ES2687702T3 - Método para protección contra enfermedad causada por patógenos secundarios - Google Patents

Abstract

Una vacuna que consiste en un virus de la gripe canina inactivado y, opcionalmente, un adyuvante para su uso en la proteccion de un canido contra Streptococcus equi.

Description

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DESCRIPCION

Método para protección contra enfermedad causada por patógenos secundarios Campo de la invención

Se ha observado que la administración de una vacuna contra un patógeno primario protege contra enfermedad causada por un patógeno secundario, u oportunista. Por ejemplo, se protegió a perros contra enfermedad causada por patógenos secundarios, como las subespecies zooepidemicus de Streptococcus equi (S. equi), inmunizándolos contra patógenos colaterales.

Antecedentes de la invención

Se ha asociado S. equi con enfermedad respiratoria infecciosa canina (CIRD por sus siglas en inglés), que ha sido reconocida como una infección multifactorial que afecta principalmente a los perros de perrera (Chalker et al., Veterinary Microbiology 95 (2003):149-156). Sin embargo, se ha observado que se puede aislar S. equi de perros que no son de perrera, sanos, asintomáticos. S. equi contribuye a la gravedad de CIRD solamente en combinación con otros patógenos.

Se ha identificado el virus de la gripe canina (CIV) como un virus H3N8 que guarda una alta homología con el virus de la gripe equina. Se ha observado que la gripe canina es muy virulenta en ciertos tipos de perros. Por ejemplo, se observó que fue la causa de un brote que mató a varios galgos de carreras en perreras en Jacksonville, Florida. Aunque el 100 por cien de los perros expuestos estaban infectados, se observaron signos clínicos manifiestos de infección solamente en un 80 por ciento. Por otra parte, mientras que algunos de los perros expuestos a CIV desarrollan una enfermedad aguda con signos clínicos de neumonía, la mayoría de los perros experimentan un síndrome más suave, como una tos que persiste entre 10 y 21 días.

La patente internacional WO01/74386 divulga virus de la gripe equina adaptados al frío generado experimentalmente que se pueden administrar a un animal para tratar una enfermedad respiratoria como puedan ser enfermedades respiratorias, sin limitarse solo a ella, como secreción nasal, que se debe, según se cree, directa o indirectamente a herpes virus equino (EHV) u otros virus.

APVMA: "Notice of registration of agricultural and veterinary. Chemical products" de febrero de 2008 divulga una vacuna canina que comprende antígeno de Bordetella bronchiseptica inactivado y virus parainfluenza canino inactivado.

Deshpande Muralldhar S et al: Veterinary Therapeutics, Veterinary learning systems, vol. 10, no. 3,1 (2009), p103- 112 divulga virus de la gripe canina (CIV) subtipo H3N8 y evalúa la eficacia de una vacuna CIV inactivada en cachorros de sabueso de 6-8 semanas de vida. Divulga que el daño pulmonar causado por CIV puede suponer infecciones secundarias.

Castleman et al: FASEB J. vol. 20, no. 4, Parte 1, (2006), página A214 divulga observaciones patológicas en perros infectados con virus de la gripe canina H3N8. Divulga además que en las infecciones de la gripe canina espontáneas, la neumonía bacteriana secundaria fue común.

Yoon et al: Emerging Infectious Diseases, vol. 11, no. 12, (2005), p 1974-1976 divulga un estudio de un brote de enfermedad respiratoria en galgos de carreras. Se observa que dicho brote fue debido a virus de la gripe H3N8. No se descarta una posible contribución a dicho brote de S. zooepidemicus.

La patente internacional WO 2005/002618 divulga una composición de vacuna para su uso contra enfermedad respiratoria infecciosa canina que comprende uno cualquiera o más entre (a) un agente capaz de desarrollar una respuesta inmunitaria en un perro contra S. zooepidemicus; (b) un agente capaz de desarrollar una respuesta inmunitaria en un perro contra M. cvnos y (c) un agente capaz de desarrollar una respuesta inmunitaria en un perro contra una Chlamydophila. La vacuna puede comprender además un agente capaz de desarrollar una respuesta inmunitaria en un perro contra el virus de parainfluenza canina CPIV.

La patente internacional WO2007/118206 divulga un virus de la gripe canina aislado (CIV) y divulga que el CIV puede utilizarse en una vacuna de combinación.

La patente internacional WO2007/047938 divulga un virus de la gripe aislado que es capaz de infectar cánidos y causar enfermedad respiratoria en el cánido y el divulga que el virus de la gripe puede utilizarse en una vacuna de combinación.

Los autores de la invención han observado que la gravedad de S. equi y de CIV se potencia por co-infección uno con otro.

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Sumario de la invención

Un método para proteger un cánido contra enfermedad causada por patógenos secundario comprende la administración de una vacuna contra un patógeno primario. Se inmuniza el cánido al que se va a proteger con una vacuna CIV, protegiendo así el cánido contra enfermedades causadas por un patógeno secundario S. equi. Como consecuencia, se protege al cánido tanto contra CIV como contra S. equi.

Breve descripción de las figuras

Figura 1, Puntuaciones clínicas tras el desafío con CIV, gráficos de las puntuaciones clínicas promedio para cada grupo de tratamiento desde los dos días antes del desafío con CIV hasta 13 días después del desafío. Se desafió a todos los perros con CIV en el día del estudio 35 y se llevó un seguimiento diario a partir del día 2 hasta el día 13 tras el desafío con CIV en cuanto a los signos clínicos. Se trazó un gráfico de las puntuaciones clínicas promedio para cada grupo de tratamiento frente a los días tras el tratamiento. Se remite a la Tabla 4 para las puntuaciones clínicas.

Figura 2, excreción CIV nasal tras el desafío, gráficos de los títulos de virus promedio para cada grupo medidos por recogida de hisopos nasales en cada uno de los días uno a 10 tras el desafío. Se desafió a todos los perros de los grupos 1, 3 y 4 con CIV el día 35. Se recogieron los hisopos nasales el día antes del desafío (día 1) para confirmar que los cachorros estaban desprovistos de CIV. Se llevó un seguimiento de la excreción de virus nasal en los perros desafiados recogiendo hisopos nasales diariamente durante 10 días (día 1 a 10 tras el desafío) y realizando la titulación en monocapas MDCK. Se calcularon y se trazaron en gráfico los títulos de virus promedio para cada grupo de tratamiento, expresado como Log-i0 DICT50/ml frente a los días tras el desafío.

Figura 3, aislamiento de S. equi de hisopos nasales y lavado pulmonar, gráficos del porcentaje de perros en cada grupo positivos para S. equi desde el día antes del desafío con CIV al día 14 tras el desafío.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un método para proteger cánidos contra enfermedades causadas por patógenos secundarios que no presentan signos clínicos en ausencia de factores de compromiso, tales como co-infección con otro patógeno. En tales casos, aun en el caso en el que ninguno de los patógenos en sí presente signos clínicos, los dos en combinación tienen como resultado una patogénesis potenciada y una enfermedad clínicamente significativa.

El subtipo del virus de la gripe canina (CIV) H3N8 puede causar enfermedad respiratoria aguda en ciertos perros. Los autores de la invención han determinado que Streptococcus equi subsp. zooepidemicus (S. equi) exacerbó la enfermedad causada por CIV investigando la patogénesis tras la co-infección de perros con CIV y S. equi. De manera similar, observaron que los perros infectados con S. equi en solitario no presentaban signos clínicos, pero que cuando fueron desafiados tanto con CIV como con S. equi, se observó la enfermedad clínica activa. Siendo así, concluyeron que la inmunización con una vacuna de CIV protegía a los perros contra el desafío dual con CIV virulento y S. equi. Inesperadamente, se pudo prevenir la enfermedad respiratoria causada por S. equi mediante la administración de una vacuna contra CIV.

Los perros desafiados con S. equi en solitario no presentaron ningún signo clínico, excreción bacteriana ni lesiones pulmonares. Los perros desafiados solamente con CIV desarrollaron algunos signos clínicos, excreción viral y lesiones pulmonares. Las puntuaciones clínicas, la excreción de CIV y/o S. equi y las puntuaciones pulmonares fueron sustancialmente superiores en los perros desafiados con CIV más S. equi cuando se compararon con los perros desafiados con CIV en solitario o S. equi en solitario. Las puntuaciones pulmonares, las puntuaciones clínicas y la excreción bacteriana fueron significativamente más bajas en los perros vacunados con CIV desafiados con CIV más S. equi cuando se compararon con los perros no vacunados desafiados con CIV en solitario o CIV más S. equi.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término patógeno primario se refiere a un patógeno que puede causar signos clínicos de una enfermedad en algunos animales, pero no necesariamente con una severidad que pueda detectarse en todos los animales expuestos al patógeno.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término patógeno secundario se refiere a un patógeno que no tiene probabilidad de causar signos clínicos de una enfermedad en animales expuestos al patógeno a no ser que el animal esté debilitado por la exposición a otro patógeno o que se encuentre en un estado debilitado de otra forma y que se denomina a veces, patógeno oportunista.

Un patógeno que por sí mismo sería un patógeno secundario y que no tiene probabilidad de causar signos clínicos de enfermedad puede funcionar como patógeno primario cuando está presente con otro u otros patógenos secundarios.

Se puede hacer referencia a CIV como un patógeno primario y se puede hacer referencia a S. equi como un patógeno secundario.

La tos de las perreras es una importante enfermedad de los perros causada por una serie de patógenos virales y

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bacterianos. CIV y S. equi constituyen dos nuevos patógenos que han sido aislados frecuentemente en los últimos años de casos de enfermedad respiratoria canina, en particular, en perros de perrera y de refugio.

Los autores de la invención han investigado la patogénesis de infección dual con CIV y S. equi en perros y han evaluado la eficacia de la vacuna CIV en infección dual. A diferencia de los perros infectados solamente con CIV; la mayoría de los perros infectados con CIV más S. equi presentaron una fiebre clínica que duró más tiempo y signos clínicos más graves, en particular tos, que duraron más tiempo. La excreción de S. equi nasal en los perros con desafío dual fue muy alta con respecto al número de perros positivos en cuanto a la excreción y duración de la excreción. Asimismo, el desafío dual indujo puntuaciones de pulmón sustancialmente más altas en comparación con CIV en solitario o S. equi en solitario. Se observó que los perros desafiados con S. equi en solitario no presentaron fiebre clínica, signos clínicos de enfermedad respiratoria ni lesiones pulmonares. Por otra parte, no se detectó S. equi en las secreciones nasales de los perros desafiados solamente con S. equi. Se observó que S. equi en solitario no es capaz de inducir ninguna enfermedad y que S. equi es un patógeno oportunista que, en presencia de CIV, conduce a la colonización bacteriana. S. equi exacerba la fiebre, otros signos clínicos y la patología de pulmón asociada causada por CIV. Los autores de la invención descubrieron que la administración de vacuna de CIV mitigó los signos clínicos, la excreción viral/bacteriana y las lesiones de pulmón inducidas no solamente por CIV, sino también por CIV más S. equi. La vacunación contra CIV previno la enfermedad respiratoria causada por CIV y por patógenos oportunistas como S. equi.

S. equi para desafío puede obtenerse de animales infectados, como por ejemplo como el aislado utilizado en el ejemplo que se ofrece más adelante, o se pueden obtener de entidades depositarias, como pueda ser un aislado disponible de ATCC, No. 6580.

Entre los ejemplos de virus de la gripe canina que se pueden utilizar para desafiar, como por ejemplo en el ejemplo que se ofrece más adelante, y/o preparar vacunas para su administración de acuerdo con la invención se incluyen cualquiera de los virus H3N8 descritos en la solicitud de patente estadounidense No. 11/582,652, registrada el 18 de octubre de 2006 (Solicitud publicada US 2007/0092537), la solicitud de patente estadounidense No. 11/544,841, registrada el 6 de octubre de 2006 (Solicitud publicada US 2007/0082012), Solicitud internacional No. PCT/US2006/04161, registrada el 19 de octubre de 2006 y solicitud de patente estadounidense No. 11/956,658, registrada el 14 de diciembre de 2007.

Las vacunas de CIV de la presente invención tienen virus avirulentos, atenuados o inactivados, o comprenden subunidades antigénicas. Se pretende que los virus avirulentos y atenuados incluyan virus recombinantes, así como aislados avirulentos, virus de pasaje, virus adaptados en frío y virus a los que se han hecho menos virulentos o no patógenos a través de otros medios. La vacuna de CIV también puede ser una vacuna comercial como la vacuna CIV distribuida por Intervet Inc./Schering-Plough Animal Health, Elkhorn, NE, NOBIVAC® Canine Flu H3N8. De acuerdo con la invención puede utilizarse cualquier vacuna CIV inactivada eficaz.

La presente invención proporciona además vacunas de combinación para provocar la inmunidad protectora contra el virus de la gripe canina (CIV) y otras enfermedades, p.ej., otras enfermedades infecciosas caninas. Dichas vacunas tendrán virus y/o bacterias avirulentos, atenuados y/o inactivados y/o comprenderán subunidades antigénicas. Por consiguiente, la presente invención proporciona vacunas de combinación que incluyen una o más cepas de CIV, p.ej., CIV H3N8 inactivada, en combinación con otro u otros patógenos y/o inmunógenos caninos, incluyendo p.ej., patógenos/inmunógenos para provocar inmunidad contra el virus del moquillo canino, adenovirus canino, adenovirus canino tipo 2, parvovirus canino, virus de parainfluenza canina, coronavirus canino, herpesvirus canino, pneumovirus canino y/o variedades serológicas de Leptospira, p.ej., variedad serológica de Leptospira kirschneri, grippotyphosa, variedades serológicas de Leptospira interrogans canicola, Leptospira interrogans icterohaemorrhagiae y/o variedad serológica de Leptospira interrogans pomona. Entre otros patógenos/inmunógenos caninos que se pueden añadir a una vacuna de combinación de la presente invención se incluyen Bordetella bronchiseptica; organismos de Leishmania como Leishmania major y Leishmania infantum; especies Borrelia (spp.) spirochetes, incluyendo B. burgdorferi sensu stricto (ss), B. burgdorferi ss, B. garinii y B. afzelii; una especie Mycoplasma (p.ej. Mycoplasma cynos); virus de la rabia; y Ehrlichia canis. En realizaciones en particular, una vacuna de combinación de la presente invención consiste en CIV con virus de parainfluenza canina (CPI) y/o adenovirus canino de tipo 2 (CAV2) y/o Bordetella bronchiseptica (BB) y/o parvovirus canino (CPV) y/o virus del moquillo canino (CDV) y/o coronavirus canino, en cualquier combinación. En una de dichas realizaciones, la vacuna consiste en virus de la gripe canina, Bordetella bronchiseptica y virus de parainfluenza canina. En otra de dichas realizaciones, la vacuna consiste en virus de la gripe canina, virus del moquillo canino, adenovirus canino de tipo 2, parvovirus canino y virus de parainfluenza canina. En modos de realización en particular, cuando la vacuna de combinación de la presente invención comprende una o más cepas virales y/o bacterianas, dichas cepas son avirulentas, atenuadas y/o inactivadas.

Las vacunas de la presente invención pueden administrarse a través de cualquier ruta incluyendo: administración parenteral, inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección peritoneal, inyección intradérmica, administración oral, administración intranasal, escarificación y combinaciones de las mismas. En una realización preferente de la invención, se administra la vacuna por inyección intramuscular.

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Las vacunas de la presente invención pueden contener o no un adyuvante. Entre los ejemplos de adyuvantes para su uso en las vacunas de la presente invención se incluyen aquellas que contienen una emulsión aceite y agua y/o hidróxido de aluminio. En éste último caso, puede utilizarse un hidróxido de aluminio de una fuente comercial, por ejemplo, Alhydrogel, [Superfos Biosector, Frederikssund, Dinamarca] y Rehydrogel (Reheis Inc.). La emulsión aceite y agua comprende normalmente aceite mineral o aceites metabolizables (p.ej., aceite vegetal, aceite de pescado). Se pueden utilizar detergentes no iónicos o tensioactivos como emulsionantes. Entre los ejemplos de emulsionantes se incluyen Tween 80/ Span 80, Arlecel 80/ Tween 80 y Montanides (Seppic, Paris, Francia). En el caso de emulsiones adyuvantes, generalmente 5-25 % del volumen es aceite y 75-95 % del volumen es acuoso. En algunas realizaciones, la emulsión adyuvante es 20 % aceite y 80 % acuosa en volumen. La cantidad de hidróxido de aluminio está comprendida normalmente entre aproximadamente 5 % y 15 % de la fase acuosa. En algunas realizaciones, Emunade® es el adyuvante.

Para algunas realizaciones, se puede utilizar ISCOM como adyuvante. ISCOM es el acrónimo de Immune Stimulating Complex y la tecnología ha sido descrita por Morein et al. [Nature 308:457-460 (1984)]. Un ISCOM puede formarse convenientemente de una entre dos formas. En algunas realizaciones, se incorpora físicamente el antígeno en la estructura durante su formulación. En otras realizaciones, una matriz ISCOM (tal como la suministra Isconova) no contiene antígeno, pero se mezcla con el antígeno que seleccione el usuario final antes de la inmunización. Tras el mezclado, los antígenos están presentes en solución con la matriz ISCOM pero no se incorporan físicamente en la estructura.

Para comprender más claramente la invención se ofrece el siguiente ejemplo. Tiene un fin meramente ilustrativo y ha de entenderse que no limita el ámbito o los principios subyacentes de la invención en absoluto. Para las personas especializadas en la material serán evidentes diversas modificaciones de la invención dentro del ámbito reivindicado que se enmarcan en la invención a partir del ejemplo y la descripción del presente documento.

Ejemplo

Introducción

Se utilizó en el estudio un total de 32 perros, de 7 a 8 semanas de vida. Se vacunó a un grupo de 10 perros con dos dosis de virus de la gripe canina H3N8 inactivado, administrado con una separación de 21 días. Se desafió a los perros vacunados con CIV virulento y S. equi dos semanas después de la vacuna de refuerzo. Se utilizaron los 3 grupos de perros restantes para evaluar la patogénesis tras el desafío simple y dual sin vacunación. Se desafió a un grupo de 6 perros con CIV en solitario y a otro grupo de 6 perros con S. equi en solitario. Se desafió a un grupo de 10 perros con CIV y S. equi.

Se llevó un seguimiento de todos los perros en cuanto a los signos clínicos de enfermedad respiratoria y excreción viral y/o bacteriana. Se recogieron las muestras antes de la vacunación del grupo vacunado, antes de la administración de desafío de todos los grupos y en el momento de la necropsia de todos los grupos para determinar el título de anticuerpo para CIV. Se sometió a eutanasia a los perros a los 14 días tras el desafío con CIV (Día de estudio 49) y se evaluaron los pulmones en cuanto a las lesiones pulmonares. En el momento de la necropsia, se recogieron muestras de lavado pulmonar para el aislamiento de S. equi.

Se utilizó un lote comercial de vacuna de virus inactivado H3N8 de la gripe canina (Intervet Inc., Elkhorn, NE) para vacunar perros de 7-8 semanas de vida en el Grupo 4.

Todos los perros del Grupo 4 fueron CIV seronegativos en la primera vacunación y todos los perros de los Grupos 1, 2 y 3 fueron CIV seronegativos en el momento del desafío con CIV.

Tabla 1 Grupos de tratamiento:

Grupos de tratamiento

No. de cachorros Día de vacunación Organismos de desafío y día de desafío Día de necropsia

1

6 NA Simple CIV - Día 35 Día 49

2

6 NA Simple S. equi- Día 38 Día 49

3

10 NA Dual CIV- Día 35 S. equi - Día 38 Día 49

4

10 0, 21 Dual CIV- Día 35 S. equi - Día 38 Día 49

Se clasificó a los perros por sexo y camada y se les asignaron números aleatorios generados por ordenador. Se clasificaron los perros por los números aleatorios en orden ascendente y se los asignó a grupos de tratamiento.

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Se vacunó a los 10 perros del Grupo 4 con vacuna CIV por inyección subcutánea de 1 ml de vacuna CIV (serie # 219104) en los días del estudio 0 y 21.

Evaluación clínica: Se realizaron evaluaciones clínicas y se registraron las temperaturas en los días del estudio 33 y 34 (dos días antes del desafío con CIV) y en el día del desafío con CIV (día del estudio 35) para todos los perros. Se realizaron las observaciones clínicas siguiendo la Guía de Evaluación Clínica.

Recogida de muestras: Se recogieron aproximadamente 5 ml de muestras de sangre de todos los perros el día antes de la administración de desafío de CIV (día de estudio 34). Se recogieron también hisopos nasales de todos los perros de los Grupos 1, 3 y 4 el día del estudio 34 para detectar la excreción de CIV.

Virus de la gripe canina: Se utilizó el aislado de virus CIV14-06A recogido en el pasaje 3 (etiquetado como “virus de la gripe canina CIV14-06A (P3)) como virus de desafío. Se aisló el virus originalmente desde un perro que padecía enfermedad respiratoria canina. El día del desafío, se descongeló fluido de virus congelado inmediatamente antes de su uso y se diluyó en medio de Eagles modificado con Dulbecco frío esterilizado (DMEM) hasta un volumen final de 2 ml por perro que contenía una dosis de desafío dirigida de 7,5 Log-iü DICT50.

Streptococcus equi subsp zooepidemicus: Se obtuvo el aislado bacteriano de un perro que había residido en un refugio de animales y fallecido de enfermedad respiratoria canina compleja. Se aisló la bacteria, se purificó y se caracterizó como S. equi subsp zooepidemicus. Se preparó el material de desafío cultivando las bacterias en caldo de infusión cerebro-corazón (BHI) y diluyendo para obtener 1X109 ufc/ml.

Administración de desafío

Virus de gripe canina: Se desafió a los perros de los Grupos 1, 3 y 4 con CIV el día 35. Para administrar el desafío, se colocaron cuatro perros en una cámara de Plexiglas y se utilizaron 8 ml de virus de desafío (2 ml/perro) para generar aerosol a lo largo de un período de 25-30 minutos. Se expuso a los perros al aerosol durante un total de 40 minutos.

S. equi subsp zooepidemicus: Se desafió a los perros de los Grupos 2, 3 y 4 con S. equi el día 38 del estudio. Se instiló medio mililitro (0,5 ml) de material de desafío que contenía 1 x 109 ufc de S. equ/7ml en cada orificio nasal de todos los perros utilizando una cánula nasal.

Seguimiento tras el desafío

Signos clínicos: Se registró la temperatura rectal y se llevó a cabo la evaluación clínica para cada perro diariamente durante 13 días tras el desafío.

Recogida de hisopo nasal

Virus de la gripe canina: Se recogieron hisopos nasales de cada perro diariamente durante 10 días desde el día del desafío para evaluar la excreción de CIV. Se recogieron hisopos nasales en medio de transporte de virus.

Aislamiento de S.equi: Se recogieron hisopos nasales para aislamiento de bacterias utilizando medio de transporte bacteriano una vez cada tres días tras el desafío hasta el día de la necropsia.

Recogida de sangre: Se recogieron muestras de sangre (aproximadamente 5-10 ml) el día de la necropsia para evaluar el título de anticuerpos contra CIV:

Necropsia/Disposición

Un perro (ID CAUELW) del Grupo 3 murió el día del estudio 43 (es decir, 8 días después del desafío con CIV y 5 días después del desafío con S. equi) debido a dificultad respiratoria severa. El perro presentó fiebre, abatimiento, tos fuerte y disnea durante dos días antes de morir. La necropsia reveló neumonía severa caracterizada por adherencias fibrosas entre los lóbulos pulmonares y la pared torácica, consolidación y micro-abscesos en los lóbulos del pulmón.

Un perro (ID CAUELZ) del Grupo 1 presentó fiebre, tos fuerte, abatimiento y disnea en los días del estudio 43 y 44. Por tanto, el veterinario de la investigación sometió a eutanasia al perro el día 44 (9 días después del desafío con CIV) y realizó la necropsia. Las lesiones del pulmón se caracterizaron por la consolidación que indicó neumonía.

Muestras y observaciones de la necropsia tras el desafío: Todos los perros restantes fueron sometidos a eutanasia el día 14 después del desafío con CIV. Se sometió a eutanasia a los perros inmediatamente antes de la necropsia para permitir una rápida evaluación del pulmón antes de que se establecieran los cambios post-mortem. Se recogieron también lavados de pulmón de tejidos pulmonares nuevos para aislamiento bacteriano.

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GUIA DE EVALUACION CLINICA

Una vez que entró en la sala de aislamiento, el personal que llevaba a cabo la evaluación clínica deambuló por ella para evaluar la actitud de los animales y después continuó con las observaciones clínicas. Se completaron las observaciones clínicas primero para cada perro antes de llevar a cabo otros procedimientos, como la administración de desafío. Se siguieron las siguientes directrices para puntuar cada signo clínico.

Secreción nasal

0 = Ausente

0,5 = Secreción serosa: gotas de líquido transparente diluido del orificio nasal. En este punto el líquido debe salir fuera de la nariz para ser registrado.

1 = Secreción mucopurulenta, suave a moderada: un líquido opaco con moco que cae al menos a medio camino entre la nariz y la boca.

2 = Secreción mucopurulenta, severa: el moco cae pasando la boca.

Secreción ocular

0 = Ausente: no se considera secreción ocular una pequeña cantidad de material seco y costroso en la comisura del ojo

0,5 = Secreción serosa: Líquido transparente que cae desde los ojos al menos a medio camino hasta la boca.

1 = Descarga mucopurulenta, suave a moderada: líquido opaco mezclado con moco que cae al menos a medio camino desde el ojo hasta la boca.

2 = Descarga mucopurulenta, severa: Líquido o moco que cae a medio camino hasta la nariz y o que rodea el ojo y empapa el pelo de las esquinas interior y exterior del ojo.

Tos

0 = Ausente

0,5 = Suave: Tan solo se observa una tos breve.

1.0 = Moderada: La tos es persistente, se produce de forma repetida en el período de observación.

2.0 = Grave: La tos va acompañada de sonidos de asfixia y arcadas.

Estornudos Disnea

0 = Ausente 0 = Ausente (respiración normal)

2 = Presente 2 = Presente (respiración dificultosa)

Abatimiento

0= Ausente (Actividad normal)

2= Presente: El perro está menos activo o juguetón en comparación con lo normal. Se registra a los cachorros cuando están aletargados o tumbados y reacios a levantarse cuando se lleva a cabo la observación.

Métodos de análisis

Ensayo de inhibición de hemaglutinación (HAI): Se midieron los anticuerpos para CIV en las muestras de suero de perro por ensayo de inhibición de hemaglutinación (HAI). Brevemente, se llevó a cabo una dilución doble sucesiva del suero de ensayo en PBS en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo en U. Se agregó un volumen equivalente (25 jl) de suspensión de virus que contenía 4 unidades HA de CIV25-06B a cada pocillo que contenía el suero de ensayo y se incubaron las placas a 20-25 °C durante 60 ± 5 minutos para dejar que tuviera lugar la reacción antígeno-anticuerpo. A continuación, se agregaron 50 jl de una suspensión de rBc de gallo al 0,5 %. Se incubaron las placas a 20-25 °C durante 45-60 minutos y se hizo la lectura de los resultados HAI. Se registró el título de HAI como el recíproco de la dilución máxima del suero que presentó inhibición de hemaglutinación. Se llevaron a cabo todos los ensayos por duplicado y se determinó el título de HAI criterio de valoración.

Titulación de CIV en cultivo celular: Para confirmar el título del material de desafío y medir la excreción viral en perros a los que se administró desafío, se determinaron los títulos virales en material de desafío y en hisopo nasal por titulación en células MDCK. Se sembraron células MDCK en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos durante 23 días y se inoculó una suspensión viral 10 veces diluida de forma sucesiva o muestras preparadas de hisopos nasales. Se incubaron las placas a una temperatura de 36 ± 2 °C y 4-6 % de CO2. Siete días después de la infección, se observaron las placas en cuanto al efecto citopático (CPE) y se calculó el criterio de valoración del 50 % utilizando el método de Spearman-Karber. Se expresaron los títulos virales como Log-iü DICT50/ml.

Aislamiento de S. equi: Se inocularon sobrenadantes de muestra en las placas de agar con sangre (10 jl) y se incubaron las placas a 36 ± 2 °C durante 24-48 horas. Se siguieron identificando las colonias que presentaron hemolisis como S. equi por tinción de Gram, la morfología, las características de la colonia y las pruebas de

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identificación normales (pruebas de oxidasa, catalasa y coagulasa).

Análisis de los datos

Variables de los resultados: La puntuación de la lesión pulmonar fue la variable principal. Otras variables incluyeron signos clínicos, excreción viral, excreción bacteriana y serología.

Análisis estadístico

Puntuación de lesión pulmonar: Se convirtió el porcentaje de consolidación de cada lóbulo pulmonar durante la necropsia en una puntuación ponderada basada en el sistema de puntuación pulmonar. Se compararon las puntuaciones del pulmón medias para varios grupos utilizando la prueba exacta de suma de rangos de Wilcoxon. Asimismo, se registra la estimación de eficacia de vacuna de fracción mitigada en relación con los grupos no vacunados y el intervalo de confianza de 95 % para la estimación.

Puntuaciones clínicas: Se sumaron las puntuaciones clínicas en cuanto a la fiebre, secreción ocular, secreción nasal, estornudos, tos, abatimiento y disnea durante 13 días tras el desafío para obtener la suma de una puntuación clínica de cada perro. Se compararon las puntuaciones sumadas entre los grupos de tratamiento utilizando la prueba exacta de suma de rangos de Wilcoxon.

Excreción viral: Se sumaron los títulos virales (Log™ DICT50/ml) durante 10 días tras el desafío para cada perro. Se analizó el área bajo la curva media (AUC) y el número de días de excreción del virus utilizando la prueba exacta de suma de rangos de Wilcoxon.

Excreción bacteriana: Se analizó el número de días de excreción bacteriana aplicando la prueba exacta de suma de rangos de Wilcoxon y se comparó el número de días positivos en cuanto a la excreción entre los grupos de tratamiento.

Seroconversión: Se registró la media geométrica de los títulos de anticuerpo en diferentes puntos temporales.

Se llevó a cabo el análisis estadístico utilizando SAS versión 9.1.3 (SAS Institute, Cary, NC, Estados Unidos). Se declaró la importancia estadística para p<0,05.

Prueba de validez y criterios de aceptabilidad

Todos los perros, excepto los del Grupo 4, fueron negativos para los anticuerpos de CIV en el momento del desafío con CIV.

Todos los perros, excepto los del Grupo 2, fueron negativos en cuanto a la excreción de CIV nasal en el momento del desafío con CIV. No se analizó a los perros del Grupo 2 en cuanto a la excreción de CIV:

Todos los perros no vacunados desafiados con CIV (Grupos 1 y 3) presentaron diversos grados de lesiones de pulmón tras el desafío con CIV.

RESULTADOS Y CONCLUSIÓN

Validez: Todos los perros del Grupo 4 fueron CIV seronegativos antes de la primera vacunación y todos los perros no vacunados (Grupos 1, 2 y 3) permanecieron seronegativos antes del desafío con CIV (Tabla 2). Todos los perros también fueron negativos para CIV y/o excreción de S. equi en el momento del desafío con CIV (Tablas 5 y 6).

Seroconversión: Se trazó una tabla de los títulos de anticuerpo HAI y se compararon entre los grupos de tratamiento (Tabla 2). Todos los perros vacunados se seroconvirtieron en CIV tras la vacunación. Los títulos de anticuerpo HAI entre 10 y 160, con un promedio geométrico de títulos de anticuerpo (TPG) de 73 el día 34. La mayoría de las vacunas (80 %) desarrolló un título HAI de 40 o superior. Todos los perros en los grupos no vacunadas fueron CIV seronegativos en el momento del desafío con CIV (título HAI <10). Tras el desafío, los títulos de anticuerpo en los perros vacunados alcanzaron niveles muy altos (TPG >6378), lo cual demostró la eficacia de la vacuna en la sensibilización del sistema inmunitario contra CIV virulento. Los títulos HAI en todos estos perros fueron al menos 2560. Los perros no vacunados desafiados con CIV de los Grupos 1 y 3 se seroconvirtieron tras el desafío con CIV con un TPG de 226 y 278, respectivamente. Todos los perros del Grupo 2 permanecieron CIV seronegativos en el momento de la necropsia lo que confirmó que no fueron expuestos a CIV y los procedimientos de bioseguridad fueron eficaces.

Tabla 2: Título de anticuerpo de inhibición de la hemaglutinación

Tratamiento

ID perro Día de estudio

0

35 49

Desafío con CIV

CAUELZ NT* <10 80**

(Grupo 1)

CAUENF NT <10 320

CAUENR

NT <10 640

CAUEMP

NT <10 160

CAUELN

NT <10 320

CAUEMZ

NT <10 160

TPG <10 226

Desafío con S. equi (Grupo 2)

CAUELS NT <10 <10

CAUEME

NT <10 <10

CAUENM

NT <10 <10

CAUENU

NT <10 <10

CAUELM

NT <10 <10

CAUELR

NT <10 <10

TPG <10 <10

Desafío dual con CIV más S. equi (Grupo 3)

CAUELU NT <10 320

CAUELW

NT <10 H***

CAUENK

NT <10 320

CAUELX

NT <10 960

CAUEPU

NT <10 160

CAUENN

NT <10 960

CAUEMR

NT <10 160

CAUEMN

NT <10 320

CAUELP

NT <10 80

CAUENA

NT <10 160

TPG <10 278

Vacunación CIV y desafío dual con CIV más S. equi (Grupo 4)

CAUELT <10 160 5120

CAUEN W

<10 160 7680

CAUEPB

<10 160 >10240A

CAUEMB

<10 40 5120

CAUENP

<10 160 2560

CAUEMS

<10 10 >10240A

CAUENL

<10 120 >10240A

CAUEML

<10 10 >10240A

CAUELL

<10 160 5120

CAUEMX

<10 80 3840

TPG

<10 73 6378

*NT= no analizado; **Muestra recogida el día 10 tras el desafío;

H***= Muestra hemolizada. Muestra recogida el día 9 tras el desafío.

A Para las muestras con título HI de >10240, se utilizó el valor 10240 para calcular el TPG

Confirmación de desafío: Se titularon las muestras de virus de desafío congeladas y almacenadas a -50 °C o menos antes y después de la administración del desafío en células MDCK y se confirmó que la dosis era 7,73 Log10 DICT50 de CIV14-06A por perro. Adicionalmente, no hubo una sustancial diferencia entre las muestras de retención antes 5 del desafío y después del desafío.

La muestra de retención de S. equi titulada en placas de agar de sangre confirmó que el título de material de desafío era 1 x 109 ufp/ml. Las bacterias siguieron siendo viables durante el curso de la administración de desafío.

10 Temperatura rectal y signos clínicos: Se registraron las temperaturas rectales en todos los grupos de tratamiento diariamente desde el día del estudio 33 al día 48 (Tabla 3). En el Grupo 1 (CIV solamente), dos de los seis perros desarrollaron fiebre clínica (> 39,5 °C) solamente durante un día. Uno de los dos perros desarrolló también un grave abatimiento y fue sometido a eutanasia. En el Grupo 2, uno de los seis perros (S. equi solamente) desarrolló fiebre suave durante un día. En el Grupo 3, desafiado tanto con CIV como con S. equi, 90 % (9 de 10) de los perros 15 desarrolló fiebre y la mayoría de ellos (70 %) presentó fiebre durante al menos dos días. El 50 % de los perros vacunados (5 de 10, Grupo 4) desarrolló también fiebre tras el desafío dual. Sin embargo, la fiebre duró solamente un día.

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una vacuna que consiste en un virus de la gripe canina inactivado y, opcionalmente, un adyuvante para su uso en la protección de un cánido contra Streptococcus equi.

   5
2. 2. Una vacuna de combinación que consiste en un virus de la gripe canina inactivado y uno o más inmunógenos adicionales y, opcionalmente, un adyuvante, para su uso en la protección de un cánido contra Streptococcus equi, en la que el uno o más inmunógenos adicionales se seleccionan del grupo que consiste en virus del moquillo canino, adenovirus canino, parvovirus canino, virus de parainfluenza canina, coronavirus canina, herpesvirus canino,

   10 pneumovirus canino, variedades serológicas de Leptospira, organismos Leishmania, especies de Borrelia (spp.,), Bordetella bronchiseptica, especies de Mycoplasma, virus de la rabia, Ehrlichia canis.
3. 3. Una vacuna para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 en la que Streptococcus equi es Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

   15
4. 4. Una vacuna para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la que el virus de la gripe canina es un virus de la gripe canina inactivado.

   Puntuación clínica promedio

   Figura 1

   imagen1

   Titulación promedio (Logio DICTso/ml)

   Figura 2

   imagen2

   -1 1 2 3 4 5 6 7

   Días tras desafío con virus CIV

   8 9 10

   Porcentaje de perros positivos para S. equi

   imagen3