KR20110126726A - 개과 동물의 인플루엔자의 치료를 위한 백신 및 방법 - Google Patents

개과 동물의 인플루엔자의 치료를 위한 백신 및 방법

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KR20110126726A
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셀리 린 실즈
한스 안소니 드라이어
마이클 존 휴터
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화이자 프로덕츠 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 개과 동물의 인플루엔자 바이러스에 관련된 질환에 대한 신규 백신 및 치료법을 제공한다. 본 발명은 인플루엔자 바이러스 항원, 및 이들 항원을 개과 동물, 특히 개에게 제공하는 방법을 개시한다. 본 발명은 감쇠되거나 죽은 백신에 관한 것이다. 본 발명은 실험에 의해 발생된 개과 동물 및 말과 동물의 인플루엔자 바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 H3, N8, H3N8, H7N7 및 개과 동물 또는 말과 동물의 인플루엔자 바이러스로부터의 하나 이사의 게놈 구획을 함유하는 바이러스도 포함한다. 본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스에 의해 발병되는 질환으로부터 개과 동물, 특히 개를 보호하기 위한, 이들 바이러스의 치료 조성물에서의 용도에 관한 것이다.

Description

개과 동물의 인플루엔자의 치료를 위한 백신 및 방법{VACCINES AND METHODS TO TREAT CANINE INFLUENZA}
본 발명은 개과 동물의 인플루엔자 바이러스에 관련된 질환 치료를 위한 신규 백신 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 인플루엔자 바이러스 항원 및 이들 항원을 개과 동물, 특히 개에게 제공하는 방법을 개시한다. 본 발명은 감쇠된 백신 및 죽은 백신에 관한 것이다. 본 발명은 실험에 의해 생성된 개과 동물 및 말과 동물의 인플루엔자 백신 및 바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 개과 동물 또는 말과 동물의 인플루엔자 바이러스로부터의 하나 이상의 게놈 구획을 함유하는 인플루엔자 A, H3, N8, H3N8 및 H7N7 바이러스도 포함한다. 본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스에 의해 발병되는 질환으로부터 개과 동물, 특히 개를 보호하기 위한 치료 조성물에서의 이들 바이러스의 용도에 관한 것이다.
말과 동물의 인플루엔자 바이러스는 약 1956년 이래로 말에서의 주요 호흡기 병원체로 인식되어 왔다. 말과 동물의 인플루엔자 바이러스에 의해 발병되는 질환의 증상은 심각할 수 있으며, 흔히 속발성 세균 감염증이 뒤따른다. 말과 동물의 인플루엔자 바이러스의 두 가지 아유형, 즉 아유형-1(표현형은 A/Equine/Prague/1/56(H7N7)임) 및 아유형-2(표현형은 A/Equine/Miami/1/63(H3N8)임)가 알려져 있다. 현재, 우세한 바이러스 아유형은 아유형-2, 즉 H3N8 균주이다. 현재는, 이 균주가 개과 동물을 감염시킬수 있는 것으로 생각되며, 이는 일부 경우에서 36%로 보고된 개과 동물 치사율을 가질 정도로 상당히 발병성일 수 있다. 말과 동물의 인플루엔자 바이러스 전체 또는 일부가 개로 종간 전달되어 급성 호흡기 질환을 수반하는 신규 개과 동물의 특이적 인플루엔자 바이러스를 생성시킬 수 있다. 문헌[Transmission of Equine Influenza to Dogs (피. 씨. 크로포드 등, Science 310, 482-485 (2005))] 참조. 이러한 신규 개과 동물의 인플루엔자를 치료 및 예방하는데 효과적인 백신이 명백하고도 설득력 있게 요구되고 있다.
발명의 개요
본 발명은 말과 동물 및 개과 동물의 인플루엔자 항원, 백신 및 이들 백신을 사용하여 개과 동물, 특히 개를 개과 동물의 인플루엔자에 의해 발병되는 감염증, 질환 및 증상으로부터 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스에 의해 발병되는 질환에 대해 동물을 보호하기 위한 치료 조성물도 제공한다. 백신 제조 방법 및 동물 치료 방법이 본원에 기재된다. 본 발명의 항원은 H3N8 항원 아유형을 갖는 인플루엔자를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 임의의 조류 또는 포유동물로부터의 임의의 확인된 인플루엔자 바이러스 균주(더욱 통상적으로는 H3N8 균주로 불림)일 수 있다. 인플루엔자는 돼지과 동물, 조류, 말과 동물 또는 개과 동물을 포함하지만 이들로 국한되지는 않는 임의의 포유동물로부터 유래될 수 있다. 말과 동물 및 개과 동물의 인플루엔자 바이러스 및 관련 항원이 바람직하다. H3 또는 N8로 지칭되는 단백질을 갖는 균주가 개시된다. H3N8 둘 다를 갖는 균주가 바람직하다. H7N7로 지칭되는 단백질을 갖는 균주도 개시된다.
항원 농도 및 백신 생성 방법이 기재된다. 세포 배양 배지 및 바이러스 생육 방법도 기재된다. 감쇠되고 죽고 불활성화된 바이러스의 백신 제제 및 백신 보조제, 배합물, 형태 및 담체, 투여량, 투여 경로 및 분석법이 모두 기재된다.
정의 및 약어
하기 정의가 본원에 적용되며, 정의되지 않은 용어는 당해 분야의 숙련자가 통상적으로 사용하는 의미를 갖는다.
측정가능한 수치 변수와 관련하여 사용되는 "약"은 변수의 표시된 값 및 표시된 값의 실험 오차 내(예컨대, 평균에 대해 95% 신뢰 구간 내)에 또는 표시된 값의 10% 내에 속하는 변수의 모든 값(어느 쪽이 더 큰지에 관계없이)을 일컫는다.
"능동 면역"은 개에서 체액성 면역 및/또는 세포-매개성 면역 둘 다를 포함한다.
"항체"는 항원에 대한 면역 반응의 결과로서 특이적인 항원에 결합할 수 있는 면역 글로불린 분자를 말한다. 면역 글로불린은 "불변" 및 "가변" 영역을 갖는 "경질" 및 "중질" 폴리펩타이드 쇄로 구성되는 혈청 단백질이고, 불변 영역의 조성에 기초하여 다수의 부류(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)로 분류된다. 소정 항원에 "특이적인" 항체는 항체의 가변 영역이 특이적인 항원만 인식하고 결합함을 나타낸다. 항체는 다클론성 혼합물 또는 단클론성일 수 있다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래되는 완전 면역 글로불린일 수 있거나, 또는 완전 면역 글로불린의 면역 반응성 부위일 수 있다. 항체는 예컨대 Fv, Fab', F(ab')2를 비롯한 다양한 형태로, 또한 단일 쇄로 존재할 수 있다.
"항원" 또는 "면역원"은 개체에 노출될 때 항원에 대해 특이적인 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 항원 결정기(선형, 정합형 또는 둘 다)를 함유하는 분자를 지칭한다. 항원 결정기는 T-세포 수용체 또는 특이적인 항체에 결합하는 항원의 특이적인 부위이고, 전형적으로는 약 3개의 아미노산 잔기 내지 약 20개의 아미노산 잔기를 포함한다. 용어 항원은 아단위 항원-항원이 천연적으로 수반되는 전체 생물체로부터 분리 및 독립된 항원-및 죽거나 감쇠되거나 불활성화된 세균, 바이러스, 진균, 기생균 또는 다른 미생물을 말한다. 용어 항원은 또한 항유전인자형 항체 또는 그의 분절 같은 항체, 및 항원 또는 항원 결정소(항원 결정기)를 모방할 수 있는 합성 펩타이드 미모토프(mimotope)를 가리킨다. 항원이라는 용어는 또한 DNA 면역화 용도에서와 같이 생체 내에서 항원 또는 항원 결정소를 발현하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 말한다.
"항원성"은 단백질 또는 폴리펩타이드에 대항하여 활동하는 항체에 의해 면역 특이적으로 결합되는 단백질 또는 폴리펩타이드의 능력을 일컫는다.
"개과 동물"은 통상 개로 불리는 동물을 포함하지만, 개과에 속하는 다른 일원도 포함한다.
"세포 면역 반응"은 면역 반응을 참조한다.
"반려 동물"은 애완 동물로 생각되는, 사육되는 인간이 아닌 임의의 동물을 말한다. 이들은 개, 고양이, 말, 양, 토끼, 원숭이, 및 마우스, 래트, 햄스터, 게르빌루스쥐 및 흰족제비를 비롯한 설치류를 포함할 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
"말과 동물"은 통상 말로 불리는 동물을 포함하지만, 말과에 속하는 다른 일원도 포함한다.
"부형제"는 항원이 아닌 백신의 임의의 성분을 가리킨다.
"제 1 백신", "제 2 백신", "제 3 백신" 등은 동일하거나 상이할 수 있고 통상 임의의 순서로 투여될 수 있는, 별도로 투여될 수 있는 백신을 말한다. 따라서, 제 3 백신은 제 2 백신 전 또는 후에 개체에 투여될 수 있다.
본원에 사용되는 경우 "이종"은 상이한 바이러스, 종 또는 균주로부터 유래됨을 의미한다.
본원에 사용되는 "상동성"은 본원에서 사용되는 경우 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열이 공유하는 동일성의 정도를 말한다.
바이러스 종과 관련하여 사용되는 경우 "상동"은 동일한 바이러스 종 또는 균주를 의미한다.
본원에 사용되는 경우 "숙주 세포"는 플라스미드, 바이러스 또는 다른 벡터가 잠복해 있는 세균 또는 진핵생물 세포(포유동물, 조류 또는 곤충을 포함함)를 의미한다.
"체액성 면역 반응"은 면역 반응을 참조한다.
"하이브리도마"는 단클론성 항체를 참조한다.
개체에서의 "면역 반응"은 항원에 대한 체액성 면역 반응, 세포성 면역 반응 또는 체액성 및 세포성 면역 반응의 발생을 일컫는다. "체액성 면역 반응"은 항체에 의해 매개되는 것이다. "세포성 면역 반응"은 T-림프구 또는 다른 백혈구 세포 또는 둘 다에 의해 매개되는 것이며, 사이토카인, 케모카인 및 활성화된 T-세포, 백혈구 세포 또는 둘 다에 의해 생성되는 유사한 분자의 생성을 포함한다. 당해 분야에 공지되어 있는 표준 면역 분석법 및 중화 분석법을 이용하여 면역 반응을 결정할 수 있다.
"면역원성"은 확인된 질환을 발병시키는 세균 또는 바이러스에 특이적으로 대향하여 유도되는 면역 반응을 이끌어내는 단백질 또는 폴리펩타이드의 능력을 지칭한다.
항원의 "면역학적 방어량" 또는 "면역 반응을 유발시키는데 효과적인 양"은 건강에 불리한 효과 또는 이들의 합병증을 비롯한 질환의 징후 또는 증상을 예방하거나 경감시키는데 적절한, 수용체에서 면역원성 반응을 유도하는데 효과적인 양이다. 체액성 면역 또는 세포-매개성 면역 또는 둘 다를 유도할 수 있다. 백신 조성물에 대한 동물의 면역원성 반응은 예를 들어 항체 역가의 측정, 림프구 증식 분석법을 통해 간접적으로, 또는 야생형 균주를 시험 적용한 후 징후 및 증상의 모니터링을 통해 직접적으로 평가될 수 있다. 백신에 의해 부여되는 방어 면역은 예컨대 치사율, 유병율, 온도 수치 및 전반적인 신체 상태 같은 임상적 징후의 감소, 및 개체의 전체적인 건강 및 행동을 측정함으로써 평가될 수 있다. 면역 반응은 세포성 면역 및/또는 체액성 면역의 유도를 포함할 수 있지만 이들로 한정되지는 않는다. 치료 효과적인 백신의 양은 사용되는 특정 바이러스, 또는 예방 접종되는 동물의 상태에 따라 달라질 수 있으며, 수의사에 의해 결정될 수 있다.
"비강내" 투여는 코를 통해 또는 코에 의해 개체의 체내로 백신 같은 성분을 도입함을 말하며, 주로 비강 점막을 통한 성분의 수송을 포함한다.
본원에서 사용되는 "단리된"은 단독으로 또는 이종 숙주 세포, 또는 염색체 또는 벡터(예컨대, 플라스미드, 파지 등) 내에 포함되어 그의 천연 발생 환경으로부터 제거됨을 의미한다. "단리된 세균", "단리된 혐기성 세균", "단리된 세균 균주", "단리된 바이러스", "단리된 바이러스 균주" 등은 세균 또는 바이러스를 천연 발생 환경으로부터 분리할 때와 같이, 세균 또는 바이러스가 예컨대 배양액 중에 다른 미생물을 실질적으로 함유하지 않는 조성물을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 같은 임의의 특수하게 정의된 성분을 기재하는데 사용되는 경우 "단리된"은 폴리펩타이드 또는 핵산 같은 성분이 통상적으로 발견되는 원래의 세포 환경으로부터 분리된 성분을 일컫는다. 그러므로, 예로서 본원에서 사용될 때, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드로 제작된 재조합 세포주는 "단리된" 핵산을 사용한다. 다르게는, 특정 단백질 또는 특이적인 면역원성 분절이 백신으로서 청구 또는 사용되는 경우, 이는 동정 및 분리되고 천연에서 존재할 수 있는 방식에 비해 다소 정제되었기 때문에 단리된 것으로 생각된다. 단백질 또는 그의 특이적인 면역원성 분절이 항원을 생성시키는 재조합 세균 또는 진핵생물 발현 벡터에서 생성되는 경우, 이는 단리된 단백질 또는 핵산으로서 존재하는 것으로 간주된다. 예컨대, 폴리뉴클레오타이드로 제작된 재조합 세포주는 "단리된" 핵산을 사용한다.
"대사될 수 있는 보조제"는 식물유를 기제로 하는 보조제 같이, 표적 종에 의해 대사될 수 있는 성분으로 이루어진 보조제이다. 대사될 수 있는 보조제는 대사될 수 있는 오일일 수 있다. 대사될 수 있는 오일은 전형적으로 식물 및 동물에서 발생되고 통상 주로 트라이아실글라이세롤(트라이글라이세라이드 또는 중성 지방으로도 알려져 있음)의 혼합물로 이루어지는 지방 및 오일이다. 이들 비극성 비수용성 성분은 글라이세롤의 지방산 트라이에스터이다. 트라이아실글라이세롤은 이들의 세 지방산 잔기의 종류 및 위치에 따라 상이하다. "대사될 수 없는 보조제"와 비교된다.
"대사될 수 없는 보조제"는 유화액이 투여되는 동물 개체의 신체에 의해 대사될 수 없는 성분으로 이루어진 보조제를 말한다. 본 발명의 유화액에 사용하기 적합한 대사될 수 없는 오일은 알케인, 알켄, 알카인 및 이들의 상응하는 산 및 알콜, 이들의 에터 및 에스터, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 오일의 개별 화합물은 경질 탄화수소 화합물, 즉 6 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 이러한 성분이다. 오일은 합성에 의해 제조될 수 있거나 또는 석유 제품으로부터 정제될 수 있다. 본 발명의 유화액에 사용하기 바람직한 대사될 수 없는 오일은 예를 들어 광유, 파라핀유 및 사이클로파라핀을 포함한다. 용어 "광유"는 증류 기법을 통해 석유로부터 수득되는 액체 탄화수소의 혼합물인 대사될 수 없는 보조제 오일을 말한다. 이 용어는 "액화 파라핀", "액체 바셀린" 및 "백색 광유"와 동의어이다. 이 용어는 또한 "경질 광유", 즉 석유의 증류에 의해 유사하게 수득되지만 백색 광유보다 약간 더 낮은 비중을 갖는 오일도 포함하고자 한다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 제18판 (펜실베이니아주 이스턴; Mack Publishing Company, 1990, 페이지 788 및 1323)] 참조. 다양한 상업적인 공급처, 예컨대 제이.티. 베이커(J.T. Baker)(펜실베이니아주 필립스버그), 유에스비 코포레이션(USB Corporation)(오하이오주 클리블런드)으로부터 광유를 수득할 수 있다. 바람직한 광유는 드라케올(DRAKEOL; 등록상표)이란 명칭으로 시판중인 경질 광유이다.
"단클론성 항체"는 모두 특정 항원상의 하나의 항원 결정기로만 향하는, 단일 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 항체를 말한다. 단클론성 항체를 생성시키는데 사용되는 항원은 병원체의 단리된 단백질 또는 전체 병원체로서 제공될 수 있다. "하이브리도마"는 골수종 세포 및 특이적인 항체-생성 세포의 융합에 의해 생성된 잡종 세포로 이루어지는 줄기 세포주이다. 일반적으로, 단클론성 항체는 마우스로부터 유래되나; 단클론성 항체는 또한 파지 디스플레이 기술, 또는 파지 디스플레이 기술 또는 마우스가 아닌 종으로부터의 잡종 세포에 상응하는 방법에 의해 생성된 항원의 특정 항원 결정기에 대항하여 생성되는 항체의 클론성 개체군을 지칭한다.
어떤 사건에 후속하는 "N일" 또는 "M일"은 각각 그 사건 후 N번째 날 또는 M번째 날의 임의의 시점을 말한다. 예를 들어, 제 1 백신을 투여한지 14일 후에 제 2 백신으로 개체를 예방 접종한다는 것은 제 1 백신 투여 후 14일째의 임의의 시점에 제 2 백신을 투여함을 의미한다.
"ORF"는 "개방 판독 프레임", 즉 유전자의 코딩 영역을 가리킨다.
"경구" 투여는 구강을 통해 또는 구강에 의해 개체의 체내로 백신 같은 성분을 도입함을 말하며, 삼키기 또는 구강 점막을 통한 수송(예컨대, 설하 또는 구강 흡수) 또는 둘 다를 포함한다. 기관내도 경구 투여이다.
"비구강" 투여는 예를 들어 비강에 한 방울 이상의 소적을 넣음으로써 이루어지는 것과 같이, 비강 및 구강을 통해 또는 이들에 의해 개체의 체내로 백신 같은 성분을 도입함을 말한다. 비구강 투여는 경구 및 비강내 투여에 수반되는 수송 과정을 포함한다.
"비경구 투여"는 소화관을 포함하지 않는 경로를 통해 또는 그러한 경로에 의해 개체의 체내로 백신 같은 성분을 도입함을 나타낸다. 비경구 투여는 피하 투여, 근육내 투여, 경피 투여, 피내 투여, 복강내 투여, 안내 투여 및 정맥내 투여를 포함한다. 본원에서, 비경구 투여는 주로 구강, 비강, 기관 및 폐에서의 점막 조직을 통한 성분의 수송을 포함하는 투여 경로를 배제한다.
"약학적으로 허용가능한"은 건전한 의학적 판단의 영역 내에서 부당한 독성, 자극, 알러지 반응 등이 없이 개체의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합당한 이점-대-위험 비에 상응하고, 의도되는 용도에 효과적인 성분을 일컫는다.
"약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분의 생물학적 활성의 효율을 방해하지 않고 그가 투여되는 개체에 독성이지 않은 담체 매질을 일컫는다.
"다클론성 항체"는 특정 병원체 또는 항원에 대해 만들어진 항체의 혼합된 개체군을 일컫는다. 일반적으로, 개체군은 다양한 항체 군을 함유하며, 각 군은 병원체 또는 항원의 특정 항원 결정기를 향한다. 다클론성 항체를 만들기 위하여, 접종 또는 감염에 의해 전체 병원체 또는 단리된 항원을 숙주 내로 도입하는데, 이는 숙주로 하여금 병원체 또는 항원에 대한 항체를 만들도록 유도한다.
"감염 예방"은 확인된 질환을 발병시키는 세균 또는 바이러스의 복제를 방지 또는 억제하거나, 또는 세균 또는 바이러스의 전염을 억제하거나, 또는 세균 또는 바이러스가 숙주 내에서 그 자신의 자리를 잡는 것을 방지하거나, 또는 감염에 의해 발병된 질환의 증상을 경감시킴을 의미한다. 처치는 세균 또는 바이러스 농도(load)가 감소되는 경우 치료인 것으로 생각된다.
백신과 관련하여 본원에 사용되는 "보호", "보호하는" 등은 백신이 백신에 사용된 항원(들)이 유래되는 생물체에 의해 발병되는 질환의 증상을 방지 또는 감소시킴을 의미한다. 용어 "보호", "보호하는" 등은 또한 백신이 개체에 이미 존재하는 질환 또는 질환의 하나 이상의 증상을 "치료"하는데 사용될 수 있음을 의미한다.
"호흡" 투여는 연무화된(원자화된) 성분의 흡입을 통해 또는 흡입에 의해 개체의 체내로 백신 같은 성분을 도입함을 일컫는다. 호흡 투여에서, 주요 수송 메카니즘은 기관, 기관지 및 폐에서의 점막을 통한 원자화된 성분의 흡수를 포함하며, 따라서 비강내 또는 경구 투여와는 상이하다.
본 발명의 항체를 기재하는데 사용되는 경우 "특이적인"은 본 발명의 항체의 가변 영역이 특이적인 H3N8 균주만을 인식하고 결합함(즉, H3N8 단백질과 폴리펩타이드 사이의 국지적인 서열 동일성, 상동성 또는 유사성의 존재에도 불구하고, 결합 친화력에서의 측정가능한 차이에 의해 특정 H3N8 단백질을 다른 공지 단백질과 구분할 수 있음)을 나타낸다. 특이적인 항체는 또한 항체의 가변 영역 외의, 특히 분자의 불변 영역 내의 서열과의 상호작용을 통해 다른 단백질(또는 ELISA 기법에서의 다른 항체)과 상호작용할 수 있다. 본 발명의 항체의 결합 특이성을 결정하는 선별 분석법은 널리 공지되어 있고, 당해 분야에서 통상적으로 수행된다. 이러한 분석법의 포괄적인 논의에 대해서는, 할로우(Harlow) 등(편집)의 문헌[Antibodies : A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; 뉴욕주 콜드 스프링 하버 (1988), 제6장]을 참조한다. 당해 분야에 널리 공지되어 있고 통상적으로 수행되는 임의의 방법을 이용하여 본 발명의 항체를 생성시킬 수 있다.
"아단위 백신"은 해당 병원체(예컨대, 바이러스, 세균, 기생체 또는 진균)로부터의 항원으로부터 유도되거나 상기 항원에 상동인 하나 이상의 항원을 포함하지만 모든 항원을 포함하는 것은 아닌 백신의 유형을 말한다. 이러한 조성물은 완전 병원체 세포 또는 병원체 입자, 또는 이러한 세포 또는 입자의 용해물을 실질적으로 함유하지 않는다. 그러므로, 병원체 또는 그의 유사체로부터의 적어도 부분적으로 정제되거나 또는 실질적으로 정제된 면역원성 폴리펩타이드로부터 아단위 백신을 제조할 수 있다. 아단위 백신중의 항원 또는 항원들을 수득하는 방법은 표준 정제 기법, 재조합 생성 또는 화학적 합성을 포함한다. 따라서, "아단위 백신"은 완전한 바이러스, 세균 또는 다른 면역원의 한정된 항원 성분 또는 성분들로 이루어진 백신을 말한다.
"특이적인 면역원성 분절"은 한 서열에 특이적인 항체에 의해 인식될 수 있는 서열의 일부를 의미한다.
"개체"는 개 같은 포유동물을 포함하는, 면역 시스템을 갖는 임의의 동물을 지칭한다.
"TCID50"은 "조직 배양액 감염 투여량"이고, 접종되는 세포 배양액의 소정 배치의 50%를 감염시키는데 필요한 바이러스의 희석도로서 정의된다. 본원 전체에서 이용되는 스피어맨-카버(Spearman-Karber) 방법을 비롯한 다양한 방법을 이용하여 TCID50을 계산할 수 있다. 스피어맨-카버 방법의 기재에 대해서는, 매히(B. W. Mahy) 및 캉그로(H. O. Kangro)의 문헌[Virology Methods Manual 25-46 (1996)]을 참조한다.
"치료제"는 바이러스 감염증 또는 그에 의해 발병되는 질환 또는 질병의 치료에 도움을 주는 임의의 분자, 화합물, 바이러스 또는 처치, 바람직하게는 감쇠되거나 죽은 바이러스를 일컫는다.
본원에서 "치료 효과량"은 바이러스(예컨대, H3N8), 세균, 기생균 또는 진균 같은 병원체로 감염됨으로써 발병되는 질환(건강에 대한 유해 효과 또는 그의 합병증을 포함함)의 징후 또는 증상을 방지 또는 경감시키는데 적절한, 항원 또는 백신을 수용하는 개체(예컨대, 개)에서 면역 반응을 유도하는 항원 또는 백신의 양을 지칭한다. 체액성 면역 또는 세포-매개성 면역 또는 체액성 및 세포-매개성 면역 둘 다를 유도할 수 있다. 백신에 대한 동물의 면역원성 반응은 예를 들어 항체 역가의 측정, 림프구 증식 분석법을 통해 간접적으로, 또는 야생형 균주를 시험 적용한 후 징후 및 증상을 모니터링함으로써 직접적으로 평가할 수 있다. 백신에 의해 부여되는 방어 면역은 예컨대 치사율, 유병율, 온도 수치 및 전반적인 신체 상태 같은 임상적 징후의 감소, 및 개체의 전체적인 건강 및 행동을 측정함으로써 평가할 수 있다. 치료 효과적인 백신의 양은 사용되는 특정 바이러스 또는 개체의 상태에 따라 달라질 수 있으며, 당해 분야의 숙련자에 의해 결정될 수 있다.
"전염되는"이란, 제 1 동물(개)로부터 제 2 동물(개)(전염되는 바이러스에 대해 혈청 전환을 나타냄)로 옮겨질 수 있는 바이러스를 의미한다.
"치료하는"은 이러한 용어가 적용되는 장애, 질병 또는 질환을 역전시키거나, 경감시키거나, 진행을 억제하거나, 방지하거나, 또는 이러한 장애, 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상을 방지함을 가리킨다.
"치료"는 바로 위에 정의된 "치료하는" 행위를 일컫는다.
"백신"은 변형되어 살아 있거나, 감쇠되거나, 죽은 바이러스, 또는 아단위 백신 또는 상기의 임의의 조합으로부터 선택되는 면역원성 조성물을 지칭한다. 개체에 백신을 투여하면 면역 반응이 야기된다. 비경구, 경구 등을 비롯한 임의의 공지 투여 경로에 의해 백신을 직접 개체 내로 도입할 수 있다.
제1부. 항원 및 바이러스 균주, 이들의 생성, 제조, 백신으로의 배합 및 백신의 투여
본 발명의 한 양태는 하기 항원을 사용하여 면역원성 반응을 불러일으키는 백신을 제공한다.
본 발명의 유용한 항원(들). 본 발명의 항원은 아유형 H3 헤마글루티닌 및 아유형 N8 뉴라미니다제, 또는 H3N8 바이러스로 통상적으로 지칭되는 H3N8 아유형을 갖는 인플루엔자 바이러스를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는, 임의의 조류 또는 포유동물로부터의 임의의 확인된 인플루엔자 바이러스 균주일 수 있다. 인플루엔자는 돼지과 동물, 말과 동물 또는 개과 동물을 비롯한(이들로 한정되지는 않음) 임의의 포유동물 또는 조류로부터 유래될 수 있다. 말과 동물 및 개과 동물의 인플루엔자 항원이 바람직하다. 균주는 H3 또는 N8로 지칭되는 아유형 당단백을 갖고, 더욱 바람직하게는 균주는 H3 및 N8을 둘 다 갖는다.
문헌[Transmission of Equine Influenza to Dogs (피. 씨. 크로포드 등, Science 310, 482-485 (2005)]에 기재되어 있는 바와 같이, 균주, 변이형, 돌연변이체 및 그의 변이형도 바람직하다. 바이러스성 HA는 인플루엔자 바이러스의 숙주 종 특이성의 결정적인 결정인자이다.
본 발명의 인플루엔자 항원은 개, 말, 돼지 및 가금류(집에서 기르거나 야생이거나 둘 다)로부터 단리될 수 있다. 샘플 수집을 위해 선택되는 동물은 가볍거나 심각한 호흡기 증상 및 열을 포함할 수 있는 급성 및/또는 아급성 임상적 증상을 나타내어야 한다. 동물은 또한 식욕 감퇴 및 혼수 상태의 징후를 나타낼 수 있다. 임상 시편으로부터의 비강 또는 인두 점액 샘플을 포유동물 또는 조류 세포 배양액, 배아 발생된 계란에 접종하거나, 비강 통로 또는 목을 닦아냄으로써 수집하거나, 또는 비장, 폐, 편도선 및 간 같은 조직 및 폐 세척액을 수집함을 비롯한 바이러스 단리 방법은 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 세포 배양액에서 바이러스의 세포 변성 효과를 관찰할 수 있으며, 요막액 또는 세포 용해물에 대하여 인간, 수탉, 칠면조 또는 기니아 피그 적혈구 세포를 접합시키는 이들의 능력(이는 인플루엔자 바이러스의 존재에 대한 추정 증거임)을 시험할 수 있다.
바이러스 균주 및 가능한 항원의 명명. 유형 A 인플루엔자 바이러스 균주는 비리온 표면 상의 이들의 당단백의 항원 특징에 기초하여 아유형으로 세분된다. 이들 바이러스 당단백은 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)이다. 전형적으로, HA 아유형을 먼저 호칭하고 NA 아유형을 두번째로 호칭하는 바, H3N8은 헤마글루티닌 아유형 3 및 뉴라미니다제 아유형 8을 갖는 바이러스를 나타낸다. 아유형은 HA 및 NA의 혈청학적 분석에 기초한다. 본원에 개시된 절차를 이용하여, 이들 임의의 아유형에 대한 백신을 제조할 수 있다. 현재, 16종의 확인된 HA 아유형 및 9종의 확인된 NA 아유형이 있다. 아직 기재되지 않은 더 많은 것들이 야생에는 존재할 수 있다. 구체적으로, 확인된 아유형은 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 및 H16, 및 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 및 N9를 포함한다. 이들 아유형의 모든 조합 및 임의의 아유형과 이들의 임의의 조합 및 상기 기재된 절차 또는 실질적으로 유사한 절차를 이용하여 미래에 확인될 미래의 아유형의 조합이 본 발명의 유용한 항원으로서 본원에 기재 및 청구된다. 아유형의 다른 HA 및 NA 조합도 모두 개시된다. 이는 바람직한 아유형 H3N8 및 H7N7을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.
인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)은 바이러스를 숙주 세포 상의 그의 수용체에 부착시키고 바이러스 외피를 세포내 세포낭의 막과 융합시켜 감염 과정을 개시하는 비리온 표면 당단백이다. 이는 또한 방어 항체의 자극 및 형성에 가장 중요한 비리온 성분이기도 하다. HA의 아미노산 서열, 따라서 그의 N-글라이코실화 부위의 위치는 바이러스 게놈에 의해 결정된다.
효과적인 교정 기능을 갖지 않아 높은 비율의 전사 실책을 야기하여 표면 당단백 HA 및 NA에서 아미노산 치환을 유발할 수 있는 RNA 의존성-RNA 폴리머라제에 의해 인플루엔자 바이러스의 분단된 네거티브 스트랜드(negative stranded) RNA 게놈을 복제한다. 이러한 높은 돌연변이 빈도의 결과중 하나는 바이러스 개체군이 HA 상의 N-연결된 글라이칸의 수 및 위치 면에서 대다수와 상이한 돌연변이체를 함유한다는 것이다. 이러한 올리고사카라이드의 구조는 HA 상의 이들의 위치에 의해, 또한 바이러스가 생육되는 숙주 세포에 의해 제공되는 생합성 트리밍(trimming) 효소의 어레이에 의해 결정될 수 있다. 그러므로, 바이러스 게놈의 유연성 및 숙주-특이적인 글라이코실화 구성은 함께 둘중 어느 한 과정에 의해 발생될 수 있는 것과는 구조 및 기능 면에서 더욱 이질적인 바이러스 개체군을 생성시킬 수 있다. 이러한 다양성은 다양한 생물학적 영역에서의 이들 바이러스의 생존 및 항체 및 항바이러스제를 중화시키는 억제 효과를 극복하는 이들의 능력을 담당하는 것으로 생각된다. 다양한 균주의 바이러스 게놈에서의 돌연변이를 확인하였으며, 이들 돌연변이된 균주도 본원에서 청구된다. 예를 들어, 이들 돌연변이체중 일부는 본원에 참고로 인용된 문헌[Transmission of Equine Influenza to Dogs (피. 씨. 크로포드 등, Science 310, 482-485 (2005)]에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 말과 동물의 인플루엔자 균주 A/Equine/2/Miami/1/63으로 수집 및 확인된 특이적이 균주로부터 제조된 백신도 개시한다. 이 균주는 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재의 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)에 ATCC VR 317로 기탁되어 있다. 이 균주는 1963년 마이애미에서 병 든 말의 비강 세척액으로부터 처음으로 단리되었다. 바이러스를 닭 배아에서 5회 계대배양하였다. 이 바이러스는 H3N8로 분류된다.
말로부터 유래된 노쓰 어메리카의 H3N8 인플루엔자 바이러스의 다른 예는 A/Equine/Kentucky/1998이다. 말로부터 유래된 H3N8의 추가적인 예는 A/Equine/Kentucky/15/2002, A/Equine/Ohio/1/2003, A/Equine/Kentucky/1/1994, A/Equine/Massachusetts/213/2003, A/Equine/Wisconsin/2003 및 A/Equine/New York/1999이다. 다른 예는 유럽의 H3N8 인플루엔자 바이러스에서 유래된 A/Equine/Newmarket/A2/1993이다.
본 발명은 또한 개과 동물의 인플루엔자 균주 A/canine/Iowa/13628/2005 및 균주 A/canine/Iowa/9A1/B5/08/D12로서 수집 및 확인된 특이적인 균주로부터 제조된 백신도 개시한다. 뒤쪽 균주인 균주 A/canine/Iowa/9A1/B5/08/D12는 2006년 6월 29일자로 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재의 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 UC25509로서 기탁되었으며, ATCC 기탁 번호는 PTA-7694이다. 이 바이러스는 H3N8로 분류된다.
상기 균주에 덧붙여, 본 발명자들은 하기 방식으로 수득된 균주를 개시한다. 호흡기 질환의 임상적 징후를 나타내는 개 또는 일군의 개를 확인하고, 구강 또는 비강 분비물의 샘플 또는 개의 호흡기 조직 또는 내장 기관 조직으로부터 유래되는 샘플을 수득하며, 샘플을 분석하고, H3N8 인플루엔자 바이러스의 존재를 확인한다. 본원에 기재된 절차를 이용하여, 이 바이러스 항원을 단리, 정제, 배양, 생육, 생성, 농축시키고, 화이자(Pfizer) 개 인플루엔자 바이러스로서 동정한다. 배아 발생된 계란 또는 개 세포 또는 둘 다에 적합화시키고 계대배양시킨 다음, 종균 개 인플루엔자 H3N8 바이러스로서 동정한다. 개과 동물에서 유래되는 H3N8 인플루엔자 바이러스가 바람직하다. 말과 동물 또는 돼지과 동물에서 유래되는 H3N8뿐만 아니라 아유형 H3 또는 N8의 인플루엔자 바이러스도 사용할 수 있다. 본 발명자들은 하기 방식으로 수득되는 균주를 개시한다. 개 또는 일군의 개를 말 인플루엔자 H3N8로 감염시킨다. 호흡기 질환의 임상적 또는 준임상적인 징후를 나타내는 개로부터 구강 또는 비강 분비물의 샘플, 또는 개의 호흡기 조직 또는 폐 세척액 또는 내장 기관 조직으로부터 유래되는 샘플을 수득하고, 샘플을 분석한 다음, H3N8 인플루엔자 바이러스의 존재를 확인한다. 본원에 기재된 절차를 이용하여, 이 바이러스 항원을 단리, 정제, 배양, 생육, 생성, 농축시키고, 개과 동물의 인플루엔자 바이러스로서 동정한다. 배아 발생된 계란 또는 개과 동물 세포 또는 둘 다에 적합화시키고 계대배양시킨 다음, 종균 개과 동물의 인플루엔자 H3N8 바이러스로서 동정한다. 개과 동물에서 유래되는 H3N8 인플루엔자 바이러스가 바람직하다. 말과 동물 또는 돼지과 동물에서 유래되는 H3N8뿐만 아니라 아유형 H3 또는 N8의 인플루엔자 바이러스도 사용할 수 있다. 본원에 상세히 기재되는 말과 동물 또는 개과 동물에서 유래되는 바이러스와 동일한 방식으로 돼지과 동물에서 유래되는 H3N8 바이러스를 처리한다.
제2부. 제1부의 항원으로부터 생성되는 백신의 생성, 제조, 배합 및 투여에 대한 상세한 설명
제2a부) 논의. 제1부의 바이러스 항원을, 그의 발병력을 감소시키도록 개질되고 유용한 배합물 또는 백신 배합물로 배합되는 바이러스 항원을 포함하는 물질의 유용한 조성물로 제조할 수 있다. 하기 기재내용은 개에서 인플루엔자 바이러스 감염에 수반되는 임상적 징후를 예방 또는 치료하거나, 또는 개과 동물 또는 말과 동물의 인플루엔자 바이러스에 의해 발병되는 개의 질환을 예방하는데 유용한 백신의 생성, 제조, 배합 및 투여에 대한 세부사항을 제공한다. 치료되어야 하는 개과 동물의 인플루엔자 감염증은 말과 동물의 인플루엔자 바이러스에 의해 발병될 수 있거나, 또는 이는 말과 동물의 인플루엔자 바이러스로부터 유래되는 새로운 변형 개과 동물의 인플루엔자일 수 있다. 본원에 기재되는 처치는 개과 동물 질환에서 개과 동물 또는 말과 동물의 인플루엔자 바이러스의 발산을 방지하는데 도움을 주도록 작용할 수 있다.
동물, 구체적으로는 개를 말과 동물 및 개과 동물의 인플루엔자 바이러스에 대항하여 백신으로 처치 및 면역화시키기 위한 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있다. 이 방법은 특히 개에서 H3N8 인플루엔자 바이러스에 대항하여 면역 반응을 유도할 수 있는 제 1, 제 2 및/또는 제 3 백신 치료 효과량을 개에게 투여함을 포함한다. 본 발명의 백신은 일반적으로 말과 동물 또는 개과 동물의 인플루엔자 바이러스의 발병성 균주에 의해 발병되는 질환에 대항하여 개를 면역화시키는 예방용 처치이고자 한다.
본원에서 본 발명자들은 능동 및/또는 수동 면역을 제공하는 백신을 개시한다. 전체 백신 또는 이들의 단백질의 특이적인 면역원성 분절은 말과 동물 또는 개과 동물의 인플루엔자 바이러스에 대해 치료용 처치로서 주어지는 경우 효과적일 것으로 예측된다. 그러므로, 본 발명에 의해 제공되는 면역은 능동 또는 수동 면역일 수 있으며, 백신의 의도되는 용도는 예방용 또는 치료용일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 백신은 개과 동물 또는 말과 동물의 인플루엔자 바이러스의 임의의 형태에 대해 개를 면역화시키기 위한 백신을 추가로 포함한다.
제2b부) 백신 생성 및 항원 농도. 이 부분에 기재되는 백신은 선택된 바이러스를 세포 내에서 생육시킴으로써 생성될 수 있다. 말 또는 개 포유동물 세포 배양액에서 바이러스를 생성시키는 것이 바람직하다. 계란에서의 바이러스(항원) 생육 또는 생성이 또한 바람직하다. 개과 동물의 신장 세포주가 바람직하다. 또한, 임의의 유용한 배지 및 고양이, 말, 소 또는 돼지 세포주로부터 유래되는 포유동물 또는 조류 세포주로부터 유래될 수 있는 복제가 허용되는 세포주에서 바이러스를 전파시킬 수 있다. 백신은 전형적으로 103 내지 109 TCID50(불활성화 전의 바이러스의 수준)을 함유한다. 다르게는, 헤마글루틴화 억제(HI) 시험, 단일 방사상 확산 또는 헤마글루틴화 분석법에 의해 바이러스 제제중 항원 함량을 분석할 수 있으며, 이 분석을 이용하여 1회 투여당 투여되는 양으로서 10 내지 10,000 HA 단위/ml, 더욱 전형적으로는 100 내지 2000 HA 단위/ml, 흔히는 100 내지 1000 HA 단위/ml의 역가를 갖는 백신이 선호된다.
바이러스 생육: 세포주 및 배아 발생된 계란. 인플루엔자 바이러스의 전파에 바람직한 세포주는 개과 동물 신장(DK)이다. 1차 및 불멸화된 말과 동물 신장(EK), 말과 동물 피부(ED), 돼지과 동물 고환(ST), 돼지과 동물 신장(PK), 소과 동물 신장(BK), 고양이과 동물 신장(FK), 베로(Vero) 및 1차 및 불멸화된 닭 배아 섬유아세포(CEF)를 포함하는 다른 세포주를 사용할 수 있다. 인플루엔자 바이러스를 생육시키는데 바람직한 세포 배양 시스템은 전통적인 착생성 단일층 배양액이다. 다르게는, 현탁액 및 미소담체 세포 배양 시스템도 사용할 수 있다. 바람직한 미소담체는 사이토덱스(Cytodex) 3 미소담체 비이드[애머샴 바이오사이언시즈 리미티드(Amersham Biosciences Ltd.)]이다. 미소담체의 다른 예는 유리, 실리콘 및 덱스트란, DEAE, 콜라겐, 덱스트란 또는 젤라틴으로 이루어진 비이드를 포함한다.
세포주의 배양 및 인플루엔자 바이러스의 전파에 바람직한 용기는 롤러 병(roller bottle)이며, 바람직한 롤러 병 표면적은 1760cm2이나, 490 내지 4250cm2일 수 있다. 다르게는, 다른 유용한 세포 배양 체제는 플라스크(150 내지 420cm2), 적층 모듈(21,000 내지 340,000cm2) 및 교반 탱크(1.0 내지 900L)를 포함한다. 바람직한 감염 중복도(MOI)는 0.001 내지 0.1이지만, 0.0001 내지 2.0에 이를 수 있다. 세포 배양액으로부터 바이러스를 수획하기에 바람직한 시간대는 감염 2 내지 5일 후이지만, 감염 후 1일째 내지 7일째일 수 있다.
배아 발생된 계란에 접종함에 의해서도 바이러스 전파를 달성할 수 있다. 전형적으로는, 바이러스 전파에 0 내지 12일령의 배아 발생된 계란을 사용한다. 바람직하게는 7 내지 8일령의 배아 발생된 계란을 바이러스 생육에 사용한다. 바이러스를 계란의 양막 강 내로 접종한다. 양막의 세포에서 바이러스가 복제되며, 다량이 양수 중으로 다시 방출된다. 접종한지 2 내지 3일 후, 양수중의 바이러스를 수획할 수 있다.
세포 배양 배지: 인플루엔자 바이러스를 전파시키기에 바람직한 세포 배양 배지 배합물은 하기를 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다: 덜베코(Dulbecco's) 개질 이글 배지(DMEM), 기본 개질 이글 배지, 옵티멤(Optimem) 및 라이보비츠(Leibovitz)-15(L-15) 배지. 전형적으로, 세포 배양 배지는 트립신 0.1 내지 10단위로 보충된다. 다르게는, 트립신의 식물 유래된 등가물(예컨대, 아큐타제) 2 내지 100단위를, 바이러스의 효율적인 전파를 위해 세포 배양액에 사용할 수도 있다. 동물-유래된 성분의 부재 또는 존재하에 세포 배양 배지를 사용할 수 있다. 동물-유래된 성분을 사용한 보충의 예는 최종 농도 0.5 내지 10%의 감마-조사된 혈청이다.
제2c부) 불활성화되거나 죽은, 아유형 및 감쇠되고 개질되어 -살아있는 백신 제조.
불활성화되거나 죽은 백신. 본 발명의 한 실시양태에서, 백신은 임의의 말 또는 개과 동물의 감염성 인플루엔자 균주로부터 선택되는 H3N8 말과 동물 또는 개과 동물의 균주를 포함하는 불활성화되거나 죽은 H3N8 인플루엔자 바이러스 백신을 포함한다. 문헌[Transmission of Equine Influenza to Dogs (피. 씨. 크로포드 등, Science 310, 482-485 (2005)] 참조. 백신은 또한 돼지로부터 유래되는 인플루엔자 H3N8 또는 아유형 H3 또는 N8의 임의의 인플루엔자로 이루어질 수도 있다. 당해 분야에 널리 공지되어 있는 방법에 의해 불활성화된 백신을 제조한다. 예를 들어, 바이러스가 높은 역가로 전파되면, 당해 분야의 숙련자는 당해 분야에 널리 공지되어 있는 방법에 의해 항원으로서 작용하는 양의 바이러스를 수득할 수 있음을 쉽게 알 것이다. 예를 들어, 희석, 농축 또는 추출에 의해 항원으로서 작용하는 양의 바이러스를 수득할 수 있다. 이들 방법 모두를 이용하여 백신을 생성시키기에 적절한 항원으로서 작용하는 양의 바이러스를 수득하였다. 포르말린(예컨대, 0.1 내지 10%), 베타프로프리올락톤(BPL)(예컨대, 0.01 내지 10%) 또는 2원 에틸렌이민(BEI)(예를 들어, 1 내지 10mM)(본원에서는 이것이 바람직함)으로 처리함으로써, 또는 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 다른 방법을 이용하여 바이러스를 불활성화시킬 수 있다. 통상적으로 사용되는 조건 및 약제가 제안되지만, 당해 분야의 숙련자는 다른 약제 및 농도도 알고 있음이 분명하다.
상기 상세히 기재된 죽은 바이러스 생성에 덧붙여, 다양한 감쇠 수단도 가능하며, 당해 분야에 널리 공지 및 기재되어 있고 본원에 적용될 수 있다. 개질된 살아있는 백신으로의 감쇠도 가능하다. 이들 기법중 몇몇은 본원에서 아래에 기재된다. 더욱 바람직한 감쇠 형태 중에는 세포 배양액에서의 연속적인 계대배양, 동물에서의 연속적인 계대배양, 유전자 개질을 발생시키는 다양한 방법 및 자외선 또는 화학적 돌연변이 발생이 있다.
아단위 백신. 또한, 이종 원핵세포 발현[예를 들어, 이. 콜라이(E. coli), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella) 등] 및 이종 진핵세포 발현{예를 들어, 효모[피키아(Pichia), 야로위아(Yarrowia)], 곤충 세포[바쿨로바이러스(Baculovirus)] 등} 및 바이러스 벡터(예를 들어, 개과 동물 아데노바이러스, 인간 아데노바이러스, 폭스바이러스, 개과 동물 헤르페스바이러스)를 포함하지만 이들로 국한되지는 않는 재조합 발현 기법에 의해 말과 동물 또는 개과 동물의 인플루엔자 아단위 백신을 생성시킬 수 있다.
감쇠되고 개질되어 -살아 있는 백신. 감쇠된 바이러스 개과 동물 백신은, 최적 온도 미만에서 더 이상 질환을 발병시킬 수 없지만 방어 면역 반응을 이끌어낼 수는 있는 상태까지 연속적으로 계대배양시킴을 포함하는 연속적인 계대배양에 의해 감쇠된 세포주 또는 계란에서 배양된 인플루엔자 바이러스, 바람직하게는 인플루엔자에서 유래되는 H3N8로부터 제조된다.
야생형 인플루엔자 바이러스 균주를 세포 배양액 중에서 연속적으로 계대배양시킴으로써 인플루엔자 바이러스를 감쇠시킬 수 있다. 바이러스 균주의 면역원성 특징은 완전히 보유하면서 질병을 발병시키는 능력은 상실할 때까지, 바이러스 균주를 다양한 세포 시스템에서 계대배양할 수 있다. 숙주 내로 접종된 후, 바이러스는 어느 한도까지 증식될 수 있다. 또한 연속적으로 계대배양하여 과-감쇠된 균주를 수득함에 의해서도 적합한 감쇠된 바이러스 균주를 수득할 수 있다. "과-감쇠"는 감쇠를 위한 계대배양의 횟수가 병원성을 제거하는데 통상적으로 필요한 것보다 상당히 더 많음을 의미한다. 감쇠된 바이러스는 이들 다수의 계대배양 후 면역원성 능력이 손상되지 않도록 그의 항원성을 보유한다(예컨대, 그의 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 항원을 둘 다 보유한다). 이러한 균주는 실제로 투여될 때 아무런 증상 또는 부작용을 생성시키지 않고, 따라서 안전하고 효능 있는 백신이다.
인플루엔자 바이러스 균주의 저온-적합화를 통해 인플루엔자 바이러스의 감쇠를 달성할 수 있다. 야생형 인플루엔자 바이러스를 계대배양시킨 후, 낮아진 온도에서 생육되는 바이러스를 선택함을 포함하는 방법에 의해, 저온-적합화된 인플루엔자 바이러스 균주를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 배아 발생된 계란에서 점진적으로 더 낮아지는 온도에서 야생형 인플루엔자 바이러스를 연속적으로 계대배양함으로써, 낮아진 온도에서 안정적으로 복제되는 바이러스 혼합물의 특정 일원을 선택함에 의해, 저온-적합화된 인플루엔자 바이러스를 생성시킬 수 있다. 저온-적합화된 인플루엔자 바이러스 균주는 온도 감수성 표현형을 나타낼 수 있다. 온도 감수성 저온-적합화된 인플루엔자 바이러스는 낮아진 온도에서는 복제되지만, 야생형 바이러스가 복제되고 플라크를 형성하는 더 높은 특정 생육 온도의 조직 배양액 세포에서는 더 이상 복제되거나 플라크를 형성하지 않는다. 온도 감수성 바이러스가 생육되는 온도를 본원에서는 이 온도 감수성 바이러스에 대한 "복제가 허용되는" 온도라고 하며, 온도 감수성 바이러스는 생육되지 않지만 상응하는 야생형 바이러스는 생육되는 더 높은 온도를 본원에서는 이 온도 감수성 바이러스에 대해 "복제가 허용되지 않는" 온도라고 한다. 예를 들면, 특정한 온도 감수성 저온-적합화된 인플루엔자 바이러스는 약 30℃ 이하에서 배아 발생된 계란에서 복제되며, 약 34℃의 복제가 허용되는 온도에서 조직 배양액 세포에서 플라크를 형성하지만, 약 37℃의 복제가 허용되지 않는 온도에서 조직 배양액 세포에서 플라크를 형성하지 않는다. 특정한 저온-적합화된 인플루엔자 바이러스는 지배적인 간섭 표현형을 가질 수 있다. 즉, 이들은 다른 인플루엔자 바이러스와 함께 세포 내로 동시 감염될 때 감염을 지배함으로써, 이 다른 바이러스의 생육을 손상시킨다. 저온-적합화된 인플루엔자 바이러스는 또한 재조합 수단을 통해 생성될 수도 있다. 이 접근법에서는, 확인된 저온-적합화, 감쇠, 온도 감수성 또는 지배적인 간섭 표현형을 수반하는 하나 이상의 특이적인 돌연변이를 확인하고, 역행 유전자 접근법을 이용하여 야생형 인플루엔자 바이러스 균주 내로 다시 도입한다. 역행 유전자학은 인플루엔자 바이러스-감염된 세포로부터 단리된 RNA 폴리머라제 착체를 사용하여 돌연변이(들)를 함유하는 인공적인 인플루엔자 바이러스 게놈 구획을 전사하고, 헬퍼 바이러스를 이용하여 합성된 RNA 구획(들)을 바이러스 입자 내로 혼입시킨 다음, 목적하는 변화를 함유하는 바이러스를 선택함을 포함한다.
제2d부) 백신 보조제, 배합물 , 형태 및 담체 . 본원에서 제공되는 백신의 성분은 바람직하게는 하나 이상의 보조제를 포함한다. 보조제는 특히 알룸(0.5 내지 20%, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 더욱 바람직하게는 2 내지 5%), 인산알루미늄(0.5 내지 20%, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 더욱 바람직하게는 2 내지 5%), 수산화알루미늄(알하이드로겔 또는 리하이드라겔, 0.5 내지 20%, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 더욱 바람직하게는 2 내지 5%)을 비롯한 리비(RIBI) 보조제 시스템[리비 인코포레이티드(Ribi Inc.)] 알루미늄 염, 콜레스테롤, 수중유적형 유화액, 예컨대 프로인트(Freund's) 완전 및 불완전 보조제 같은 유중수적형 유화액, 블록 공중합체(CytRx, 조지아주 애틀랜타), SAF-M[치론(Chiron), 캘리포니아주 에머리빌], 암피겐(AMPHIGEN; 등록상표) 보조제, 10 내지 100㎍의 바람직한 사포닌 농도 및 바람직하거나 다른 사포닌 분획 약 50㎍을 갖는 퀼(Quil) A, QS-21[케임브리지 바이오텍 인코포레이티드(Cambridge Biotech Inc.), 매사추세츠주 케임브리지], GPI-0100[갈레니카 파마슈티칼즈, 인코포레이티드(Galenica Pharmaceuticals, Inc.), 앨라배마주 버밍엄] 같은 사포닌 및 사포닌들, 모노포스포릴 지질 A, 아브리딘 지질-아민 보조제, 이. 콜라이(재조합 또는 다른)로부터의 열-불안정성 장 독소, 콜레라 독소, 또는 뮤라밀 다이펩타이드를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 면역원성 조성물은 예컨대 인터류킨, 인터페론 또는 다른 사이토카인 같은 하나 이상의 다른 면역 조절제를 추가로 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 또한 젠타마이신 및 머티올레이트도 포함할 수 있다.
백신의 성분은 담체, 용매 및 희석제를 비롯한 약학적으로 허용가능한 부형제, 등장화제, 완충제, 안정화제, 보존제, 면역 조절제(예를 들어, 인터류킨, 인터페론 및 다른 사이토카인), 혈관-수축제, 항균제, 항진균제 등을 포함할 수 있다. 전형적인 담체, 용매 및 희석제는 물, 염수, 덱스트로즈, 에탄올, 글라이세롤 등을 포함한다. 대표적인 등장화제는 염화나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 솔비톨, 락토즈 등을 포함한다. 유용한 안정화제는 젤라틴, 알부민 등을 포함한다.
H3N8 인플루엔자 바이러스 백신은 투여 경로, 저장 조건 등에 따라 다양한 형태로 제공된다. 예를 들면, 백신을 주사기, 적하기, 분무기 등에 사용하기 적합한 수용액 또는 수성 분산액으로서 제조할 수 있거나, 또는 사용 전에 염수, HEPES 완충액, 또는 제 2 개 백신의 수성 면역원성 분획 등에서 용액으로 재구성되는 동결건조된 분말로서 제조할 수 있다.
본 발명의 실시양태중 어느 하나의 백신을 이용되는 투여 방식에 따라 약학적으로 허용되는 담체 중에 배합한다. 당해 분야의 숙련자는 살아있거나 죽은 말과 동물 또는 개과 동물의 인플루엔자 또는 이들의 면역원성 분절; 말과 동물 또는 개과 동물의 인플루엔자, 이들의 특이적인 면역원성 분절을 코딩하는 재조합 바이러스 또는 세균 벡터; 또는 말과 동물 또는 개과 동물의 인플루엔자 또는 이들의 특이적인 면역원성 분절을 코딩하는 DNA 분자를 포함하는 백신을 용이하게 배합할 수 있다.
근육내 주사가 바람직한 경우, 등장성 배합물이 바람직하다. 일반적으로, 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 솔비톨 및 락토즈를 포함할 수 있다. 특정한 경우, 포스페이트 완충된 염수 같은 등장성 용액이 바람직하다. 배합물은 젤라틴 및 알부민 같은 안정화제를 추가로 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 혈관-수축제를 배합물에 첨가한다. 본 발명에 따른 약학 제제는 멸균성이고 발열원을 함유하지 않은 상태로 제공된다. 그러나, 당해 분야의 숙련자는 본 발명의 백신을 포함하는 약학적으로 허용가능한 담체에 바람직한 배합물이 임의의 개과 동물의 백신, 폴리펩타이드(항원) 아단위 백신, 재조합 바이러스 벡터 백신 및 DNA 백신에 대하여 미국 농무부, 또는 캐나다 또는 멕시코 또는 유럽의 어느 한 나라 같은 외국에서의 상응하는 정부 부처에서 공표된 규제에서 승인된 약학 담체임을 잘 알 것이다. 그러므로, 본 발명의 백신의 상업적인 생산을 위한 약학적으로 허용되는 담체는 미국 또는 외국의 적절한 정부 부처에서 이미 승인되었거나 앞으로 승인될 담체이다. 백신은 약학적으로 허용될 수 있는 보조제와 추가로 혼합될 수 있다. 본 발명의 백신의 특정 배합물에서는, 백신을 다른 개과 동물의 백신과 조합하여, 다른 개과 동물의 병원체에 의해 발병되는 매우 다양한 질환에 대항하여 개과 동물을 보호할 수 있는 여러 종류의 균이 혼합된(polyvalent) 백신 제품을 생성시킨다.
백신 조성물은 임의적으로 약학 비히클, 부형제 또는 매질로서의 역할을 하는 백신-상용성의 약학적으로 허용가능한(즉, 멸균 및 비-독성) 액체, 반고체 또는 고체 희석제를 포함할 수 있다. 희석제는 물, 염수, 덱스트로즈, 에탄올, 글라이세롤 등을 포함할 수 있다. 등장화제는 특히 염화나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 솔비톨 및 락토즈를 포함할 수 있다. 안정화제는 특히 알부민을 포함한다. 대사될 수 있는 보조제, 대사될 수 없는 보조제, 프로인트 완전 보조제 및 프로인트 불완전 보조제 같은 오일을 기제로 하는 보조제, 마이콜레이트를 기제로 하는 보조제(예를 들어, 트레할로즈 다이마이콜레이트), 세균 리포폴리사카라이드(LPS), 펩티도글라이칸[즉, 뮤레인, 뮤코펩타이드, 또는 N-오파카, 뮤라밀 다이펩타이드(MDP) 또는 MDP 유사체 같은 당단백], 프로테오글라이칸[예를 들어, 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae)로부터 추출됨], 스트렙토코커스 제제(예컨대, OK432), 바이오스팀(Biostim™)(예를 들어, 01K2), EP 109 942 호, EP 180 564 호 및 EP 231 039 호의 "이스콤즈(Iscoms)", 수산화알루미늄, 사포닌, DEAE-덱스트란, 중성 오일(예컨대, 미글라이올), 식물유(예컨대, 땅콩유), 리포좀 및 플루로닉(Pluronic; 등록상표) 폴리올을 비롯한, 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 보조제를 백신 조성물에 사용할 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 투여 경로에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사가능한 용도에 적합한 멸균 수용액 또는 수성 분산액의 형태로, 또는 동결-건조 기법을 이용하여 동결건조된 형태로 면역원성 조성물을 제조할 수 있다. 동결건조된 면역원성 조성물은 전형적으로 약 4℃에서 유지되며, 보조제를 사용하여 또는 보조제 없이 안정화 용액, 예컨대 염수 및/또는 HEPES 중에서 용액으로 재구성될 수 있다.
또한, 본 발명의 면역원성 및 백신 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 "약학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 보조제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항균제, 항진균제, 등장화제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 담체(들)는 본 발명의 성분과 상용성이고 면역화되는 개체에 유해하지 않다는 점에서 "허용가능해야" 한다. 전형적으로, 담체는 멸균성이고 발열원을 함유하지 않는다.
제2e부) 백신 투여량 및 분석법. H3N8 인플루엔자 바이러스 백신의 투여 크기는 전형적으로 투여 경로에 따라 약 2.0 내지 0.1ml의 부피를 갖는다. 불활성화된 백신은 전형적으로 103 내지 109 TCID50(불활성화 전 바이러스의 수준)을 함유한다. 다르게는, 바이러스 제제중 항원 함량은 10 내지 10,000 HA 단위/ml의 역가를 갖는 백신을 선호하며, 이는 1회 투여당 투여되는 양으로서 100 내지 2000 HA 단위/ml, 더욱 바람직하게는 100 내지 1000 HA 단위/ml를 가질 수 있다. 개질된 살아있는 바이러스 또는 감쇠된 바이러스를 함유하는 백신의 경우, 치료 효과 투여량은 일반적으로 약 105 내지 약 108 TCID50이다. 인플루엔자 H3 또는 N8 단백질 같은 아단위 항원을 함유하는 백신의 경우, 치료 효과 투여량은 일반적으로 약 10 내지 약 100㎍이다. 본 발명에서 유용한 보조제 및 첨가제의 양 및 농도를 당해 분야의 숙련자가 용이하게 결정할 수 있기는 하지만, 본 발명은 백신 조성물 2ml 투여량당 약 50 내지 약 2000㎍, 바람직하게는 약 500㎍의 보조제를 포함하는 조성물을 고려한다.
분석법. 바이러스 단리 또는 바이러스 항원, 바이러스 RNA 또는 특이적인 항체 검출 방법에 의해 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있다. 바이러스 또는 바이러스 성분을 검출하는데 이용되는 방법은 폐 조직, 비강 상피 세포 또는 기관지 폐포 세척액 내용물의 면역 형광, 조직 샘플의 면역 조직 화학, 효소 결합된 면역 흡착 분석법(ELISA), 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 세포 배양액 및 면역 퍼옥시다제, 바이러스 유형 및 아유형을 결정하기 위한 형광 항체 염색, 및 신속한 효소-면역 분석 멤브레인 시험을 포함한다. 인플루엔자 바이러스에 대해 전형적으로 분석되는 조직은 폐, 폐 세척액, 편도선, 기관, 비장 및 혈청을 포함한다. 또한 특이적으로 다양한 바이러스 항원 결정기, 즉 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA) 항원 결정기를 표적으로 하는 단클론성 항체도 이용할 수 있다. 인플루엔자를 진단하기 위한 가장 통상적인 혈청학적 분석법은 헤마글루티닌 억제(HI) 분석법이다. 이의 이점중 하나는 상이한 아유형 및 아유형 내에서의 항원 변이형을 식별할 수 있다는 것이다. 말과 동물, 개과 동물, 돼지과 동물 또는 조류에서 유래되는 혈청을 사용하여 HI 분석법을 수행할 수 있다. 항체를 측정하는 보다 정밀한 방법은 단일 방사상 용혈(SRH) 기법이다. SRH는 HI 분석법보다 더욱 민감하고, 더 큰 정밀도를 갖는다. 대역 면적에서의 50% 증가는 항체의 상승을 나타내고, 현재의 감염의 증거이다.
제2f부) 투여 시간 및 경로. 6주령, 더욱 바람직하게는 8주령 개에 바람직하게 접종한다. 개는 바람직하게는 개의 상태 및 그의 환경에 따라 피하 주사(SC)를 통해 각각 전형적으로 3 내지 4주, 바람직하게는 3주 간격으로 투여되는 2회의 투여를 받아야 한다. 이는 최대한의 넓은 면역원성 반응을 수득하게 한다. 본 발명의 다른 실시양태에서는, 개를 3회 연속적으로 예방 접종하여 최대한의 넓은 면역 반응을 생성시킨다. 단일 투여로 1년마다 다시 예방 접종하는 것이 권장된다. 필요한 경우 3개월 및/또는 6개월에 개에게 임의적으로 효능 촉진제를 투여할 수 있다. 바람직한 경로는 약 1mL를 사용하는 피하 주사이지만, 약 1mL를 사용하는 근육내(IM), 또는 약 0.1 내지 0.3mL를 사용하는 피내(ID), 0.2 내지 0.5mL를 사용하는 경구, 비구강 또는 비강 경로도 바람직하다. 당해 분야의 숙련자는 이용되는 다른 투여 시간, 주사 부위, 양 및 투여 경로를 잘 알 것이다.
본 발명의 백신의 실시양태중 임의의 하나의 투여 경로는 피내, 근육내, 안내, 복강내, 정맥내, 경구, 비구강 및 피하뿐만 아니라 흡입, 좌약 또는 경피를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 바람직한 투여 경로는 피내, 근육내, 복강내, 비구강 및 피하 주사를 포함한다. 주사기, 분무기, 연무기, 바늘 없는 주사 장치, 또는 미소발사체 충격 유전자 건[바이오리스틱(Biolistic) 충격]을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 임의의 수단에 의해 백신을 투여할 수 있다.
제3부. 선택된 백신의 생성, 제조, 배합 및 투여에 대한 구체적인 설명.
여기에서 본 발명자들은 개과 동물의 인플루엔자를 치료하기 위한 죽거나 불활성화된 한 종류의 균에 대항할 수 있는(monovalent) 백신에 대한 보다 상세하고 구체적인 설명을 제공한다.
제3a부) 한 종류의 균에 대항할 수 있는 죽거나 불활성화된 바이러스 개과 동물의 인플루엔자 백신
H3N8 인플루엔자 바이러스의 불활성화되고 보조제가 첨가된 배양액을 포함하는, 개과 동물 또는 말과 동물의 인플루엔자로부터 유래되는 바람직한 인플루엔자 유래된 H3N8 항원을 비롯하여 상기 제1부에 기재되어 있는 임의의 항원을 사용함.
두 종류의 균에 대항할 수 있는 죽거나 불활성화된 개과 동물의 인플루엔자 백신
상기 제1부에 기재되어 있는 임의의 항원, 바람직하게는 개과 동물 및 말과 동물의 인플루엔자로부터 유래되는 인플루엔자 유래된 H3N8 항원, H3N8 인플루엔자 바이러스의 불활성화되고 보조제가 첨가된 배양액을 사용함. 개과 동물의 항원은 하나의 개과 동물의 인플루엔자 바이러스로부터 유래되는 한편, 말과 동물의 항원은 하나의 말과 동물의 인플루엔자 바이러스로부터 유래된다. 개과 동물의 항원은 또한 2종의 개과 동물의 인플루엔자 바이러스 또는 2종의 말과 동물의 인플루엔자 바이러스로 이루어질 수 있다.
세 종류의 균에 대항할 수 있는 죽거나 활성화된 바이러스 백신
상기 제1부에 기재되어 있는 임의의 항원, 더욱 바람직하게는 개과 동물 또는 말과 동물의 인플루엔자로부터 유래되는 인플루엔자에서 유래된 H3N8 항원, H3N8 인플루엔자 바이러스의 불활성화되고 보조제가 첨가된 배양액을 사용함. 세 종류의 균에 대항할 수 있는 하기 백신이 기재된다: a) 개과 동물의 항원이 1종의 개과 동물의 인플루엔자 바이러스로부터 유래되고 말과 동물의 항원이 2종의 말과 동물의 인플루엔자 바이러스로부터 유래됨; b) 개과 동물의 항원이 2종의 개과 동물의 인플루엔자 바이러스로부터 유도되고 말과 동물의 항원이 1종의 말과 동물의 인플루엔자 바이러스로부터 유래됨; c) 개과 동물의 항원이 3종의 개과 동물의 인플루엔자 바이러스로부터 유래되고/되거나 말과 동물의 항원이 3종의 말과 동물의 인플루엔자 바이러스로부터 유래됨. 세 종류의 균에 대항할 수 있는 백신을 제조하기 위하여 상기의 임의의 조합이 기재된다.
제3b부) 죽거나 불활성화된 백신 생성 및 항원 농도.
선택된 백신을 세포에서 생육시킴으로써, 이 부분에 기재된 백신을 생성시킬 수 있다. 말과 동물 또는 개과 동물의 포유동물 세포 배양액에서의 바이러스의 생성이 바람직하고, 계란에서의 바이러스(항원) 생육 또는 생성도 바람직하다. 개 신장 세포주가 더욱 바람직하다. 고양이과 동물, 말과 동물, 소과 동물, 조류 또는 돼지과 동물의 세포주로부터 유도될 수 있는 복제가 허용되는 세포주를 비롯한 임의의 유용한 배지에서도 바이러스 전파를 달성할 수 있다. 백신은 105 내지 108 TCID50(불활성화 전의 바이러스의 수준)을 함유해야 한다. 다르게는, 헤마글루틴화 억제(HI) 시험 또는 헤마글루틴화 분석법에 의해 바이러스 제제를 분석할 수 있다. 이 분석법을 이용하여, 투여되는 양으로서 10 내지 10,000 HA 단위/mL, 더욱 전형적으로는 100 내지 2000 HA 단위/mL, 흔히 100 내지 1000 HA 단위/mL의 역가를 갖는 백신을 선호한다.
죽거나 불활성화된 바이러스 생육: 세포주 및 배아 발생된 계란
인플루엔자 바이러스를 생육시키는데 바람직한 세포 배양 시스템은 전통적인 착생성 단일층 배양액이다. 다르게는, 현탁액 및 미소담체 세포 배양 시스템도 사용할 수 있다. 바람직한 미소담체는 사이토덱스 3 미소담체 비이드(애머샴 바이오사이언시즈 리미티드)이다. 세포주 배양 및 인플루엔자 바이러스 전파에 바람직한 용기는 롤러 병 체제이고, 바람직한 롤러 병 표면적은 1760cm2이지만 850 내지 4250cm2일 수 있다. 바람직한 감염 중복도(MOI)는 0.001 내지 0.1이지만, 0.0001 내지 2.0일 수 있다. 세포 배양액으로부터의 바이러스의 바람직한 수획은 감염 후 2일째 내지 5일째이지만, 감염 후 1일째 내지 7일째일 수 있다.
세포 배양 배지: 인플루엔자 바이러스 생육을 전파하는데 바람직한 세포 배양 배지 배합물은 하기를 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다: 덜베코 개질 이글 배지(DMEM), 기본 개질 이글 배지, 옵티멤 및 라이보비츠-15(L-15) 배지. 전형적으로, 세포 배양 배지는 트립신 0.1 내지 10단위로 보충된다.
제3c부) 죽거나 불활성화된 불활성화. 생성 후, 당해 분야에서 통상적으로 이용되는 임의의 방법으로 바이러스를 죽이거나 불활성화시킬 수 있다. 더욱 바람직한 방법은 아래 기재되는 BEI로 바이러스 체액을 불활성화시키는 것이다. 또한, 포르말린 또는 BPL로 바이러스 함유 유체를 불활성화시키는 것도 유용하다.
제3d부) 죽거나 불활성화된 백신 보조제, 배합물 , 형태 및 담체 . 제1부의 항원, 특히 불활성화되거나 죽은 바이러스를 다양한 방식으로 배합하여 유용한 백신을 생성시킬 수 있다. 바람직한 배합물은 죽은 백신을 보조제와 조합하는 것이다. 본 발명의 백신과 함께 다수의 보조제를 사용할 수 있으며, 몇몇 바람직한 것이 기재된다. 보조제의 양은 전형적으로 1mL 투여량중 약 25 내지 약 1000㎍을 차지한다. 개과 동물의 인플루엔자 백신에 특히 유용한 보조제는 하기를 포함하며, 이들은 또한 조합되어(바람직한 조합은 아래 기재됨) 사용될 수 있다: 알룸(0.5 내지 20%, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 더욱 바람직하게는 2 내지 5%), 인산알루미늄(0.5 내지 20%, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 더욱 바람직하게는 2 내지 5%), 수산화알루미늄(0.5 내지 20%, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 더욱 바람직하게는 2 내지 5%인 알하이드로겔 또는 리하이드로겔)을 비롯한 알루미늄 염, 암피겐(등록상표) 보조제, 사포닌(바람직한 것은 1 내지 100㎍의 퀼 A 또는 QS-21 또는 QA-21, 케임브리지 바이오테크 인코포레이티드, 매사추세츠주 케임브리지), GPI-0100(갈레니카 파마슈티칼즈, 인코포레이티드, 앨라배마주 버밍엄), 콜레스테롤, 또는 다른 합성 중합체, DEAE 덱스트란, 스쿠알렌 등(바람직한 사포닌 농도는 10 내지 100㎍이고, 약 50㎍이 바람직하다).
바람직한 보조제 및 조합은 2, 3, 4 또는 5% 알룸, 알룸과 퀼A의 임의의 조합이고, 임의의 공지의 시판중인 백신 보조제 및 배합물을 사용한다. 특히 바람직한 것은 2 내지 5% 알룸 단독, 퀼 A 단독 및 퀼 A와 콜레스테롤("QAC"로 알려짐)이다. QAC를 단독으로 또는 추가적인 퀼 A 및 콜레스테롤과 조합하여 사용할 수 있다. 다른 공지의 보조제도 사용할 수 있다. 백신의 다른 성분을 조정하여 백신의 물리적 및 화학적 특성을 개질시킬 수 있다. 예를 들어, 보조제는 전형적으로 1mL 투여량중 약 25 내지 약 1000㎍을 차지한다. 유사하게, 본원에 기재된 백신을 항생제(이는 1mL 투여량중 약 1 내지 약 60㎍을 차지할 수 있음)와 조합할 수 있다. 다른 성분도 가능하다.
제3e부) 죽거나 불활성화된 백신 투여량 및 분석법. H3N8 인플루엔자 바이러스 백신의 투여 크기는 전형적으로 투여 경로에 따라 약 2.0 내지 0.1ml이다. 개질된 살아있는 바이러스 또는 감쇠된 바이러스를 함유하는 백신의 경우, 치료 효과 투여량은 일반적으로 약 105 내지 약 108 TCID50이다. 인플루엔자 H3 또는 N8 단백질 같은 아단위 항원을 함유하는 백신의 경우, 치료 효과 투여량은 일반적으로 약 10 내지 약 100㎍이다. 불활성화된 인플루엔자 바이러스를 함유하는 백신의 경우, 백신은 103 내지 109 TCID50(불활성화 전의 바이러스의 수준)을 함유해야 한다. 백신은 바람직하게는 1회 투여당 투여되는 양으로서 100 내지 1000 HA 단위/ml를 갖는다. 가장 바람직한 것은 1회 투여당 약 640 HA이다.
제3f부) 죽거나 불활성화된 백신, 투여 시간 및 경로. 예방 접종 시간에 대해서는 제2f부를 참조한다. 바람직한 경로는 약 1mL를 사용하는 피하 주사(SC)이지만, 약 1mL의 근육내(IM) 또는 1.0 내지 0.2mL를 사용하는 피내 및 0.2 내지 0.5mL를 사용하는 비구강 및 비강도 바람직하다.
제4부. 백신의 조합
본 발명의 항원 및 백신을 다른 제품 또는 백신과 조합할 수 있다. 예를 들어, 이들을 화이자의 고양이 밴가드(Vanguard; 등록상표) 라인(다수의 제품을 포함함) 및/또는 밴가드 플러스(Vanguard Plus) CCV/L4(등록상표)를 비롯한 다수의 제품을 포함하는 화이자의 고양이 밴가드 플러스(등록상표) 및 다른 조합과 액체 또는 건조된 분획으로 조합하여 주요 강아지 질환에 대해 완벽한 보호력을 제공할 수 있다. 말과 동물 또는 개과 동물의 인플루엔자 바이러스 항원을 하기 개과 동물의 항원과 임의의 다양한 조합으로 조합할 수 있다: 개과 동물의 파라인플루엔자(CPIV), 개과 동물의 디스템퍼 바이러스(CDV), 개과 동물의 파보바이러스(CPV), 개과 동물의 아데노바이러스-1(CAV-1), 개과 동물의 아데노바이러스-2(CAV-2), 렙토스피라 카니콜라(Leptospira canicola), 렙토스피라 그립포티포사(Leptospira grippotyphosa), 렙토스피라 익테로하에모라지아에(Leptospira icterohaemorrhagiae), 렙토스피라 포모나(Leptospira pomona), 렙토스피라 브라티슬라바(Leptospira bratislava), 개과 동물의 호흡기 코로나바이러스(CRCV), 장의 개과 동물의 코로나바이러스(CCV), 소과 동물의 코로나바이러스(BCV) 및 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica) 항원.
또한, 본 발명의 말과 동물 또는 개과 동물의 인플루엔자 바이러스 항원 및 백신을 보르데텔라 브론키셉티카[p68 또는 브론키신(Bronchicine; 등록상표) 또는 캔백(Canvac) CCi(등록상표)] 및/또는 개과 동물의 파라인플루엔자(CPIV) 및/또는 개과 동물의 호흡기 코로나바이러스(CRCV) 및/또는 소과 동물의 코로나바이러스(BCV) 백신과 조합하여, 개집 감기의 통상적인 병원체에 대항하여 보호하기 위하여 예비-제공(pre-boarding) 백신을 제공할 수 있다. 조합 백신의 최초 투여량은 3주일 간격으로 2회의 1mL 투여이며, 후속 제공 전에 1mL 효능 촉진제를 제공할 수 있다.
제5부. 백신의 구체적인 예
하기 백신을 구체적으로 제공한다.
실시예 1 내지 3 포유동물 세포 생육
a) 2 또는 5% 알룸 또는 b) QAC중 세포 유래되는 화이자 말과 동물 H3N8(A/Equine/2/Miami/1/1963)
실시예 4 내지 6 포유동물 세포 생육
a) 2 또는 5% 알룸 또는 b) QAC중 세포 유래되는 화이자 임상 단리물 개 H3N8 A/Canine/Iowa/9A1/B5/D8/D12.
실시예 7 내지 9 조류 알 생육
a) 2 또는 5% 알룸 또는 b) QAC중 알 유래되는 화이자 말과 동물 H3N8
실시예 10 및 11 조류 알 생육
a) 2 또는 5% 알룸 또는 b) QAC중 알 유래되는 화이자 임상 단리물 개과 동물 H3N8
제6부. 백신 시험 절차의 구체적인 예
하기를 이용하여 본 발명의 백신을 평가 및 확인할 수 있다.
6주령 이상의 목적 출산된 연구용 개에게 본원에 기재된 백신을 투여한다. 1군당 5 내지 20마리의 개를 사용하여 개를 백신 군으로 분배한다. 피하 또는 근육내 경로를 통해 1mL 투여 2회 또는 0.5mL 투여 2회(3주간의 간격)로 백신을 투여한다. 대조용 개에게는 위약 백신을 투여한다. 제 1 및 제 2 예방 접종일에, 이어 제 2 예방 접종 후 1주일에 2회씩 및 시험 적용 후에 각 개로부터 혈청 샘플을 수집한다. 예방 접종된 개로부터의 혈청을 HI(헤마글루티닌 억제) 또는 SRH(단일 방사상 용혈)을 통해 백신 항원으로의 혈청 전환에 대해 시험한다. 제 2 예방 접종 후 14일째 또는 28일째에 비강내 또는 경구 경로(기관내를 포함할 수 있음)를 통해 에어로졸 또는 소적에 의해 개에게 H3N8 바이러스를 시험 적용한다. 시험 적용 후 호흡기 증상, 열, 식욕 감퇴, 혼수 상태 같은 임상적 징후를 모니터링함으로써 질환으로의 임상적 징후에 대해 개를 관찰한다. 시험 적용 후 10 내지 14일동안 매 2일마다 예방 접종된 개 및 예방 접종되지 않는 대조용을 닦아냄으로써 비강 분비물을 수집하여, 시험 적용 바이러스의 발산을 측정한다. 세포 조직 배양액(바람직하게는 개 신장)에 의해 발산 바이러스의 존재를 확인한다. 기관, 편도선, 폐를 비롯한 조직 샘플을 시험 적용 후 개의 아군으로부터 수집한다. 개 조직 샘플중 바이러스의 존재를 상기 기재된 바와 같이 또는 면역 조직 화학적 분석에 의해 확인한다. 시험 적용 바이러스 및 조직 샘플중 바이러스의 발산을 비교함으로써, 효과적인 백신으로 예방 접종된 개는 예방 접종되지 않은 대조용 개에 비해 더 낮은 바이러스 농도 또는 더 낮은 바이러스 양을 갖는다. 효과적인 백신은 예방 접종된 동물에서 더 낮은 바이러스 농도 또는 더 낮은 바이러스 양을 생성시키고, 예방 접종된 동물은 예방 접종되지 않은 대조용에 비해 인플루엔자 감염에 수반되는 임상적 징후의 감소를 나타낸다.
도 1은 말과 동물의 항원 백신으로 예방 접종된 개의 기하 평균 주사 부위 반응을 도시한다.
도 2는 말과 동물의 인플루엔자 바이러스 백신으로 예방 접종되고 개과 동물의 인플루엔자 바이러스를 시험 적용한(challenged) 동물에서의 평균 폐 경화 백분율을 도시한다.
구체적인 실시예
개에서 개과 동물의 인플루엔자 백신의 시험 적용 및 효능 연구 평가. 인플루엔자 바이러스에 대항하여 개과 동물에서 종간 보호를 제공하기 위한 말과 동물의 인플루엔자 백신, 죽은 바이러스의 평가.
말과 동물의 인플루엔자 바이러스 A/Equine/2/Miami/1/63 및 A/Equine/Ohio/1/2003 함유 백신의 혈청 보호를 평가하기 위하여, 7 내지 10주령의 개를 9개 처치군중 하나로 분배하였다(표 1). 0일째 및 21일째 연구일에 피하 경로를 통해 1.0mL 투여량으로 개에게 예방 접종하였다. 0일째 연구일(제 1 예방 접종), 21일째(제 2 예방 접종) 및 35일째(제 2 예방 접종 후 14일째)에 연구에 등록된 모든 개로부터 혈청을 수집하였다. 모든 혈청 샘플에 있어서 Miami63, Ohio03 및 CIV에 대한 HAI를 분석하였다. 혈청학적 반응 데이터가 표 2에 기재된다. 하기 IVP 군은 35일째 연구일에 예방 접종되지 않은 동물과 비교하여 혈청학적 역가에서의 통계학적으로 유의한 차이를 나타내었다: T02, T03, T04, T06, T07, T08 및 T09(표 2). 또한, 하기 IVP 군에서는 21일째 연구일에 통계학적으로 유의한 차이가 관찰되었다: T06, T07, T08 및 T09(표 2).
예비 안전성
혈청학적 반응을 측정함에 덧붙여, 이 연구에서는 예비 백신 안전성을 평가하였다. 종합적으로, 평가된 임의의 IVP에서 임상적으로 중요한 백신에 수반되는 반응은 관찰되지 않았다. 연구 과정 동안 백신에 수반되는 전신 반응은 관찰되지 않았다. 또한, 어느 처치군에서도 제 1 예방 접종 후 주사 부위 팽윤이 관찰되지 않았다. 21일째(제 2 예방 접종 전), 5개 처치군으로부터의 동물 34마리에서 주사 부위의 촉진시 작은 팽윤이 검출되었다. 이들 군 중에서, 4개의 군(T02, T03, T06 및 T07)에는 2% 알룸을 보충한 반면, 다섯번째 처치군(T09)에는 퀼-A/콜레스테롤/및 다른 보조제를 보충한다. 이 21일째 팽윤의 기하 평균 부피는 치료 전체에서 크기 면에서 0.07 내지 0.24cm3이었다.
제 2 예방 접종 후, 22 내지 24일째 연구일에, 동물 87마리중 58마리에서 주사 부위 팽윤이 관찰되었다. 이들 팽윤은 예방 접종한지 24시간 후에(22일째) 최고였으며, 24일째 연구일까지 완전히 없어질 때까지 크기가 감소하였다. 주사 부위 팽윤은 만질 때 아프거나 뜨겁지 않았지만, 5마리는 만지기 어려운 것으로 밝혀졌다.
시험 적용에 의한 인플루엔자 바이러스에 대항하여 개과 동물에서 종간 보호를 제공하기 위한, 말과 동물의 인플루엔자 백신, 죽은 바이러스의 평가
9개의 처치군중 하기 6개 군에 CIV를 시험 적용하였다: T01, T02, T03, T06, T07 및 T09. 0일째 연구일, 즉 시험 적용일에 50ml당 약 1:8의 HA로 제 2 예방 접종받은지 6주일 된 동물은 CIV 1mL당 약 6.9 로그를 나타내었다. 돼지과 동물의 인플루엔자 바이러스 호흡기 질환 모델과 유사한 모델에서 기관내 경로를 통해 개에게 시험 적용하였다. 모든 동물에게서 호흡기 질환에 수반되는 하기 임상적 징후가 매일 관찰되었다: 콧물, 눈물, 재채기, 구역질, 식욕 감퇴, 우울증 또는 기침. 또한, 매일 중이 온도 및 바이러스 단리를 위한 비강/인두 면봉을 수집하였다.
시험 적용된 동물중 약 50%가 호흡기 질환의 임상적 징후를 나타낼 때까지 매일 임상적 관찰을 보고 및 추적하였다. 시험 적용된지 5일 후, 59마리의 시험 적용된 동물중 31마리가 하기 임상적 징후중 하나 이상을 나타내었다: 콧물, 눈물 및/또는 기침. 따라서, 5일째 연구일에, 모든 동물을 안락사시키고 검시하였다. 폐 경화 등급을 기록하고, 바이러스 단리를 위한 샘플을 수집하였다.
폐 경화 등급의 %는 이 시험 적용으로 호흡기 질환이 성공적으로 실현되었음을 나타내었다. 모든 동물 전체에서 경화의 %는 9마리 동물에서 60%, 8마리 동물에서 10 내지 35%, 26마리 동물에서 10% 미만, 16마리 동물에서 경화 없음으로 나타났다(도 2). 처치군 전체에서 폐 경화를 갖는 동물의 수는 표 4에 기재된다. 처치군 및 음성 대조군 사이에서 수치 차이가 관찰되지만, 폐 경화, 폐 및 편도선 조직에서의 바이러스 단리의 통계학적으로 유의한 차이는 검출되지 않았다(표 5). 폐 세척액 샘플로부터, 음성 대조군과 T02, T07 및 T09 사이에서 바이러스 단리 결과의 통계학적으로 유의한 차이(P<=0.05)가 검출되었다(표 6).
개과 동물의 혈청 전환 연구의 처치군
군 IVP
T01 염수-음성 대조군
T02 Miami 63-320 HAI 투여-2% 알룸
T03 Miami 63-640 HAI 투여-2% 알룸
T04 Miami 63-320 HAI 투여-퀼-A/콜레스테롤
T05 Miami 63-640 HAI 투여-퀼-A/콜레스테롤
T06 오하이오 03-320 HAI 투여-2% 알룸
T07 오하이오 03-640 HAI 투여-2% 알룸
T08 오하이오 03-640 HAI 투여-퀼-A/콜레스테롤
T09 오하이오 03-640 HAI 투여-퀼-A/콜레스테롤/및 다른 보조제
말과 동물의 인플루엔자 항원 백신(36252)으로 예방 접종된 개에서의 혈청학적 역가 데이터 요약
CIV에 대한 HAI 역가
처치군 0일째 21일째 35일째
군 IVP N 실제 기하 평균 최소 최대 GM 최소 최대
T01 염수 10 <8 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
T02 Miami 63-낮은 투여량-2% 알룸 9 <8 4.0 4.0 4.0 9.3 * 4.0 16.0
T03 Miami 63-높은 투여량-2% 알룸 10 <8 4.0 4.0 4.0 12.1 * 4.0 128.0
T04 Miami 63-낮은 투여량-퀼-A/콜레스테롤 10 <8 4.0 4.0 4.0 9.2 * 4.0 16.0
T05 Miami 63-높은 투여량-퀼-A/콜레스테롤 8 <8 4.0 4.0 4.0 7.3 4.0 16.0
T06 오하이오 03-낮은 투여량-2% 알룸 10 <8 17.1 * 8.0 64.0 48.5 * 32.0 128.0
T07 오하이오 03-높은 투여량-2% 알룸 10 <8 11.3 * 4.0 32.0 55.7 * 32.0 128.0
T08 오하이오 03-높은 투여량-퀼-A/콜레스테롤 10 <8 7.5 * 4.0 16.0 18.4 * 8.0 32.0
T09 오하이오 03-높은 투여량-퀼-A/및 다른 보조제 10 <8 32.0 * 4.0 128.0 84.4 * 8.0 256.0
*=T01과 표시된 군 사이의 유의한 차이(P≤0.05)
처치군에 의한 각 연구일에서의 양성 주사 부위 반응의 빈도 분포
처치군 양성 주사 부위 반응
군 IVP D0 D2 D3 D21 D22 D23 D24
T01 염수 0 0 0 0 0 0 0
T02 Miami 63-낮은 투여량-2% 알룸 0 0 0 8/8 7/9 8/9 7/9
T03 Miami 63-높은 투여량-2% 알룸 0 0 0 8/10 10/10 6/9 8/9
T04 Miami 63-낮은 투여량-퀼-A/콜레스테롤 0 0 0 0 6/10 6/10 5/10
T05 Miami 63-높은 투여량-퀼-A/콜레스테롤 0 0 0 0 6/9 5/8 5/8
T06 오하이오 03-낮은 투여량-2% 알룸 0 0 0 6/10 10/10 7/8 9/9
T07 오하이오 03-높은 투여량-2% 알룸 0 0 0 7/10 9/10 10/10 9/10
T08 오하이오 03-높은 투여량-퀼-A/콜레스테롤 0 0 0 0 0 0 0
T09 오하이오 03-높은 투여량-퀼-A/콜레스테롤/및 다른 보조제 0 0 0 5/10 10/10 10/10 8/9
양성 폐 경화 등급을 갖는 처치군당 동물의 수
IVP T01 T02 T03 T06 T07 T09
양성의 수 8 5 9 7 5 9
음성의 수 2 4 1 3 5 1
처치군에 의한 폐 및 편도선 샘플로부터의 바이러스 단리
IVP 바이러스 단리 여부: 단리되지 않음/단리됨
폐 편도선
단리되지 않음 단리됨 단리되지 않음 단리됨
수 % 수 % 수 % 수 %
T01 7 70.0 3 30.0 9 90.0 1 10.0
T02 8 88.9 1 11.1 9 100.0 0 0
T03 10 100.0 0 0 10 100 0 0
T06 9 90.0 1 10.0 9 90.0 1 10.0
T07 10 100.0 0 0 10 100.0 0 0
T09 10 100.0 0 0 10 100.0 0 0
처치군에 의한 폐 세척액 샘플로부터의 바이러스 단리
바이러스 단리 여부: 단리됨/단리되지 않음
단리되지 않음 단리됨
IVP 수 백분율 수 백분율
T01 2 20.0 8 80.0
T02 7 77.8 2 22.2*
T03 5 50.0 5 50.0
T06 7 70.0 3 30.0*
T07 10 100.0 0 0*
T09 10 100.0 0 0*
*는 T01과 처치군 사이의 통계학적으로 유의한 차이(p≤0.05)를 나타낸다.
구체적인 기재내용의 결론
본 상세한 설명 및 첨부된 청구의 범위에서, 단수 품목은 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한 한개의 대상 또는 복수개의 대상을 일컬을 수 있음에 유의해야 한다. 그러므로, 예를 들어 "화합물"을 함유하는 조성물의 인용은 단일 화합물 또는 둘 이상의 화합물을 포함할 수 있다.
상기 상세한 설명은 예시용이지 제한용이 아님을 알아야 한다. 당해 분야의 숙련자는 상기 상세한 설명을 읽고 다수의 실시양태를 쉽게 알 것이다. 그러므로, 본 발명의 영역은 첨부된 청구의 범위가 부여하는 등가물의 전체 범위와 함께 상기 청구의 범위를 참조하여 결정되어야 한다. 특허, 특허원 및 간행물을 비롯한, 모든 제품 및 인용에 대한 개시내용은, 그 전체가 모든 목적을 위해 본 발명에 인용된다.
본원에 개시 및 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이도 제조 및 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 실시양태에 의하여 기재되었으나, 당해 분야의 숙련자는 본 발명의 개념, 원리 및 영역으로부터 벗어나지 않으면서 본원에 기재된 조성물 및/또는 방법 및 방법의 단계 또는 일련의 단계에 변화를 용이하게 적용할 수 있을 것이다. 더욱 구체적으로, 동일하거나 유사한 결과를 달성하면서 본원에 기재된 약제를 화학적 및 생리학적으로 관련된 특정 약제로 대체할 수 있음도 명백하다. 당해 분야의 숙련자에게 명백한 이러한 유사한 치환 및 변경은 모두 첨부된 청구의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 원리, 영역 및 개념 내에 속하는 것으로 간주된다.
아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC) PTA-7694 20060629

Claims (7)

  1. 개로부터 분리되고 아유형(subtype) H3N8이며 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 PTA-7694로서 기탁된 바이러스로 구성되는 죽은 인플루엔자 바이러스가 하나 이상 함유된 백신을 치료 효과량 개에게 투여하는 것을 포함하는, 아유형 H3 인플루엔자 바이러스에 의한 질환에 대해 개를 면역화시키는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 백신이 보조제를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 보조제가 a) 대사될 수 있는 보조제, b) 대사될 수 없는 보조제, c) 2% 알룸(Alum), d) 5% 알룸, e) 퀼(Quil) A 및 f) 콜레스테롤 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 보조제가 2% 알룸인 방법.
  5. 개로부터 분리되고 아유형 H3N8이며 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 PTA-7694로서 기탁된 바이러스로 구성되는 죽은 인플루엔자 바이러스가 하나 이상 함유된 백신을 개에게 투여하는 것을 포함하는, 아유형 N8 인플루엔자 바이러스에 의한 개의 질환을 예방하거나 경감시키는 방법.
  6. 개로부터 분리되고 아유형 H3N8이며 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 PTA-7694로서 기탁된 바이러스로 구성되는 죽은 인플루엔자 바이러스가 하나 이상 함유된 백신을 개에게 투여하는 것을 포함하는, 아유형 H3N8 인플루엔자 바이러스에 의한 개의 질환을 예방하거나 경감시키는 방법.
  7. 감쇠되거나 죽은 인플루엔자 바이러스가 하나 이상 함유된 백신을 치료 효과량으로 개에게 투여하는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 대해 개를 면역화시키는 방법으로서, 상기 감쇠되거나 죽은 바이러스가
    a) 개과 동물의 인플루엔자 균주 A/canine/Iowa/13628/2005 및
    b) 개과 동물의 인플루엔자 균주 A/canine/Iowa/9A1/B5/08/D12로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
KR1020117022664A 2005-10-07 2006-09-25 개과 동물의 인플루엔자의 치료를 위한 백신 및 방법 KR20110126726A (ko)

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