BR112012022680B1

BR112012022680B1 - uso de uma vacina inativada contra vírus da influenza canina

Info

Publication number: BR112012022680B1
Application number: BR112012022680-0A
Authority: BR
Inventors: Nallakannu P. Lakshmanan; Muralidhar S. Deshpande; Huchappa Gowda Jayappa; Terri Lee Wasmoen
Original assignee: Intervet International B.V
Priority date: 2010-03-10
Filing date: 2011-03-08
Publication date: 2021-03-02
Also published as: CA2791396C; AU2011224507A1; JP2013522209A; BR112012022680A2; CA2791396A1; ES2687702T3; EP2544717A1; EP2544717B1; RU2586294C2; CN102791287A; ZA201206713B; WO2011112593A1; RU2012143152A; KR20130018681A

Abstract

MÉTODOS PARA PROTEGER UM ANIMAL CANINO E UM CANINO DOENÇA, E, USO DE UMA VACINA CONTRA VÍRUS DA INFLUENZA CANINA. Um método para proteger um animal contra doença causada por um patógeno secundário, compreendendo obter uma vacina compreendendo um antígeno contra um patógeno primário, e administração ao animal de uma quantidade imunogenicamente eficaz da vacina contra o patógeno primário.

Description

Referência aos pedidos relacionados

[001] Este pedido reivindica prioridade sob 35 USC. § 119(e) doPedido Provisório US de Número de Série 61/312.380 depositado aos 20 de Março de 2010, cujo conteúdo é aqui incorporado em sua totalidade como referência.

Campo da invenção

[002] Foi verificado que a administração de uma vacina contra umpatógeno primário protege contra doença causada por um patógeno secundário, ou oportunista. Por exemplo, caninos foram protegidos da doença causada por patógenos secundários, tal como Streptococcus equisubespécie zooepidemicus (S. equi), pela imunização contra patógenos colaterais.

Fundamentos da invenção

[003] S. equi tem estado associado com doença respiratória infeciosacanina (canine infectious respiratory disease, CIRD), que tem sido reconhecida como uma infecção multifatorial que principalmente afeta cães mantidos em canil (Chalker et al., Veterinary Microbiology 95 (2003):149- 156). Foi verificado, contudo, que S. equi poderia ser isolado de cães assintomáticos, saudáveis, não mantidos em canil. S. equi contribui para a severidade de CIRD apenas em combinação com outros patógenos.

[004] Vírus da influenza canina (canine influenza virus, CIV) temsido identificado como um vírus H3N8 elevadamente homólogo ao vírus de influenza equina. Tem sido verificado que o vírus da influenza canina é virulento em determinados tipos de cães. Por exemplo, foi verificado que ele é a causa de uma epidemia que matou vários Greyhounds de corrida em canis em Jacksonville, Flórida. Embora 100 por cento dos cães expostos se tornaram infectados, foi verificado que apenas 80 por cento manifestaram os sinais clínicos da infecção. Além disso, embora alguns cães expostos ao CIV tenham desenvolvido uma doença aguda com sinais clínicos de pneumonia, os cães em sua maioria experimentam síndrome mais suave tal como uma tosse que persiste por 10 a 21 dias..

[005] Verificou-se que as severidades tanto de S. equi quanto de CIVsão intensificadas pela coinfecção por ambos.

Sumário da invenção

[006] Um método para proteger um canino contra doença causadapor patógenos secundários compreende administrar uma vacina contra um patógeno primário. Em uma modalidade preferida o canino a ser protegido é imunizado com uma vacina contra CIV, protegendo deste modo o canino contra doença causada por um patógeno secundário tal como S. equi. Como uma consequência, o canino é protegido contra ambos CIV e S. equi.

Breve Descrição das figuras

[007] Figura 1, Pontuações Clínicas após teste com CIV, representagraficamente as pontuações clínicas médias para cada grupo de tratamento desde dois dias antes do teste com CIV até 13 dias após o teste. Todos os cães foram testados com CIV no dia 35 do estudo e foram monitorados diariamente desde o dia 2 até o dia 13 após o teste com CIV para sinais clínicos. As pontuações clínicas médias para cada grupo de tratamento foram plotadas contra os dias após teste. Referir à Tabela 4 para pontuações clínicas.

[008] Figura 2, Excreção Nasal de CIV após teste, representagraficamente os títulos virais médios para cada grupo medido pela coleta com mechas absorventes nasais em cada um dos dias desde dia 1 até dia 10 após o teste. Todos os cães em Grupos 1, 3 e 4 foram testados com CIV no dia 35. As mechas absorventes nasais foram coletadas no dia antes do teste (dia 1) para confirmar se os cães filhotes estavam livres de CIV. Excreção nasal viral foi monitorado em cães testados pela coleta com mechas absorventes nasais diariamente por 10 dias (dia 1 até 10 dias após o teste) e realização de titulação sobre monocamadas de MDCK. Os títulos virais médios para cada grupo de tratamento, expressados como Log10 TCID50/mL, foram calculados em plotados contra os dias após teste.

[009] Figura 3, Isolamento de S. equi das mechas absorventes nasaise de lavagem pulmonar, representa graficamente a percentagem de cães em cada grupo positivos para S. equi desde o dia antes do teste com CIV até o dia 14 após o teste.

Descrição detalhada da invenção

[0010] A presente invenção é direcionada a um método para proteger caninos contra doença causada por patógenos secundários que não apresentam sinais clínicos na ausência de fatores comprometedores, tal como coinfecção com outro patógeno. Em tais casos, mesmo que cada patógeno em si mesmo não apresente sinais clínicos, aos dois juntos resultam em patogênese intensificada e doença clinicamente significativa.

[0011] Vírus da influenza canina (CIV) de subtipo H3N8 pode causar doença respiratória aguda em alguns cães. Foi determinado que Streptococcus equisubespécie zooepidemicus (S. equi) exacerbou a doença causada CIV pela investigação da patogênese após coinfecção de cães com CIV e S. equi. Similarmente, verificou-se que cães infectados com S. equi sozinho não apresentaram sinais clínicos, mas quando testados com ambos CIV e S. equi, foi observada doença clínica. Verificou-se então que imunização com uma vacina contra CIV protegeu os cães contra teste duplo com CIV virulento e S. equi. Surpreendentemente, doença respiratória causada por S. equi poderia ser evitada pela administração de uma vacina contra CIV.

[0012] Cães testados com S. equi sozinho não exibiram nenhuns sinais clínicos, excreção bacteriana ou lesões pulmonares. Cães testados com CIV sozinho desenvolveram alguns sinais clínicos, excreção viral e lesões pulmonares. As pontuações clínicas, excreção de CIV e/ou S. equi, e pontuações pulmonares foram substancialmente mais altas em cães testados com CIV mais S. equi quando comparados com cães testados com CIV sozinho ou com apenas S. equi. As pontuações pulmonares, pontuações clínicas e excreção bacteriana foram significativamente menores em cães vacinados contra CIV testados com CIV mais S. equi quando comparados com cães não vacinados testados com quer CIV sozinho quer CIV mais S. equi.

[0013] Como aqui usado, o termo patógeno primário refere-se a um patógeno que pode causar sinais clínicos de uma doença em alguns animais, mas não necessariamente de tal severidade que possam ser detectados em todos os animai expostos ao patógeno.

[0014] Como aqui usado, o termo patógeno secundário refere-se a um patógeno que provavelmente não é o causador de sinais clínicos de uma doença em animais expostos ao patógeno a não ser que o animal esteja enfraquecido pela exposição a outro patógeno ou esteja diferentemente em um estado enfraquecido, também algumas vezes chamado de um patógeno oportunista.

[0015] Um patógeno que em si mesmo seria um patógeno secundário e não provavelmente causaria sinais clínicos de doença pode funcionar como um patógeno primário quando presente com um ou mais outros patógeno os secundários.

[0016] Para o propósito de ilustração, e não de limitação, nas modalidades aqui apresentadas CIV pode ser chamado de um patógeno primário e S. equi pode ser chamado de um patógeno secundário.

[0017] Tosse canina é uma doença importante em cães causada por numerosos patógenos virais e bacterianos. CIV e S. equisão dois patógenos novos que têm sido isolados frequentemente nos anos recentes dos casos de doença respiratória canina, especialmente em cães de canil e cães de abrigo.

[0018] Foi investigada a patogênese de infecção dupla com CIV e S. equi em cães e foi avaliada a eficácia da vacina contra CIV em infecção dupla. Diferentemente dos cães infectados com apenas CIV, a maioria dos cães infectados com CIV mais S. equi exibiu febre clínica que demorou mais, e sinais clínicos mais severos, especialmente tosse, que perduraram mais tempo. Excreção nasal por S. equi em cães duplamente testados foi muito mais intenso com respeito ao número de cães positivos para excreção e a duração da excreção. Ademais, teste duplo induziu pontuações pulmonares substancialmente mais altas em comparação com quer CIV sozinho com quer S. equi sozinho. Verificou-se que cães testados com S. equi sozinho não exibiram febre clínica, sinais clínicos de doença respiratória ou lesões pulmonares. Ademais, S. equinão foi detectável nas secreções nasais de cães testados com S. equi sozinho. Verificou-se que S. equi sozinho não é capaz de induzir nenhuma doença e que S. equié um patógeno oportunista que na presença de CIV ocasiona colonização bacteriana. S. equi exacerba febre, outros sinais clínicos e patologia pulmonar associada causada por CIV. Verificou-se que administração de vacina contra CIV mitigou os sinais clínicos, a excreção viral/bacteriana e as lesões pulmonares induzida(s), não apenas por CIV sozinho, mas também por CIV mais S. equi. A vacinação contra CIV preveniu doença respiratória causada por CIV e por patógenos oportunistas tal como S. equi.

[0019] S. equi para teste pode ser obtido de animais infectados, tal como o isolado usado no exemplo que segue, ou pode ser obtido de depósitos, tal como um isolado disponível na ATCC, de Número 6580.

[0020] Exemplos de vírus de influenza canina que podem ser usados para teste, tal como no exemplo abaixo, e/ou para preparar vacinas para administração de acordo com a invenção incluem os vírus H3N8 descritos em Pedido de Patente US de Número 11/582.652, depositado aos 18 de Outubro de 2006 (Pedido US Publicado 2007/0092537), Pedido de Patente US de Número 11/544.841, depositado aos 6 de Outubro de 2006 (Pedido US Publicado 2007/0082012), Pedido Internacional de Número PCT/US2006/04161, depositado aos 19 de Outubro de 2006, e Pedido de Patente US de Número 11/956.658, depositado aos 14 de Dezembro de 2007, todos os quais são pelo presente aqui incorporados em suas totalidades como referências.

[0021] As vacinas contra CIV da presente invenção terão vírus virulentos, atenuados, ou mortos, ou compreenderão subunidades antigênicas. Vírus virulentos e atenuado são intencionados para incluírem vírus recombinantes, bem como isolados virulentos, vírus mudados de cultivo, vírus adaptados ao frio e vírus tornados menos virulentos ou não patogênicos por outros meios. A vacina contra CIV também pode ser uma vacina comercial tal como a vacina contra CIV disponível na Intervet Inc./Schering-Plough Animal Health, Elkhorn, NE, NOBIVAC® Canine Flu H3N8. Qualquer vacina contra CIV eficaz pode ser usada de acordo com a invenção.

[0022] A presente invenção adicionalmente obtém combinação de vacinas para produzir imunidade protetora contra vírus da influenza, e.g., vírus da influenza canina (CIV) e outras doenças, e.g., outras doenças infecciosas caninas. Tais vacinas terão vírus virulentos, atenuados e/ou mortos e/ou bactérias, e/ou compreenderão subunidades antigênicas. Consequentemente, a presente invenção obtém combinação de vacinas que incluem uma ou mais cepas de CIV, e.g., CIV H3N8 inativado, em combinação com um ou mais outros imunógenos e/ou patógenos caninos, incluindo, e.g.,imunógenos/patógenos para produzir imunidade contra vírus de cinomose canina, adenovírus canino, adenovírus canino de tipo 2, parvovírus canino, coronavírus canino, vírus do herpes canino, pnemovírus canino, e/ou serotipos Leptospira, e.g., Leptospira kirschneri serotipo grippotyphosa, Leptospira interrogans serotipo canicola, Leptospira interrogans icterohaemorrhagiae, e/ou Leptospira interrogans serotipo pomona. Imunógenos/patógenos caninos adicionais que podem ser adicionados em uma vacina de combinação da presente invenção inclui Bordetella bronchiseptica; organismos de Leishmania tais como Leishmania major e Leishmania infantum; espiroquetas espécies (spp.) Borrelia, incluindo B. burgdorferi sensu stricto (ss), B. burgdorferi ss, B. garinii, e B. afzelir, uma espécie Mycoplasma (e.g., Mycoplasma cynos); vírus da raiva; e Ehrlichia canis. Em modalidades específicas uma vacina de combinação da presente invenção compreende CIV com vírus da parainfluenza canina (canine parainfluenza virus, CPI) e/ou adenovírus canino de tipo 2 (canine adenovirus type 2, CAV2) e/ou Bordetella bronchiseptica (BB) e/ou parvovírus canino (canine parvovirus, CPV), e/ou vírus da cinomose canina (canine distemper virus, CDV), e/ou coronavírus canino, em qualquer tal combinação. Em uma tal modalidade a vacina compreende vírus da influenza canina, Bordetella bronchiseptica e vírus da parainfluenza canina. Em outra tal modalidade a vacina compreende vírus da influenza canina, vírus da cinomose canina, adenovírus canino de tipo 2, parvovírus canino, e vírus da parainfluenza canina. Em modalidades específicas, quando a vacina de combinação da presente invenção compreende um ou mais cepas virais e/ou bacterianas, tais cepas são avirulentas, estão atenuadas, e/ou mortas.

[0023] As vacinas da presente invenção podem ser administradas por qualquer rota incluindo: administração parenteral, injeção intramuscular, injeção subcutânea, injeção peritoneal, injeção intradermal, administração oral, administração intranasal, escarificação e combinações dos mesmos. Em uma modalidade preferida da invenção, a vacina é administrada por injeção intramuscular.

[0024] As vacinas da presente invenção pode quer conter um adjuvante quer não conter um adjuvante. Exemplos de adjuvantes para uso nas vacinas da presente invenção incluem aqueles contendo uma emulsão de óleo e água, e/ou hidróxido de alumínio. No último caso, hidróxido de alumínio de uma fonte comercial pode ser usado, por exemplo, Alhydrogel, [Superfos Biosector, Frederikssund, Dinamarca] e Rehydrogel (Reheis Inc.). A emulsão de óleo e água tipicamente compreende óleo mineral ou óleos metabolizáveis (e.g. óleo vegetal, óleo de peixe). Detergentes ou tensoativos não iônicos podem ser usados como emulsificadores. Exemplos de emulsificadores incluem Tween 80/Span 80, Arlecel 80/Tween 80, e Montanides (Seppic, Paris, França). No caso de emulsões de adjuvante, geralmente 5-25% do volume é óleo 75-95% do volume é aquoso. Em algumas modalidades, a emulsão de adjuvante é 20% de óleo e 80% aquoso em volume. A quantidade de hidróxido de alumínio está habitualmente entre cerca de 5% e 15% da fase aquosa. Em algumas modalidades, Emunade® é o adjuvante.

[0025] Para algumas modalidades, ISCOM pode ser usado como adjuvante. ISCOM é um acrônimo para Immune Stimulating Complex (complexo estimulante imune) e a tecnologia foi descrita por Morein et al. [Nature 308:457-460 (1984)]. Um ISCOM pode ser convenientemente formado em uma de duas maneiras. Em algumas modalidades é fisicamente incorporado na estrutura durante sua formulação. Em outras modalidade, uma matriz-ISCOM (conforme fornecida, por exemplo, por Isconova) não contém antígeno mas é misturada com o antígeno escolhido pelo usuário final antes da imunização. Após misturação, os antígenos estão presentes em solução com a matriz-ISCOM mas não estão fisicamente incorporados na estrutura.

[0026] O seguinte exemplo é fornecido para um entendimento mais esclarecido da invenção. Ele é meramente ilustrativo e é entendido que em nenhuma maneira não limita o escopo ou os princípios subjacentes da invenção. Várias modificações da invenção dentro do escopo reivindicado se tornarão evidentes para aquelas pessoas experientes na técnica à qual a invenção pertence a partir do exemplo a da descrição aqui.

EXEMPLO Introdução

[0027] Um total de 32 cães, de idade de 7 a 8 semanas foi usado no estudo. Um grupo de 10 cães foi vacinado com duas doses de vacina de vírus da influenza canina H3N8 morto, administradas 21 dias separadas uma da outra. Os cães vacinados foram testados com CIV virulento e S. equi, duas semanas mais tarde com a vacina de reforço. Os 3 grupos restantes de cães foram usados para avaliar a patogênese após testes único e duplo sem vacinação. Um grupo de 6 cães foi testado com CIV sozinho e o outro grupo de 6 cães foi testado com S. equi sozinho. Um grupo de 10 cães foi testado com ambos CIV e S. equi.

[0028] Todos os cães foram monitorados para sinais clínicos de doença respiratória e excreção bacteriana e/ou viral. Amostras de soro foram coletadas antes da vacinação do grupo de vacinação., antes da administração de teste de todos os grupos, e no momento da necropsia de todos os grupos para determinar o título de anticorpos para CIV. Cães foram submetidos à eutanásia 14 dias após o teste com CIV (Dia de estudo 49) e pulmões foram avaliados para lesões pulmonares. No momento da necropsia, amostras de lavagem pulmonar foram coletadas para isolamento de S. equi.

[0029] Um lote comercial de vacina de vírus da influenza canina H3N8 morto (Intervet Inc., Elkhorn, NE) foi usado para vacinar cães de 7-8 semanas de idade em Grupo 4.

[0030] Todos os cães em Grupo 4 foram soronegativos para CIV na primeira vacinação e todos os cães em Grupos 1, 2 e 3 foram soronegativos para CIV no momento do teste com CIV. Tabela 1 - Grupos de tratamento:

[0031] Cães foram selecionados por sexo e ninhada e receberam números aleatórios gerados por computador. Os cães foram selecionados pelos números aleatórios em ordem ascendente e distribuídos para grupos de tratamento.

[0032] Todos os 10 cães em Grupo 4 foram vacinados com vacina contra CIV por injeção subcutânea de 1 mL de vacina contra CIV (Número de Série 219104) nos dias de estudo 0 e 21.

[0033] Avaliação clínica: avaliações clínicas foram feitas e temperaturas foram registradas nos dias de estudo 33 e 34 (dois dias antes do teste com CIV), e no dia de teste com CIV (dia de estudo 35) para todos os cães. Observações clínicas foram realizadas seguindo o Guia de Avaliação Clínica.

[0034] Coleta de amostras: amostras de aproximadamente 5 mL de sangue foram coletadas de todos os cães no dia antes da administração de teste com CIV (dia de estudo 34). Mechas absorventes nasais também foram coletadas de todos os cães em Grupos 1, 3 e 4 no dia de estudo 34 para detectar excreção de CIV.

[0035] Vírus da influenza canina: O isolado de vírus CIV14-06A colhido em mudança de cultivo 3 (rotulado como “Vírus da influenza canina, CIV14-06A (P3)) foi usado como vírus de teste. Este vírus originalmente foi isolado de um cão sofrendo com doença respiratória canina. No dia do teste, fluido de vírus congelado foi descongelado imediatamente antes do uso e diluído em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (Dulbecco’s Modified Eagles Medium, DMEM) frio para um volume final de 2 mL por cão contendo uma dose de teste alvo de 7,5 Log10TCID50.

[0036] Streptococcus equisubespécie zooepidemicus: O isolado bacteriano foi obtido de um cão residindo em um abrigo de animal e morto de complexo de doença respiratória canina. As bactérias foram isoladas, purificadas e caracterizadas como S. equisubespécie zooepidemicus. O material de teste foi preparado por bactérias crescendo sobre caldo de Infusão de Coração e Cérebro (Brain Heart Infusion, BHI) e diluição para obter 1x109 cfu/mL.

Administração de teste

[0037] Vírus da influenza canina: Cães em Grupos 1, 3 e 4 foram testados com CIV no dia 35. Para administração de teste, quatro cães foram deixados em uma câmara de Plexiglas e 8 mL de vírus de teste (2 mL/cão) foram usados para gerar aerossol durante um período de aproximadamente 25-30 minutos. Os cães foram expostos ao aerossol por um total de 40 minutos.

[0038] S. equisubespécie zooepidemicus:Cães em Grupos 2, 3 e 4 foram testados com S. equi no dia de estudo 38. Meio mililitro (0,5 mL) de material de teste contendo 1x109 cfu de S. equi/mL foi instilado em cada narina de todos os cães usando uma cânula nasal.

Monitoramento de pós-teste

[0039] Sinais clínicos: Temperatura retal foi registrada e avaliação clínica foi realizada em cada cão diariamente por 13 dias após o teste.

Coleta com mecha absorvente nasal

[0040] Vírus da influenza canina: Mechas absorventes nasais foram coletadas de cada cão diariamente por 10 dias desde o dia do teste com o propósito de avaliar a excreção de CIV. Mechas absorventes nasais foram coletadas em meio de transporte de vírus.

[0041] Isolamento de S. equi: Mechas absorventes nasais foram coletadas para isolamento bacteriano usando meio de transporte bacteriano uma vez a cada três dias após o teste até o dia da necropsia.

[0042] Coleta de sangue: Amostras de sangue (aproximadamente 5-10 mL) foram coletadas no dia de necropsia com o propósito de avaliar os títulos de anticorpo contra CIV.

Necropsia/Remoção

[0043] Um cão (ID CAUELW) em Grupo 3 morreu no dia de estudo 43 (i.e., 8 dias após o teste com CIV e 5 dias após o teste com S. equi) devido à angústia respiratória severa. O cão exibiu febre, depressão, tosse severa e dispnéia por dois dias antes da morte. A necropsia revelou pneumonia severa caracterizada por adesões fibrinosas entre lobos pulmonares e parede torácica, consolidação e microabscessos sobre os lobos pulmonares.

[0044] Um cão (ID CAUELZ) em Grupo 1 exibiu febre, tosse severa, depressão e dispneia nos dias de estudo 43 e 44. Portanto, o veterinário pesquisador matou o cão no dia 44 (9 dias após o teste com CIV) e realizou necropsia. As lesões pulmonares foram caracterizadas por consolidação sugerindo pneumonia.

[0045] Observações de necropsia após teste &espécimes: Todos os cães restantes foram submetidos à eutanásia no dia 14 após o teste com CIV. Os cães foram submetidos à eutanásia imediatamente antes da necropsia para permitir a rápida avaliação pulmonar antes das mudanças post-mortem se estabelecerem. Lavagens pulmonares de tecidos de pulmão novos também foram coletadas para isolamento bacteriano.

GUIA DE AVALIAÇÃO CLÍNICA

[0046] Ao entrar na sala de isolamento, o pessoal desempenhando a avaliação clínica caminhou pelo local para avaliar a atitude dos animais e então continuou com as observações clínicas. As observações clínicas foram completadas primeiro para cada cão antes de serem conduzidos outros procedimentos, tal como administração de teste. As seguintes orientações foram usadas para pontuar cada sinal clínico. Descarga nasal 0 = Ausente. 0,5 = Descarga serosa: líquido transparente, fino, goteja da narina. Fluido precisa ser escorrido do nariz para ser aqui registrado. 1 = Descarga mucopurulenta, suave a moderada: Fluido turvo misturado com muco escorre pelo menos metade do percurso entre o nariz e a boca. 2 = Descarga mucopurulenta, severa: Muco escorre para além da boca. Descarga ocular 0 = Ausente: Pequena quantidade de material encrostado seco no canto do olho não é considerada uma descarga ocular. 0,5 = Descarga serosa: Fluido transparente é descarregado escorrendo dos olhos pelo menos metade do percurso até a boca. 1 = Descarga mucopurulenta, suave a moderada: Fluido turvo misturado com muco escorre pelo menos metade do percurso do olho até a boca. 2 = Descarga mucopurulenta, severa: Fluido ou muco escorre metade do percurso do nariz ou bordas do olho e molha o pelo no canto interior ou exterior do olho. Tosse 0 = Ausente 0,5 = Suave: Apenas uma tosse breve é observada. 1 = Moderada: Tosse é persistente, ocorrendo repetidamente no período de observação. 2 = Severa: Tosse é acompanhada por sons de sufocação ou ânsia de vômito. Espirro 0 = Ausente 2 = Presente Dispneia 0 = Ausente (Respiração normal) 2 = Presente (Respiração dificultada) Depressão 0= Ausente (Atividade normal). 2= Presente: Cão é menos ativo ou brincalhão, em comparação com normal. Cães filhotes são registrados se letárgicos ou em estado deitado e relutantes em permanecerem de pé enquanto observação é conduzida.

Métodos analíticos

[0047] Ensaio de inibição de hemaglutinação (hemagglutination Inhibition, HAI): Anticorpos para CIV em amostras de soro de cão foram medidos pelo ensaio de inibição de hemaglutinação (HAI). Resumidamente, uma diluição dupla serial de soro de teste foi realizada em PBS em placas de microtitulação de 96 cavidades de fundo em U. Um volume igual (25 μL) de suspensão de vírus contendo 4 unidades de HA de CIV25-06B foi adicionado em cada cavidade contendo o soro de teste, e as placas foram incubadas a 2025°C por 60±5 minutos para ocorrer reação de antígeno-anticorpo. Então, 50 μL de suspensão de RBC de galo 0,5% foram adicionados. As placas foram incubadas a 20°C-25°C por 45-60 minutos e os resultados de HAI foram lidos. O título de HAI foi registrado como o recíproco da diluição mais alta do soro mostrando inibição de hemaglutinação. Todos os ensaios foram realizados duas vezes e o título de HAI de ponto final foi determinado..

[0048] Titulação de CIV em cultura de células: Para confirmar o título de material de teste e para medir a excreção viral em cães administrados com teste, os títulos virais em material de teste, e mecha absorvente foram determinados por titulação em células MDCK. Células MDCK foram semeadas em placas de cultura de tecido de 96 cavidades por 2-3 dia, e foram inoculadas com suspensão viral diluída serialmente dez vezes ou amostras das mechas absorventes nasais. As placas foram incubadas em temperatura de 36°C±2°C e 4-6 % de CO2. Sete dias após infecção, as placas foram observadas para efeito citopático (cytopathic effect, CPE), e o ponto final de 50% para infectividade foi calculado usando o método de Spearman-Karber. Os títulos virais foram expressados como Log10TCID50/mL.

[0049] Isolamento de S. equi: Sobrenadantes de amostra foram inoculados sobre placas de ágar sangue (10 μL) e as placas foram incubadas a 36°C±2°C por 24-48 horas. Colônias exibindo hemólise foram depois identificadas como S. equi por coloração de Gram, morfologia, características de colônia e testes de identificação padrão (tais como testes com oxidase, catalase e coagulase).

Análise de dados

[0050] Variáveis medidas: Pontuação de lesão pulmonar foi a variável principal. Outras variáveis incluíram sinais clínicos, excreção viral, excreção bacteriana e sorologia.

Análise estatística

[0051] Pontuações de lesão pulmonar: A consolidação percentual de cada lobo pulmonar pontuado durante necropsia foi convertida em pontuação ponderal baseado no sistema de pontuação pulmonar. Pontuações pulmonares medianas para vários grupos foram comparando usando os testes da Soma Exata de Pontos de Wilcoxon. Estimativa de fração mitigada de eficiência de vacina relativa aos grupos não vacinados e o intervalo de confiança de 95% para a estimativa também são relatados.

[0052] Pontuações clínicas: Pontuações clínicas para febre, descarga ocular, descarga nasal, espirro, tosse, depressão, e dispneia, para 13 dias após teste foram somadas para obter uma pontuação clínica somada para cada cão. As pontuações somadas foram comparadas entre os grupos de tratamento usando testes de Soma Exata de Pontos de Wilcoxon.

[0053] Excreção viral: Títulos virais (Log10 TCID50/mL) foram somados durante 10 dias após o teste para cada cão. A área sob a curva média (mean area under curve, AUC) e o número de dias de excreção viral foram analisados usando os testes de Soma Exata de Pontos de Wilcoxon.

[0054] Excreção bacteriana: O número de dias de excreção bacteriana foi analisado usando os testes de Soma Exata de Pontos de Wilcoxon e o número de dias positivos para excreção foi comparado entre os grupos de tratamento.

[0055] Soroconversão: Médias geométricas de títulos de anticorpo em instantes de tempo diferentes foram relatadas.

[0056] Análise estatística foi realizada usando SAS version 9.1.3 (SAS Institute, Cary, NC, USA). Significância estatística foi declarada para p<0,05.

Critérios de aceitabilidade e validade de teste

[0057] Todos os cães, exceto aqueles em Grupo 4, foram negativos para anticorpos contra CIV no momento do teste com CIV.

[0058] Todos os cães, exceto aqueles em Grupo 2, foram negativos para excreção nasal de CIV no momento do teste com CIV. Cães em Grupo 2 não foram testados para excreção de CIV.

[0059] Todos os cães não vacinados testados com CIV (Grupos 1 e 3) exibiram graus variados de lesões pulmonares após teste com CIV.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

[0060] Validade: Todos os cães em Grupo 4 foram soronegativos para CIV antes da primeira vacinação, e todos os cães não vacinados (Grupos 1, 2 e 3) permaneceram soronegativos antes do teste com CIV (Tabela 2). Todos os cães também foram negativos para excreção de CIV e/ou S. equi no momento do teste com CIV (Tabelas 5 & 6).

[0061] Soroconversão: Os títulos de anticorpo de HAI foram tabulados e comparados entre os grupos de tratamento (Tabela 2). Todos os cães vacinados foram soroconvertidos para CIV após vacinação. Os títulos de anticorpo de HAI variaram entre 10 e 160, com um GMT de 73 no dia 34. A maioria dos vacinados (80%) desenvolveu um título de HAI de 40 ou acima. Todos os cães em grupos não vacinados foram soronegativos para CIV no momento do teste com CIV (título de HAI <10). Após o teste, os títulos de anticorpo em cães vacinados alcançaram níveis muito altos (GMT>6378), demonstrando a eficácia da vacina em iniciação do sistema imune contra CIV virulento. Os títulos de HAI em todos estes cães foram pelo menos 2.560. Os cães não vacinados testados com CIV em Grupos 1 e 3 foram soroconvertidos após teste com CIV com GMT de 226 e 278, respectivamente. Todos os cães em Grupo 2 permaneceram soronegativos para CIV no momento da necropsia confirmando que não foram expostos ao CIV e os procedimentos de biossegurança foram eficazes. Tabela 2: Título de anticorpo de inibição de hemaglutinação

*NT= Não testado; **Amostra coletada no dia 10 após teste; H***= Amostra hemolisada. Amostra coletada no dia 9 após teste. A Para amostras com título de HI >10240, o valor de 10240 foi usado para o cálculo de GMT

[0062] Confirmação de teste: Amostras de vírus de teste congeladas earmazenadas a -50°C ou mais frias antes e após administração de teste foramtituladas sobre células MDCK e a dose confirmada foi de 7,73 Log10TCID50de CIV14-06A por cão. Adicionalmente, não houve diferença substancial entre amostras de retenção de pré-teste e de pós-teste.

[0063] A amostra de retenção de S. equi titulada sobre placas de ágar sangue confirmaram que o título do material de teste é 1x109 pfu/mL. As bactérias permaneceram viáveis durante o curso da administração de teste.

[0064] Temperatura retal e sinais clínicos: Temperaturas retais em todos os grupos de tratamento foram registradas diariamente desde o dia de estudo 33 até o dia 48 (Tabela 3). Em Grupo 1 (CIV sozinho), dois dos seis cães desenvolveram febre clínica (>39,5°C) apenas por um dia. Um dos dois cães também desenvolveu depressão severa e foi submetido à eutanásia. Em Grupo 2, um dos seis cães (S. equi sozinho) desenvolveu febre suave apenas por um dia. Em Grupo 3 testado com CIV e S. equi, 90% (9 de 10) dos cães desenvolveu febre e a maioria deles (70%) exibiu febre por pelo menos dois dias. Cinquenta por cento dos cães vacinados (5 de 10, Grupo 4) também desenvolveram febre após teste duplo. Contudo, a febre demorou apenas um dia. Tabela 3: Temperatura Retal

Números em negrito indicam febre clínica.

[0065] Todos os cães também foram monitorados diariamente, desde o dia de estudo 33 até 48, para outros sinais clínicos tais como descarga ocular, descarga nasal, espirro, tosse, dispneia e depressão. Todos os cães testados com CIV e com CIV mais S. equi (Grupos 1, 3 e 4) exibiram variedade de sinais clínicos iniciando desde dois dias após teste (Tabela 4 e Figura 1). Tosse e dispneia foram os sinais clínicos predominantes. Todos os cães em Grupos 1 (6/6) e 3 (10/10), exibiram graus variados de tosse demorando em média 2,7 dias e 4,5 dias, respectivamente. Por outro lado, apenas 60% dos cães vacinados em Grupo 4 (6/10) exibiram tosse demorando em média 1,3 dias. Um cão (ID CAUELZ) em Grupo 1 foi submetido à eutanásia 9 dias após teste com CIV devido à depressão e à dispneia. Foi verificado que um cão (ID CAUELW) em Grupo 3 morreu 8 dias após teste com CIV. Nenhum dos seis cães testados com S. equi sozinho exibiu quaisquer sinais clínicos. Tabela 4: Pontuações de sinais clínicos após teste com CIV

O = Descarga Ocular; N = Descarga Nasal; C = Tosse; S = Espirro; D=Dispneia; P = Depressão; F=Febre;* Teste com CIV; ** Teste com S. equi

[0066] Os resultados sugerem que CIV pode causar doença respiratória severa em cães que poderia levar à mortalidade. S. equi atua como patógeno secundário e intensifica a doença induzida por CIV. S. equi sozinho não induziu por si só nenhuma doença clínica.

[0067] Excreção viral: Excreção viral nasal foi monitorado em todos os cães testados com CIV (Grupos 1, 3 e 4) no dia antes do teste, e então, diariamente desde o dia 1 até o dia 10 após o teste. O título viral médio para cada grupo, expressado como Log10TCID50/mL, foi plotado contra dias após teste (Tabela 5 e Figura 2). Cinquenta por cento dos cães em Grupos 1 e 4 e todos os cães (100%) em Grupo 3 iniciaram excreção CIV em suas secreções nasais desde dia 1 após teste. Aproximadamente 2 dias após teste, todos os cães em todos os três grupos foram positivos para excreção nasal viral. A excreção viral alcançou seu pico entre 4 e 5 dias após teste com CIV seguido por uma gota precipitada no dia 6 (Figura 2). Ambos os não vacinados e vacinados pararam de apresentar excreção de CIV em suas secreções nasais aproximadamente no dia 8 após teste. O título viral para cada cão foi somado durante período de 10 dias após teste e análise estatística foi realizada. A estimativa da área sob a curva média foi significativamente mais alta para Grupos 1 r 3 (17,0 Log10 TCID50/mL e 18,6 Log10 TCID50/mL, respectivamente) em comparação com Grupo 4 (8,9 Log™ TCID50/mL) (P=0,0075 e P<0,0001 para grupos 1 e 3, respectivamente). O número médio de dias de excreção em Grupos 1 e 3 (5,7 dias e 5,8 dias, respectivamente) também foi significativamente maior (P=0,0356 e P=0,0033, respectivamente) comparado com o Grupo 4 (4 dias). Os resultados demonstram que a vacina de CIV significativamente reduziu a excreção nasal viral em cães vacinados. Tabela 5: Excreção nasal de CIV após teste

[0068] Excreção bacteriana: Cães testados com S. equi em Grupos 2, 3 e 4 foram monitorados para excreção nasal de S. equi nos dias -4 (antes do teste com CIV), e nos dias 0, 3, 6, 9 e 11 após teste com S. equi (Tabela 6 e Figura 3). Adicionalmente, amostras de lavagem pulmonar de todos os cães em Grupos 2, 3 e 4 foram coletadas no momento da necropsia para isolamento de S. equi. Todos os cães em todos os grupos, exceto aqueles em Grupo 1 (não testado), foram negativos para excreção de S. equi no momento do teste com CIV ou S. equi. Nenhum dos cães testados com S. equi sozinho (Grupo 2) foi positivo para excreção nasal de S. equi no momento após teste com S. equi. Contudo, S. equi foi isolado da amostra de lavagem pulmonar de um cão (17%) em Grupo 2. Em contraste, 100% dos cães em Grupo 3, testados com ambos CIV mais S. equi, foram positivos para S. equi em suas secreções nasais 3 e 6 dias após o teste com S. equi e a maioria deles (67%) continuou com excreção de bactérias por pelo menos 9 dias após o teste. A maioria dos cães em Grupo 3 (67%) também foi positiva para S. equi em suas lavagens pulmonares (11 dias após teste com S. equi) sugerindo que as bactérias colonizaram e se multiplicaram no trato respiratório inferior. A maioria (60%) dos cães vacinados contra CIV testados com CIV mais S. equitambém apresentou excreção de S. equi em suas secreções nasais 3 dias pós-teste com S. equi. Seis dias em diante, o número de cães com excreção de S. equi foi substancialmente menor em Grupo 4 comparado com Grupo 3. Apenas 20% dos cães vacinados foram positivos para S. equi em suas amostras de lavagem pulmonar. Tabela 6: Isolamento de S. EQUIapós teste das mechas absorventes nasaise da lavagem pulmonar

* Número de cães positivos para S. equi/Número de cães no grupo

[0069] Lesões pulmonares: Consolidação pulmonar/pneumonia é a lesão patológica principal em todas as infecções de influenza. Todos os cães (100%) nos grupos de teste com CIV e teste com CIV mais S. equi (Grupos 1 e 3) exibiram graus variados de consolidação pulmonar, enquanto que apenas 3 cães (30%) no grupo vacinado contra CIV (Grupo 4) desenvolveram consolidação pulmonar das quais duas foram muito suaves (Tabela 7). Apenas um cão(17%) no grupo de teste com S. equi (Grupo 2) exibiu lesões pulmonares e elas foram suaves. Em Grupo 1, as lesões pulmonares foram predominantemente observadas em lobos craniais enquanto que em Grupo 3, as lesões pareceram estar presentes em todos os lobos pulmonares. Lesões pulmonares são foram caracterizadas por hemorragias e consolidação avermelhada e hepatização. As pontuações pulmonares em Grupo 1 variaram entre 0,5 e 32,97 com uma pontuação mediana = 17,27, e em Grupo 3, entre 5,53 e 39,74 com uma pontuação pulmonar mediana = 23,29. Em Grupo 4, as pontuações variaram entre 0 e 25,54 com pontuação mediana =0. Estimativa de fração mitigada de eficácia de vacina em relação ao teste com CIV foi de 88,3% com CI de 95% (60%, 100%), e relativa a teste com CIV mais S. equi foi de 88,0% com CI de 95% (58%, 100%). As pontuações pulmonares em Grupo 4 foram significativamente menores comparadas com Grupo 1 (P=0,0019) e Grupo 3 (P=0,0002). Embora as pontuações pulmonares em Grupo 3 fossem mais altas comparadas com Grupo 1, elas não foram significativamente diferentes (P=0,5622). Os dados demonstram que a vacina contra CIV auxilia na prevenção de lesões pulmonares induzidas por CIV e por CIV mais S. equi. Tabela 7: Pontuações de lesão pulmonar após teste com CIV e/ou teste com S. EQUI

[0070] Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com suas modalidades específicas, será entendido que ela será capaz de outras modificações e este pedido é intencionado para incluir quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção incluindo, em geral, os princípios da invenção e incluindo tais desvios da presente revelação como vêm da prática conhecida ou habitual dentro da técnica à qual a invenção pertence. Todas as patentes e todos os pedidos publicados aqui mencionadas(os) são incorporadas(os) em sua totalidade como referências.

Claims

1. Uso de uma vacina inativada contra vírus da influenza canina (CIV), caracterizadopelo fato de ser na preparação de um medicamento para proteger um canino contra Streptococcus equi.

2. Uso de uma vacina inativada contra CIV de acordo com a reivindicação 1, caracterizadoainda pelo fato de que o Streptococcus equi é Streptococcus equi subespécie Zooepidemicus (S. equi).

3. Uso de uma vacina inativada contra CIV de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que a vacina contra CIV compreende ainda um ou mais imunógenos adicionais que é selecionado do grupo que consiste em vírus da cinomose canina, adenovírus canino, parvovírus canino, vírus da parainfluenza canina, coronavírus canino, vírus do herpes canino, pneumovírus canino, serotipos de Leptospira, organismos Leishmania, uma espécie (spp.) Borrelia; Bordetella bronchiseptica, espécie Mycoplasma, vírus da raiva, Ehrlichia canis, e quaisquer combinações dos mesmos.

4. Uso de uma vacina inativada contra CIV de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizadopelo fato de que a vacina CIV inativada contém vírus da influenza canina morto.