KR20130018681A

KR20130018681A - 2차 병원체에 의해 야기되는 질환에 대해 보호하는 방법

Info

Publication number: KR20130018681A
Application number: KR1020127023384A
Authority: KR
Inventors: 날라칸누 피. 락쉬마난; 무라리드하르 에스. 데쉬판데; 후차파 고우다 자야파; 테리 리 와스묀
Original assignee: 인터벳 인터내셔널 비.브이.
Priority date: 2010-03-10
Filing date: 2011-03-08
Publication date: 2013-02-25
Also published as: CA2791396C; AU2011224507A1; JP2013522209A; BR112012022680A2; CA2791396A1; ES2687702T3; EP2544717A1; EP2544717B1; RU2586294C2; CN102791287A; ZA201206713B; BR112012022680B1; WO2011112593A1; RU2012143152A

Abstract

1차 병원체에 대한 항원을 포함하는 백신을 제공하는 단계 및 1차 병원체에 대한 백신의 면역원성 유효량을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 2차 병원체에 의해 야기되는 질환에 대해 동물을 보호하는 방법.

Description

2차 병원체에 의해 야기되는 질환에 대해 보호하는 방법{METHOD FOR PROTECTING AGAINST DISEASE CAUSED BY SECONDARY PATHOGENS}

관련 출원에 대한 교차 참고

본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2010년 3월 10일 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/312,380을 우선권으로 청구하고, 이의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.

발명의 분야

1차 병원체에 대한 백신의 투여가 2차 또는 기회감염 병원체에 의해 야기되는 질환에 대해 보호하는 것으로 발견되었다. 예를 들어, 병생(collateral) 병원체에 대해 면역화시킴으로써 갯과 동물이 2차 병원체, 예컨대 스트렙토코쿠스 에쿠이(Streptococcus equi) 아종 주에피데미쿠스(zooepidemicus) (에스. 에쿠이 (S. equi))에 의해 야기되는 질환으로부터 보호되었다.

발명의 배경

에스. 에쿠이가 견사(kennel)에 있는 개에 주로 영향을 미치는 다인성 감염으로 인지되는 갯과 감염성 호흡기 질환 (CIRD: canine infectious respiratory disease)과 연관되었다 (문헌 [Chalker et al., Veterinary Microbiology 95 (2003): 149-156]). 그러나, 견사에 있지 않은 건강한 무증상 개에서 에스. 에쿠이가 단리될 수 있었음이 발견되었다. 에스. 에쿠이는 다른 병원체와 조합되는 경우에만 CIRD의 중증도에 기여한다.

갯과 인플루엔자 (CIV: canine influenza virus)가 말과(equine) 인플루엔자 바이러스와 고도로 상동성인 H3N8 바이러스로서 확인되었다. 갯과 인플루엔자는 특정 유형의 개에서 병독성인 것으로 확인되었다. 예를 들어, 이는 플로리다주 잭슨빌의 견사에서 여러 경주용 그레이하운드를 사망시킨 돌발(outbreak)의 원인인 것으로 확인되었다. 노출된 개의 100％가 감염되었지만, 80％만 감염의 임상 징후를 나타낸 것으로 발견되었다. 또한, CIV에 노출된 일부 개에서는 폐렴의 임상 징후와 함께 급성 질환이 발생하였지만, 대부분의 개는 더 경도의 증후군 예컨대 10일 내지 21일 동안 지속되는 기침을 경험한다.

본 발명가들은 에스. 에쿠이 및 CIV 양쪽의 중증도가 서로와의 공동-감염에 의해 강화된다는 것을 발견하였다.

발명의 개요

2차 병원체에 의해 야기되는 질환에 대해 갯과 동물을 보호하는 방법이 1차 병원체에 대한 백신을 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 보호될 갯과 동물을 CIV 백신으로 면역화시킴으로써, 2차 병원체 예컨대 에스. 에쿠이에 의해 야기되는 질환에 대해 갯과 동물을 보호한다. 결과적으로, 갯과 동물이 CIV 및 에스. 에쿠이 양쪽 모두에 대해 보호된다.

도면의 간단한 설명
CIV 챌린지(challenge) 후의 임상 점수인 도 1은 CIV 챌린지 2일 전부터 챌린지 후 13일까지의 각각의 처리 군에 대한 평균 임상 점수를 도표화한다. 모든 개에 연구 제35일에 CIV를 챌린지하고, CIV 챌린지로부터 -2일부터 CIV 챌린지 13일 후까지 임상 징후에 대해 매일 모니터링하였다. 각각의 처리 군에 대한 평균 임상 점수를 챌린지 후의 일수에 대해 플롯팅하였다. 임상 점수에 대해 표 4를 참조한다.
챌린지 후의 코 CIV 유출(shedding)인 도 2는 챌린지 후 제1일 내지 제10일 각각에 코 면봉채취물을 수집함으로써 측정된 각각의 처리 군에 대한 평균 바이러스 역가를 도표화한다. 군 1, 3 및 4 내의 모든 개에 제35일에 CIV를 챌린지시켰다. 코 면봉채취물을 챌린지 전날 (제-1일)에 수집하여, 강아지에 CIV가 없었음을 입증하였다. 챌린지된 개에서 10일 (챌린지 후 제1일 내지 제10일) 동안 매일 코 면봉채취물을 수집하고 MDCK 단층 상에서 적정을 수행함으로써 코 바이러스 유출을 모니터링하였다. Log₁₀ TCID₅₀/㎖로 표현되는, 각각의 처리 군에 대한 평균 바이러스 역가를 계산하고, 챌린지 후의 일수에 대해 플롯팅하였다.
코 면봉채취물 및 폐 세척액으로부터의 에스. 에쿠이 단리인 도 3은 CIV 챌린지 전날부터 챌린지 후 제14일까지의 에스. 에쿠이에 대해 양성인 각각의 군 내의 개의 백분율을 도표화한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 손상 인자, 예컨대 또 다른 병원체와의 공동-감염의 부재 시에 임상 징후를 제시하지 않는 2차 병원체에 의해 야기되는 질환에 대해 갯과 동물을 보호하는 방법에 관한 것이다. 이러한 경우에, 심지어 어느 한쪽 병원체 혼자서는 임상 징후를 제시하지 않더라도, 둘이 함께는 강화된 발병기전 및 임상적으로 유의한 질환을 초래한다.

갯과 인플루엔자 바이러스 (CIV) 서브타입 H3N8은 특정 개에서 급성 호흡기 질환을 야기할 수 있다. 본 발명가들은 CIV 및 에스. 에쿠이로의 개의 공동-감염 후 발병기전을 연구함으로써 스트렙토코쿠스 에쿠이 아종 주에피데미쿠스 (에스. 에쿠이)가 CIV에 의해 야기되는 질환을 악화시켰음을 결정하였다. 유사하게, 본 발명가들은 에스. 에쿠이 단독으로 감염된 개는 임상 징후를 제시하지 않았지만, CIV 및 에스. 에쿠이 양쪽 모두가 챌린지된 경우에는, 활성 임상 질환이 관찰되었음을 발견하였다. 그 후, 본 발명가들은 CIV 백신으로의 면역화가 병독성 CIV 및 에스. 에쿠이로의 이중 챌린지에 대해 개를 보호하였음을 발견하였다. 예상 밖으로, 에스. 에쿠이에 의해 야기되는 호흡기 질환이 CIV에 대한 백신을 투여함으로써 방지될 수 있었다.

에스. 에쿠이가 단독으로 챌린지된 개는 어떠한 임상 징후, 박테리아 유출 또는 폐 병변도 나타내지 않았다. CIV가 단독으로 챌린지된 개에서는 약간의 임상 징후, 바이러스 유출 및 폐 병변이 발생하였다. CIV가 단독으로 또는 에스. 에쿠이가 단독으로 챌린지된 개와 비교했을 때 CIV + 에스. 에쿠이가 챌린지된 개에서 임상 점수, CIV 및/또는 에스. 에쿠이 유출, 및 폐 점수가 실질적으로 더 높았다. CIV가 단독으로 또는 CIV + 에스. 에쿠이가 챌린지된 예방접종되지 않은 개와 비교했을 때 CIV + 에스. 에쿠이가 챌린지된, CIV가 예방접종된 개에서 폐 점수, 임상 점수 및 박테리아 유출이 유의하게 더 낮았다.

본원에서 사용된 바와 같이, 1차 병원체라는 용어는 일부 동물에서 질환의 임상 징후를 야기할 수 있지만, 이러한 병원체에 노출된 모든 동물에서 검출될 수 있을 정도의 중증도일 필요는 없는 병원체를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 2차 병원체라는 용어는 동물이 또 다른 병원체에 대한 노출에 의해 쇠약해지거나 또는 다른 방식으로 쇠약해진 상태이지 않는 한 이러한 병원체에 노출된 동물에서 임상 징후를 야기할 것 같지 않은 병원체를 지칭하고, 이는 때때로 기회감염 병원체로도 지칭된다.

혼자서는 2차 병원체일 것이고 질환의 임상 징후를 야기할 것 같지 않은 병원체가 하나 이상의 다른 2차 병원체와 함께 제시되는 경우에 1차 병원체로서 기능할 수 있다.

설명의 목적을 위해, 그리고 비-제한적으로, 본원에 제시된 실시양태에서, CIV는 1차 병원체로 지칭될 수 있고, 에스. 에쿠이는 2차 병원체로 지칭될 수 있다.

켄넬 코프(kennel cough)는 다수의 바이러스 및 박테리아 병원체에 의해 야기되는 개에서의 중요한 질환이다. CIV 및 에스. 에쿠이는 갯과 호흡기 질환 사례로부터, 특히 견사 및 보호소 개에서 최근 몇년 동안 빈번하게 단리된 2개의 신규 병원체이다.

본 발명가들은 개에서의 CIV 및 에스. 에쿠이의 이중 감염의 발병기전을 연구하였고, 이중 감염에서의 CIV 백신의 효능을 평가하였다. CIV 단독으로 감염된 개와 달리, CIV + 에스. 에쿠이로 감염된 개들 대다수는 더 오래 지속된 임상적인 고열, 및 더 오래 지속된 더욱 중증인 임상 징후, 특히 기침을 나타냈다. 유출에 대해 양성인 개의 수 및 유출 기간과 관련하여, 이중으로 챌린지된 개에서의 코 에스. 에쿠이 유출이 매우 높았다. 또한, 이중 챌린지가 CIV 단독 또는 에스. 에쿠이 단독과 비교하여 실질적으로 더 높은 폐 점수를 유도하였다. 본 발명가들은 에스. 에쿠이가 단독으로 챌린지된 개가 임상적인 고열, 호흡기 질환의 임상 징후 또는 폐 병변을 나타내지 않았음을 발견하였다. 또한, 에스. 에쿠이가 단독으로 챌린지된 개의 코 분비물(secretion)에서 에스. 에쿠이가 검출가능하지 않았다. 본 발명가들은 에스. 에쿠이 단독은 어떠한 질환도 유도할 수 없다는 것과 에스. 에쿠이가 CIV의 존재 하에 박테리아 콜로니화에 이르는 기회감염 병원체라는 것을 발견하였다. 에스. 에쿠이는 CIV에 의해 야기되는 고열, 기타 임상 징후, 및 조합 폐 병리학을 악화시킨다. 본 발명가들은 CIV 백신을 투여하는 것이 CIV 단독뿐만 아니라 CIV + 에스. 에쿠이에 의해 또한 야기된 이러한 임상 징후들, 바이러스/박테리아 유출 및 폐 병변을 완화시켰음을 발견하였다. CIV에 대한 예방접종이 CIV 및 기회감염 병원체 예컨대 에스. 에쿠이에 의해 야기된 호흡기 질환을 방지하였다.

챌린지용 에스. 에쿠이는 하기의 예에서 사용된 단리물과 같이 감염된 동물로부터 수득할 수 있거나, 또는 ATCC 번호 6580으로부터 입수가능한 단리물과 같이 기탁소로부터 수득할 수 있다.

하기 실시예에서와 같이 챌린지용으로 및/또는 본 발명에 따른 투여를 위한 백신을 제조하기 위해 사용될 수 있는 갯과 인플루엔자 바이러스의 예로는 2006년 10월 18일 출원된 미국 특허 출원 번호 11/582,652 (미국 출원 공개 2007/0092537), 2006년 10월 6일 출원된 미국 특허 출원 번호 11/544,841 (미국 출원 공개 2007/0082012), 2006년 10월 19일 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2006/04161 및 2007년 12월 14일 출원된 미국 특허 출원 번호 11/956,658 (이들 모두는 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기술된 H3N8 바이러스 중 임의의 것이 포함된다.

본 발명의 CIV 백신에는 무독성(avirulent), 약독화 또는 사멸 바이러스가 있거나, 또는 백신이 항원성 서브유닛을 포함할 것이다. 무독성 및 약독화 바이러스는 재조합 바이러스, 뿐만 아니라 무독성 단리물, 계대배양 바이러스, 저온 적응 바이러스 및 기타 수단에 의해 덜 병독성이거나 비-병원성이게 된 바이러스를 포함하도록 의도된다. CIV 백신은 또한 시판 백신 예컨대 인터벳 인크(Intervet Inc.)/쉐링 플라우 애니멀 헬스(Schering-Plough Animal Health) (네브래스카주 엘혼)에서 입수가능한 CIV 백신인 노비백? 케이나인 플루 H3N8((NOBIVAC? Canine Flu H3N8)일 수 있다. 임의의 효과적인 CIV 백신을 본 발명에 따라 사용할 수 있다.

본 발명은 인플루엔자 바이러스, 예를 들어, 갯과 인플루엔자 바이러스 (CIV) 및 기타 질환, 예를 들어, 기타 갯과 감염성 질환에 대한 방어 면역을 이끌어내기 위한 조합 백신을 추가로 제공한다. 이러한 백신에는 무독성, 약독화 및/또는 사멸 바이러스 및/또는 박테리아가 있고/있거나 백신이 항원성 서브유닛을 포함할 것이다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 CIV 균주, 예를 들어, 불활성화된 CIV H3N8을 갯과 디스템퍼 바이러스, 갯과 아데노바이러스, 갯과 아데노바이러스 유형 2, 갯과 파르보바이러스, 갯과 파라인플루엔자 바이러스, 갯과 코로나바이러스, 갯과 헤르페스바이러스, 갯과 뉴모바이러스, 및/또는 렙토스피라(Leptospira) 혈청형, 예를 들어, 렙토스피라 키르쉬네리(Leptospira kirschneri) 혈청형 그리포티포사(grippotyphosa), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans) 혈청형 카니콜라(canicola), 렙토스피라 인테로간스 익테로헤모라기아에(icterohaemorrhagiae), 및/또는 렙토스피라 인테로간스 혈청형 포모나(pomona)에 대한 면역성을 이끌어 내기 위한 병원체/면역원이 예를 들어 포함되는 하나 이상의 기타 갯과 병원체 및/또는 면역원과 조합하여 포함하는 조합 백신을 제공한다. 본 발명의 조합 백신에 첨가될 수 있는 추가의 갯과 병원체/면역원에는 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica); 리슈마니아(Leishmania) 생물 예컨대 리슈마니아 메이저(Leishmania major) 및 리슈마니아 인판툼(Leishmania infantum); 비. 부르그도르페리(B. burgdorferi) 센수 스트릭토(sensu stricto) (ss), 비. 부르그도르페리 ss, 비. 가리니이(B. garinii), 및 비. 아프젤리이(B. afzelii)가 포함되는 보렐리아(Borrelia) 종 (spp.) 스피로체트(spirochete); 마이코플라즈마(Mycoplasma) 종 (예를 들어, 마이코플라즈마 시노스(Mycoplasma cynos)); 광견병 바이러스; 및 에를리키아 카니스(Ehrlichia canis)가 포함된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조합 백신은 CIV를 갯과 파라인플루엔자 바이러스 (CPI) 및/또는 갯과 아데노바이러스 유형 2 (CAV2) 및/또는 보르데텔라 브론키셉티카 (BB) 및/또는 갯과 파르보바이러스 (CPV), 및/또는 갯과 디스템퍼 바이러스 (CDV), 및/또는 갯과 코로나바이러스와 함께 임의의 이러한 조합으로 포함한다. 한 이러한 실시양태에서, 백신은 갯과 인플루엔자 바이러스, 보르데텔라 브론키셉티카 및 갯과 파라인플루엔자 바이러스를 포함한다. 또 다른 이러한 실시양태에서, 백신은 갯과 인플루엔자 바이러스, 갯과 디스템퍼 바이러스, 갯과 아데노바이러스 유형 2, 갯과 파르보바이러스, 및 갯과 파라인플루엔자 바이러스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조합 백신이 하나 이상의 바이러스 및/또는 박테리아 균주를 포함하는 경우, 이러한 균주들은 무독성, 약독화 및/또는 사멸 균주이다.

본 발명의 백신은 비경구 투여, 근육내 주사, 피하 주사, 복강내 주사, 피내 주사, 경구 투여, 비강내 투여, 난절법 및 이들의 조합이 포함되는 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 근육내 주사에 의해 백신이 투여된다.

본 발명의 백신은 애주번트를 함유할 수 있거나 또는 애주번트를 함유하지 않을 수 있다. 본 발명의 백신에서 사용하기 위한 애주번트의 예로는 오일 및 수 에멀션을 함유하는 것들, 및/또는 수산화알루미늄이 포함된다. 후자의 경우에, 시판원으로부터의 수산화알루미늄, 예를 들어, 알히드로겔(Alhydrogel) (수퍼포스 바이오섹터(Superfos Biosector), 덴마크 프레데릭순) 및 리히드로겔(Rehydrogel) (리하이스 인크(Reheis Inc.))을 사용할 수 있다. 오일 및 수 에멀션은 전형적으로 미네랄 오일 또는 대사성 오일 (예를 들어, 식물성 오일, 어유)을 포함한다. 비-이온성 세제 또는 계면활성제가 유화제로서 사용될 수 있다. 유화제의 예로는 트윈(Tween) 80/ 스팬(Span) 80, 아라셀(Arlacel) 80/ 트윈 80, 및 몬타니드(Montanide) (셉픽(Seppic), 프랑스 파리)가 포함된다. 애주번트 에멀션의 경우, 일반적으로, 부피의 5-25％는 오일이고, 부피의 75-95％는 수성이다. 일부 실시양태에서, 애주번트 에멀션은 부피 기준으로 20％ 오일 및 80％ 수성이다. 수산화알루미늄의 양은 일반적으로 수성 상의 약 5％ 내지 15％이다. 일부 실시양태에서, 에머네이드(Emunade)?가 애주번트이다.

일부 실시양태에 대해, ISCOM이 애주번트로 사용될 수 있다. ISCOM은 면역 자극 복합체(Immune Stimulating Complex)에 대한 두문자어이고, 이러한 기술이 문헌 [Morein et al. Nature 308:457-460 (1984)]에 기술되어 있다. 2가지 방식 중 하나로 ISCOM이 편리하게 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 항원이 구조물 내에 이의 제형 동안 물리적으로 혼입된다. 다른 실시양태에서는, ISCOM-매트릭스 (예를 들어, 이스코노바(Isconova)가 공급하는 바와 같음)가 항원을 함유하지 않지만, 면역화 전에 최종 사용자가 이를 선택된 항원과 혼합한다. 혼합 후, 항원이 ISCOM-매트릭스와 함께 용액 내에 존재하지만, 구조물 내로 물리적으로 혼입되지는 않는다.

하기의 실시예는 본 발명의 더욱 명확한 이해를 위해 제공된다. 이는 단지 설명적이고, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주 또는 기본적인 원리를 제한하지 않는 것으로 이해된다. 청구된 범주 내에서의 본 발명의 다양한 변형이 본원의 실시예 및 설명으로부터 본 발명의 속하는 업계의 당업자에게 명백할 것이다.

실시예

서론

총 32마리의 7주 내지 8주령 개를 이러한 연구에서 사용하였다. 21일 간격으로 투여된 2회 용량의 갯과 인플루엔자 H3N8 사멸 바이러스 백신을 개 10마리의 군에 예방접종하였다. 예방접종된 개에 병독성 CIV 및 에스. 에쿠이를 부스터(booster) 예방접종 2주 후에 챌린지하였다. 나머지 3개의 군의 개는 예방접종 없이 단일 및 이중 챌린지 후의 발병기전을 평가하는데 사용하였다. 개 6마리의 한 군에 CIV를 단독으로 챌린지하였고, 개 6마리의 또 다른 군에 에스. 에쿠이를 단독으로 챌린지하였다. 개 10마리의 군에 CIV 및 에스. 에쿠이 양쪽 모두를 챌린지하였다.

모든 개를 호흡기 질환의 임상 징후 및 바이러스 및/또는 박테리아 유출에 대해 모니터링하였다. 예방접종 전에 예방접종 군으로부터, 챌린지 투여 전에 모든 군으로부터, 그리고 부검 시점에 모든 군으로부터 혈청 샘플을 수집하여, CIV에 대한 항체 역가를 결정하였다. CIV 챌린지 14일 후 (연구 제49일)에 개를 안락사시키고, 폐 병변에 대해 폐를 평가하였다. 부검 시점에, 폐 세척액 샘플을 에스. 에쿠이 단리를 위해 수집하였다.

갯과 인플루엔자 H3N8 사멸 바이러스 백신의 시판 로트 (인터벳 인크, 네브래스카주 엘혼)를 군 4에서 7-8주령 개에 예방접종하는데 사용하였다.

군 4의 모든 개는 1차 예방접종 시 CIV에 대해 혈청반응 음성이었고, 군 1, 2 및 3의 모든 개는 CIV 챌린지 시점에 CIV에 대해 혈청반응 음성이었다.

개들을 성별 및 동복자(litter)에 의해 분류하고, 컴퓨터로 생성된 무작위 번호를 할당하였다. 개들을 증가되는 순서의 무작위 번호에 의해 분류하고, 처리 군에 할당하였다.

군 4의 개 10마리 모두에게 연구 제0일 및 제21일에 1 ㎖ CIV 백신 (시리얼# 219104)을 피하 주사에 의해 예방접종하였다.

임상 평가: 제33일 및 제34일 (CIV 챌린지 2일 전) 및 CIV 챌린지일 (연구 제35일)에 모든 개에 대해 임상 평가를 수행하였고 온도를 기록하였다. 임상 평가 지침을 따라 임상 관찰을 수행하였다.

샘플 수집: CIV 챌린지 투여 전날 (연구 제34일)에 모든 개로부터 약 5 ㎖의 혈액 샘플을 수집하였다. CIV 유출을 검출하기 위해 연구 제34일에 군 1, 3 및 4의 모든 개로부터 코 면봉채취물을 또한 수집하였다.

갯과 인플루엔자 바이러스: 제3 계대에 수확된 바이러스 단리물 CIV14-06A ("갯과 인플루엔자 바이러스, CIV14-06A (P3)으로 표지됨)을 챌린지 바이러스로 사용하였다. 최초의 이러한 바이러스는 갯과 호흡기 질환을 앓고 있는 개로부터 단리하였다. 챌린지일에, 동결된 바이러스액을 사용 직전에 해동시키고, 무균성 저온 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM: Dulbecco's Modified Eagles Medium)에서 7.5 Log₁₀TCID₅₀의 표적화된 챌린지 용량을 함유하는 2 ㎖/개의 최종 부피로 희석하였다.

스트렙토코쿠스 에쿠이 아종 주에피데미쿠스: 박테리아 단리물을 동물 보호소에 거주하고 갯과 복합 호흡기 질환으로 사망한 개로부터 수득하였다. 박테리아를 단리하고, 정제하고, 에스. 에쿠이 아종 주에피데미쿠스로서 특징화하였다. 박테리아를 뇌 심장 침출액 (BHI: Brain Heart Infusion) 브로스(broth) 상에서 성장시키고, 1×10⁹ cfu/㎖를 수득하도록 희석함으로써, 챌린지 물질을 제조하였다.

챌린지 투여

갯과 인플루엔자 바이러스: 군 1, 3 및 4의 개에 제35일에 CIV를 챌린지하였다. 챌린지를 투여하기 위해, 4마리의 개를 플렉시글라스(Plexiglas) 챔버 내에 놓고, 8 ㎖의 챌린지 바이러스 (2 ㎖/개)를 사용하여 약 25-30분의 기간에 걸쳐 에어로졸을 생성시켰다. 개들을 총 40분 동안 이러한 에어로졸에 노출시켰다.

에스. 에쿠이 아종 주에피데미쿠스: 군 2, 3 및 4의 개에 연구 제38일에 에스. 에쿠이를 챌린지하였다. 1×10⁹ cfu의 에스. 에쿠이/㎖를 함유하는 챌린지 물질 0.5 ㎖를 코 삽입관을 사용하여 모든 개의 각각의 콧구멍 내에 점적하였다.

챌린지 후 모니터링

임상 징후: 챌린지 후 13일 동안 매일 각각의 개에 대해 직장 온도를 기록하고 임상 평가를 수행하였다.

코 면봉채취물 수집

갯과 인플루엔자 바이러스: CIV 유출을 판단하기 위해 챌린지일로부터 10일 동안 매일 각각의 개로부터 코 면봉채취물을 수집하였다. 코 면봉채취물을 바이러스 수송 배지 내에 수집하였다.

에스. 에쿠이 단리: 챌린지 후에 3일 마다 한번씩 부검일까지 박테리아 수송 배지를 사용하여 박테리아 단리를 위해 코 면봉채취물을 수집하였다.

혈액 수집: CIV에 대한 항체 역가를 평가하기 위해 혈액 샘플 (약 5-10 ㎖)을 부검일에 수집하였다.

부검/처분

군 3의 개 1마리 (ID CAUELW)가 중증 호흡기 곤란으로 인해 연구 제43일 (즉, CIV 챌린지 8일 후 및 에스. 에쿠이 챌린지 5일 후)에 사망하였다. 이러한 개는 사망하기 전 2일 동안 고열, 우울증, 중증 기침, 및 호흡곤란을 나타냈다. 폐엽과 흉벽 사이의 섬유소 부착물, 경화 및 폐엽 상의 미세농양을 특징으로 하는 중증 폐렴이 부검에서 밝혀졌다.

군 1의 개 1마리 (ID CAUELZ)가 연구 제43일 및 제44일에 고열, 중증 기침, 우울증 및 호흡곤란을 나타냈다. 따라서, 연구 수의사가 이러한 개를 제44일 (CIV 챌린지 9일 후)에 안락사시키고, 부검을 수행하였다. 폐 병변이 폐렴을 시사하는 경화를 특징으로 하였다.

챌린지 후 부검 관찰 & 검체: 나머지 개 모두를 CIV 챌린지 후 제14일에 안락사시켰다. 부검 직전에 개를 안락사시켜서, 사후 변화가 시작되기 전에 폐를 신속하게 평가하도록 하였다. 신선한 폐 조직으로부터의 폐 세정액을 박테리아 단리를 위해 또한 수집하였다.

임상 평가 지침

단리실에 들어갈 때, 임상 평가를 수행하는 직원이 걸어다니면서 동물들의 태도를 판단한 후, 임상 관찰을 계속하였다. 다른 절차, 예컨대 챌린지 투여를 수행하기 전에 각각의 개에 대해 임상 관찰을 먼저 완료하였다. 하기의 지침을 각각의 임상 징후를 채점하는데 사용하였다.

코 배출물(discharge)

0 = 없음

0.5 = 묽은 배출물: 가느다란 맑은 유체가 콧구멍으로부터 뚝뚝 떨어졌다. 여기에 기록되기 위해서는 유체가 코에서 흘러 나와야 한다.

1 = 경도 내지 중등도의 점액농성 배출물: 점액과 혼합된 뿌연 유체가 적어도 코에서 입까지의 절반 아래로 흐른다.

2 = 중증 점액농성 배출물: 점액이 입을 지나 흐른다.

눈 배출물

0 = 없음: 눈 가장자리의 소량의 건조된 딱지 물질은 눈 배출물로 간주하지 않는다.

0.5 = 묽은 배출물: 투명한 유체가 적어도 입까지의 절반 아래로 눈으로부터 흘러내리면서 배출된다.

1 = 경도 내지 중등도의 점액농성 배출물: 점액과 혼합된 뿌연 유체가 적어도 눈에서 입까지의 절반 아래로 흐른다.

2 = 중증 점액농성 배출물: 유체 또는 점액이 코까지의 절반 아래로 흐르거나, 또는 눈의 테두리를 두르고, 눈의 안쪽 또는 바깥쪽 가장자리의 모발을 적신다.

기침

0 = 없음

0.5 = 경도: 오직 1회의 짧은 기침만 관찰된다.

1.0 = 중등도: 관찰 기간 동안 반복적으로 일어나면서, 기침이 지속된다.

2.0 = 중증: 목이 메이거나 구역질하는 소리가 기침에 동반된다.

재채기

0 = 없음

2 = 있음

호흡곤란

0 = 없음 (정상적인 호흡)

2 = 있음 (고통스러운 호흡)

우울증

0 = 없음 (정상적인 활동)

2 = 있음: 정상과 비교하여 개가 덜 활동적이거나 쾌활하다. 관찰이 수행되는 동안 무기력하거나 또는 누워있고 서있기를 꺼리면 강아지를 기록한다.

분석 방법

적혈구응집 억제 (HAI: Hemagglutination Inhibition) 검정법: 개 혈청 샘플 내의 CIV에 대한 항체를 적혈구응집 억제 (HAI) 검정법에 의해 측정하였다. 간략하게, 테스트 혈청의 연속적인 2배 희석을 PBS로 U자형 바닥의 96웰 미량역가 플레이트에서 수행하였다. 4 HA 유닛의 CIV25-06B를 함유하는 동일한 부피 (25 ㎕)의 바이러스 현탁액을 테스트 혈청을 함유하는 각각의 웰에 첨가하고, 항원-항체 반응이 일어나도록 플레이트를 20-25℃에서 60±5분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 50 ㎕의 0.5 ％ 수탉 RBC 현탁액을 첨가하였다. 플레이트를 20-25℃에서 45-60분 동안 인큐베이션하고, HAI 결과를 판독하였다. 적혈구응집 억제를 나타낸 혈청의 최고 희석의 역수로서 HAI 역가를 기록하였다. 모든 검정법을 이중으로 수행하였고, 종점 HAI 역가를 결정하였다.

세포 배양액 내의 CIV 적정: 챌린지 물질의 역가를 확인하고, 챌린지가 투여된 개에서의 바이러스 유출을 측정하기 위해, 챌린지 물질 및 코 면봉채취물에서의 바이러스 역가를 MDCK 세포에서의 적정에 의해 결정하였다. MDCK 세포를 96웰 조직 배양 플레이트에 2-3일 동안 시딩(seeding)하고, 연속적으로 10배 희석된 바이러스 현탁액 또는 코 면봉 채취물로부터 제조된 샘플을 이에 접종하였다. 플레이트를 36±2℃ 온도 및 4-6 ％ CO₂에서 인큐베이션하였다. 감염 7일 후, 플레이트를 세포병변 효과 (CPE: cytopathic effect)에 대해 관찰하였고, 감염력에 대한 50％ 종점을 스피어만-카버(Spearman-Karber) 방법을 사용하여 계산하였다. 바이러스 역가를 Log₁₀TCID₅₀/㎖로 표현하였다.

에스. 에쿠이 단리: 샘플 상청액을 혈액 한천 플레이트 상에 접종하고 (10 ㎕), 플레이트를 36±2℃에서 24-48시간 동안 인큐베이션하였다. 용혈을 나타내는 콜로니를 추가로 그람(Gram) 염색, 형태학, 콜로니 특징 및 표준 확인 테스트 (에컨대 산화효소(oxidase), 카탈라제(catalase) 및 응고효소(coagulase) 테스트)에 의해 에스. 에쿠이로 확인하였다.

데이터 분석

결과 변수: 폐 병변 점수가 1차 변수였다. 기타 변수에는 임상 징후, 바이러스 유출, 박테리아 유출 및 혈청학이 포함되었다.

통계 분석

폐 병변 점수: 부검 동안 채점된 각각의 폐엽의 경화 백분율을 폐 채점 시스템을 기초로 가중 점수로 변환시켰다. 각종 군에 대한 중앙값 폐 점수를 윌콕슨의 정확 순위 합계(Wilcoxon Exact Rank Sum) 테스트를 사용하여 비교하였다. 예방접종되지 않은 군에 비한 백신 효율의 완화 분획 추정치 및 추정치에 대한 95％ 신뢰 구간을 또한 보고한다.

임상 점수: 챌린지 후 13일 동안의 고열, 눈 배출물, 코 배출물, 재채기, 기침, 우울증 및 호흡곤란에 대한 임상점수를 합산하여, 각각의 개에 대한 합산 임상 점수를 수득하였다. 합산 점수를 윌콕슨의 정확 순위 합계 테스트를 사용하여 처리 군들 간에 비교하였다.

바이러스 유출: 바이러스 역가 (Log₁₀ TCID₅₀/㎖)를 각각의 개에 대해 챌린지 후 10일에 걸쳐 합산하였다. 평균 곡선하 면적 (AUC: area under curve) 및 바이러스 유출 일수를 윌콕슨의 정확 순위 합계 테스트를 사용하여 분석하였다.

박테리아 유출: 박테리아 유출 일수를 윌콕슨의 정확 순위 합계 테스트를 사용하여 분석하였고, 유출에 대해 양성인 일수를 처리 군들 간에 비교하였다.

혈청전환: 상이한 시점들에서의 기하 평균 항체 역가를 보고하였다.

통계 분석을 SAS 버전 9.1.3 (에스에이에스 인스티튜트(SAS Institute), 미국 노스캐롤라이나주 캐리)을 사용하여 수행하였다. p<0.05에 대해 통계적 유의성이 선언되었다.

테스트 타당성 및 허용성 기준

군 4의 개를 제외한 모든 개가 CIV 챌린지 시점에 CIV 항체에 대해 음성이었다.

군 2의 개를 제외한 모든 개가 CIV 챌린지 시점에 코 CIV 유출에 대해 음성이었다. 군 2의 개는 CIV 유출에 대해 테스트하지 않았다.

CIV가 챌린지된 모든 예방접종되지 않은 개 (군 1 및 3)가 CIV 챌린지 후 다양한 정도의 폐 병변을 나타냈다.

결과 및 토론

타당성: 군 4의 모든 개가 1차 예방접종 전에 CIV에 대해 혈청반응 음성이었고, 모든 예방접종되지 않은 개 (군 1, 2 및 3)는 CIV 챌린지 전에 여전히 혈청반응 음성이었다 (표 2). 모든 개는 또한 CIV 챌린지 시점에 CIV 및/또는 에스. 에쿠이 유출에 대해 음성이었다 (표 5 & 6).

혈청 전환: HAI 항체 역가를 표로 만들고, 처리 군들 간에 비교하였다 (표 2). 모든 예방접종된 개가 예방접종 후 CIV로 혈청전환되었다. HAI 항체 역가는 10 내지 160 범위였고, 이때 제34일에 GMT가 73이었다. 예방접종 군의 대다수 (80％)에서 40 이상의 HAI 역가가 발생하였다. 예방접종되지 않은 군의 모든 개는 CIV 챌린지 시점에 CIV에 대해 혈청반응 음성이었다 (HAI 역가 <10). 챌린지 후, 예방접종된 개에서의 항체 역가가 매우 높은 수준에 도달하였고 (GMT>6378), 이는 병독성 CIV에 대해 면역계를 프라이밍(priming)시키는 것에서의 백신의 효율을 실연한다. 이러한 개들 모두에서의 HAI 역가가 2560 이상이었다. 군 1 및 3의 CIV가 챌린지된 예방접종되지 않은 개들은 CIV 챌린지 후 혈청전환되었고, 이때 GMT는 각각 226 및 278이었다. 군 2의 모든 개는 부검 시에 여전히 CIV에 대해 혈청반응 음성이었고, 이는 이들이 CIV에 노출되지 않았고 생물보안(biosecurity) 절차가 효과적이었음을 확증한다.

챌린지 확증: 챌린지 투여 전 및 후에 동결되어 -50℃ 이하에서 보관된 챌린지 바이러스 샘플을 MDCK 세포 상에서 적정하였고, 용량이 개 당 7.73 Log₁₀TCID₅₀의 CIV14-06A인 것으로 확증되었다. 추가적으로, 챌린지 전과 챌린지 후의 보존 샘플 간에 실질적인 차이가 없었다.

혈액 한천 플레이트 상에서 적정된 에스. 에쿠이 보존 샘플에서 챌린지 물질 역가가 1×10⁹ pfu/㎖인 것으로 확증되었다. 챌린지 투여 과정 동안 박테리아가 여전히 생육성이었다.

직장 온도 및 임상 징후: 모든 처리 군에서의 직장 온도를 연구 제33일부터 제48일까지 매일 기록하였다 (표 3). 군 1 (CIV 단독)에서, 6마리의 개 중 2마리에서 임상적인 고열 (≥39.5℃)이 하루 동안만 발생하였다. 이러한 2마리 중 1마리에서는 중증 우울증이 또한 발생하였고, 이를 안락사시켰다. 군 2 (에스. 에쿠이 단독)에서, 6마리의 개 중 1마리에서 경도의 고열이 하루 동안만 발생하였다. CIV 및 에스. 에쿠이 양쪽 모두가 챌린지된 군 3에서는, 개들의 90％ (10마리 중 9마리)에서 고열이 발생하였고, 이들 중 대다수 (70％)가 2일 이상 동안 고열을 나타냈다. 예방접종된 개들의 50％ (10마리 중 5마리, 군 4)에서 이중 챌린지 후 고열이 또한 발생하였다. 그러나, 이러한 고열이 하루 동안만 지속되었다.

모든 개를 기타 임상 징후 예컨대 눈 배출물, 코 배출물, 재채기, 기침, 호흡곤란 및 우울증에 대해 연구 제33일부터 제48일까지 또한 매일 모니터링하였다. CIV 및 CIV + 에스. 에쿠이가 챌린지된 모든 개 (군 1, 3 및 4)가 챌린지 2일 후에 시작되는 다양한 임상 징후를 나타냈다 (표 4 및 도 1). 기침 및 호흡곤란이 우세한 임상 징후였다. 군 1 (6/6) 및 3 (10/10)의 모든 개가 각각 평균 2.7일 및 4.5일 동안 지속되는 다양한 정도의 기침을 나타냈다. 반면에, 군 4의 예방접종된 개의 60％ (6/10)만 평균 1.3일 동안 지속되는 경도의 기침을 나타냈다. 군 1의 개 1마리 (ID CAUELZ)를 우울증 및 호흡곤란으로 인해 CIV 챌린지 9일 후 안락사시켰다. 군 3의 개 1마리 (ID CAUELW)가 CIV 챌린지 8일 후 사망한 것으로 발견되었다. 에스. 에쿠이가 단독으로 챌린지된 6마리의 개는 어떠한 임상 징후도 나타내지 않았다.

이러한 결과들은 CIV가 개에서 사망에 이를 수 있는 중증 호흡기 질환을 야기할 수 있다는 것을 시사한다. 에스. 에쿠이는 2차 병원체로서 작용하고, CIV-유도 질환을 강화시킨다. 에스. 에쿠이 단독은 독자적으로 어떠한 임상 질환도 유도하지 않았다.

바이러스 유출: 코 바이러스 유출을 모든 CIV-챌린지 개 (군 1, 3 및 4)에서 챌린지 전날, 및 챌린지 후 제1일부터 제10일까지 모니터링하였다. Log₁₀TCID₅₀/㎖로 표현되는 각각의 군에 대한 평균 바이러스 역가를 챌린지 후의 일수에 대해 플롯팅하였다 (표 5 및 도 2). 군 1 및 4의 개의 50％ 및 군 3의 모든 개 (100％)에서 챌린지 후 제1일부터 이들의 코 분비물에서의 CIV 유출이 시작되었다. 챌린지 2일 후까지, 3개의 군 모두 내의 모든 개가 코 바이러스 유출에 대해 양성이었다. 바이러스 유출은 CIV 챌린지 4일 후와 5일 후 사이에 피크에 도달한 후, 제6일에 급격하게 하락하였다 (도 2). 예방접종되지 않은 군 및 예방접종된 군 양쪽 모두에서 챌린지 후 제8일에는 이들의 코 분비물에서의 CIV 유출이 정지되었다. 각각의 개에 대한 바이러스 역가를 챌린지 후 10일의 기간에 걸쳐 합산하였고, 통계 분석을 수행하였다. 평균 곡선하 면적 추정치가 군 1 및 3 (각각 17.0 Log₁₀ TCID₅₀/㎖ 및 18.6 Log₁₀ TCID₅₀/㎖)에 대해 군 4 (8.9 Log₁₀ TCID₅₀/㎖)에 비교하여 유의하게 더 높았다 (군 1 및 3에 대해 각각 P=0.0075 및 P<0.0001). 군 1 및 3에서의 평균 유출 일수 (각각 5.7일 및 5.8일)가 또한 군 4 (4일)에 비교하여 유의하게 더 높았다 (각각 P=0.0356 및 P=0.0033). 이러한 결과들은 예방접종된 개에서 CIV 백신이 코 바이러스 유출을 유의하게 감소시켰음을 실연한다.

박테리아 유출: 군 2, 3 및 4의 에스. 에쿠이가 챌린지된 개들을 에스. 에쿠이 챌린지로부터 -4일 (CIV 챌린지 전), 및 에스. 에쿠이 챌린지 0일 후, 3일 후, 6일 후, 9일 후 및 11일 후에 에스. 에쿠이의 코 유출에 대해 모니터링하였다 (표 6 및 도 3). 추가적으로, 군 2, 3 및 4의 모든 개로부터의 폐 세척액 샘플을 에스. 에쿠이 단리를 위해 부검 시점에 수집하였다. 군 1의 개 (테스트하지 않음)를 제외한 모든 군 내의 모든 개가 CIV 또는 에스. 에쿠이로의 챌린지 시점에 에스. 에쿠이 유출에 대해 음성이었다. 에스. 에쿠이가 단독으로 챌린지된 개들 (군 2)은 에스. 에쿠이 챌린지 후의 어느 시점에도 코 에스. 에쿠이 유출에 대해 양성이지 않았다. 그러나, 에스. 에쿠이가 군 2의 개 1마리 (17％)의 폐 세척액 샘플로부터 단리되었다. 반면에, CIV + 에스. 에쿠이 양쪽이 챌린지된 군 3의 개 100％가 에스. 에쿠이 챌린지 3일 후 및 6일 후의 이들의 코 분비물에서 에스. 에쿠이에 대해 양성이었고, 이들 중 대다수 (67％)에서 챌린지 후 9일 이상 동안 계속 박테리아가 유출되었다. 군 3의 개의 대다수 (67％)가 또한 이들의 폐 세정액 (에스. 에쿠이 챌린지 11일 후)에서 에스. 에쿠이에 대해 양성이었고, 이는 박테리아가 하부 기도에서 콜로니화 및 증식되었음을 시사한다. CIV + 에스. 에쿠이가 챌린지된 CIV-예방접종 개의 대다수 (60％)의 코 분비물에서도 에스. 에쿠이 챌린지 3일 후에 에스. 에쿠이가 유출되었다. 그 후 6일 동안, 에스. 에쿠이가 유출되는 개의 수가 군 3과 비교하여 군 4에서 실질적으로 더 적었다. 예방접종된 개의 20％만 이들의 폐 세척액 샘플에서 에스. 에쿠이에 대해 양성이었다.

폐 병변: 폐 경화/폐렴은 모든 인플루엔자 감염에서의 주요 병리학적 병변이다. CIV 및 CIV + 에스. 에쿠이 챌린지 군 (군 1 및 3)의 모든 개 (100％)가 다양한 정도의 폐 경화를 나타낸 반면, CIV가 예방접종된 군 (군 4)의 개 3마리 (30％)에서만 폐 경화가 발생하였고, 이들 중 2마리는 매우 경도였다 (표 7). 에스. 에쿠이 챌린지 군 (군 2)에서는 1마리 (17％)만 폐 병변을 나타냈고, 경도였다. 군 1에서는 폐 병변이 전엽에서 우세하게 관찰된 반면, 군 3에서는 병변이 모든 폐엽 내에 존재하는 것으로 보였다. 폐 병변은 출혈 및 붉은색을 띠는 경화 및 간변을 특징으로 하였다. 군 1에서의 폐 점수는 0.5 내지 32.97 범위였고, 중앙값 점수 = 17.27이었으며, 군 3에서는 5.53 내지 39.74였고, 중앙값 폐 점수 = 23.29였다. 군 4에서는, 점수가 0 내지 25.54 범위였고, 중앙값 점수 = 0이었다. 백신 효율의 완화 분획 추정치는 CIV 챌린지에 비해 95％ CI (60％, 100％)에서 88.3％였고, CIV + 에스. 에쿠이 챌린지에 비해 95％ CI (58％, 100％)에서 88.0％였다. 군 4에서의 폐 점수가 군 1 (P=0.0019) 및 군 3 (P=0.0002)과 비교하여 유의하게 더 낮았다. 군 3에서의 폐 점수가 군 1과 비교하여 더 높았지만, 이들은 유의하게 상이하지 않았다 (P=0.5622). 이러한 데이터는 CIV 백신이 CIV에 의해 유도된 폐 병변 및 CIV + 에스. 에쿠이에 의해 유도된 폐 병변의 예방에 도움이 된다는 것을 실연한다.

본 발명이 이의 구체적인 실시양태와 함께 기술되었지만, 추가적인 변형이 가능할 것으로 이해될 것이며, 본 출원은, 일반적으로 본 발명의 원리를 포괄하고, 본 발명이 속하는 업계 내의 공지된 또는 통상적인 실행 범위 내에 있는 것과 같은 본 출원으로부터의 변경이 포함되는, 본 발명의 임의의 변동, 사용 또는 개조를 포괄하도록 의도된다. 본원에서 언급된 모든 특허 및 공개된 출원은 전문이 참고로 포함된다.

Claims

1차 병원체에 대한 항원을 포함하는 백신을 제공하는 단계 및 1차 병원체에 대한 백신의 면역원성 유효량을 갯과 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 2차 병원체에 의해 야기되는 질환에 대해 갯과 동물을 보호하는 방법.

갯과 인플루엔자 바이러스 (CIV: canine influenza virus)에 대한 백신을 제공하는 단계 및 면역원성 유효량의 CIV 백신을 갯과 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 2차 병원체에 의해 야기되는 질환에 대해 갯과 동물을 보호하는 방법.

제3항에 있어서, 2차 병원체가 스트렙토코쿠스 에쿠이(Streptococcus equi) 아종 주에피데미쿠스(Zooepidemicus) (에스. 에쿠이 (S. equi))인 방법.

갯과 인플루엔자 바이러스 (CIV)에 대한 백신을 제공하는 단계 및 면역원성 유효량의 CIV 백신을 갯과 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 갯과 감염성 호흡기 질환 (CIRD: canine infectious respiratory disease)에 대해 갯과 동물을 보호하는 방법.

제5항에 있어서, 백신이 하나 이상의 추가의 면역원을 추가로 포함하는 조합 백신인 방법.

제6항에 있어서, 하나 이상의 추가의 면역원이 갯과 디스템퍼 바이러스, 갯과 아데노바이러스, 갯과 파르보바이러스, 갯과 파라인플루엔자 바이러스, 갯과 코로나바이러스, 갯과 헤르페스바이러스, 갯과 뉴모바이러스, 렙토스피라(Leptospira) 혈청형, 리슈마니아(Leishmania) 생물, 보렐리아(Borrelia) 종 (spp.), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 마이코플라즈마(Mycoplasma) 종, 광견병 바이러스, 에를리키아 카니스(Ehrlichia canis), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

제4항에 있어서, 백신이 하나 이상의 추가의 면역원을 추가로 포함하는 조합 백신인 방법.

제8항에 있어서, 하나 이상의 추가의 면역원이 갯과 디스템퍼 바이러스, 갯과 아데노바이러스, 갯과 파르보바이러스, 갯과 파라인플루엔자 바이러스, 갯과 코로나바이러스, 갯과 헤르페스바이러스, 갯과 뉴모바이러스, 렙토스피라 혈청형, 리슈마니아 생물, 보렐리아 종 (spp.), 보르데텔라 브론키셉티카, 마이코플라즈마 종, 광견병 바이러스, 에를리키아 카니스, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

CIV 백신을 갯과 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 2차 병원체에 의해 야기되는 질환에 대해 갯과 동물을 보호하기 위한 CIV 백신의 용도.

CIV 백신을 갯과 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 에스. 에쿠이 질환에 대해 갯과 동물을 보호하기 위한 CIV 백신의 용도.