CN102791287A - 用于保护免于二级病原体引起的疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

保护动物免于二级病原体引起的疾病的方法，其包括提供针对初级病原体的包含抗原的疫苗以及将免疫原性有效量的该针对初级病原体的疫苗施用于动物。

Description

用于保护免于二级病原体引起的疾病的方法
相关申请的交叉引用
本申请根据美国法典第35篇第119(e)条要求获得2010年3月10日提交的美国临时申请序列号61/312,380的优先权，其内容由此完整地通过引用而并入。
发明领域
发现施用针对初级病原体的疫苗保护免于二级或机会病原体引起的疾病。例如，通过针对旁系病原体(collateral pathogens)免疫保护犬免于二级病原体如马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subspecies zooepidemicus)(马链球菌(S. equi))引起的疾病。
发明背景
马链球菌(S. equi)与犬传染性呼吸道疾病(CIRD)相关，其已被公认为主要影响舍养狗(kenneled dogs)的多因素感染(Chalker等, Veterinary Microbiology 95 (2003):149-156)。然而发现，可以从无症状的、健康的非舍养狗分离马链球菌。马链球菌仅仅与其它病原体相结合促成CIRD的严重性。
犬流感(CIV)已经被鉴定为与马流感病毒高度同源的H3N8病毒。已经发现犬流感在某些类型的狗中是强毒的。例如，发现它是杀死Jacksonville, Florida的狗舍中数条赛狗(racing Greyhounds)的病发的原因。虽然100％的暴露的狗被感染，但是仅仅发现80％显现出感染的临床体征。而且，尽管一些暴露于CIV的狗发生具有肺炎的临床体征的急性疾病，大多数狗经历较温和的综合征，如持续10-21天的咳嗽。
我们已经发现，马链球菌和CIV的严重性均通过与其中另一病原体的共感染增加。
发明概述
保护犬免于二级病原体引起的疾病的方法包括施用针对初级病原体的疫苗。在一个优选的实施方案中，以CIV疫苗免疫待保护的犬，从而保护犬免于二级病原体如马链球菌引起的疾病。作为结果，犬针对CIV和马链球菌二者得以保护。
附图简要说明
图1，CIV攻击后的临床评分，该图表示从CIV攻击前2天至攻击后13天每个处理组的平均临床评分。在研究的第35天用CIV攻击所有的狗，从CIV攻击前第2天至CIV攻击后13天每天监测临床体征。将每个处理组的平均临床评分针对攻击后的天数作图。临床评分参见表4。
图2，攻击后的鼻CIV脱落，该图表示通过在攻击后第1-10天每天收集鼻拭子测定的每组的平均病毒滴度。在第35天用CIV攻击第1、3和4组中所有的狗。在攻击前那天(第-1天)收集鼻拭子以验证小狗没有CIV。通过每天收集鼻拭子 (攻击后第1天至第10天)达10天以及在MDCK单层上进行滴定以监测被攻击的狗中的鼻病毒脱落。计算每个处理组的平均病毒滴度(表示为Log 10 TCID50/mL)并针对攻击后的天数作图。
图3，从鼻拭子和肺灌洗液分离马链球菌，该图表示从CIV攻击前那天至攻击后第14天每组中马链球菌阳性的狗的百分比。
发明的详细说明
本发明涉及保护犬免于二级病原体引起的疾病的方法，所述二级病原体在不存在损害性因素如与另一种病原体共感染的情况下没有表现临床体征。在这种情况下，即使任一病原体本身不会表现临床体征，但它们两种一起导致增强的发病和临床显著的疾病。
犬流感病毒(CIV)亚型H3N8在某些狗中可以引起急性呼吸道疾病。我们通过研究用CIV和马链球菌共感染狗之后的发病确定了马链球菌兽疫亚种(马链球菌)加重了CIV引起的疾病。类似地，我们发现，单独用马链球菌感染的狗没有表现临床体征，但是当用CIV和马链球菌二者攻击时，观察到活跃的临床疾病。然后我们发现，用CIV疫苗免疫保护狗免于强毒的CIV和马链球菌的双重攻击。出乎意料的是，通过施用针对CIV的疫苗可以预防马链球菌引起的呼吸道疾病。
单独用马链球菌攻击的狗没有表现任何临床体征、细菌脱落(shedding)或肺部病变。单独用CIV攻击的狗发生了一些临床体征、病毒脱落和肺部病变。当与单独用CIV或单独用马链球菌攻击的狗相比时，用CIV加上马链球菌攻击的狗中的临床评分、CIV和/或马链球菌脱落和肺部评分实质上更高。当与单独用CIV或用CIV加上马链球菌攻击的未接种的狗相比时，用CIV加上马链球菌攻击的CIV接种的狗中肺部评分、临床评分和细菌脱落明显更低。
本发明使用的术语初级病原体是指在一些动物中可能引起疾病的临床体征、但未必达到在所有暴露于病原体的动物中可检测出该疾病的这种严重性的病原体。
本发明使用的术语二级病原体是指除非通过暴露于另一种病原体而使动物虚弱或者动物另外处于虚弱状态、否则在暴露于该病原体的动物中不可能引起疾病的临床体征的病原体，有时也称为机会病原体。
当连同一种或更多种其它二级病原体存在时，自身是二级病原体并且不可能引起疾病的临床体征的病原体可以作为初级病原体起作用。
为了说明而不是限制的目的，在文提供的实施方案中，CIV可被称为初级病原体，马链球菌可被称为二级病原体。
犬舍咳(Kennel cough)是许多病毒和细菌病原体引起的在犬中的重要疾病。CIV和马链球菌是近年来从犬呼吸道疾病病例中、尤其是舍养狗和收养狗(shelter dogs)中频繁分离的两种新的病原体。
我们在狗中研究了CIV和马链球菌双重感染的发病机理并评价了CIV疫苗在双重感染中的效应。和单独用CIV感染的狗不同，大多数CIV加上马链球菌感染的狗表现持续更久的临床发热，以及更严重的临床体征，尤其是持续更久的咳嗽。关于脱落和脱落持续时间阳性的狗的数量，双重攻击的狗中的鼻马链球菌脱落非常高。而且，与单独的CIV或单独的马链球菌相比，双重攻击诱导了明显更高的肺部评分。我们发现，单独用马链球菌攻击的狗没有表现临床发热、呼吸道疾病的临床体征或肺部病变。而且，在单独用马链球菌攻击的狗的鼻分泌物中没有检测到马链球菌。我们发现，单独的马链球菌不能诱导任何疾病，马链球菌是在CIV存在的情况下导致细菌群集的机会病原体。马链球菌加重了CIV引起的发热、其它临床体征和相关的肺病态。我们发现，施用CIV疫苗减轻不仅是单独的CIV而且是CIV加上马链球菌诱导的临床体征、病毒/细菌脱落和肺部病变。针对CIV的接种预防CIV以及机会病原体如马链球菌引起的呼吸道疾病。
用于攻击的马链球菌可以从被感染的动物获得，如随后的实施例中使用的分离物，或者可以从保藏中心获得，如从ATCC编号6580获得的分离物。
可以用于攻击(如在下面的实施例中)和/或用于制备用于根据本发明的施用的疫苗的犬流感病毒的例子包括美国专利申请号11/582,652(2006年10月18日提交，公开的申请US 2007/0092537)、美国专利申请号11/544,841(2006年10月6日提交，公开的申请US 2007/0082012)、国际申请号PCT/US2006/04161(2006年10月19日提交)和美国专利申请号11/956,658(2007年12月14日提交)中所述的H3N8病毒中的任一种，上述所有文献在此处被完整地通过引用并入。
本发明的CIV疫苗将具有无毒的、减毒的或灭活的病毒，或包含抗原亚单位。无毒和减毒的病毒意在包括重组病毒以及无毒分离物、传代的病毒、冷适应的病毒(cold adapted viruses)和通过其它方法使其具有更弱毒性或非致病性的病毒。CIV疫苗也可以是商业的疫苗，如从Intervet Inc./Schering-Plough Animal Health, Elkhorn, NE, NOBIVAC® Canine Flu H3N8可获得的CIV疫苗。根据本发明可以使用任何有效的CIV疫苗。
本发明进一步提供了组合疫苗，其用于引起针对流感病毒例如犬流感病毒(CIV)、和其他疾病例如其它犬传染病的保护性免疫。这种疫苗将具有无毒的、减毒的和/或灭活的病毒和/或细菌，和/或包含抗原亚单位。因此，本发明提供了组合疫苗，其包括一种或更多种的CIV株，例如失活的CIV H3N8，连同一种或更多种其它犬病原体和/或免疫原，包括，例如，用于引起针对犬瘟热病毒、犬腺病毒、2型犬腺病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬冠状病毒、犬疱疹病毒、犬肺炎病毒和/或钩端螺旋体血清型(Leptospira serovars)，如寇氏钩端螺旋体伤寒感冒血清型(Leptospira kirschneri serovar grippotyphosa)、问号钩端螺旋体犬血清型(Leptospira interrogans serovar canicola)、问号钩端螺旋体出血黄疸血清型(Leptospira interrogans icterohaemorrhagiae)和/或问号钩端螺旋体波蒙那血清型(Leptospira interrogans serovar Pomona)的免疫的病原体/免疫原。可以加入本发明的组合疫苗的额外的犬病原体/免疫原包括支气管败血波氏杆菌(Bordeteiia bronchiseptica)；利什曼虫生物，如硕大利什曼原虫(Leishmania major)和婴儿利什曼原虫(Leishmania infantum)；包柔氏属物种(spp.)螺旋体，包括狭义伯氏疏螺旋体(B. burgdorferi sensu stricto (ss))、伯氏包柔螺旋体(B. burgdorferi ss)、伽氏疏螺旋体(B. garinii)和阿弗西尼疏螺旋体(B. afzelir)；支原体属物种(例如，犬支原体(Mycoplasma cynos))；狂犬病毒和犬埃立克体(Ehrlichia canis)。在具体的实施方案中，本发明的组合疫苗包括以任何这种组合的CIV与犬副流感病毒(CPI)和/或2型犬腺病毒(CAV2)和/或支气管败血波氏杆菌(BB)和/或犬细小病毒(CPV)和/或犬瘟热病毒(CDV)和/或犬冠状病毒。在一个这种实施方案中，疫苗包括犬流感病毒、支气管败血波氏杆菌和犬副流感病毒。在另一个这种实施方案中，疫苗包括犬流感病毒、犬瘟热病毒、2型犬腺病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒。在一个具体的实施方案中，当本发明的组合疫苗包括一种或更多种病毒和/或细菌株时，这些株是无毒的、减毒的和/或灭活的。
可以通过任何途径施用本发明的疫苗，包括：肠胃外施用、肌肉注射、皮下注射、腹腔注射、皮内注射、口腔施用、鼻内施用、划痕及其组合。在本发明的一个优选实施方案中，通过肌肉注射施用疫苗。
本发明的疫苗可以包含佐剂或不包含佐剂。本发明用于疫苗中的佐剂的例子包括包含油和水乳剂的那些，和/或氢氧化铝。在后一种情况下，可以使用来自商业来源的氢氧化铝，例如，Alhydrogel, [Superfos Biosector, Frederikssund, Denmark]和Rehydrogel (Reheis Inc.)。油和水乳剂典型地包括矿物油或可代谢的油(例如，植物油，鱼油)。非离子去垢剂或表面活性剂可以用作乳化剂。乳化剂的例子包括吐温80/ Span 80、Arlecel 80 /吐温80、和Montanides(Seppic，巴黎，法国)。在佐剂乳剂的情况下，通常5-25％的体积是油，75-95％的体积是水相。在一些实施方案中，佐剂乳剂是按体积计20％的油和80％水相。氢氧化铝的量通常为水相的约5％-15％。在一些实施方案中，Emunade®是佐剂。
对于一些实施方案，ISCOM可以用作佐剂。ISCOM是免疫刺激复合物(Immune Stimulating Complex)的首字母缩写词，该技术由Morein等[Nature 308:457-460 (1984)]所述。可以以两种方法中的一种方便地形成ISCOM。在一些实施方案中，抗原在其制剂期间被物理地掺入结构中。在其它实施方案中，ISCOM-基质(如例如Isconova所提供的)不包含抗原，但在免疫前由最终用户将其与选择的抗原混合。混合后，抗原与ISCOM-基质存在于溶液中，但没有被物理地掺入结构中。
为了更清楚地理解本发明，提供了下列实施例。这仅仅是说明性的，应理解为不是以任何方式限制本发明的范围或根本原则。根据本文的实施例和说明书，要求保护范围内的本发明的各种修改对于本发明所涉及的本领域技术人员是显而易见的。
实施例
介绍
在本研究中使用总共32只7-8周大的狗。一组10只狗用两次剂量的犬流感H3N8灭活的病毒疫苗接种，间隔21天施用。在增强接种后两周，用强毒的CIV和马链球菌攻击接种的狗。在没有接种的单次和双重攻击后，用剩余的3组狗来评价疾病发生。单独用CIV攻击一组6只狗，单独用马链球菌攻击另一组6只狗。用CIV和马链球菌二者攻击一组10只狗。
对所有的狗监测呼吸道疾病的临床体征和病毒和/或细菌脱落。在接种之前从接种组采集血液样本，在攻击施用之前从所有组采集血液样本，在尸体解剖时从所有组采集血液样本以确定针对CIV的抗体滴度。在CIV攻击后14天(研究的第49天)将狗安乐死，评价肺部的肺部病变。在尸体解剖时，收集肺灌洗样本用于分离马链球菌。
将一批商售的犬流感H3N8灭活的病毒疫苗(Intervet Inc., Elkhorn, NE)用来接种第4组中7-8周大的狗。
在首次免疫时，第4组中所有狗都是CIV血清阴性的，在CIV攻击时，第1、2和3组中所有狗都是CIV血清阴性的。
表1 处理组
Figure 126446DEST_PATH_IMAGE002
根据性别和同胎(litters)将狗分类，分配计算机生成的随机编号。通过升序的随机编号将狗分类并分配到处理组。
在研究的第0天和第21天通过皮下注射1 mL CIV疫苗(序列号#219104)以CIV疫苗接种第4组中的所有10只狗。
临床评价：在研究的第33天和第34天(CIV攻击前两天)以及在CIV攻击那天(研究的第35天)对所有狗进行临床评价并记录温度。根据临床评价指南进行临床观察。
样本采集：在CIV攻击施用前那天(研究的第34天)从所有的狗采集约5 mL血液样本。还在研究的第34天从第1、3和4组中所有的狗采集鼻拭子以检测CIV脱落。
犬流感病毒：将在第3代时收获的病毒分离物CIV14-06A(标记为“犬流感病毒，CIV14-06A(P3))用作攻击病毒。这种病毒最初是从患有犬呼吸道疾病的狗分离的。在攻击的那天，在临使用前融化冷冻的病毒液并在无菌的冷达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中稀释至2 mL终体积/狗，其包含7.5 Log10TCID50的靶向性攻击剂量。
马链球菌兽疫亚种：从居住在动物收养所并死于犬呼吸道疾病复合症的狗获得细菌分离物。将细菌分离、纯化并鉴定为马链球菌兽疫亚种。通过使细菌在脑心浸液(BHI)肉汤上生长并稀释以获得1X109 cfu/mL而制备攻击材料。
攻击施用
犬流感病毒：在第35天用CIV 攻击第1、3和4组中的狗。对于施用攻击，将四只狗放置在有机玻璃室(Plexiglas chamber)中，用8 mL攻击病毒(2 mL/狗)在约25 - 30分钟期间产生气溶胶。将狗暴露于气溶胶总共40分钟。
马链球菌兽疫亚种：在研究的第38天用马链球菌攻击第2、3和4组中的狗。用鼻导管将半毫升(0.5 mL)包含1x109 cfu马链球菌/mL的攻击材料滴入所有狗的每个鼻孔。
攻击后监测
临床体征：攻击后13天每天对于每只狗记录直肠温度并进行临床评价。
鼻拭子收集
犬流感病毒：从攻击那天起10天每天从每只狗收集鼻拭子以评价CIV脱落。将鼻拭子收集在病毒转运介质中。
马链球菌分离：在攻击后每三天一次直到尸体解剖那天用细菌转运介质收集鼻拭子用于细菌分离。
血液采集：在尸体解剖那天收集血液样本(约5-10 mL)以评价针对CIV的抗体滴度。
尸体解剖/处置
第3组中一只狗(ID CAUELW)在研究的第43天(即用CIV攻击后8天以及用马链球菌攻击后5天)由于严重的呼吸窘迫而死亡。狗在死亡前两天表现出发热、抑郁、剧烈咳嗽和呼吸困难。尸体解剖显示了重症肺炎，其特征为肺叶和胸壁之间的纤维性粘连、肺叶上的实变(consolidation)和微脓肿。
第1组的一只狗(ID CAUELZ)在研究的第43天和第44天表现出发热、剧烈咳嗽、抑郁和呼吸困难。因此，研究兽医在第44天(CIV攻击后9天)使狗安乐死并进行尸体解剖。肺部病变的特征在于实变，这暗示有肺炎。
攻击后尸体解剖观察和样本：在CIV攻击后第14天使所有剩余的狗安乐死。在临尸体解剖前使狗安乐死以允许在其中的死后变化之前快速的肺评价。还从新鲜肺组织收集肺清洗液用于细菌分离。
临床评价指南
在进入隔离室后，进行临床评价的人员进入以评价动物的状态，然后继续临床观察。在实施其它程序如攻击施用之前首先对每只狗完成临床观察。下列指南用于对每种临床体征进行评分。
鼻分泌物(discharge)
0 = 没有。
0.5 = 严重分泌物：薄的、清澈的流体从鼻孔滴下。流体必须流出鼻子才被记录在这里。
1 = 粘液脓性分泌物，轻度至中度：与粘液混合的不透明流体从鼻子到嘴流下至少半途。
2 = 粘液脓性分泌物，严重的：粘液流过嘴。
眼分泌物
0 =没有：在眼角的小量干燥的结痂物质不被认为是眼分泌物。
0.5 = 严重分泌物：分泌的清澈的流体从眼睛到嘴流下至少半途。
1 = 粘液脓性分泌物，轻度至中度：与粘液混合的不透明流体从眼睛到嘴流下至少半途。
2 = 粘液脓性分泌物，严重的：液体或粘液至鼻子流下半途或沿眼睛的边缘以及浸湿眼睛的内角或外角的毛发。
咳嗽
0 = 没有。
0.5 = 轻度：仅仅观察到一次短暂的咳嗽。
1.0 = 中度：在观察期间持续重复地发生咳嗽。
2.0 = 严重的：咳嗽伴随窒息或呕吐声
打喷嚏 呼吸困难
0 = 没有 0 =没有(正常呼吸)
2 =存在 2 = 存在(呼吸费力)
抑郁
0= 没有(正常活动)
2= 存在：与正常相比，狗的活动性或顽皮性变弱。如果进行观察时昏昏欲睡或躺倒以及勉强站立则对小狗进行记录。
分析方法
血凝抑制(HAI)分析：通过血凝抑制(HAI)分析测定狗血清样本中针对CIV的抗体。简而言之，在U型底的96孔微量滴定板中在PBS中进行试验血清的系列2倍稀释。将等体积(25 μL)的包含4 HA单位的CIV25-06B的病毒悬浮液加入每个包含试验血清的孔中，并将该板在20-25℃孵育60±5分钟从而使抗原-抗体反应发生。然后，加入50μL 0.5％公鸡RBC悬浮液。将板在20-25℃孵育45-60分钟并读取HAI结果。记录作为显示血凝抑制的血清的最高稀释度的倒数的HAI滴度。所有试验都一式两份进行，测定终点HAI滴度。
细胞培养物中的CIV滴定：为了验证攻击材料的滴度以及为了测定施用攻击的狗中的病毒脱落，通过MDCK细胞中的滴定测定攻击材料中的病毒滴度以及鼻拭子。将MDCK细胞接种在96孔组织培养板中2-3天，用10倍系列稀释的病毒悬浮液或者从鼻拭子制备的样本接种。在36±2℃的温度和4-6％CO2条件下孵育平板。感染后七天，观察平板的细胞病理效应(CPE)，用斯皮尔曼-寇式法(Spearman-Karber method)计算对于感染的50％终点。病毒滴度表示为Log10TCID50/mL。
马链球菌分离：将样本上清接种到血液琼脂平板上(10 μL)并将平板在36±2℃孵育24-48小时。通过革兰氏染色、形态学方法、菌落特征和标准鉴定测试(如氧化酶、过氧化氢酶和凝固酶测试)将表现溶血的菌落鉴定为马链球菌。
数据分析
结果变量：肺部病变评分是主要的变量。其它变量包括临床体征、病毒脱落、细菌脱落和血清学。
统计学分析
肺部病变评分：基于肺评分系统将尸体解剖期间评分的每个肺叶的实变百分比转换为加权评分。用Wilcoxon秩和检验(Wilcoxon Exact Rank Sum tests)比较各组的中位数肺部评分。还报告相对于未接种组的疫苗效应的减轻分数估计值以及对于估计值的95％置信区间。
临床评分：对于攻击后13天的发热、眼分泌物、鼻分泌物、打喷嚏、咳嗽、抑郁和呼吸困难的临床评分进行了总计以获得对于每只狗的总计的临床评分。用Wilcoxon秩和检验(Wilcoxon Exact Rank Sum tests)比较处理组之间的总计的评分。
病毒脱落：对于每只狗在攻击后10天总计病毒滴度(Log10 TCID50/mL)。用Wilcoxon秩和检验(Wilcoxon Exact Rank Sum tests)分析平均曲线下面积(AUC)和病毒脱落的天数。
细菌脱落：用Wilcoxon秩和检验(Wilcoxon Exact Rank Sum tests)分析细菌脱落的天数，比较处理组之间脱落阳性的天数。
血清转化：报告在不同时间点的抗体滴度的几何平均数。
使用SAS 9.1.3版(SAS Institute，Cary，NC，USA)进行统计学分析。统计学显著性宣布为p<0.05。
测试有效性和可接受性标准
所有的狗，除了第4组中的那些狗，在CIV攻击时CIV抗体为阴性。
所有的狗，除了第2组中的那些狗，在CIV攻击时鼻CIV脱落为阴性。没有测试第2组的狗的CIV脱落。
所有用CIV攻击的未接种的狗(第1组和第3组)在CIV攻击后表现出不同程度的肺部病变。
结果与讨论
有效性：第4组中所有的狗在首次接种前是CIV血清阴性的，所有未接种的狗(第1、2和3组)在CIV攻击前保持血清阴性(表2)。所有的狗在CIV攻击时对于CIV和/或马链球菌脱落也是阴性的(表5和表6)。
血清转化：在处理组之间对HAI抗体滴度列表并比较(表2)。所有接种的狗在接种后血清转化为CIV。在第34天时HAI抗体滴度范围为10-160，GMT为73。大多数的接种者(80％)发展为40或更高的HAI滴度。在CIV攻击时，未接种的组中所有的狗都是CIV血清阴性(HAI滴度<10)。攻击后，接种的狗中的抗体滴度达到非常高的水平(GMT>6378)，表明了疫苗在引发针对强毒的CIV的免疫系统中的效应。所有这些狗中的HAI滴度至少为2560。在CIV攻击后，在第1组和第3组中用CIV攻击的未接种的狗发生血清转化，GMT分别为226和278。在尸体解剖时，第2组中的所有的狗保持CIV血清阴性，验证了它们没有暴露于CIV并且生物安全程序是有效的。
表2：血凝抑制抗体滴度
Figure 43586DEST_PATH_IMAGE004
*NT=未测出；**攻击后第10天收集的样本；
H***= 溶血的样本。攻击后第9天收集的样本。
A对于HI滴度>10240的样本，使用10240的值来计算GMT。
攻击验证：将攻击施用之前和之后在-50℃或更低温度冷冻并储存的攻击病毒样本在MDCK细胞上滴定，剂量被验证为每只狗7.73 Log10TCID50的CIV14-06A。此外，在攻击前和攻击后保留样本之间没有实质差别。
在血液琼脂平板上滴定的马链球菌保留样本验证了攻击材料滴度为1X109 pfu/mL。在攻击施用过程期间细菌仍然是活的。
直肠温度和临床体征：从研究的第33天至第48天每天记录所有处理组中的直肠温度(表3)。在第1组中(单独的CIV)，六只狗中的两只发生仅持续一天的临床发热(≥39.5℃)。两个狗中的一只还发生了严重的抑郁，实施了安乐死。在第2组中，六只狗(单独的马链球菌)中的一只发生仅持续一天的轻度发热。在用CIV和马链球菌攻击的第3组中，90％(10只中的9只)的狗发生发热，它们中的大多数(70％)表现出持续至少2天的发热。接种的狗的50％(10只中的5只，第4组)在双重攻击后也发生发热。然而，发热仅持续一天。
Figure 823324DEST_PATH_IMAGE006
Figure 188839DEST_PATH_IMAGE008
从研究的第33天至第48天，每天还监测所有的狗的其它临床体征，如眼分泌物、鼻分泌物、打喷嚏、咳嗽、呼吸困难和抑郁。从攻击后两天开始，用CIV以及CIV加上马链球菌攻击的所有狗(第1、3和4组)都表现出临床体征的范围(表4和图1)。咳嗽和呼吸困难是主要的临床体征。第1组(6/6)和第3组(10/10)中的所有狗都表现出分别持续平均2.7天和4.5天的不同程度的咳嗽。另一方面，第4组中仅60％的接种的狗(6/10)表现出持续平均1.3天的轻度咳嗽。因为抑郁和呼吸困难，在CIV攻击后9天将第1组中的一只狗(ID CAUELZ)安乐死。在CIV攻击后8天，发现第3组中的一只狗(ID CAUELZ)死亡。单独用马链球菌攻击的六条狗中没有一只表现出任何临床体征。
Figure 3211DEST_PATH_IMAGE010
Figure 825674DEST_PATH_IMAGE012
结果表明，CIV在狗中可以引起严重的呼吸道疾病，该疾病可导致死亡。马链球菌作为二级病原体起作用，增强CIV诱导的疾病。单独的马链球菌本身不引起任何临床疾病。
病毒脱落：在攻击前那天，然后从攻击后第1天至第10天每天在所有CIV攻击的狗中(第1、3和4组)监测鼻病毒脱落。将每个处理组的平均病毒滴度(表示为Log10TCID50/mL)针对攻击后的天数作图(表5和图2)。从攻击后第1天，第1组和第4组中50％的狗以及第3组中的所有狗(100％)开始在它们的鼻分泌物中脱落CIV。到攻击后2天，所有三组中所有的狗对于鼻病毒脱落都是阳性。在CIV攻击后4至5天，病毒脱落达到其峰值，随后在第6天急剧下降(图2)。到攻击后第8天，未接种和接种者在它们的鼻分泌物中都停止脱落CIV。在攻击后10天期间总计每只狗的病毒滴度并进行统计学分析。与第4组(8.9 Log10 TCID50/mL)相比，第1组和第3组的平均曲线下面积估计值明显更高(分别为17.0 Log10 TCID50/mL和18.6 Log10 TCID50/mL)(对于第1组和第3组分别为P=0.0075和P<0.0001)。与第4组(4天)相比，第1组和第3组中的脱落天数的平均数(分别为5.7天和5.8天)也明显更高(分别为P=0.0356和P =0.0033)。结果表明，在接种的狗中CIV疫苗明显减少了鼻病毒脱落。
表5：攻击后鼻CIV脱落
Figure 968073DEST_PATH_IMAGE014
细菌脱落：在第-4天(CIV攻击前)和马链球菌攻击后第0、3、6、9和11天监测第2、3和4组中马链球菌攻击的狗的马链球菌的鼻脱落(表6和图3)。此外，在尸体解剖时采集第2、3和4组中所有狗的肺灌洗样本用于马链球菌分离。在CIV或马链球菌攻击时，所有组中所有的狗，除了第1组中的那些狗(未检测)，对于马链球菌脱落都是阴性的。在马链球菌攻击后的任何时间点，单独用马链球菌攻击的狗(第2组)没有一只对于鼻马链球菌脱落是阳性的。然而，从第2组中的一只狗(17％)的肺灌洗样本中分离出马链球菌。相反，在马链球菌攻击后的3天和6天，用CIV加上马链球菌攻击的第3组中的100％的狗在它们的鼻分泌物中对于马链球菌是阳性的，它们中的大多数(67％)继续脱落细菌，在攻击后持续至少9天。第3组中大多数的狗(67％)在它们的肺清洗液中对于马链球菌也是阳性的(马链球菌攻击后11天)，表明细菌在下呼吸道群集并增殖。马链球菌攻击后3天，用CIV加上马链球菌攻击的CIV接种的狗的大多数(60％)在它们的鼻分泌物中也脱落马链球菌。往后6天，与第3组相比，第4组中脱落马链球菌的狗的数量明显更少。接种的狗中仅20％在它们的肺灌洗样本中对于马链球菌是阳性的。
表6: 攻击后从鼻拭子和肺灌洗样本分离马链球菌
*马链球菌阳性狗的数量/组中狗的数量。
肺部病变：肺部实变/肺炎是所有流感感染中的主要病理病变。CIV以及CIV加上马链球菌攻击组(第1组和第3组)中所有的狗(100％)都表现出不同程度的肺部实变，而CIV接种组(第4组)中只有3只狗(30％)发生肺部实变，其中两只非常轻微(表7)。马链球菌攻击组(第2组)中仅有一只狗(17％)表现出肺部病变，它们是轻微的。在第1组中，肺部病变主要在前叶(cranial lobes)观察到，然而在第3组，病变似乎存在于所有的肺叶。肺部病变的特征在于出血和红色实变和肝样变。第1组中的肺部评分范围为0.5-32.97，中位数评分=17.27，在第3组中，肺部评分范围为5.53-39.74，中位数肺部评分=23.29。在第4组中，评分范围为0-25.54，中位数评分为0。相对于CIV攻击的疫苗效应的减轻分数估计值在95% CI时为88.3％(60％，100％)，相对于CIV加上马链球菌的该估计值在95% CI时为88.0%(58%, 100%)。 与第1组(P = 0.0019)和第3组(P = 0.0002)相比，第4组中的肺部评分明显更低。尽管第3组中的肺部评分比第1组更高，它们没有显著性差异(P=0.5622)。 数据表明，CIV疫苗有助于预防CIV以及CIV加上马链球菌诱导的肺部病变。
Figure 711219DEST_PATH_IMAGE018
Figure 65102DEST_PATH_IMAGE020
尽管已经描述了本发明连同其具体实施方案，应当理解的是，它能够进行进一步的修改，本申请旨在覆盖本发明的任何变化、用途或修改，其通常覆盖本发明的原理，并包括如本发明所属领域内已知或习惯的实施内容等与本公开内容不同的内容。此处提到的所有专利和公开的申请都完整地通过引用并入。

Claims (11)

1.保护动物免于二级病原体引起的疾病的方法，其包括提供针对初级病原体的包含抗原的疫苗以及将免疫原性有效量的所述针对初级病原体的疫苗施用于所述动物。
2.保护犬免于二级病原体引起的疾病的方法，其包括提供针对初级病原体的包含抗原的疫苗以及将免疫原性有效量的所述针对初级病原体的疫苗施用于所述犬。
3.保护犬免于二级病原体引起的疾病的方法，其包括提供针对犬流感病毒(CIV)的疫苗以及将免疫原性有效量的所述CIV疫苗施用于所述犬。
4.权利要求3的方法，其中所述二级病原体是马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus)(马链球菌(S. equi))。
5.保护犬免于犬传染性呼吸道疾病(CIRD)的方法，其包括提供针对犬流感病毒(CIV)的疫苗以及将免疫原性有效量的所述CIV疫苗施用于所述犬。
6.权利要求5的方法，其中所述疫苗是组合疫苗，其进一步包含一种或更多种额外的免疫原。
7.权利要求6的方法，其中一种或更多种额外的免疫原选自犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬冠状病毒、犬疱疹病毒、犬肺炎病毒、钩端螺旋体(Leptospira)血清型、利什曼虫(Leishmania)生物、包柔氏属(Borrelia)物种(spp.)、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)、支原体属(Mycoplasma)物种、狂犬病毒、犬埃立克体(Ehrlichia canis)及其任意组合。
8.权利要求4的方法，其中所述疫苗是组合疫苗，其进一步包含一种或更多种额外的免疫原。
9.权利要求8的方法，其中一种或更多种额外的免疫原选自犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬冠状病毒、犬疱疹病毒、犬肺炎病毒、钩端螺旋体血清型、利什曼虫生物、包柔氏属物种(spp.)、支气管败血波氏杆菌、支原体属物种、狂犬病毒、犬埃立克体及其任意组合。
10.CIV疫苗在保护犬免于二级病原体引起的疾病中的用途，包括将所述CIV疫苗施用于所述犬。
11.CIV疫苗在保护犬免于马链球菌疾病中的用途，包括将所述CIV疫苗施用于所述犬。
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