ザウイルスの特定の表現型を含む。本発明はさらに、本発明の低温適応型ウマイ
ンフルエンザウイルスの特定の同定表現型を含む、遺伝子操作されたウマインフ
ルエンザウイルス（逆方向遺伝学を通じて産生される）を含む。本発明はまた、
インフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患から動物を防御するために
、治療組成物においてこれらのウイルスを使用することに関する。

【０００２】 （発明の背景） ウマインフルエンザウイルスは、１９５６年頃からウマにおける主要な呼吸器
系の病原体として認識されていた。ウマインフルエンザウイルスによって引き起
こされる疾患症状は重篤であり得、かつ引き続いてしばしば二次的細菌感染を引
き起こす。２つのサブタイプのウマインフルエンザウイルスが認識されている。
即ち、それらは、サブタイプ１（原型はＡ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／１／
５６（Ｈ７Ｎ７）である）およびサブタイプ２（原型はＡ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｍｉ
ａｍｉ／１／６３（Ｈ３Ｎ８）である）である。現在、優勢なウイルスのサブタ
イプは、サブタイプ２であり、これはさらに、近年ユーラシア大陸および北米大
陸の単離株の中でも分かれている。

【０００３】 ウマインフルエンザに対して現在特許化されたワクチンは、不活化（死滅）ウ
イルスワクチンである。このワクチンは、ウマに対して、あるとしても、最小限
の防御しか提供せず、そして所望されない副作用（例えば、注射部位における炎
症反応）を発生し得る。例えば、Ｍｕｍｆｏｒｄ，１９８７，Ｅｑｕｉｎｅ Ｉ
ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ＩＶ、２０７〜２１７およびＭｕｍｆｏ
ｒｄら，１９９３，Ｖａｃｃｉｎｅ １１，１１７２〜１１７４を参照のこと。
さらに、現在の治療様式は、幼若な仔馬にて使用することができない。なぜなら
この治療様式は、先天性免疫を抑えることができず、そしてより幼若な動物では
寛容を誘導し得るからである。疾患のこの重篤さに基づいて、ウマインフルエン
ザウイルス疾患からウマを防御するための安全かつ有効な治療組成物が未だに必
要である。

【０００４】 低温適応型ヒトインフルエンザウイルスを含む治療組成物の産生は、例えば，
Ｍａａｓｓａｂら、１９６０、Ｎａｔｕｒｅ ７、６１２〜６１４およびＭａａ
ｓｓａｂら、１９６９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０２、７２８〜７３２に記載さ
れている。さらに、これらの研究者は、低温適応型ヒトインフルエンザ（即ち、
通常の温度よりも低い温度での増殖に適応しているウイルス）が、このウイルス
が温度感受性である表現型を有する傾向にあること；つまり、このウイルスは野
生型ウイルスが増殖および複製する温度より高い、特定の非許容温度では十分に
増殖しないことを記載した。種々の低温適応型ヒトインフルエンザＡ型ウイルス
（既存の低温適応型ヒトインフルエンザＡ型ウイルスと再組み合わせすることに
よって産生される）は、ワクチン接種された個体において良好な免疫応答を誘発
することが示され、そして、特定の生の弱毒化低温適応型再組み合わせヒトイン
フルエンザＡ型ウイルスは、野生型ウイルスでのチャレンジに対してヒトを防御
することが証明された。例えば、Ｃｌｅｍｅｎｔｓら、１９８６、Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３、７３〜７６を参照のこと。Ｙｏｕｎｇｎｅｒらに
よる、米国特許第５，１４９，５３１号（１９９２年９月２２日発行）において
、本発明の発明者らはさらに、特定の再組み合わせ低温適応型ヒトインフルエン
ザＡ型ウイルスがまた優性干渉の表現型を有する（即ち、これらのウイルスは対
応する親の野生型株および異種のインフルエンザＡの増殖を阻害する）ことを証
明した。

【０００５】 Ｃｏｇｇｉｎｓらによる米国特許第４，６８３，１３７号（１９８７年７月２
８日発行）およびＣａｍｐｂｅｌｌらによる米国特許第４，６９３，８９３号（
１９８７年９月１５日発行）は、野生型ウマインフルエンザと弱毒化低温適応型
ヒトインフルエンザＡ型ウイルスとの再組み合わせによって産生された弱毒化治
療組成物を開示する。これらの治療組成物は、概してウマにおいて安全かつ有効
であるようだが、これらは、ヒトおよびウマのインフルエンザ遺伝子の両者を含
むウイルスを環境中に持ち込むというかなりの危険性を有する。

【０００６】 （発明の要旨） 本発明は、実験的に生産された低温適応型ウマインフルエンザウイルスと、ウ
マウイルスの少なくとも１個のゲノムセグメントを含む再組み合わせインフルエ
ンザＡ（ウマインフルエンザウイルスのゲノムセグメントが、再組み合わせウイ
ルスに対して低温適応型ウマウイルスの少なくとも１個の同定表現型を付与する
ように、低温適応によって作製された）と、逆方向遺伝学を通じて産生された、
遺伝子操作されたウマインフルエンザウイルス（これは、低温適応型ウマインフ
ルエンザウイルスの少なくとも１つの同定表現型を含む）とを提供する。同定表
現型は、低温適応、温度感受性、優性干渉および弱毒化を含む。本発明はさらに
、インフルエンザＡ型ウイルスによって引き起こされる疾患に対して動物を防御
するための治療組成物を提供する。ここで、この治療組成物は、本発明の低温適
応型ウマインフルエンザウイルス、再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルス、
または遺伝子操作されたウマインフルエンザを含む。このような治療組成物の投
与を含む、インフルエンザＡによって引き起こされる疾患から動物を防御する方
法もまた提供される。低温適応型ウマインフルエンザウイルスを産生するための
方法、および低温適応型ウマインフルエンザウイルスの少なくとも１個のゲノム
セグメントを含む再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルスを産生する方法もま
た提供される。ここでそのウマインフルエンザのゲノムセグメントは、再組み合
わせウイルスに対して低温適応型ウマインフルエンザウイルスの少なくとも１個
の同定表現型を付与する。

【０００７】 低温適応型ウマインフルエンザウイルスは、約２６℃から約３０℃の範囲の温
度で胚含有性鶏卵において複製するウイルスである。好ましくは、本発明の低温
適応型ウマインフルエンザウイルス、再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルス
、または遺伝子操作されたウマインフルエンザは、健常な動物において疾患を引
き起こさないように弱毒化される。

【０００８】 １つの実施形態において、本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイルス、
再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルス、または遺伝子操作されたウマインフ
ルエンザはまた、温度感受性であり、その結果、このウイルスは、約２６℃から
約３０℃の範囲の温度で胚含性鶏卵において複製し、約３４℃の許容温度で組織
培養細胞においてプラークを形成するが、約３９℃の非許容温度では組織培養細
胞においてプラークを形成しない。

【０００９】 １つの実施形態において、このような温度感受性のウイルスは、２つの変異を
含む：約３９℃の温度でプラーク形成を阻害する第１の変異。この変異は、ウイ
ルス性核タンパク質遺伝子をコードするゲノムセグメントと共分離し（ｃｏ−ｓ
ｅｇｒｅｇａｔｉｎｇ）する；および約３９℃の温度でウイルスタンパク質合成
全てを阻害する第２の変異。

【００１０】 別の実施形態において、本発明の低温適応型、温度感受性ウマインフルエンザ
ウイルスは、約２６℃から約３０℃の範囲の温度で胚含有性鶏卵で複製し、約３
４℃の許容温度で組織培養細胞においてプラークを形成するが、約３７℃の非許
容温度で組織培養細胞においてプラークを形成せず、後期ウイルス性タンパク質
も発現しない。

【００１１】 代表的に、本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイルスは、野生型ウマイ
ンフルエンザウイルスを１回以上継代し、次に低下した温度で安定に増殖および
複製するウイルスを選択することによって産生される。こうして作製された低温
適応型ウマインフルエンザウイルスは、特定の実施形態において、優性干渉表現
型（即ち、この低温適応型ウマウイルスが、親株のウマインフルエンザウイルス
または異種の野生型インフルエンザＡ型ウイルスと同時に感染すると、これらの
ウイルスの増殖を阻害する表現型）を含む。

【００１２】 本発明の低温適応型ウマインフルエンザの例としては、受託番号ＡＴＣＣ Ｖ
Ｒ２６２５により同定されるＥＩＶ−Ｐ８２１；受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ２６２
４により同定されるＥＩＶ−Ｐ８２４；受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ２６２７により
同定されるＥＩＶ−ＭＳＶ＋５；およびこれらのウイルスの子孫が挙げられる。

【００１３】 本発明の治療組成物は、本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイルス、再
組み合わせインフルエンザＡ型ウイルスまたは遺伝子操作されたウマインフルエ
ンザウイルスの約１０^５ＴＣＩＤ_５０単位〜約１０^８ＴＣＩＤ_５０単位、好まし
くは約２×１０^６ＴＣＩＤ_５０単位を含む。

【００１４】 本発明はまた、インフルエンザＡ型ウイルスによって引き起こされる疾患から
動物を防御する方法を包含し、その方法は、本発明の低温適応型インフルエンザ
ウイルス、再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルスまたは遺伝子操作されたウ
マインフルエンザウイルスを含む治療組成物を動物に投与する工程を包含する。

【００１５】 呼吸器系疾患について動物を治療する方法もまた提供され、その方法は本発明
の治療組成物を投与することを含む。理論によって束縛されることなく、本発明
の治療組成物の投与は、ウマインフルエンザウイルスまたは他の感染性因子に感
染した動物において、呼吸器系疾患の非特異的な干渉を示すと考えられる。この
ような感染性因子の例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：直
接的または間接的のいずれでも呼吸器系疾患を導く、任意のウイルスまたは細菌
。本発明は、呼吸器系疾患を呈する動物を、本発明の低温適応型ウマインフルエ
ンザウイルス、再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルスまたは遺伝子操作され
たウマインフルエンザウイルスを含む治療組成物を投与することによって処置す
る方法を提供する。本発明はさらに、本発明の低温適応型インフルエンザウイル
ス、再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルスまたは遺伝子操作されたウマイン
フルエンザウイルスを含む治療組成物を投与することによって、ウイルス感染お
よび／または細菌感染によって明らかに引き起こされたような幼若動物における
鼻汁を減じる方法を提供する。防御するべき好ましい動物としては、ウマ科（ｅ
ｑｕｉｄｓ）（ウマおよびポニーが特に好ましい）が挙げられる。

【００１６】 本発明のさらに別の実施形態は、低温適応型インフルエンザウイルスを産生す
る方法である。この方法は、野生型ウマインフルエンザウイルスを継代する工程
；低下した温度において増殖するウイルスを選択する工程を包含する。１つの実
施形態において、この方法は、段階的に温度を下げながら、継代工程および選択
工程を１回以上反復する工程を包含する。ウマインフルエンザウイルスの継代は
、好ましくは、胚含有性鶏卵中で行われる。

【００１７】 別の実施形態は、本発明の供与体である低温適応型ウマインフルエンザウイル
スのゲノムセグメントと、受容体であるインフルエンザＡ型ウイルスのゲノムセ
グメントとの遺伝子再組み合わせを通じて、再組み合わせインフルエンザＡ型ウ
イルスを産生する方法である。本発明の再組み合わせインフルエンザＡ型ウイル
スは、以下の工程を包含する方法によって産生される；（ａ）供与体である低温
適応型ウマインフルエンザウイルスのゲノムセグメントと受容体であるインフル
エンザＡ型ウイルスのゲノムセグメントとを混合する工程、および（ｂ）供与体
であるウマインフルエンザウイルスの同定表現型を少なくとも１個含むウイルス
を選択する工程。同定表現型としては、低温適応、温度感受性、優性干渉および
弱毒化が挙げられる。好ましくは、このような再組み合わせウイルスは、供与体
ウイルスの弱毒化表現型を少なくとも含む。代表的な再組み合わせウイルスは、
受容体ウイルスの抗原性を有する。即ち、それは、受容体ウイルスの表現型であ
る血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を保持している。

【００１８】 本発明は、本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイルスまたは再組み合わ
せインフルエンザＡ型ウイルスを繁殖させる方法を提供する。これらの方法は、
胚含有性鶏卵または組織培養細胞中での繁殖を包含する。

【００１９】 （発明の詳細な説明） 本発明は、本明細書において開示される特定の規定された表現型を含む、実験
的に作製された低温適応型ウマインフルエンザウイルスを提供する。用語「ある
」実体とは、その実体の１以上を言及することに注意しなければならない；例え
ば、「ある低温適応型ウマンフルエンザウイルス」とは、１以上の低温適応型ウ
マインフルエンザ含み得る。この様に、用語「ある」、「１以上」および「少な
くとも１個」は、本明細書において相互に交換可能に用いられ得る。用語「包含
する」、「含む」および「有する」は相互に交換可能に用いられ得ることにも注
意しなければならない。さらに、用語「〜からなる群から選択された」は、その
群中にある１以上の項目（それらの組み合わせを含む）をいう。

【００２０】 本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイルスは、研究室において作製され
たウイルスであり、そのために天然に存在するようなウイルスではない。本発明
はまた、このような低温適応型ウマインフルエンザウイルスの同定された表現型
を有するウイルスを含むので、天然に存在するウイルスの混合物から単離された
（即ち、その自然環境から取り出されるが、特許請求される表現型を有する）ウ
マインフルエンザウイルスは、本発明に含まれ得る。本発明の低温適応型ウマイ
ンフルエンザウイルスは、純度に関していかなる特定のレベルも要求しない。例
えば、胚含有性鶏卵中で増殖された低温適応型ウマウイルスは、尿膜腔液（ＡＦ
）との混合物であり得、そして培養組織細胞で増殖した低温適応型ウマインフル
エンザウイルスは、破壊された細胞および組織培養の培養液との混合物であり得
る。

【００２１】 本明細書中で使用される場合、「ウマインフルエンザウイルス」は、ウマ科（
例えば、ウマまたはポニー）に感染し、そして増殖するインフルエンザウイルス
である。本明細書で使用される場合、ウイルスの「増殖」は、ウイルスが許容的
な宿主細胞においてそれ自体を再生または「複製」する能力を意味する。このよ
うに、用語「ウイルスの増殖」および「ウイルスの複製」は、本明細書中で相互
に交換可能に用いられ得る。特定の宿主細胞におけるウイルスの増殖または複製
は、ウイルス学の分野の当業者に周知の標準的な方法により証明および測定され
得る。例えば、感染性ウイルスを含むサンプル（例えば、感染したウマからの鼻
咽頭分泌物に含有される）は、組織培養細胞において細胞障害効果（ＣＰＥ）（
例えば、ウイルス性プラーク）を引き起こす能力を試験される。感染性ウイルス
はまた、胚含有性鶏卵の尿膜腔にサンプルを接種し、次に、こうして接種された
卵のＡＦを、ＡＦ中のインフルエンザウイルス性血球凝集（ＨＡ）タンパク質の
存在により、赤血球を凝集する（即ち、血球凝集を引き起こす）その能力に関し
て試験することによって検出され得る。

【００２２】 天然に存在する、即ち、野生型のウマインフルエンザウイルスは、約３４℃〜
約３９℃の温度において十分に複製する。例えば、野生型ウマインフルエンザウ
イルスは、約３４℃の温度で胚含有性鶏卵において複製し、そして約３４℃〜約
３９℃の温度において組織培養細胞中で複製する。本明細書中に使用される場合
、「低温適応型」ウマインフルエンザウイルスは、ウマインフルエンザウイルス
の至適増殖温度よりも低い温度において増殖することに適応したウマインフルエ
ンザウイルスである。本発明の低温適応型ウマインフルエンザの一例は、約３０
℃の温度において胚含有性鶏卵中で複製するウイルスである。本発明の好ましい
低温適応型ウマインフルエンザウイルスは、約２８℃の温度において胚含有性鶏
卵中で複製する。本発明の別の好ましい低温適応型ウマインフルエンザは、約２
６℃の温度で胚含有性鶏卵中で複製する。一般的に、本発明の好ましい低温適応
型ウマインフルエンザウイルスは、胚含有性鶏卵中で約２６℃〜約３０℃の範囲
内の温度（即ち、野生型ウイルスが不充分に増殖するかまたは全く増殖しない温
度範囲）において複製する。この温度範囲内で複製するこの様なウイルスの能力
は、より高温またはより低温においても複製するその能力を除外しないことに注
意すべきである。例えば、１つの実施形態は、約２６℃の温度において胚含有性
鶏卵中で複製する低温適応型インフルエンザウイルスであるが、それは、約３４
℃の温度で組織培養細胞においてもまた複製する。野生型ウマインフルエンザウ
イルスと同様に、本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイルスは、一般的に
組織培養細胞（例えば、約３４℃の温度におけるＭａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎
臓細胞（ＭＤＣＫ））中でプラークを形成する。本発明の低温適応型ウマインフ
ルエンザウイルスに関する適切で好ましい例は、本明細書中に開示されている。

【００２３】 本発明の１つの実施形態は、野生型ウマインフルエンザウイルスの継代および
引き続き低下した温度において増殖するウイルスを選択することを包含する方法
によって生産される低温適応型ウマインフルエンザウイルスである。本発明の低
温適応型ウマインフルエンザウイルスは、例えば、段階的に低下する温度におい
て胚含有性鶏卵中で連続的に野生型ウマインフルエンザウイルスを継代し、従っ
て、低下した温度において安定的に複製するウイルス混合物の特定メンバーを選
択することによって生産され得る。継代手順の一例は、実施例の節において詳細
に開示される。継代手順の間に、１以上の変異は、インフルエンザゲノムを含有
する特定の一本鎖ＲＮＡセグメントに現われ、その変異は遺伝子型（即ち、これ
らのＲＮＡセグメントの一次ヌクレオチド配列）を変える。本明細書中で使用す
る場合、「変異」とは、インフルエンザウイルスゲノムを構築する任意の所定の
ＲＮＡセグメントの一次ヌクレオチド配列の変更である。変異の例としては、１
以上のヌクレオチドの置換、１以上のヌクレオチドの欠失、１以上のヌクレオチ
ドの挿入または２以上のヌクレオチドストレッチの逆位が挙げられる。ウイルス
混合物の中から、低温で安定して複製するメンバーを選択することによって、低
温適応表現型を有するウイルスが選択される。本明細書で使用する場合、「表現
型」とは、細胞またはウイルスのような生物学的な実体の観察可能または測定可
能な特徴である。ここで、観察される特徴は、生物学的な実体の特異的な遺伝学
的構成、即ち特定の遺伝子型に帰因する。この様に、低温適応型の表現型は、ウ
イルスゲノムの１以上の変異の結果である。本明細書中で使用する場合、用語「
変異」、「ゲノム」、「遺伝子型」、または「表現型」は、それぞれ、１以上ま
たは少なくとも１個の変異、ゲノム、遺伝子型、または表現型をいう。

【００２４】 低温適応型ウマインフルエンザウイルスにおいて観察し得るさらなる表現型が
発生し得、そして一般には、このようなウイルスのゲノムにおける１以上のさら
なる変異の結果である。例えば、本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイル
スは、さらに弱毒化され得、優性干渉を示し得、および／または温度感受性であ
り得る。

【００２５】 １つの実施形態において、本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイルスは
、弱毒化によって特徴付けられる表現型を有する。低温適応型ウマインフルエン
ザウイルスは、ウマインフルエンザウイルスに感受性のある動物にこのウイルス
を投与すると、野生型ウマインフルエンザウイルスに感染した動物において観察
される臨床的徴候と比較して、このウマインフルエンザウイルスに感受性のある
動物において臨床的徴候の減少を生じるかまたは臨床的徴候を生じない場合、「
弱毒化」されている。例えば、野生型ウマインフルエンザウイルスに感染した動
物は、発熱、くしゃみ、咳、機能低下（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、および鼻汁を
呈する。対照的に、本発明の弱毒化低温適応型ウマインフルエンザウイルスを投
与された動物は、最小限の臨床的疾患徴候を呈するか、または全く臨床的疾患徴
候を呈さない（即ち、検出不可）。

【００２６】 別の実施形態において、本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイルスは、
温度感受性表現型を含む。本明細書で用いられる場合、温度感受性低温適応型ウ
マインフルエンザウイルスは、低下した温度で複製するが、野生型ウイルスが複
製およびプラークを形成する、より高温の特定の増殖温度において組織培養細胞
中でもはや複製せず、プラークも形成しない。理論によって束縛はされないが、
温度感受性の表現型を有するウマインフルエンザウイルスの複製は、上部気道の
低温通過部に主に限定され、そしてウイルスが疾患徴候をより引き起こし易い下
部気道においては効率的に複製しない。温度感受性ウイルスが増殖する温度は、
本明細書中、この温度感受性ウイルスについての「許容温度」といわれ、そして
、この温度感受性ウイルスは増殖しないが、対応する野生型ウイルスが増殖する
より高い温度は、本明細書中、この温度感受性ウイルスについての「非許容温度
」といわれる。例えば、本発明の特定の温度感受性の低温適応型ウマインフルエ
ンザウイルスは、約３０℃以下（好ましくは約２８℃または約２６℃）の温度に
おいて胚含有性鶏卵中で複製し、そして約３４℃の許容温度において組織培養細
胞中でプラークを形成するが、約３９℃の非許容温度において組織培養細胞中で
プラークを形成しない。本発明の他の温度感受性低温適応型ウマインフルエンザ
ウイルスは、約３０℃以下（好ましくは約２８℃または約２６℃）の温度におい
て胚含有性鶏卵中で複製し、そして約３４℃の許容温度において組織培養細胞中
でプラークを形成するが、約３７℃の非許容温度においては組織培養細胞中でプ
ラークを形成しない。

【００２７】 本発明の特定の低温適応型ウマインフルエンザウイルスは、優性干渉の表現型
を有する；即ち、これらのウイルスは、別のインフルエンザＡ型ウイルスととも
に細胞に同時感染した場合、感染を支配し、それにより他のウイルスの増殖を害
する。例えば、優性干渉である表現型を有する本発明の低温適応型ウマインフル
エンザウイルスが、野生型（親型）ウマインフルエンザウイルス（Ａ／ｅｑｕｉ
ｎｅ／Ｋｅｎｔｕｃｋｙ／１／９１（Ｈ３Ｎ８））とともにＭＤＣＫ細胞に同時
感染した場合、親ウイルスの増殖は害される。従って、有毒インフルエンザウイ
ルス（即ち、疾患徴候を引き起こすインフルエンザウイルス）に最近曝された、
またはまもなく曝される動物において、この動物の上部気道へ優性干渉の表現型
を有する低温適応型ウマインフルエンザウイルスを含む治療組成物を投与するこ
とにより、有毒ウイルスの増殖が害され、それにより有毒ウイルスへの免疫応答
がない場合ですら、その動物において疾患が緩和または低減される。

【００２８】 温度感受性の表現型を有する低温適応型ウマインフルエンザの優性干渉は、標
準的なウイルス学の方法によって測定され得る。例えば、ＭＤＣＫ細胞の別々の
単層を、（ａ）有毒野生型インフルエンザＡ型ウイルス、（ｂ）温度感受性の低
温適応型ウマインフルエンザウイルスおよび（ｃ）同時感染で両ウイルスに感染
させ得る（全ての感染は、１細胞当たり約２のプラーク形成単位（ｐｆｕ）の感
染多重度（ＭＯＩ）で行う）。感染後、種々の感染した細胞からのウイルスの収
量は、低温適応型ウマインフルエンザウイルスについての許容温度および低温適
応型ウマインフルエンザウイルスについての非許容温度で行われる二連のプラー
クアッセイにより測定される。温度感受性表現型を有する低温適応型ウマインフ
ルエンザウイルスは、その非許容温度でプラークを形成することができないが、
他方、野生型ウイルスは、許容温度でも非許容温度でもプラークを形成できる。
従って、低温適応型ウイルスの存在下で野生型ウイルスの増殖を測定することは
、野生型ウイルスにのみ感染した細胞の非許容温度でのウイルスの収量と、二重
に感染した細胞における野生型ウイルスの非許容温度での収量とを比較すること
により可能である。

【００２９】 本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイルスは以下の同定表現型の１以上
によって主に特徴付けられる；低温適応、温度感受性、優性干渉、および／また
は弱毒化。本明細書で用いられる場合、語句「低温適応、温度感受性、優性干渉
、および／または弱毒化の同定表現型を含むウマインフルエンザウイルス」とは
、そのような表現型を有するウイルスをいう。このようなウイルスの例としては
、以下が挙げられるが、これらに限定されない：受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ２６２
５により同定されるＥＩＶ−Ｐ８２１、受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ２６２４により
同定されるＥＩＶ−Ｐ８２４および受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ２６２７により同定
されるＥＩＶ−ＭＳＶ＋５、ならびにＥＩＶ−ＭＳＶ０、ＥＩＶ、ＭＳＶ＋１、
ＥＩＶ−ＭＳＶ＋２、ＥＩＶ−ＭＳＶ＋３、およびＥＩＶ−ＭＳＶ＋４。このよ
うなウイルスの産生は、実施例に記載される。例えば、低温適応型ウマインフル
エンザウイルスであるＥＩＶ−Ｐ８２１は、以下によって特徴付けられる（即ち
、以下の同定表現型を有する）：（ａ）低温適応（例えば、約２６℃の温度にお
いて胚含有性鶏卵中での複製能力）；（ｂ）温度感受性（例えば、約３７℃の非
許容温度において、組織培養細胞中でのプラークの形成不能性および後期遺伝子
産物の発現不能性、ならびに約３９℃の非許容温度において組織培養細胞中での
プラークの形成不能性およびウイルス性タンパク質の合成不能性）；（ｃ）ウマ
インフルエンザウイルスに感受性のある動物への投与における弱毒化；ならびに
（ｄ）優性干渉（例えば、野生型インフルエンザＡ型ウイルスとともに細胞に同
時感染する場合、野生型ウイルスの増殖に干渉する能力）。同様に、低温適応型
ウマインフルエンザウイルス、ＥＩＶ−Ｐ８２４は、以下によって特徴付けられ
る：（ａ）低温適応（例えば、約２８℃の温度における胚含有性鶏卵中での複製
能力）；（ｂ）温度感受性（例えば、約３９℃の非許容温度における組織培養細
胞でのプラーク形成の不能性）；および（ｃ）優性干渉（例えば、野生型インフ
ルエンザＡ型ウイルスとともに細胞に同時感染する場合、野生型ウイルスの増殖
に干渉する能力）。別の例では、低温適応型ウマインフルエンザ、ＥＩＶ−ＭＳ
Ｖ＋５は、以下によって特徴付けられる：（ａ）低温適応（例えば、約２６℃の
温度における胚含有性鶏卵中での複製能力）；（ｂ）温度感受性（例えば、約３
９℃の非許容温度における組織培養細胞でのプラーク形成の不能性）；および（
ｃ）ウマインフルエンザウイルスに感受性のある動物への投与における弱毒化。

【００３０】 特定の場合では、特定の表現型に関連した１以上の変異が生じるＲＮＡセグメ
ントは、本明細書中で開示されるように、標準的方法により再組み合わせ分析を
通じて決定され得る。１つの実施形態において、本発明の低温適応型ウマインフ
ルエザウイルスは、このウイルスのゲノムにおいて少なくとも２個の変異と相関
する温度感受性表現型を含む。この実施形態において、２個の変異のうち１個（
本明細書中に開示されるように再組み合わせ分析によって位置決めされる）は、
このウイルスが約３９℃の非許容温度において組織培養細胞中でプラークを形成
する能力を阻害（即ち、ブロックまたは防止）する。この変異は、ウマインフル
エンザウイルスのゲノムのセグメントと共に分離し、このゲノムは、ウイルスの
核タンパク質（ＮＰ）遺伝子をコードする（すなわち、この変異はＮＰ遺伝子と
同じＲＮＡセグメントに位置している）。この実施形態において、第２の変異は
、約３９℃の非許容温度で全てのタンパク質合成を阻害する。このように、非許
容温度で、ウイルスゲノムは、いかなるウイルス性タンパク質も発現することが
できない。これらの特徴を有する低温適応型ウマインフルエンザウイルスの例は
、ＥＩＶ−Ｐ８２１およびＥＩＶ−ＭＳＶ＋５である。ＥＩＶ−Ｐ８２１は、実
施例１Ａに記載された方法によって胚含有性鶏卵中で野生型ウマインフルエンザ
の連続的な継代により産生される。ＥＩＶ−ＭＳＶ＋５は、実施例１Ｅに記載さ
れるように、ＥＩＶ−Ｐ８２１のさらなる連続的な継代により得られた。

【００３１】 さらに、約３９℃の非許容温度においてプラーク形成およびウイルス性タンパ
ク質の合成を阻害する２個の変異を含む低温適応型温度感受性のウマインフルエ
ンザウイルスは、約３７℃の非許容温度でウイルスが後期遺伝子産物を合成する
能力および組織培養細胞中においてプラークを形成する能力を阻害する一以上の
さらなる変異を含み得る。これらの特徴を有する低温適応型ウマインフルエンザ
ウイルスの例は、ＥＩＶ−Ｐ８２１である。このウイルス単離株は、約２６℃の
温度で胚含有性鶏卵中で複製し、そして約３９℃の温度でプラークを形成せず、
ウイルスタンパク質も発現しない。さらに、ＥＩＶ−Ｐ８２１は、約３７℃の非
許容温度でＭＤＣＫ細胞でプラークを形成せず、そしてこの温度で後期遺伝子発
現は、後期タンパク質が産生されない様式で阻害される（すなわち、通常レベル
のＮＰタンパク質が合成され、減少したかまたは検出できないレベルのＭ１また
はＨＡタンパク質が合成され、そして増強したレベルのポリメラーゼタンパク質
が合成される）。この表現型は、差次的なウイルスタンパク質合成により型決定
されるので、この表現型は、全てのウイルスタンパク質合成の阻害により型決定
され、約３９℃の非許容温度で認められるタンパク質合成表現型とは異なる。

【００３２】 米国特許法施行規則１．８０２（ａ〜ｃ）に従って、低温適応型ウマインフル
エンザウイルス（本明細書中、ＥＩＶ−Ｐ８２１およびＥＩＶ−Ｐ８２４と呼ば
れる）は、ブタペスト条約の下で、アメリカンタイプカルチャーコレクション（
ＡＴＣＣ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａ
ｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９）に、それぞれ、ＡＴＣＣ受託番号ＡＴ
ＣＣ ＶＲ−２６２５およびＡＴＣＣ ＶＲ−２６２４として、１９９８年７月
１１日に受託された。低温適応型ウマインフルエンザウイルスＥＩＶ−ＭＳＶ＋
５は、ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ−２６２７として、１９９８年８月３日
にＡＴＣＣに受託された。米国特許法施行規則１．８０６に従って、これらの受
託物は、少なくとも３０年間にわたり、そして受託機関がこれらの受託物のサン
プルの最新の分譲請求を受領した後少なくとも５年の期間にわたり保管される。
米国特許法施行規則１．８０８（ａ）（２）に従って、公衆に対する利用性に対
して寄託者に課された全ての制限は、特許の付与後に取り消し不能に排除される
。

【００３３】 本発明の好ましい低温適応型ウマインフルエンザウイルスは、ＥＩＶ−Ｐ８２
１、ＥＩＶ−Ｐ８２４、およびＥＩＶ−ＭＳＶ＋５の同定特徴を有する。特に好
ましい低温適応型ウマインフルエンザウイルスとしては、ＥＩＶ−Ｐ８２１、Ｅ
ＩＶ−Ｐ８２４、ＥＩＶ−ＭＳＶ＋５、およびこれらのウイルスの子孫が挙げら
れる。本明細書中で用いられる場合、「子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）」は、「子孫（
ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）」であり、そしてこのように、親ウイルスと比較してわず
かに表現型が変化し得るが、親ウイルスの同定特徴（例えば、低温適応、温度感
受性、優性干渉、または弱毒化）を保持し得る。例えば、低温適応型ウマインフ
ルエンザウイルスＥＩＶ−ＭＳＶ＋５は、低温適応型ウマインフルエンザウイル
スＥＩＶ−Ｐ８２１の「子孫」である。「子孫」はまた、供与者である親ウイル
スの１以上の同定表現型を含む、再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルスを含
む。

【００３４】 本発明の再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルスは、供与者である本発明の
低温適応型ウマインフルエンザウイルスのゲノムセグメントと、受容者であるイ
ンフルエンザＡ型ウイルスのゲノムセグメントとを遺伝子再組み合わせし、次い
で、再組み合わせウイルスが、供与者である低温適応型ウマインフルエンザウイ
ルスの少なくとも１つの同定表現型を獲得するように、供与者ウイルス由来のそ
の８つのＲＮＡゲノムセグメントのうちの少なくとも１つを得ている再組み合わ
せウイルスを選択することにより生成される。同定表現型としては、低温適応、
温度感受性、弱毒化、および優性干渉が挙げられる。好ましくは、本発明の再組
み合わせインフルエンザＡ型ウイルスは、供与者ウイルスの少なくとも弱毒化表
現型を得る。再組み合わせインフルエンザウイルスを単離する方法は、ウイルス
学の当業者に周知であり、そして例えば、Ｆｉｅｌｄｓら、１９９６、Ｆｉｅｌ
ｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ；および
Ｐａｌｅｓｅら、１９７６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１７：８７６−８８４に開示さ
れる。Ｆｉｅｌｄｓら（同書）およびＰａｌｅｓｅら（同書）は、その全体が本
明細書中に参考として援用される。

【００３５】 適切な供与者ウマインフルエンザウイルスは、本発明の低温適応型ウマインフ
ルエンザウイルス（例えば、受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ２６２５により同定される
ＥＩＶ−Ｐ８２１、受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ２６２４により同定されるＥＩＶ−
Ｐ８２４、または受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ２６２７により同定されるＥＩＶ−Ｍ
ＳＶ＋５）である。適切な受容者インフルエンザＡ型ウイルスは、別のウマイン
フルエンザウイルス（例えば、Ａ／ｅｑｕｉｎｅ／Ｓｕｆｆｏｌｋ／８９（Ｈ３
Ｎ８）のようなユーラシアサブタイプ２ウマインフルエンザまたはＡ／Ｐｒａｇ
ｕｅ／１／５６（Ｈ７Ｎ７）のようなサブタイプ１ウマインフルエンザウイルス
）であり得る。受容者インフルエンザＡ型ウイルスはまた、供与者である低温適
応型ウマインフルエンザウイルスと再組み合わせウイルスを形成し得る任意のイ
ンフルエンザＡ型ウイルスであり得る。このようなインフルエンザＡ型ウイルス
の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ
Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１５６／９７（
Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、およびＡ／Ｈｏ
ｎｇ Ｋｏｎｇ／１／６８（Ｈ３Ｎ２）のようなヒトインフルエンザウイルス；
Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／１５／３０（Ｈ１Ｎ１）のようなブタウイルス；な
らびにＡ／ｍａｌｌａｒｄ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／６７５０／７８（Ｈ２Ｎ２）お
よびＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２５８／９７（Ｈ５Ｎ１）のよ
うなトリウイルス。本発明の再組み合わせウイルスとしては、得られた再組み合
わせウイルスが、供与者ウイルスの少なくとも１つの同定表現型を有する限り、
供与者と受容者の遺伝子セグメントの任意の組み合わせが挙げられ得る。

【００３６】 本発明の再組み合わせ（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）ウイルスの１例は、「６＋
２」再組み合わせウイルスであり、ここで、６個の「内在性遺伝子セグメント」
（すなわち、ＮＰ遺伝子、ＰＢ２遺伝子、ＰＢ１遺伝子、ＰＡ遺伝子、Ｍ遺伝子
およびＮＳ遺伝子を含むセグメント）は、ドナーの低温適応型ウマインフルエン
ザウイルスのゲノム由来であり、そして２個の「外来遺伝子セグメント」（すな
わち、ＨＡ遺伝子およびＮＡ遺伝子を含むセグメント）は、レシピエントのイン
フルエンザＡ型ウイルス由来である。このように産生されて得られたウイルスは
、ドナー低温適応型ウマインフルエンザウイルスの弱毒化表現型、低温適応性表
現型、温度感受性表現型、および／または優性干渉表現型を有するが、レシピエ
ント株の抗原性を有する。

【００３７】 なお別の実施形態において、本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイルス
は、組換え手段によって産生され得る。このアプローチにおいて、同定された低
温適応性表現型、弱毒化表現型、温度感受性表現型、および／または優性干渉表
現型に関連する１以上の特定の変異が同定され、そして逆方向遺伝学的アプロー
チを用いて野生型ウマインフルエンザウイルス株に導入し戻される。逆方向遺伝
子学は、インフルエンザウイルスに感染した細胞から単離されたＲＮＡポリメラ
ーゼ複合体を使用して、変異を含む人工インフルエンザウイルスゲノムセグメン
トを転写する工程、ヘルパーウイルスを使用して、その合成されたＲＮＡセグメ
ントをウイルス粒子に組み込む工程、次いで、所望の変化を含むウイルスについ
て選択する工程を包含する。インフルエンザウイルスについての逆方向遺伝学的
方法は、例えば、Ｅｎａｍｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．８７，３８０２−３８０５；およびＰａｌｅｓｅらによる米国特許第５，
５７８，４７３号（１９９６年１１月２６日発行）（これらの両方は、それらの
全体が参考として本明細書中に援用される）において記載される。このアプロー
チは、当業者が、長期間の低温適応プロセス、ならびにインビトロおよびインビ
ボの両方で所望のウイルス表現型を有する変異体を選択するプロセスを経る必要
なく、本発明のさらなる低温適応型ウマインフルエンザウイルスを産生すること
を可能にする。

【００３８】 本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイルスは、当業者に周知の標準的な
ウイルス学的方法によって増殖され得、これらの方法の例を本明細書中に開示す
る。例えば、低温適応型ウマインフルエンザウイルスは、胚含有鶏卵または真核
生物組織培養細胞において増殖され得る。本発明の低温適応型ウマインフルエン
ザウイルスを増殖するための適切な連続真核生物細胞株としては、インフルエン
ザウイルスの増殖を支持する細胞株（例えば、ＭＤＣＫ細胞）が挙げられる。本
発明の低温適応型ウマインフルエンザウイルスを増殖するための他の適切な細胞
としては、サル、ウシ、ハムスターまたはニワトリの初代腎臓細胞培養物が挙げ
られるが、これらに限定されない。

【００３９】 １つの実施形態において、本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスによって引
き起こされる疾患に対して動物を防御するための治療組成物を提供し、ここで、
この治療組成物は、低温適応型ウマインフルエンザウイルス、または低温適応に
よって生成されたウマインフルエンザウイルスの少なくとも１つのゲノムセグメ
ントを含む再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルスのいずれかを含み、ここで
、このウマインフルエンザウイルスゲノムセグメントは、低温適応型ウマインフ
ルエンザウイルスの少なくとも１つの同定表現型を与える。さらに、本発明の治
療組成物は、１以上の変異を含むように遺伝子操作されたウマインフルエンザウ
イルスを含み得、これらの変異は、本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイ
ルスに対して特定の同定表現型を与えることが同定されている。本明細書中で使
用される場合、句「インフルエンザＡ型ウイルスによって引き起こされる疾患」
とは、毒性インフルエンザＡ型ウイルスに感染した動物において観察される臨床
的徴候をいう。このような臨床的徴候の例としては、発熱、くしゃみ、咳、鼻汁
、ラ音、食欲不振および抑うつが挙げられるが、これらに限定されない。さらに
、句「インフルエンザＡ型によって引き起こされる疾患」は、感染動物による毒
性ウイルスの散布を含むように本明細書中で定義される。動物において観察され
た臨床的徴候が毒性ウマインフルエンザウイルスによる感染と相関することの確
認は、いくつかの方法によってなされ得、これらの方法としては、その動物にお
けるウマインフルエンザウイルスに対する特異的抗体および／またはＴ細胞応答
の検出が挙げられる。好ましくは、動物において観察された臨床的徴候が毒性イ
ンフルエンザＡ型ウイルスによる感染と相関することの確認は、罹患した動物か
らのウイルスの単離（例えば、動物の鼻咽頭腔からウイルス含有分泌物を拭き取
る（ｓｗａｂ）ことによる）によってなされる。ウイルス単離の確認は、胚含有
鶏卵への単離された分泌物の接種による、単離された分泌物を接種された組織培
養細胞におけるＣＰＥの検出によってなされ得、ここで、ウイルス複製は、接種
された卵由来のＡＦが赤血球を凝集させる能力（これは、インフルエンザウイル
ス赤血球凝集素タンパク質の存在を示唆する）によってか、または市販の診断試
験（例えば、Ｄｉｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商標）ＦＬＵ Ａ試験）の使用によっ
て検出される。

【００４０】 本明細書中で使用される場合、用語「防御する」とは、例えば、被験体動物に
おけるインフルエンザＡ型ウイルス感染を予防または処置することを包含する。
従って、本発明の治療組成物は、例えば、インフルエンザ疾患から被験体動物を
防御するための予防ワクチンとして使用され得、これは、毒性ウイルスへの動物
の曝露前のある時点でその動物に治療組成物を投与することによる。

【００４１】 優性干渉表現型を有する低温適応型ウマインフルエンザウイルスを含む本発明
の治療組成物もまた、毒性インフルエンザＡ型ウイルスに最近感染したか、また
はその後数日中に曝露されそうな動物を処置するために使用され得、その結果、
この治療組成物は、その動物による毒性ウイルスに対する抗体の産生の前に、毒
性ウイルスの増殖に直ちに干渉する。優性干渉表現型を有する低温適合性ウマイ
ンフルエンザウイルスを含む治療組成物は、その後の曝露前に、本発明の低温適
応型ウマインフルエンザウイルスが、処置される動物の上気道において複製する
およその期間に対応する期間（例えば、約７日までの間）、効果的に投与され得
る。優性干渉表現型を有する低温適応型ウマインフルエンザウイルスを含む治療
組成物は、毒性ウマインフルエンザウイルスに対する曝露後に、感染動物が疾患
の症状を示すのに必要とされる時間に対応する期間（例えば、約２日までの間）
、効果的に投与され得る。

【００４２】 本発明の治療組成物は、インフルエンザウイルス疾患に感受性の任意の動物（
例えば、ヒト、ブタ、ウマおよび他のウマ科、水生鳥類、家畜鳥類および狩猟鳥
類、アザラシ、ミンク、およびクジラ）に投与され得る。好ましくは、本発明の
治療組成物は、ウマ科に投与される。さらにより好ましくは、本発明の治療組成
物は、ウマに投与され、ウマインフルエンザ疾患に対して防御する。

【００４３】 ウマインフルエンザウイルス疾患に対してウマを防御するために利用可能な現
在のワクチンは、幼若の仔ウマの防御には効果的でない。これは、ほぼおそらく
、これらのワクチンが、これらの若い動物中に存在する母系抗体に打ち勝てず、
そしてしばしば、早齢（例えば、３ヶ月齢）でのワクチン接種は、免疫ではなく
むしろ寛容を導き得る。１つの実施形態において、および既存のウマインフルエ
ンザウイルスワクチンとは対照的に、本発明の低温適応型ウマインフルエンザウ
イルスを含む治療組成物は、明らかに、幼若動物において免疫を生じ得る。従っ
て、本発明の治療組成物は、幼若の仔ウマ（約３ヶ月齢ほどの若さの）に安全か
つ効果的に投与され、寛容を誘導することなくウマインフルエンザ疾患に対して
防御し得る。

【００４４】 １つの実施形態において、本発明の治療組成物は、多価であり得る。例えば、
本発明の治療組成物は、本発明の１以上の低温適応型ウマインフルエンザウイル
ス、１以上の再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルス、および／または本発明
の１以上の遺伝子操作したウマインフルエンザウイルスの組み合わせを提供する
ことによって、インフルエンザＡ型ウイルスの１つより多い株から動物を防御し
得る。多価治療組成物は、例えば、北アメリカサブタイプ−２ウイルス単離株（
例えば、Ａ／ｅｑｕｉｎｅ／Ｋｅｎｔｕｃｋｙ／１／９１（Ｈ１Ｎ８））、およ
びユーラシアサブタイプ−２ウイルス単離株（例えば、Ａ／ｅｑｕｉｎｅ／Ｓｕ
ｆｆｏｌｋ／８９（Ｈ３Ｎ８））；または１以上のサブタイプ−２ウイルス単離
体およびサブタイプ−１ウイルス単離株（例えば、Ａ／ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇ
ｕｅ／１／５６（Ｈ７Ｎ７））に対する、少なくとも２つの低温適応型ウマイン
フルエンザウイルスを含み得る。同様に、本発明の多価治療組成物は、本発明の
低温適応型ウマインフルエンザウイルスおよび再組み合わせインフルエンザＡ型
ウイルス、または本発明の２つの再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルスを含
み得る。本発明の多価治療組成物はまた、インフルエンザＡ型ウイルスに加えて
、１以上の他の感染性因子に対して防御するための、１以上の処方物を含み得る
。このような他の感染性因子としては、以下が挙げられるが、これらに限定され
ない：ウイルス；細菌；真菌および真菌関連微生物；ならびに寄生生物。好まし
い多価治療組成物としては、本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイルス、
再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルス、または遺伝子操作したウマインフル
エンザウイルスと、ウマを冒す１以上の他の感染性因子に対して防御的な１以上
の組成物とを含むが、これらに限定されない。防御される適切な感染性因子とし
ては、ウマ伝染性貧血ウイルス、ウマヘルペスウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイ
ルス、西部ウマ脳脊髄炎ウイルスまたはベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、破傷
風ウイルス、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ、およびＥｈｒｌｉｃｈｉ
ａ ｒｅｓｔｉｃｉｉが挙げられるが、これらに限定されない。

【００４５】 本発明の治療組成物は、処置される動物が寛容し得る賦形剤中に処方され得る
。このような賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロ
ース溶液、ハンクス溶液、および他の水性の生理学的平衡塩類溶液が挙げられる
。賦形剤はまた、微量の添加剤（例えば、等張性および化学的安定性または生物
学的安定性を増強する物質）を含み得る。緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、
重炭酸緩衝液、およびＴｒｉｓ緩衝液が挙げられ、安定剤の例としては、Ａ１／
Ａ２安定剤（Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ，Ｄｅｓ Ｍｏｉｎ
ｅｓ，ＩＡから入手可能）が挙げられる。標準的な処方物は、液体または固体の
いずれかであり得、固体は、動物への投与のために懸濁液または溶液として適切
な液体に取り込まれ得る。１つの実施形態において、非液体処方物は、賦形剤、
塩、緩衝液、安定剤などを含み得、投与前に、滅菌水または滅菌生理食塩水がこ
れらに添加され得る。

【００４６】 本発明の治療組成物はまた、１以上のアジュバントまたはキャリアを含み得る
。アジュバントは、代表的に、特定の抗原に対する動物の免疫応答を増強する物
質であり、そしてキャリアとしては、処置される動物における治療組成物の半減
期を増加する化合物が挙げられる。本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイ
ルスまたは再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルスを含む治療組成物の１つの
利点は、有効なワクチンを産生するためにアジュバントおよびキャリアが必要と
されないことである。さらに、当業者に公知の多くの場合において、本発明の治
療組成物の利点は、いくつかのアジュバントまたはキャリアの使用によって妨げ
られる。しかし、アジュバントまたはキャリアの使用は、本発明によって除外さ
れないことに留意すべきである。

【００４７】 本発明の治療組成物は、毒性ウマインフルエンザウイルスでのチャレンジから
動物を防御するのに十分な量の低温適合性ウマインフルエンザウイルスを含む。
１つの実施形態において、本発明の治療組成物は、約１０^５の組織培養物感染用
量−５０（ＴＣＩＤ_５０）単位のウイルス〜約１０^８のＴＣＩＤ_５０単位のウイ
ルスの範囲の量の低温適応型ウマインフルエンザウイルスを含み得る。本明細書
中で使用される場合、「ＴＣＩＤ_５０単位」は、感染された細胞培養物の５０％
において細胞変性効果を生じるウイルスの量である。ＴＣＩＤ_５０を測定および
計算するための方法は、当業者に公知であり、そして例えば、ＲｅｅｄおよびＭ
ｕｅｎｃｈ，１９３８，Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｈｙｇ．２７，４９３−４９７（その
全体が参考として本明細書中に援用される）において利用可能である。本発明の
好ましい治療組成物は、約１０^６ＴＣＩＤ_５０単位〜約１０^７ＴＣＩＤ_５０単位
の本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイルスまたは再組み合わせインフル
エンザＡ型ウイルスを含む。約２×１０^６ＴＣＩＤ_５０単位の本発明の低温適応
型ウマインフルエンザウイルスまたは再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルス
を含む治療組成物が、さらにより好ましい。

【００４８】 本発明はまた、インフルエンザＡ型ウイルスによって引き起こされる疾患に対
して動物を防御するための方法を包含し、この方法は、本発明の治療組成物を動
物に投与する工程を包含する。ウマインフルエンザウイルスによって引き起こさ
れる疾患に対してウマを防御する方法が好ましく、これらの方法は、低温適合性
ウマインフルエンザウイルスをウマに投与する工程を包含する。効果的な様式で
治療組成物を投与するための受容可能なプロトコルは、個々の用量サイズ、用量
の数、用量投与の頻度、および投与の様式を含む。このようなプロトコルの決定
は、当業者によって達成され得、そして例を本明細書中に開示する。

【００４９】 インフルエンザＡ型ウイルスによって引き起こされる疾患に対して動物を防御
するための好ましい方法は、本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイルス、
再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルス、または遺伝子操作したウマインフル
エンザウイルスを含む単回用量の治療組成物を、その動物に投与する工程を包含
する。適切な単回用量は、適切な期間にわたって１回以上投与した場合に、動物
を疾患から防御し得る用量である。本発明の方法は、治療組成物のその後の（す
なわち、ブースター）用量を投与する工程を包含し得る。ブースター投与は、最
初の投与後の約２週間〜数年に与えられ得る。ブースター投与は、好ましくは、
動物の免疫応答が疾患からその動物を防御するのに不十分になる場合に投与され
る。適切かつ好ましい投薬スケジュールの例を、実施例の節に開示する。

【００５０】 本発明の治療組成物は、ウイルスが、処置される動物の上気道中の粘膜細胞に
侵入しそしてその粘膜細胞中で複製するように、種々の手段によって動物に投与
され得る。このような手段としては、鼻内投与、経口投与、および眼内投与が挙
げられるが、これらに限定されない。インフルエンザウイルスは、上気道の粘膜
に自然に感染するので、本発明の治療組成物を投与するための好ましい方法は、
鼻内投与による。このような投与は、カニューレを取り付けた注射器の使用によ
ってか、またはワクチン接種される動物の鼻および口の上に取り付けられる噴霧
器の使用によって達成され得る。

【００５１】 インフルエンザＡ型ウイルスによって引き起こされる疾患に対して動物を防御
するための本発明の治療組成物の効力は、種々の方法で試験され得る。これらの
方法としては、抗体の検出（例えば、赤血球凝集素阻害（ＨＡＩ）試験による）
、処置される動物内の細胞性免疫の検出、または処置した動物の毒性のウマイン
フルエンザウイルスを用いたチャレンジ（処置された動物が疾患の発症に対して
耐性であるか否かを決定するため）が挙げられるが、これらに限定されない。さ
らに、毒性の野生型ウマインフルエンザウイルスが以前に接種されたかまたは接
種に感受性である動物における疾患症状を改善または減少するための、優性干渉
表現型を有する低温適合性ウマインフルエンザウイルスを含む本発明の治療組成
物の効力は、処置された動物における疾患症状の減少または非存在についてスク
リーニングすることによって試験され得る。

【００５２】 本発明はまた、本発明の治療組成物を産生するための方法を包含する。本発明
の治療組成物を作製するための適切かつ好ましい方法を、本明細書中に開示する
。１つの型の本発明の治療組成物（すなわち、低温適合性ウマインフルエンザウ
イルス）の産生に関与する適切な工程は、以下を包含する：（ａ）例えば、胚含
有鶏卵において、インビトロで野生型ウマインフルエンザウイルスを継代する工
程；（ｂ）低下した温度で増殖するウイルスを選択する工程；（ｃ）所望の低い
温度で安定に増殖するウイルス集団が選択されるまで、徐々に低い温度で継代工
程および選択工程を１回以上繰り返す工程；および（ｄ）得られたウイルス調製
物を適切な賦形剤と混合する工程。

【００５３】 本発明の別の型の治療組成物（すなわち、適応により生成されるウマインフル
エンザウイルスの少なくとも１つのゲノムセグメントを有する再組み合わせイン
フルエンザＡ型ウイルス）を生成することに関与する適切な工程は、（ａ）ドナ
ー低温適応型ウマインフルエンザウイルス（好ましくは、弱毒化、温度感受性、
または優性干渉の表現型もまた有する）のゲノムセグメントを、レシピエントイ
ンフルエンザＡ型ウイルスのゲノムセグメントと混合する工程、および（ｂ）そ
のドナーウマインフルエンザウイルスの少なくとも１つの同定表現型（ｉｄｅｎ
ｔｉｆｙｉｎｇ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を有する再組み合わせウイルスを選択す
る工程を包含する。選択するための同定表現型としては、弱毒化、低温適応、温
度感受性、および優性干渉が挙げられる。これらの表現型についてスクリーニン
グする方法は、当業者に周知であり、そして本明細書中に開示されている。弱毒
化の表現型を少なくとも有するウイルスについてスクリーニングすることが、好
ましい。

【００５４】 低温適応により生成されるウマインフルエンザウイルスの少なくとも１つのゲ
ノムセグメントを有する再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルスを生成するた
めにこの方法を使用して、選択される1つの型の再組み合わせウイルスの１つの
型は、「６＋２」再組み合わせであり、その６つの「内部遺伝子セグメント」（
すなわち、ＮＰ遺伝子、ＰＢ２遺伝子、ＰＢ１遺伝子、ＰＡ遺伝子、Ｍ遺伝子、
およびＮＳ遺伝子をコードするセグメント）は、ドナー低温適応型ウマインフル
エンザウイルスゲノムに由来し、そしてその２つの「外部遺伝子セグメント」（
すなわち、ＨＡ遺伝子よびＮＡ遺伝子をコードするセグメント）は、レシピエン
トインフルエンザＡ型ウイルスに由来する。このように生成されて生じたウイル
スは、ドナー低温適応型ウマインフルエンザウイルスの低温適応、弱毒化、温度
感受性、および／または干渉の表現型を有し得るが、レシピエント株の抗原性を
有し得る。

【００５５】 別の実施形態において、本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイルスを含
む治療組成物は、呼吸疾患（例えば、ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）または他
のウイルスに直接的もしくは間接的に起因すると考えられる、鼻汁（（ｎａｓａ
ｌ ｄｉｓｃｈａｒｇｅ）（ウマ獣医により、鼻汁（ｓｎｏｔ）とも呼ばれる）
が挙げられるがこれに限定されない、呼吸疾患）を処置するために、動物に投与
され得る。本明細書中で使用される場合、用語「処置する」とは、本発明の治療
組成物が、動物における疾患（例えば、呼吸疾患）を減少または排除する能力を
いう。このような疾患は、このましくは、以前から存在する状態であり、そして
／または、好ましくは、そのような疾患を引き起こすことができる病原菌に対す
る最近の曝露または処置の２〜３日以内の後の曝露に起因する。本発明の治療組
成物は、感染（例えば、呼吸疾患（好ましくは上部呼吸器疾患）を直接的または
間接的のいずれかでもたらす任意のウイルスもしくは細菌であるが、これらに限
定されない）を処置するために、ウマ科の動物（好ましくは、約３月齢〜約２年
齢の）に、安全かつ有効に投与され得る。先天性免疫は、誕生から最初の約３ヶ
月を通して若い動物を防御すると考えられるが、約３月齢と６月齢との間に先天
性免疫は減少し始め、動物を感染に対して感受性にする。本発明の治療組成物は
、これらの動物における呼吸疾患を有効に処置し得る。本発明の治療組成物はま
た、動物における二次ウイルス感染および／または二次細菌感染を阻害するため
に使用され得る。さらに、本発明の治療組成物は、病原菌により生じる他の疾患
を、直接的または間接的のいずれかで処置するために使用され得る。

【００５６】 理論により拘束されないけれども、本発明の治療組成物は、抗体の生成に依存
しない非特異的干渉応答を誘導し；むしろこの応答は、そのような本発明の治療
組成物の投与により誘発される、サイトカイン産生の増加におそらく起因し、疾
患の軽減をもたらす。優性干渉は、本明細書中で、本発明のウマインフルエンザ
ウイルスが親野生型株および異種インフルエンザＡ型ウイルスの増殖を阻害する
能力をいう。本明細書中で使用される場合、非特異的干渉は、本発明のウマイン
フルエンザウイルスが、親野生型株および他の病原菌（例えば、呼吸疾患をもた
らすウイルスまたは細菌であるが、これらに限定されない）の増殖を、好ましく
は抗体媒介性免疫がそのウイルスの投与に応答して確立され得る前に、阻害する
能力をいう。

【００５７】 好ましい実施形態は、以下からなる群より選択されるウイルスを含む本発明の
治療組成物を、動物に投与する工程を包含し、治療組成物は、非特異的干渉を示
す：優性干渉表現型を有する低温適応型ウマインフルエンザウイルス；および低
温適応および優性干渉表現型を付与するウマインフルエンザウイルスゲノムの一
部を含む、再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルス。一部とは、本明細書にお
いて、１つ以上のゲノムセグメント、または１つ以上のゲノムフラグメントをい
い；この実施形態においては、低温適応表現型および優性干渉表現型をコードす
る、その１つ以上のゲノムセグメント、または１つ以上のゲノムフラグメントを
いう。

【００５８】 呼吸疾患に罹患したウマへの本発明の治療組成物の投与は、好ましくは、約７
日未満、より好ましくは５日未満、そしてなおより好ましくは約１〜３日以内に
、疾患の徴候の減少をもたらす。疾患の段階は、鼻汁および熱の症状を伴う初期
発症から、優勢な症状として鼻汁を伴う後期段階までの範囲であり得る。

【００５９】 呼吸疾患により生じる疾患について動物を処置するための好ましい方法は、そ
の動物に、本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイルス、再組み合わせイン
フルエンザＡ型ウイルス、または遺伝子操作したウマインフルエンザウイルスを
含む、単回用量の治療組成物を投与する工程を包含する。そのような投与は、本
明細書の他の場所に記載されるように達成され得る。例としては、カニューレに
適応されたシリンジの使用、または処置されるべき動物の鼻および口の上に適応
された噴霧器の使用が、挙げられるがこれらに限定されない。適切な用量は、適
切な時間にわたって１回以上投与される場合、疾患について動物を処理すること
ができる用量である。本発明の好ましい治療組成物は、約１０^７ ＴＣＩＤ_５０ 単位〜約１０^８ ＴＣＩＤ_５０単位の、本発明の低温適応型ウマインフルエンザ
ウイルスまたは再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルスを含む。本発明の方法
はまた、後の用量の治療組成物を投与する工程も包含し得る。

【００６０】 なお別の実施形態において、本発明のウイルスは、別の病原菌に対するワクチ
ンの免疫応答を刺激するためのアジュバントとして使用され得る。

【００６１】 以下の実施例は、本発明の例示の目的のために提供され、そして本発明の範囲
を制限するようには意図されない。

【００６２】 （実施例１） 本実施例は、本発明のいくつかの低温適応型ウマインフルエンザウイルスの作
製および表現型の特徴付けを開示する。

【００６３】 Ａ．親ウマインフルエンザウイルスであるＡ／ｅｑｕｉｎｅ／Ｋｅｎｔｕｃｋ
ｙ／１／９１（Ｈ３Ｎ８）（Ｔｏｍ Ｃｈａｍｂｅｒｓ，ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ ｏｆ Ｋｅｎｔｕｃｋｙ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹから入手した）
を、外来宿主種（すなわち、胚含有鶏卵）において、以下の様式で低温適応に供
した。約０．１ミリリットル（ｍｌ）の未希釈ＡＦ（約１０^６プラーク形成単位
（ｐｆｕ）のウイルスを含む）を、卵殻に開けた小さい穴を通して尿膜腔中に注
射することによって、胚を含有した１０日齢または１１日齢の鶏卵（例えば、Ｔ
ｒｕｓｌｏｗ Ｆａｒｍｓ，Ｃｈｅｓｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＤまたはＨｙＶａｃ，
Ａｄｅｌ，ＩＡより入手可能）に、その親ウマインフルエンザウイルスを接種し
た。この卵の穴を、ネイルポリッシュを用いて密封し、そしてこの卵を、適切な
温度に設定した加湿インキュベーター中で３日間、インキュベートした。インキ
ュベーションの後、この卵を明かりにすかして調べ、そして生存していないすべ
ての卵を廃棄した。その卵殻の一部を無菌的に除去し、滅菌した鉗子を用いて絨
毛尿膜（ＣＡＭ）を剥がし、そして滅菌したピペットを用いてＡＦを取り出すこ
とによって、生存する胚からＡＦを収集した。この収集したＡＦを、継代の間凍
結した。その後、このＡＦを、表１に記されるように、未希釈でかまたはリン酸
緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に１：１０００希釈するかのいずれかで使用して
、２回目の継代のための新しい組の卵に接種するなどした。合計６９回の継代を
完了した。初期の継代は、約３４℃（継代１〜２）または約３０℃のいずれかで
行い、そしてその後の継代において、インキュベーション温度を、約２８℃また
は約２６℃のいずれかまで下げた。安定な弱毒化ウイルスの所望の表現型の選択
の確率を増加するために、最初の連続継代を、表１に示されるように、連続継代
ツリーの５つの異なる枝（ｌｉｍｂ）（Ａ〜Ｅ）を含むように拡張した。

【００６４】 （表１：枝Ａ〜Ｅの継代履歴）

【００６５】

【表１】 ^*＝感染性尿膜腔液を、これらの継代において、１：１０００希釈した。

【００６６】 Ｂ．節Ａに記載される低温適応手順を遂行されたウイルス単離株を、温度感受
性（すなわち、低温または許容温度（例えば、約３４℃）で低温適応型ウイルス
が増殖するが、より高温または非許容温度（例えば、約３７℃〜約３９℃）では
もはやプラークを形成しない、表現型）について、以下のように試験した。各低
温適応型継代において、このＡＦを、約３４℃でのプラークアッセイにより力価
測定した。定期的に、このアッセイからの個々のプラークを、プラーク領域を切
り出すこと、およびＭＤＣＫ細胞の単層を含む９６ウェルトレイ中に切り出した
寒天プラグを配置することによって、クローン単離した。この９６ウェルトレイ
を一晩インキュベートし、そしてその収量を、約３４℃でインキュベートした９
６ウェルトレイおよび約３９℃でインキュベートした９６ウェルトレイの２連で
のＣＰＥアッセイにより、温度感受性についてアッセイした。このアッセイによ
り温度感受性変異体として記録されたクローンのパーセント（すなわち、３４℃
で増殖するが３９℃では増殖しないウイルスプラークの数を、プラーク総数で除
算したもの）を計算した。そしてそれを表２に示す。その後、温度感受性単離株
を、非許容温度でのタンパク質合成について、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によるウイルスにより合成された放射性標識タンパ
ク質の可視化によって、評価した。

【００６７】 （表２：温度感受性であった単離クローンのパーセント）

【００６８】

【表２】 温度感受性について試験したクローン性単離株から、更なる研究のために２つ
を選択した。クローンＥＩＶ−Ｐ８２１を、表１に規定されるような、枝Ｂの４
９回目の継代から選択し、そしてクローンＥＩＶ−Ｐ８２４を、枝Ｃの４８回目
の継代から選択した。これらのウイルス単離株の両方が、温度感受性であり、温
度約３９℃にて、両方の単離株のプラーク形成が阻害された。この温度にて、タ
ンパク質合成が、ＥＩＶ−Ｐ８２１により完全に阻害されたが、ＥＩＶ−Ｐ８２
４は、正常なレベルのタンパク質合成を示した。さらに、ＥＩＶ−Ｐ８２１によ
るプラーク形成が、温度約３７℃で阻害され、そしてこの温度で、後期遺伝子発
現が阻害された。すなわち、正常なレベルのＮＰタンパク質が合成され、減少し
たＭ１タンパク質もしくはＨＡタンパク質が合成されるかまたは全く合成されず
、そして増強されたレベルのポリメラーゼタンパク質が合成された。３７℃で観
察された表現型（差次的ウイルスタンパク質合成により分類した）は、約３９℃
で観察されたタンパク質合成表現型（これは、すべてのウイルスタンパク質の合
成の阻害により分類した）と異なった。ウイルスＥＩＶ−Ｐ８２１を、Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受
託番号ＡＴＣＣ ＶＲ−２６２５のもとで寄託し、そしてウイルスＥＩＶ−Ｐ８
２４を、受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ−２６２４のもとでＡＴＣＣに寄託している。

【００６９】 Ｃ．単離株ＥＩＶ−Ｐ８２１の変異のさらなる特徴づけを、以下のように、再
組み合わせ分析により実行した。インフルエンザウイルスにおける再組み合わせ
分析により、当業者が、特定の環境下で、インフルエンザＡ型ウイルスゲノムを
含む８つのＲＮＡセグメントのうちの特定のセグメント上に存在する推定変異と
、所定のウイルスの表現型とを相関付けることを、可能にする。この技術は、例
えば、Ｐａｌｅｓｅら（同書）に記載されている。ＥＩＶ−Ｐ８２１と鳥類イン
フルエンザウイルスであるＡ／ｍａｌｌｒａｄ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／６７５０／
７８との混合感染を、以下のように実施した。ＭＤＣＫ細胞に、感染多重度（Ｍ
ＯＩ）２ｐｆｕ／細胞のＥＩＶ−Ｐ８２１と、ＭＯＩが２ｐｆｕ／細胞、５ｐｆ
ｕ／細胞、または１０ｐｆｕ／細胞のいずれかのＡ／ｍａｌｌｒａｄ／Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ／６７５０／７８とで、同時感染させた。感染した細胞を、温度約３４
℃でインキュベートした。種々の同時感染の収量を力価測定し、そして個々のプ
ラークを、約３４℃で単離し、そして生じたクローン性単離株を、それらが約３
９℃および約３７℃で増殖でき、そして約３９℃、約３７℃、および約３４℃で
それらの遺伝子を発現（すなわち、ウイルスタンパク質を合成）できるか否かに
関して、特徴付けた。タンパク質合成を、放射性標識した感染細胞溶解物のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析により評価した。２つの親ウイルスのＨＡタンパク質、ＮＰタ
ンパク質およびＮＳ−１タンパク質（その各々が、別個のゲノムセグメントによ
りコードされる）が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により区別可能であった。なぜなら
、これらの特定のウイルスタンパク質は、ウマインフルエンザウイルスまたは鳥
類インフルエンザウイルスのいずれかに由来するので、異なる見かけの分子量で
移動するからである。この方法において、少なくともこのＨＡ遺伝子、ＮＰ遺伝
子およびＮＳ−１遺伝子について、親ウイルスの特定の表現型（例えば、温度感
受性およびタンパク質合成表現型）が、これらの遺伝子を保有するゲノムセグメ
ントと共分離する（ｃｏ−ｓｅｇｒｅｇａｔｅ）か否かを評価することが、可能
であった。ａ）非許容温度約３９℃でプラーク形成を阻害する変異（すなわち、
ＣＰＥの誘導）またはｂ）非許容温度約３９℃でタンパク質合成を阻害する変異
と、ＥＩＶ−Ｐ８２１ ＨＡタンパク質、ＥＩＶ−Ｐ８２１ ＮＰタンパク質、
およびＥＩＶ−Ｐ８２１ ＮＳ−１タンパク質の各々との共分離を調査する再組
み合わせ分析の結果を、それぞれ、表３および表４に示す。

【００７０】 （表３：ＥＩＶ−Ｐ８２１ の３９℃でのプラーク形成表現型と、鳥類インフ
ルエンザウイルスであるＡ／ｍａｌｌａｒｄ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／６７５０／７
８との再集合分析）

【００７１】

【表３】 ^１ 温度約３９℃で組織培養細胞においてＣＰＥを誘導することができるクロー
ン性単離株の数^２ 温度約３９℃で組織培養細胞においてＣＰＥを誘導する能力が阻害されたク
ローン性単離株の数。

【００７２】 （表４：鳥類インフルエンザウイルス，Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ／６７５０／７８でのＥＩＶ−Ｐ８２１ ３９℃タンパク質合成表現型の再集
合分析）

【００７３】

【表４】 ^１約３９℃の温度ですべてのウイルスタンパク質を合成するクローン分離株の数^２ 約３９℃の温度ですべてのウイルスタンパク質を合成する能力を阻害されたク
ローン分離株の数。

【００７４】 この結果は、約３９℃の非許容温度においてＥＩＶ−Ｐ８２１にプラークを形
成し得なくさせる変異を有するウマＮＰ遺伝子の関連を示す。しかし、この結果
は、約３９℃の非許容温度においてＥＩＶ−Ｐ８２１にウイルスタンパク質を発
現し得なくさせる変異を有するＨＡ、ＮＰ、またはＮＳ−１遺伝子のいずれの関
連も示唆しなかった。従って、これらのデータはまた、ウイルスＥＩＶ−Ｐ８２
１において観察されるプラーク形成表現型およびタンパク質合成表現型が、別個
の変異の結果であったことを示した。

【００７５】 Ｄ．本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイルスが優性干渉性の表現型を
有するか否か、すなわち、本発明の低温適応型ウマインフルエンザウイルスが野
生型親ウイルスＡ／Ｋｅｎｔｕｃｋｙ／１／９１（Ｈ３Ｎ８）との混合感染にお
いて優性であるか否かを決定するためにまた研究を行った。ウイルスＥＩＶ−Ｐ
８２１およびＥＩＶ−Ｐ８２４の優性干渉性表現型を、以下のように評価した。
ＭＤＣＫ細胞の別個の単層に、２のＭＯＩで親ウイルスＡ／Ｋｅｎｔｕｃｋｙ／
１／９１（Ｈ３Ｎ８）を単一で感染させるか、２のＭＯＩで低温適応型ウイルス
ＥＩＶ−Ｐ８２１もしくはＥＩＶ−Ｐ８２４のいずれかを単一で感染させるか、
または２＋２のＭＯＩで親ウイルスと低温適応型ウイルスのうちの１つとの両方
で同時に二重で感染させた（すべて、約３４℃の温度において）。感染から２４
時間後に、これらの培養物からの培地を収集し、そして種々の感染細胞からのウ
イルス収量を、約３４℃および約３９℃の温度で実行する二連プラークアッセイ
（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ）によって測定した。これら
のアッセイは、低温適応型ウマインフルエンザウイルスＥＩＶ−Ｐ８２１または
ＥＩＶ−Ｐ８２４が温度感受性であり、従って、約３９℃の非許容温度ではプラ
ークを形成し得ないが、親ウイルスは両方の温度でプラークを形成し得、このた
め低温適応型ウイルスの存在下において親ウイルスの増殖を測定することが可能
であるという事実を利用する。詳細には、親ウイルスの増殖に対する低温適応型
ウイルスの優性干渉性効果を、二重感染した細胞における親ウイルスの収量に対
して、親ウイルスに単一で感染した細胞の約３９℃でのウイルス収量を比較する
ことによって定量した。ＥＩＶ−Ｐ８２１は、混合感染において親ウイルスの収
量を約１／２００倍に減少し得たが、ＥＩＶ−Ｐ８２４は、混合感染において親
ウイルスの収量を約１／３２００倍に減少させた。従って、このアッセイによっ
て、低温適応型ウマインフルエンザウイルスＥＩＶ−Ｐ８２１またはＥＩＶ−Ｐ
８２４は両方とも、優性干渉性表現型を示すことが示された。

【００７６】 Ｅ．ウイルス単離株ＥＩＶ−ＭＳＶ＋５を、以下のように、ＥＩＶ−Ｐ８２１
から誘導した。ＥＩＶ−Ｐ８２１を、上記のように卵内において一度継代させて
、マスター種子ウイルス単離株（Ｍａｓｔｅｒ Ｓｅｅｄ Ｖｉｒｕｓ ｉｓｏ
ｌａｔｅ）（本明細書中ではＥＩＶ−ＭＳＶ０と表記する）を生成した。次いで
、ＥＩＶ−ＭＳＶ０を、卵内でのさらなる３回の継代に供した。各継代の終了時
のウイルス単離株を、それぞれ、ＥＩＶ−ＭＳＶ＋１、ＥＩＶ−ＭＳＶ＋２、お
よびＥＩＶ−ＭＳＶ＋３と称する。次いで、ＥＩＶ−ＭＳＶ＋３を、以下のよう
にＭＤＣＫ細胞内でのさらなる２回の継代に供した。ＭＤＣＫ細胞を、１５０ｃ
ｍ^２組織培養フラスコ内において、１０％仔ウシ血清を含有するハンクス塩類を
有するＭＥＭ組織培養培地中で増殖させた。次いで、この細胞を滅菌ＰＢＳで洗
浄し、そして増殖培地を、１フラスコあたり約８ｍｌの感染培地（ハンクス塩類
、１μｇ／ｍｌのＴＰＣＫトリプシン溶液、０．１２５％のウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液を有するＭＥＭを含む組織培養培
地）で置換した。ＭＤＣＫ細胞に、ウイルスＥＩＶ−ＭＳＶ＋３を含むＡＦ（Ｍ
ＤＣＫ細胞における第１継代について）またはＥＩＶ−ＭＳＶ＋４から収集され
たウイルスストック（ＭＤＣＫ細胞における第２継代について）を接種し、そし
てこれらのウイルスを、約３４℃で１時間吸着させた。接種物を細胞単層から除
去し、この細胞を再度ＰＢＳで洗浄し、そして１フラスコあたり約１００ｍｌの
感染培地を添加した。感染細胞を、約３４℃で２４時間インキュベートした。ウ
イルスに感染したＭＤＣＫ細胞を、細胞単層を破壊するように勢いよくフラスコ
を振盪することによって収集して、ウイルス単離株ＥＩＶ−ＭＳＶ＋４（ＭＤＣ
Ｋ細胞における第１継代）およびＥＩＶ−ＭＳＶ＋５（ＭＤＣＫ細胞における第
２継代）を得た。

【００７７】 ウイルスＥＩＶ−ＭＳＶ０およびＥＩＶ−ＭＳＶ＋５を、上記のＢ節に記載の
ように、表現型分析に供して、約３４℃、約３７℃および約３９℃の温度でプラ
ークを形成するその能力およびウイルスタンパク質を合成するその能力を決定し
た。ＥＩＶ−ＭＳＶ０およびＥＩＶ−ＭＳＶ＋５は両方とも、約３４℃の温度で
組織培養細胞においてプラークを形成したが、約３９℃の温度では、いずれのウ
イルス単離株もプラークを形成せず、検出可能なウイルスタンパク質合成も示さ
なかった。ウイルスＥＩＶ−ＭＳＶ０は、約３７℃の温度でＥＩＶ−Ｐ８２１と
同様の温度感受性表現型を有した（すなわち、ウイルスＥＩＶ−ＭＳＶ０は、プ
ラーク形成において阻害され、そして後期遺伝子発現が阻害された）。しかし、
ＥＩＶ−ＭＳＶ＋５は、その親ウイルスであるＥＩＶ−Ｐ８２１とは異なり、約
３７℃の温度で組織培養物中にプラークを形成し、そしてこの温度において、こ
のウイルスは、通常量のすべてのタンパク質を合成した。ウイルスＥＩＶ−ＭＳ
Ｖ＋５を、受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ−２６２７のもとで、ＡＴＣＣに寄託した。

【００７８】 （実施例２） 本発明の治療組成物を以下のように生成した。

【００７９】 Ａ．ＥＩＶ−Ｐ８２１の多量のストックを、以下のように、卵内において増殖
させた。約６０個の特定の病原体を含まない胚含有性鶏卵を明かりに透かして調
査し、そして生存していない卵を廃棄した。ストックウイルスを、滅菌ＰＢＳ中
で約１．０×１０^５ｐｆｕ／ｍｌまで希釈した。ウイルスを、実施例１Ａに記載
のように、卵の尿膜腔中に接種した。約３４℃の温度の加湿チャンバー内におけ
る３日間のインキュベーション後、ＡＦを、実施例１Ａに記載の方法に従って卵
から収集した。収集されたＡＦを、安定剤溶液（例えば、Ａ１／Ａ２安定剤（Ｄ
ｉａｍｏｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ，Ｄｅｓ Ｍｏｉｎｅｓ，ＩＡから
入手可能））と２５％Ｖ／Ｖ（安定剤／ＡＦ）で混合した。収集されたＡＦを遠
心管内で一つにまとめ、そして旋回バケットローターを装備したＩＥＣ Ｃｅｎ
ｔｒａ−７Ｒ冷却卓上遠心分離機（ＩＥＣ Ｃｅｎｔｒａ−７Ｒ ｒｅｆｒｉｇ
ｅｒａｔｅｄ ｔａｂｌｅ ｔｏｐ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｆｉｔｔｅｄ ｗ
ｉｔｈ ａ ｓｗｉｎｇｉｎｇ ｂｕｃｋｅｔ ｒｏｔｏｒ）において、１００
０ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって清澄化した。清澄化した液体を１
ｍｌ凍結バイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）中に分配し、そして約−７０℃で凍結さ
せた。ウイルスストックを、ＣＰＥおよび約３４℃でのプラークアッセイによっ
て、ＭＤＣＫ細胞において滴定した。

【００８０】 Ｂ．ＥＩＶ−Ｐ８２１の多量のストックを、以下のように、ＭＤＣＫ細胞中に
おいて増殖させた。ＭＤＣＫ細胞を、１５０ｃｍ^２組織培養フラスコ内において
、１０％仔ウシ血清を含有するハンクス塩類を有するＭＥＭ組織培養培地中で増
殖させた。次いで、この細胞を滅菌ＰＢＳで洗浄し、そして増殖培地を、１フラ
スコあたり約８ｍｌの感染培地で置換した。ＭＤＣＫ細胞に、約０．５ｐｆｕ／
細胞〜約０．００５ｐｆｕ／細胞の範囲のＭＯＩでウイルスストックを接種し、
そしてこれらのウイルスを、約３４℃で１時間吸着させた。接種物を細胞単層か
ら除去し、この細胞を再度ＰＢＳで洗浄し、そして１フラスコあたり約１００ｍ
ｌの感染培地を添加した。感染細胞を、約３４℃で２４時間インキュベートした
。ウイルスに感染したＭＤＣＫ細胞を、細胞単層を破壊するように勢いよくフラ
スコを振盪することによって収集し、安定剤溶液を、２５％Ｖ／Ｖ（安定剤／ウ
イルス溶液）でフラスコに添加した。この上清を無菌的に凍結バイアル中に分配
し、そして−７０℃で凍結した。

【００８１】 Ｃ．本発明の特定の低温適応型温度感受性ウマインフルエンザウイルスを含む
治療組成物を、以下のように処方した。以下の実施例３〜７に記載のようなワク
チン接種手順の直前に、ＥＩＶ−Ｐ８２１またはＥＩＶ−ＭＳＶ＋５のストック
バイアルを解凍し、そして水、ＰＢＳのいずれかを含む賦形剤中、または０．１
２５％ウシ血清アルブミンを含むハンクス塩類を有するＭＥＭ組織培養培地（Ｂ
ＳＡ−ＭＥＭ溶液）中において、動物への投与のために所望される希釈率まで希
釈した。ワクチン組成物は、ワクチン接種前には氷上に保持された。すべての治
療組成物を、ワクチン接種の直前に標準的方法によってＭＤＣＫ細胞において滴
定し、そして可能な場合には、動物に投与されたものと同じように処理された組
成物の量をワクチン接種後に滴定して、そのウイルスがその手順の間に生存可能
なままであったことを確実にする。

【００８２】 （実施例３） 低温適応型ウマインフルエンザウイルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含む治療組成物を
、以下のように、ウマインフルエンザウイルスに対して検出可能な予備的（ｐｒ
ｉｏｒ）免疫を示す３頭のウマにおける安全性およびその複製能力について試験
した。実施例１Ａに記載のように生成されたＥＩＶ−Ｐ８２１を、実施例２Ａに
記載のように卵内において増殖させ、そして実施例２Ｃに記載のように、２ｍｌ
のＢＳＡ−ＭＥＭ溶液あたり１０^７ｐｆｕのＥＩＶ−Ｐ８２１を含む治療組成物
へと処方した。

【００８３】 ウマインフルエンザウイルスに対する予備的な検出可能な血球凝集抑制（ＨＡ
Ｉ）力価を有する３頭のポニーに、以下の方法によって、ＥＩＶ−Ｐ８２１を含
む治療組成物を接種した。各々のポニーに、２ｍｌ用量のＥＩＶ−Ｐ８２１を与
えた。これは、偽外鼻孔（ｆａｌｓｅ ｎｏｓｔｒｉｌ）を通過して到達するに
十分な長さのブラントカニューレ（ｂｌｕｎｔ ｃａｎｎｕｌａ）を備えたシリ
ンジを用いて、外鼻孔あたり１ｍｌで鼻腔内投与した。

【００８４】 このポニーを、ワクチン接種の直後約３０分間およびワクチン接種後約４時間
目に、即時型アレルギー反応（例えば、くしゃみ、唾液過多、努力性呼吸もしく
は不正呼吸（ｉｒｒｅｇｕｌａｒ ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）、震え、アナフィラキ
シー、または熱）について観察した。この動物をさらに、ワクチン接種後１〜１
１日目に、遅延型アレルギー反応（例えば、嗜眠または食欲不振）についてモニ
ターした。この研究において、３頭のポニーはいずれも、ワクチン接種からの如
何なるアレルギー反応をも示さなかった。

【００８５】 このポニーを、ワクチン接種の２日前から開始してワクチン接種の１１日後ま
で続けて各日ほぼ同じ時間で毎日、ウマインフルエンザと合致する臨床的徴候に
ついて観察した。これらのポニーを、鼻分泌物、眼分泌物、食欲不振、性質（ｄ
ｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）、心拍数、毛細管補充時間（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｒｅ
ｆｉｌｌ ｔｉｍｅ）、呼吸数、呼吸困難、咳、肺音、上部歯肉（ｕｐｐｅｒ
ｇｕｍ）における毒線（ｔｏｘｉｃ ｌｉｎｅ）の存在、および体温について観
察した。さらに、顎下リンパ節および腹壁リンパ節を触診し、そしていかなる異
常をも書きとめた。この研究において、３頭のポニーはいずれも、観察期間の間
に如何なる異常反応も、顕性の臨床的徴候も示さなかった。

【００８６】 ０日目からワクチン接種後１１日目での動物におけるウイルス散布性（ｖｉｒ
ａｌ ｓｈｅｄｄｉｎｇ）について試験するために、Ｃｈａｍｂｅｒｓら，１９
９５，Ｅｑｕｉｎｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，１７，１９−２３に記載のように、鼻
咽頭スワブ（ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｓｗａｂ）をポニーから収集した
。Ｃｈａｍｂｅｒｓら（同書）は、その全体において、本明細書中において参考
として援用される。簡潔には、滅菌した２つのＤａｃｒｏｎポリエステル付刃塗
布具（Ｄａｃｒｏｎ ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ｔｉｐｐｅｄ ａｐｐｌｉｃａｔｏ
ｒｓ）（例えば、Ｈａｒｄｗｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏ．，Ｇｕｉｌｆｏ
ｒｄ，ＭＥから入手可能）を一緒に、ポニーの外鼻孔の各々に挿入した。このス
ワブ（合計４つ、各外鼻孔について２つ）を、生理的ｐＨでＰＢＳ中に５％グリ
セロール、ペニシリン、ストレプトマイシン、ネオマイシン、およびゲンタマイ
シンを含む、２．５ｍｌの冷却輸送培地を含有する１５ｍｌ円錐遠心管中に裂い
て入れた。このサンプルを湿らせた氷の上で保持し、スワブを培地中に無菌的に
絞り出し、そして鼻咽頭サンプルを２つのアリコートに分割した。１つのアリコ
ートを、実施例１に記載の方法を使用した、胚含有性卵の接種によるＥＩＶの単
離を試みるために使用した。次いで、接種した卵のＡＦを、標準的方法によって
、血球凝集を引き起こすその能力（これは、ＡＦにおけるウマインフルエンザウ
イルスの存在を示す）について試験した。ワクチン接種後２日目および３日目に
、もう一方のアリコートを、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｃｏｃｋｅｙ
ｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手可能なＤｉｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商標）Ｆｌｕ
Ａ試験によって、ウイルスについて試験した。

【００８７】 卵接種によって３頭の動物の鼻咽頭分泌物からのＥＩＶを単離する試みは失敗
した。しかし、２日目および３日目に、すべての動物が、Ｄｉｒｅｃｔｉｇｅｎ
Ｆｌｕ Ａ試験を使用してウイルス散布性の存在について試験されると陽性で
あった。このことは、ＥＩＶ−Ｐ８２１が、セロポジティブなポニーにおいて複
製しているという仮説と一致する。

【００８８】 本実施例に記載の接種動物および実施例４〜７に記載の動物におけるＥＩＶに
対する抗体力価を試験するために、ワクチン接種前およびワクチン接種後の指定
された日に、動物から採血した。血清を単離し、そしてトリプシン／過ヨウ素酸
塩またはカオリンのいずれかで処理して、通常の血清中に存在する血球凝集の非
特異的インヒビターをブロックした。血清サンプルを、例えば、９ ＣＦＲ １
１３．２のもとでＵ．Ｓ．Ｄ．Ａ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ
Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（これは、その全体において、本明細
書中において参考として援用される）によって提供される「Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎ
ｔａｌ ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ ｔｈｅ
ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏ
ｒ ｅｑｕｉｎｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ」（Ｓ
ＡＭ １２４）に記載される標準的な方法によって、新しい（ｒｅｃｅｎｔ）Ｅ
ＩＶ単離株に対する血球凝集阻害（ＨＡＩ）力価について試験した。

【００８９】 ３頭のポニーのＨＡＩ力価を表５に示す。見られ得るように、最初の力価に関
わらず、血清ＨＡＩ力価は、ＥＩＶ−Ｐ８２１でのワクチン接種後に３頭すべて
の動物において少なくとも４倍増加した。

【００９０】 これらのデータは、低温適応型ウマインフルエンザウイルスＥＩＶ−Ｐ８２１
がセロポジティブなポニーにおいて安全かつ非反応原性（ｎｏｎ−ｒｅａｃｔｏ
ｇｅｎｉｃ）であること、そしてこれらの動物が、予備的な明白な力価を有して
いたとしても、ウマインフルエンザウイルスに対する抗体力価の増加を示したこ
とを実証する。

【００９１】 （表５：ワクチン接種した動物のＨＡＩ力価^＊）

【００９２】

【表５】 ^＊ウマインフルエンザウイルスの新しい単離株によって赤血球の血球凝集を阻害
した血清の最高希釈率の逆数として、ＨＡＩ力価を表す。

【００９３】 （実施例４） 本実施例は、低温適応型ウマインフルエンザウイルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含む
治療組成物の安全性および効力を評価するための動物研究を開示する。

【００９４】 低温適応型ウマインフルエンザウイルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含む治療組成物を
、弱毒化（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）、およびビルレントウマインフルエンザウ
イルスでのチャレンジからウマを防御するその能力について、以下のように試験
した。実施例１に記載のようにして生成されたＥＩＶ−Ｐ８２１を、実施例２Ａ
に記載のように、卵内において増殖させ、そして実施例２Ｃに記載のように、２
ｍｌの水あたり１０^７ｐｆｕのウイルスを含む治療組成物へと処方した。８頭の
ＥＩＶセロポジティブなポニーを、本研究において使用した。８頭のうちの３頭
のポニーに、１０^７ｐｆｕのＥＩＶ−Ｐ８２１治療組成物を含む２ｍｌ用量でワ
クチン接種し、これは、実施例３に記載の方法と類似の方法を使用して、鼻腔内
投与した。１頭のポニーに、１０^７ｐｆｕのＥＩＶ−Ｐ８２１治療組成物を与え
た。これは、以下の方法によって微細な噴霧を作製するように適合された１０ｍ
ｌシリンジを使用して、咽頭に６ｍｌのウイルスを注入することによって、経口
投与した。針の装着のための突出した「シート」を、モデリング粘土を使用して
密封し、そしてそのキャップを適所に置いた。約１０個の孔を、２５ゲージ針を
使用して、シリンジの底部（すなわち、「シート」周辺）を通して開けた。この
シリンジを歯間腔に配置し、そして力強く、ウイルスを口の後方に注入した。残
りの４頭のポニーを、未ワクチン接種コントロールとして保持した。

【００９５】 ワクチン接種したポニーを、ワクチン接種の直後約３０分間およびワクチン接
種後約４時間目に、即時型アレルギー反応について観察し、そしてこの動物をさ
らに、ワクチン接種後１〜１１日目に、遅延型アレルギー反応についてモニター
した（両方とも、実施例３に記載のように行った）。この研究において、４頭の
ワクチン接種ポニーのいずれも、ワクチン接種からの如何なる異常な反応をも示
さなかった。

【００９６】 このポニーを、ウイルスワクチン接種の２日前から開始してワクチン接種の１
１日後まで続けて各日ほぼ同じ時間で毎日、臨床的徴候（例えば、実施例３に記
載の徴候）について観察した。この研究において、４頭のワクチン接種ポニーの
いずれも、観察期間の間に如何なる臨床的徴候をも示さなかった。この結果は、
低温適応型ウマインフルエンザウイルスＥＩＶ−Ｐ８２１が、弱毒化の表現型を
示すことを実証した。

【００９７】 ０日目からワクチン接種後１１日目でのワクチン接種動物におけるウイルス散
布性について試験するために、実施例３に記載のように、鼻咽頭スワブをポニー
から収集した。この鼻咽頭サンプルを、実施例３に記載の方法に従って、胚含有
性鶏卵内のウイルスについて試験した。

【００９８】 表６に示されるように、ウイルスを、卵での方法を使用して、わずか１つのワ
クチン接種動物からしか単離されなかった。しかし、実施例３に記述されたよう
に、この方法による単離の欠損は、ウイルス複製が起こっているという事実を排
除しない。なぜなら、複製は、より高感度な方法（例えば、Ｄｉｒｅｃｔｉｇｅ
ｎ Ｆｌｕ Ａ試験）によって検出され得るからである。

【００９９】 （表６：ワクチン接種後の卵内におけるウイルス単離）

【０１００】

【表６】 ワクチン接種動物におけるウマインフルエンザウイルスに対する抗体力価を試
験するために、ワクチン接種前およびワクチン接種後７日目、１４日目、２１日
目、および２８日目に、動物から採血した。血清サンプルを、実施例３に記載さ
れる方法に従って、単離し、そして新しいＥＩＶ単離株に対する血球凝集阻害（
ＨＡＩ）力価について試験した。

【０１０１】 ４頭のワクチン接種ポニーのＨＡＩ力価を表７に示す。

【０１０２】 （表７：ワクチン接種後のＨＡＩ力価）

【０１０３】

【表７】 実施例３の研究において記載された３頭の動物で観察されたＨＡＩ力価の増加
とは異なり、本研究における動物は、ＥＩＶ−Ｐ８２１でのワクチン接種後のＨ
ＡＩ力価において、有意な増加（すなわち、４倍よりも高い）を示さなかった。

【０１０４】 ワクチンウイルス投与から約４ヵ月半後に、８頭すべてのポニー（すなわち、
ワクチン接種した４頭および４頭の未ワクチン接種コントロール）に、以下の方
法によってチャレンジした。各動物について、１０^７ｐｆｕのビルレントウマイ
ンフルエンザウイルス株Ａ／ｅｑｕｉｎｅ／Ｋｅｎｔｕｃｋｙ／１／９１（Ｈ３
Ｎ８）を、５ｍｌの水中に懸濁した。マスクを噴霧器に接続し、そしてこのマス
クを、動物の鼻鏡部（外鼻孔を含む）に置いた。各動物が５ｍｌ全量を送達する
ために５〜１０分間かかるような設定を使用して、五（５）ｍｌを各動物に噴霧
した。実施例３に記載されるような臨床的観察を、チャレンジの３日前およびチ
ャレンジ後の１１日間毎日、すべての動物において実施した。

【０１０５】 ワクチン接種した動物が、ウマインフルエンザウイルスに対するそのＨＡＩ力
価において著しい増加を示さなかったという事実にもかかわらず、４頭すべての
ワクチン接種動物が、ウマインフルエンザウイルスチャレンジに対して防御され
た。ワクチン接種動物のいずれも、顕性の臨床的徴候も熱も示さなかったが、こ
の動物のうちの１頭は、２日間にわたり軽いぜん鳴を有した。他方で、４頭すべ
ての未ワクチン接種ポニーがウイルスを散布し、そしてウマインフルエンザウイ
ルス感染に特徴的な臨床的徴候および熱を発症した。従って、本実施例は、本発
明の治療組成物が、ウマインフルエンザ疾患からウマを防御し得ることを実証す
る。

【０１０６】 （実施例５） 本実施例は、低温適応型ウマインフルエンザウイルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含む
治療組成物の弱毒化、およびビルレントウマインフルエンザウイルスでの以後の
チャレンジからワクチン接種したウマを防御するその能力を評価するためのさら
なる動物研究を開示する。さらに、本研究は、この治療組成物の安全性および効
力に対する運動ストレスの作用を評価した。

【０１０７】 低温適応型ウマインフルエンザウイルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含む治療組成物を
、以下のように、ウマにおける安全性および効力について試験した。実施例１に
記載のようにして生成されたＥＩＶ−Ｐ８２１を、実施例２Ａに記載のように卵
内において増殖させ、そして実施例２Ｃに記載のように、５ｍｌの水あたり１０^７ ｐｆｕのウイルスを含む治療組成物へと処方した。１５頭のポニーを、この研
究に使用した。ポニーを、表８に示すように、各々５頭の動物の３つの群（２つ
のワクチン接種群および１つの未ワクチン接種コントロール群が存在すｒ）へと
無作為に割り当てた。第２群のポニーは、ワクチン接種前に運動ストレスを受け
、一方、ワクチン接種した第１群のポニーは、馬屋に収容した。

【０１０８】

【表８】 グループ２のポニーを、以下のようにワクチン接種の前にトレッドミル上で、
運動ストレスを与えた。このポニーを、トレッドミルの６時間の歩行のみでの使
用によりトレッドミルの使用に順応させた。実際の運動ストレスは、ワクチン接
種の４日前に開始し、ワクチン接種の当日に（ワクチン接種の直前に）終了する
毎日の運動レジメンを含んだ。トレッドミル運動レジメンを表９に示す。

【０１０９】

【表９】 グループ１および２に、実施例４に記載されるチャレンジのために記載される
噴霧方法により１０^７ｐｆｕのＥＩＶ−Ｐ８２１を含む治療組成物を与えた。こ
の研究でワクチン接種した全てのポニーは、ワクチン接種からの即時性または遅
発性のいずれのアレルギー反応も示さなかった。

【０１１０】 ポニーを、実施例３に記載されるような臨床的徴候について毎日観察した。観
察は、毎日およそ同じ時間に行い、ワクチン接種の２日前に始まり、ワクチン接
種後１１日間続けた。この研究でワクチン接種した全てのポニーは、観察期間の
間、いかなる明白な臨床的徴候も示さなかった。

【０１１１】 ワクチン接種前およびワクチン接種後１日目〜１１日目にワクチン接種された
動物におけるウイルス散布物（ｖｉｒａｌ ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を試験するため
に、鼻咽頭のスワブを、実施例３に記載されるようにポニーから回収した。鼻咽
頭サンプルを、実施例３に記載される方法に従い、胚含有鶏卵におけるウイスル
について試験した。ウイルスをワクチン接種された動物（すなわち、表１０に示
されるグループ１および２）から単離した。

【０１１２】

【表１０】 ワクチン接種した動物におけるウマインフルエンザウイルスに対する抗体力価
を試験するために、血液を、ワクチン接種の前およびワクチン接種後７、１４、
２１、および２８日目に回収した。血清サンプルを単離し、そして実施例３に記
載される方法に従い、新しいＥＩＶ単離体に対するＨＡＩ力価について試験した
。これらの力価を表１１に示す。

【０１１３】

【表１１】 ワクチン接種後９０日で、全ての１５頭のポニーに、実施例４に記載されるよ
うな噴霧方法により、１０^７ｐｆｕのウマインフルエンザウイルス株Ａ／ｅｑｕ
ｉｎｅ／Ｋｅｎｔｕｃｋｙ／１／９１（Ｈ３Ｎ８）を用いてチャレンジした。実
施例３に記載されるような臨床的観察を、全ての動物に対して、チャレンジ前の
３日間およびチャレンジ後１１日間毎日実施した。ワクチン接種したポニーにお
いて観察されたいかなる明確な臨床的徴候も存在しなかった。５頭の非ワクチン
接種ポニーのうちの４頭は、発熱し、そしてウマインフルエンザウイルス感染の
代表的な臨床的徴候を示した。

【０１１４】 従って、この実施例は、ワクチン接種前にウマにストレスを与えた場合でさえ
、本発明の治療的組成物が、ウマインフルエンザ疾患に対してこの動物を防御す
ることを実証する。

【０１１５】 （実施例６） この実施例は、卵の中で増殖された本発明の治療組成物と組織培養細胞中で増
殖された本発明の治療組成物との感染性を比較した。産生の観点から、胚含有鶏
卵よりも組織培養物において本発明の治療組成物を増殖させる利点を有する。し
かし、ウマインフルエンザウイルスは、細胞中では卵の中ほど高力価に増殖しな
い。さらに、このウイルスの赤血球凝集素は、感染のためにトリプシン様プロテ
アーゼによる細胞外タンパク質分解開裂を必要とする。血清はトリプシンインヒ
ビターを含むので、細胞培養物中で増殖されるウイルスは、感染性であるために
トリプシンを含む無血清培地中で増殖されなければならない。このような状態が
、決して組織培養細胞の生存性のために最適ではないことは、当業者により周知
である。さらに、これらの増殖条件は、ウマ細胞に対する変更された結合親和性
を有するウイルスについて選択し得る。これは、ウイルス感染性に影響を及ぼし
得る。なぜなら、このウイルスは、複製するためおよび免疫を刺激するために動
物の鼻粘膜に効率的に結合することを必要とするからである。従って、この実施
例で開示される研究目的は、本発明の治療組成物の感染性が、インビトロでの組
織培養において複数の継代の間増殖されることにより有害な影響を受けるか否か
を評価することであった。

【０１１６】 実施例１に記載されるように産生されたＥＩＶ−Ｐ８２１を、実施例２Ａに記
載されるように卵か、または実施例２Ｂに記載されるようにＭＤＣＫ細胞におい
て増殖させた。それぞれの例において、ウイルスを５回継代させた。ＥＩＶ−Ｐ
８２１を、その各継代後の低温適応性および温度感受性の表現型について試験し
た。卵継代ウイルス調製物および細胞継代ウイルス調製物を、実施例２Ｃに記載
されるように、１０^７ｐｆｕウイルス／２ｍｌ ＢＳＡ−ＭＥＭ溶液を含む治療
組成物中に処方し、それぞれ、卵増殖ＥＩＶ−Ｐ８２１治療組成物およびＭＤＣ
Ｋ細胞増殖ＥＩＶ−Ｐ８２１治療組成物を得た。

【０１１７】 ８頭のポニーをこの研究に用いた。各動物由来の血清を、この研究前にウマイ
ンフルエンザウイルスに対するＨＡＩ力価について試験した。これらの動物を、
それぞれ４頭のポニーからなる２つのグループのうちの１つに無作為に割り当て
た。グループＡは、卵増殖ＥＩＶ−Ｐ８２１治療組成物を受け入れ、そしてグル
ープＢは、ＭＤＣＫ増殖ＥＩＶ−Ｐ８２１治療組成物を受け入れた。これらの治
療組成物は、実施例３Ｂに記載されるように調製した。この治療組成物を、実施
例３に記載される方法により、鼻腔内投与した。

【０１１８】 これらのポニーを、実施例３に記載されるようなアレルギー反応または臨床的
徴候について、毎日ほぼ同じ時間、ワクチン接種の２日前に開始し、そしてワク
チン接種後１１日間続けて、毎日観察した。これらの動物のいずれにおいても、
アレルギー反応または明白な臨床的徴候は観察されなかった。

【０１１９】 鼻咽頭のスワブを、ワクチン接種前およびワクチン接種後１１日間毎日回収し
た。鼻のスワブにおけるウイルス物質の存在は、実施例１に記載されるように感
染したＭＤＣＫ細胞におけるＣＰＥの検出によるか、または実施例３に記載され
るような卵への播種および感染ＡＦの赤血球凝集を引き起こす能力の試験により
決定された。この物質を、ウイルスのみの存在について試験し、サンプル中のウ
イルスの力価について試験しなかった。ウイルスの単離結果を表１２に列挙する
。血液を回収し、ワクチン接種後０、７、１４、２１、および２８日目の血清サ
ンプルを、新しい単離株に対する赤血球凝集阻害抗体力価について試験した。

【０１２０】

【表１２】 表１２の結果は、卵増殖ＥＩＶ−Ｐ８２１治療組成物とＭＤＣＫ増殖ＥＩＶ−
Ｐ８２１治療組成物との間で、感染性または免疫原性において有意な差がなかっ
たことを示す。

【０１２１】 （実施例７） この実施例は、ウマインフルエンザウイルス感染からウマを防御するために必
要とされる低温適応型ウマインフルエンザウイルスを含む治療組成物の最小用量
を評価した。

【０１２２】 実施例３〜６に開示される動物研究は、本発明の治療組成物が、効果的で安全
であることを示した。それらの研究において、１０^７ｐｆｕの用量（約１０^８
ＴＣＩＤ_５０ユニットに相関する）が、用いられた。しかし、費用および安全性
の観点から、ウマインフルエンザウイルスにより引き起こされる疾患からウマを
防御する最小限のウイルス力価を使用することが有利である。この研究において
、ポニーを、低温適応型ウマインフルエンザウイルスを含む、４つの異なる用量
の治療組成物でワクチン接種して、病原性のウマインフルエンザウイルスチャレ
ンジに対してウマを防御する最小限の用量を決定した。

【０１２３】 実施例１Ａに記載されるように生成されたＥＩＶ−Ｐ８２１を実施例２Ｂに記
載されるようにＭＤＣＫ細胞において継代し、増殖させ、そして実施例２Ｃに記
載されるように、２×１０^４、２×１０^５、２×１０^６、または２×１０^７ Ｔ
ＣＩＤ_５０ユニット／１ｍｌ ＢＳＡ−ＭＥＭ溶液のいずれかを含む治療組成物
中に処方した。種々の年齢および品種の１９頭のウマをこの研究のために使用し
た。これらのウマを、４つのワクチングループ（３頭のウマからなる１つのグル
ープおよび４頭のウマからなる３つのグループ、ならびに４頭のウマからなる１
つのコントロールグループ）に割り当てた（表１３を参照のこと）。ワクチング
ループの各ポニーに、１ｍｌ用量の示された治療組成物を与え、実施例３に記載
されるのと同様の方法により鼻腔内投与した。

【０１２４】

【表１３】 これらのポニーを、ワクチン接種直後のおよそ３０分間の間およびワクチン接
種後のおよそ４時間で即効型反応について観察し、そしてこれらの動物を、遅延
型反応についてワクチン接種後１日目から１１日目にさらにモニターした（両方
とも、実施例３に記載される）。この研究においてワクチン接種したポニーは、
ワクチン接種から異常な反応も明白な臨床的徴候も示さなかった。

【０１２５】 ワクチン接種の３日前、ワクチン接種後７日目、１４日目、２１日目、および
２８日目、ならびにチャレンジ後３５日目および４２日目に、血清分析のために
血液を収集した。血清サンプルを実施例３に記載される方法に従い最新のＥＩＶ
単離株に対するＨＡＩ力価について試験した。これらの力価を表１４に示す。２
９日目のチャレンジの前に、グループ１の３頭の動物の中の２頭、グループ２の
４頭の動物の中の４頭、グループ３の４頭の動物の中の３頭、およびグループ４
の４頭の動物の中の２頭が、ワクチン接種後のＨＡＩ力価において少なくとも４
倍の増加を示した。さらに、４頭のコントロールのウマの中の２頭もまた、ＨＡ
Ｉ力価における増加を示した。この結果についての１つの解釈は、この研究にお
いて全てのウマが同じ納屋で飼育されていたので、コントロールのウマが、ワク
チン接種したウマから伝染されたワクチンウイルスに曝されたということである
。

【０１２６】

【表１４】 ワクチン接種後２９日目に、全ての１９頭のポニーを、実施例４に記載される
ような噴霧方法により、ウマインフルエンザウイルス株Ａ／ｅｑｕｉｎｅ／Ｋｅ
ｎｔｕｃｋｙ／１／９１（Ｈ３Ｎ８）を用いてチャレンジした。このチャレンジ
の用量は、それぞれの動物について５ｍｌの容量に約１０^８ ＴＣＩＤ_５０ユニ
ットのチャレンジウイルスを含むと予測的に算出された。実施例３に記載される
ような臨床的観察を、チャレンジ前の２日で始めて、チャレンジの日、およびチ
ャレンジ後１１日間、モニターした。表１４に示されるように、グループ１また
はグループ２の動物は、ウマインフルエンザ疾患の指標である臨床的徴候を示さ
ず、そしてグループ３の４頭の動物の中の１頭のみが病気にかかった。グループ
４の４頭の動物の中の２頭は病気にかかり、そして４頭のコントロール動物の中
の２頭のみが病気にかかった。表１４におけるこれらの結果は、セロコンバージ
ョンと疾患からの防御との間の関係を示した。なぜならば、例えば、ワクチン接
種期間の間に増加したＨＡＩ力価を示した２頭のコントロール動物は、チャレン
ジ後にウマインフルエンザウイルスの臨床的徴候を示さなかったからである。し
かし、別の解釈は、チャレンジウイルスの実際の力価が、１０^８ ＴＣＩＤ_５０ ユニットの計算量よりも小さかったかもしれないということであった。なぜなら
ば、これまでの結果に基づき、このチャレンジのレベルは、全てのコントロール
動物において疾患を引き起こすはずだったからである。

【０１２７】 にもかかわらず、少なくとも２×１０^６ ＴＣＩＤ_５０ユニットの低温適応型
ウマインフルエンザウイルスを含む治療組成物を受け入れたグループにおけるセ
ロコンバージョンのレベルおよび臨床的徴候の欠失は、この量が、ウマインフル
エンザ疾患に対してウマを防御するために十分であったことを示す。さらに、２
×１０^５ ＴＣＩＤ_５０ユニットの用量は、４頭のウマの中の３頭でセロコンバ
ージョンを誘導し、そしてチャレンジからの臨床的防御を与えた。従って、この
量でさえ、ウマインフルエンザ疾患に対してウマにおいて有意な防御を与えるの
に十分であり得る。

【０１２８】 （実施例８） この実施例は、低温適応型ウマインフルエンザウイルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含
む治療組成物の非特異的な干渉効果の報告を開示する。

【０１２９】 実施例１に記載されるように生成された低温適応型ウマインフルエンザウイル
スＥＩＶ−Ｐ８２１を含む治療組成物を、実施例２Ａに記載される手順と同様に
卵の中で増殖させ、実施例２Ｂに記載される手順と同様にＭＤＣＫ細胞における
継代により拡大し、そして実施例２Ｃに記載されるように治療組成物中に処方し
た。３つの飼育場の３４頭のウマを、これらの観察に含んだ。全てのウマは、不
確定な原因による鼻汁を有していた。飼育場１の約１〜２歳の２頭のウマ、飼育
場２の約１〜２歳の１５頭のウマ、および飼育場３の約３〜６歳の８頭の仔ウマ
の各々に、送達デバイスの先端をその末端に取り付けたシリンジを用いて、実施
例２に記載されるようにして生成された治療組成物を、約１０^７．５ ＴＣＩＤ_５０ ユニットの治療組成物を含む１．０ｍｌの用量で一方の鼻孔に鼻腔内投与し
た。飼育場３において、鼻汁を有する９頭の仔ウマは、本発明の治療組成物を受
けなかった。

【０１３０】 飼育場１において、２頭のウマの鼻汁は、治療組成物の投与後２日目までに改
善された。飼育場２において、１５頭のウマの鼻汁は、治療組成物の投与後１日
目までに改善された。飼育場３において、８頭のワクチン接種した仔ウマのうち
の７頭の鼻汁は、治療組成物の投与後２日目までに改善された。治療組成物を投
与されなかった９頭の仔ウマの鼻汁は、改善されなかった。

【０１３１】 （実施例９） この実施例は、低温適応型ウマインフルエンザウイルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含
む治療組成物の抗ウイルス効果の報告を開示する。

【０１３２】 実施例１に記載されるように生成された低温適応型ウマインフルエンザウイル
スＥＩＶ−Ｐ８２１を含む治療組成物を、実施例２Ａに記載される手順と同様に
卵の中で増殖させ、実施例２Ｂに記載される手順と同様にＭＤＣＫ細胞における
継代により拡大し、そして実施例２Ｃに記載されるように治療組成物中に処方し
た。１００頭のウマ（これらの全てがインフルエンザの臨床的徴候を示していた
）に、実施例８に記載されるような様式で治療組成物を投与した。投与の時に、
約２０〜３０頭のウマがインフルエンザの初期段階（水っぽい鼻汁および高い体
温を有する）にあり、そして約７０〜８０頭のウマがインフルエンザの後期段階
（粘液膿性の鼻汁、ほとんどは発熱していない）にあった。獣医はまた、インフ
ルエンザの後期段階にある約３０頭のウマを抗生物質で処置した。インフルエン
ザの臨床的徴候は、これらのうち９０頭のウマ（インフルエンザの初期段階にあ
る全てのウマ（これらは抗生物質を与えられていない）を含む）において処置の
３日以内に解消された。他の１０頭のウマは、抗生物質を続け、そして１週間で
感染の臨床的徴候が解消された。全てのウマは処置の開始の１０日以内にレース
の訓練に復帰した。本発明の治療組成物の前に、獣医は、病気のウマを抗生物質
のみで処置し、そしてウマが感染の臨床サインを解消するのに少なくとも２週間
、およびウマがレースの訓練に復帰するまでに少なくとも３週間かかった。実際
、約５０％のケースで、獣医は、抗生物質を切り換え、そしてウマの処置を続け
る必要があった。

【０１３３】 本発明の種々の実施形態は詳細に記載されているが、それらの実施形態の改変
および適応が当業者に理解されることは明らかである。しかし、このような改変
および適応は、上記の特許請求の範囲に示されるように本発明の範囲内にあるこ
とが明らかに理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヤングナー， ジュリアス エス． アメリカ合衆国 ペンシルベニア 15217， ピッツバーグ， マルボロ アベニュー 5831 Ｆターム(参考） 4C085 AA03 BA55 CC08 EE01 GG08

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 呼吸器疾患について動物を処置する方法であって、（ａ）低
   温適応型ウマインフルエンザウイルス；および（ｂ）低温適応により生成される
   ウマインフルエンザウイルスの少なくとも１つのゲノムセグメントを含む再組み
   合わせインフルエンザＡ型ウイルス、からなる群より選択されるウイルスを含む
   治療組成物を該動物に投与する工程を包含し、該ウマインフルエンザウイルスは
   、低温適応性、温度感受性、優性干渉、および弱毒化からなる群より選択される
   同定された表現型を有し、該ウマウイルスインフルエンザゲノムセグメントは、
   該再組み合わせウイルスに同定された表現型の少なくとも１つを与える、方法。
2. 【請求項２】 呼吸器疾患について動物を処置する方法であって、（ａ）優
   性干渉表現型を有する低温適応型ウマインフルエンザウイルス；および（ｂ）低
   温適応表現型および優性干渉表現型を与えるウマインフルエンザウイルスゲノム
   の一部を含む再組み合わせインフルエンザＡ型ウイルス、からなる群より選択さ
   れるウイルスを含む治療組成物を該動物に投与する工程を包含し、ここで、該治
   療組成物は非特異的干渉を示す、方法。
3. 【請求項３】 前記呼吸器疾患が、ウイルス感染または細菌感染もしくはそ
   れらの組合せにより引き起こされる、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記呼吸器疾患がインフルエンザにより引き起こされる、請
   求項１または請求項２に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記動物がウマである、請求項１または請求項２に記載の方
   法。
6. 【請求項６】 前記治療組成物が低温適応型ウマインフルエンザウイルスを
   含み、前記疾患がウイルスまたは細菌の感染もしくはそれらの組合せにより引き
   起こされ、そして前記治療組成物がウマ科の処置として投与され、それによって
   該ウマ科においてウイルス感染または細菌感染もしくはそれらの組合せに対する
   非特異的干渉応答を誘発する、請求項１または請求項２に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記治療組成物が約１０^７ ＴＣＩＤ_５０ユニット〜約１０^８ ＴＣＩＤ_５０ユニットの前記ウイルスを含む、請求項１または請求項２に記
   載の方法。
8. 【請求項８】 前記治療組成物が、感染の主要な臨床的徴候として鼻汁を示
   す呼吸器疾患についてウマ科を処置する、請求項１または請求項２に記載の方法
   。
9. 【請求項９】 前記治療組成物が、鼻汁に対して約３月〜約２年の年齢のウ
   マ科を処置する、請求項１または請求項２に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記治療組成物が、呼吸器疾患についてウマ科を処置し、
    疾患の主要な臨床的徴候が約７日以内に減少する、請求項１または請求項２に記
    載の方法。
11. 【請求項１１】 前記治療組成物が、ウイルス感染または細菌感染もしくは
    それらの組合せを阻害する、請求項１または請求項２に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記治療組成物が、ウイルスまたは細菌の二次感染もしく
    はそれらの組合わせを阻害する、請求項１または請求項２に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記呼吸器疾患がウマインフルエンザであり、そして前記
    治療組成物が優性干渉を示す、請求項１または請求項２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記治療組成物が感染の初期のサインとして鼻汁および発
    熱を示す呼吸器疾患についてウマ科を処置する、請求項１または請求項２に記載
    の方法。
15. 【請求項１５】 前記治療組成物が呼吸器疾患についてウマ科を処置し、疾
    患の主要な臨床的徴候が７日以内に減少し、そして該ウマ科のレースの訓練が処
    置の約１０日以内に再開し得る、請求項１または請求項２に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記治療組成物が抗ウイルス効果を有する、請求項１また
    は請求項２に記載の方法。