JP4163245B2 - レプトスピラブラティスラバおよび他の病原体に対する多価イヌワクチン - Google Patents

Description

本発明は、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）によって引き起こされる感染性気管気管支炎（「ケンネルコフ」（ｋｅｎｎｅｌ ｃｏｕｇｈ））からイヌを防御するための、気管支敗血症菌ｐ６８抗原を含有するワクチンおよびその使用に関する。本発明は、気管支敗血症菌ｐ６８抗原と、イヌジステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、レプトスピラブラティスラバ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）、レプトスピラカニコーラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラグリポティフォーサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、レプトスピライクテロヘモリジア（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｅｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）またはレプトスピラポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｐｏｍｏｎａ）など、イヌの別の病原体の１つまたは複数の抗原とを含有する混合ワクチンにも関する。混合ワクチンを用いて、イヌの病原体によって引き起こされる疾患からイヌを防御する方法も提供する。本発明は、レプトスピラブラティスラバによって引き起こされる感染からイヌを防御するための、レプトスピラブラティスラバを含有するワクチンおよびその使用に関する。本発明は、レプトスピラブラティスラバと、イヌジステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、レプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジアまたはレプトスピラポモナなど、イヌの別の病原体の１つまたは複数の抗原とを含有する混合ワクチンにも関する。本発明は、さらに、レプトスピラブラティスラバを含まない、前記抗原の混合ワクチンに関する。上記混合ワクチンを用いて、イヌの病原体によって引き起こされる疾患からイヌを防御する方法も提供する。

現在市販されているイヌ気管支敗血症菌ワクチン製剤は、アジュバント非添加不活性化気管支敗血症菌全細胞バクテリンで構成されている。そのような全細胞バクテリンは、細胞タンパク質関連のワクチン接種後反応をまねくことがある。気管支敗血症菌のｐ６８タンパク質は、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の外膜タンパク質（ＯＭＰ）およびパラ百日咳菌（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のＯＭＰに抗原性が類似している（Ｓｈａｈｉｎら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｃａｐａｃｉｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ６９−ｋＤ Ｏｕｔｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７１：６３〜７３、１９９０年）。このＯＭＰの防護的役割は、マウス（Ｓｈａｈｉｎら、同上；Ｎｏｖｏｔｎｙら、「Ｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ６９−ｋＤ Ｏｕｔｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ： Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａ Ａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅ」、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６４：１１４〜２２、１９９１年）、ヒト（Ｈｅら、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ａｎｄ Ｐｅｒｔａｃｔｉｎ ｏｆ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｉｎ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｅｕｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．１０：７９３〜７９８、１９９６年）、およびブタ（Ｋｏｂｉｓｃｈら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ６８−Ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ Ｏｕｔｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ｔｈｅ Ｍａｊｏｒ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ ｂｙ Ｕｓｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ−Ｐａｔｈｏｇｅｎ−Ｆｒｅｅ Ｐｉｇｌｅｔｓ」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８（２）：３５２〜３５７、１９９０年）で明らかにされている。

本発明の前には、気管支敗血症菌ｐ６８抗原がイヌで安全かつ有効なワクチンでありうることは示されていなかった。したがって、イヌにおける使用に適した、ｐ６８抗原を含有する気管支敗血症菌ワクチンを開発する必要がある。そのような気管支敗血症菌ｐ６８ワクチンが、子イヌへの投与に安全であり、また、長期の防御を与えるならば、それはさらに有利であろう。

ＣＤは、多様な症状を伴った一般的な、高死亡率のウイルス病である。ワクチン接種しておらず、免疫化されていないイヌの場合、ＣＤウイルスに感染すると、約５０％が臨床徴候を発症し、それらのイヌのうち約９０％が死亡する。

イヌ伝染性肝炎またはＩＣＨは、イヌアデノウイルス１型（ＣＡＶ−１）によって引き起こされ、肝性および全身性の内皮病変を特徴とする、イヌの一般的な、時に致死的なウイルス病である。ＣＡＶ−２は、呼吸器疾患を引き起こし、重度な場合、それには肺炎および気管支肺炎が含まれる。

ＣＰＩは、一般的なウイルス性上部呼吸器系疾患である。合併症のないＣＰＩは、軽度または無症候性でありえ、他の呼吸器病原に同時感染している場合には、徴候がより重度になる。

ＣＰＶ感染は、しばしば出血性となる嘔吐および下痢の突然発症を特徴とする腸疾患をもたらす。白血球減少症は、通常、臨床徴候を伴う。感受性のイヌならばいかなる年齢でも発症しうるが、死亡率が最も高いのは子イヌである。４〜１２週齢の子イヌでは、時にＣＰＶが心筋炎を引き起こすことがあり、その結果、短期間の目立たない疾患状態の後に、急性心不全が起こることがある。感染した後は、多くのイヌが１年間以上疾患に対して抵抗性を有する。同様に、血清陽性のメスイヌは、それらの子イヌにＣＰＶ抗体を伝え、それらのＣＰＶ抗体は、１６週齢を通して子イヌの能動免疫を阻むことができる。

ＣＣＶは、世界中であらゆる年齢の感受性のイヌに腸疾患を引き起こしている。このウイルスは、伝染性が強く、主として、感染性の糞便との直接的接触を介して伝染し、曝露後１〜４日以内に臨床的な小腸炎を引き起こしうる。疾患の重度は、他の病原体に同時感染することによって増悪することがある。ＣＣＶ感染の主要な徴候には、無食欲、嘔吐、および下痢が含まれる。通常、嘔吐の頻度は下痢の開始後１または２日以内に低下するが、下痢は、感染の経過全体を通して続くことがあり、大便は時として縞状の血液を含有することがある。ＣＣＶ感染では、ほとんどのイヌが無熱性の状態を保ち、合併症のない症例では白血球減少症が観察されていない。

レプトスピラ症は、広範な臨床徴候を伴って、あらゆる年齢のイヌで発症し、急性感染の後には通常、慢性腎炎が発症する。

Ｖａｎｇｕａｒｄ（登録商標）という商品名で販売されているものを含めたいくつかの混合ワクチンが開発されている。しかし、本発明の前には、気管支敗血症菌と、ＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶ、ＣＣＶ、ならびにレプトスピラブラティスラバ、レプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジア、およびレプトスピラポモナなどのレプトスピラ諸種などの１つまたは複数の他のイヌの病原体とからイヌを防御するいかなる効果的な混合ワクチンも存在していなかった。また、気管支敗血症菌以外のこれらの他のイヌの病原体に対する、レプトスピラブラティスラバを含む効果的な混合ワクチンも存在していなかった。混合ワクチンを開発する際の１つの問題は、有効性干渉（ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）、すなわち、組成物中の他の抗原の存在のため、混合組成物中の１つまたは複数の抗原が有効性を維持できないか、あるいは実現できないことに関する。これは、宿主例えばイヌに投与された組成物内の抗原の干渉の結果であると考えられ、これは、複数の抗原が組成物中に存在しているがゆえに宿主において誘導した免疫、抗原、抗体または防御反応によるものであると考えられる。しかし、ネコなどの他の宿主では、混合ワクチンが既知である。イヌにおける有効性干渉は、イヌの生物システムの何らかの特性のため、またはイヌの生物システムとの上記抗原の反応のためであると考えられている。

したがって、イヌへの投与に適し、かつイヌで有効性干渉を示さない、気管支敗血症菌および他の１つまたは複数のイヌの病原体に対する混合ワクチンを開発する必要がある。気管支敗血症菌を含まないそのような混合ワクチンを開発する必要性も存在する。そのような混合ワクチンが、子イヌに投与しても安全なものであり、長期の防御を与えるものであるならば、それはさらに有利であろう。

本発明は、イヌの病原体によって引き起こされる疾患からイヌを防御するワクチンおよび方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、イヌへの投与に適し、かつ気管支敗血症菌によって引き起こされる疾患からイヌを防御できるｐ６８ワクチンを提供する。本発明のそのようなワクチンは、気管支敗血症菌ｐ６８抗原と、アジュバントなどの獣医学的に許容できる担体とを含む。

別の実施形態では、本発明は、気管支敗血症菌ｐ６８抗原と、アジュバントなどの獣医学的に許容できる担体とを含むワクチンをイヌに投与することによって、気管支敗血症菌によって引き起こされる疾患からイヌを防御する方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、イヌへの投与に適し、かつレプトスピラブラティスラバによって引き起こされる疾患からイヌを防御できるレプトスピラブラティスラバワクチンを提供する。本発明のそのようなワクチンは、レプトスピラブラティスラバの細胞調製物と、アジュバントなどの獣医学的に許容できる担体とを含む。

別の実施形態では、本発明は、レプトスピラブラティスラバの細胞調製物と、アジュバントなどの獣医学的に許容できる担体とを含むワクチンをイヌに投与することによって、レプトスピラブラティスラバによって引き起こされる疾患からイヌを防御する方法を提供する。

さらに別の実施形態では、本発明は、イヌへの投与に適した混合ワクチンを提供する。本発明の混合ワクチンは、他のイヌの病原体によって引き起こされる疾患に対する防御免疫反応をイヌで誘導できる、そのような他の病原体に由来する少なくとも１つの他の抗原と併せて、気管支敗血症菌ｐ６８抗原を含む。そのような他の病原体は、イヌジステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、イヌヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス、レプトスピラブラティスラバ、レプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジア、レプトスピラポモナ、レプトスピラハージョボビス、ポルフィロモナス属全種、バクテロイデス属全種、リーシュマニア属全種、ボレリア属全種、エーリキア属全種、マイコプラズマ属全種、およびミクロスポルムカニスから選択することができる。

本発明の好ましい組合せには、そのような病原体によって引き起こされる疾患に対する防御免疫反応をイヌで誘導できる、イヌの病原体に由来する２つ以上の抗原が含まれる。そのような病原体は、イヌジステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、イヌヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス、レプトスピラブラティスラバ、レプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジア、レプトスピラポモナ、レプトスピラハージョボビス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈａｒｄｊｏｂｏｖｉｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）全種、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ）属全種、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属全種、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属全種、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）属全種、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属全種、およびミクロスポルムカニス（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ）から選択することができる。

本発明の好ましい混合ワクチンの１つは、イヌジステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス、およびイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）の弱毒化株；イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）株の不活性化調製物；ならびに気管支敗血症菌ｐ６８抗原を含む。

本発明の好ましい混合ワクチンの１つは、イヌジステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス、およびイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）の弱毒化株；ならびにイヌコロナウイルス（ＣＣＶ）株の不活性化調製物を含む。

本発明の別の好ましい混合ワクチンは、イヌジステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス、およびイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）の弱毒化株；イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）株の不活性化調製物；気管支敗血症菌ｐ６８タンパク質、ならびに５つのレプトスピラ血清型（レプトスピラブラティスラバ、レプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジア、およびレプトスピラポモナ）の不活性化細胞調製物を含む。

本発明の別の好ましい混合ワクチンは、イヌジステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス、およびイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）の弱毒化株；ならびにイヌコロナウイルス（ＣＣＶ）株の不活性化調製物；ならびに５つのレプトスピラ血清型（レプトスピラブラティスラバ、レプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジア、およびレプトスピラポモナ）の細胞調製物を含む。

本発明の別の好ましい混合ワクチンは、イヌジステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス、およびイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）の弱毒化株；イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）株の不活性化調製物；ならびに４つのレプトスピラ血清型（レプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジア、およびレプトスピラポモナ）の不活性化細胞調製物を含む。

本発明のさらに別の好ましい混合ワクチンは、ＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶ一株の弱毒化株；および気管支敗血症菌ｐ６８抗原を含む。

本発明のさらに別の好ましい混合ワクチンは、ＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶ一株の弱毒化株を含む。

本発明の別の好ましい混合ワクチンは、ＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶ一株の弱毒化株；気管支敗血症菌ｐ６８抗原；ならびにレプトスピラカニコーラおよびレプトスピライクテロヘモリジアの不活性化細胞調製物を含む。

本発明の別の好ましい混合ワクチンは、ＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶ一株の弱毒化株；ならびにレプトスピラカニコーラおよびレプトスピライクテロヘモリジアの不活性化細胞調製物を含む。

本発明のさらに別の好ましい混合ワクチンは、ＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶ一株の弱毒化株、気管支敗血症菌ｐ６８抗原、ならびに５つのレプトスピラ血清型（レプトスピラブラティスラバ、レプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジア、およびレプトスピラポモナ）の不活性化細胞調製物を含む。

本発明のさらに別の好ましい混合ワクチンは、ＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶ一株の弱毒化株、ならびに５つのレプトスピラ血清型（レプトスピラブラティスラバ、レプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジア、およびレプトスピラポモナ）の不活性化細胞調製物を含む。

本発明のさらに別の好ましい混合ワクチンは、ＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶ一株の弱毒化株、ならびに４つのレプトスピラ血清型（レプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジア、およびレプトスピラポモナ）の不活性化細胞調製物を含む。

別の好ましい混合ワクチンは、気管支敗血症菌ｐ６８抗原および弱毒化ＣＰＩウイルスを含む。

さらに別の好ましい混合ワクチンは、気管支敗血症菌ｐ６８抗原、弱毒化ＣＰＩウイルス、ならびにレプトスピラカニコーラおよびレプトスピライクテロヘモリジアの不活性化細胞調製物を含む。

本発明は、本発明の混合ワクチンをイヌに投与することによって、イヌの病原体によって引き起こされる疾患からイヌを防御する方法も提供する。

一実施形態では、本発明は、気管支敗血症菌によって引き起こされる疾患からイヌを防御できる、イヌへの投与に適した単価ワクチンを提供する。本発明の単価ワクチンは、組換え産生された気管支敗血症菌ｐ６８抗原と、アジュバントなどの獣医学的に許容できる担体とを含む。

別の実施形態では、本発明は、組換え産生された気管支敗血症菌ｐ６８抗原と、アジュバントなどの獣医学的に許容できる担体とを含む単価ワクチンをイヌに投与することによって、気管支敗血症菌によって引き起こされる疾患からイヌを防御する方法を提供する。

さらに別の実施形態では、本発明は、イヌへの投与に適した混合ワクチンを提供する。本発明の混合ワクチンは、他の抗原によって引き起こされる疾患に対する防御免疫反応をイヌで誘導できる少なくとも１つのそのような他の抗原と併せて、組換え産生された気管支敗血症菌ｐ６８抗原を含む。本発明の別の実施形態は、イヌの病原体によって引き起こされる疾患に対する防御免疫反応をイヌで誘導できる、そのような病原体に由来する２つ以上の抗原を含む。

本発明の好ましい混合ワクチンの１つは、イヌジステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス、およびイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）の弱毒化株；イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）株の不活性化調製物；ならびに４つのレプトスピラ血清型（レプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジア、およびレプトスピラポモナ）の調製物を含む。

本発明の別の好ましい混合ワクチンは、イヌジステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス、およびイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）の弱毒化株；イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）株の不活性化調製物；ならびに５つのレプトスピラ血清型（レプトスピラブラティスラバ、レプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジア、およびレプトスピラポモナ）の調製物を含む。

本発明のさらに別の好ましい混合ワクチンは、ＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶ一株の弱毒化株；ならびに４つのレプトスピラ血清型（レプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジア、およびレプトスピラポモナ）の調製物を含む。

本発明の別の好ましい混合ワクチンは、ＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶ一株、ＣＣＶ一株の弱毒化株；ならびにレプトスピラカニコーラおよびレプトスピライクテロヘモリジアの調製物を含む。

本発明のさらに別の好ましい混合ワクチンは、ＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶ一株の弱毒化株、ならびに５つのレプトスピラ血清型（レプトスピラブラティスラバ、レプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジア、およびレプトスピラポモナ）の調製物を含む。

本発明は、本発明の混合ワクチンをイヌに投与することによって、イヌの病原体によって引き起こされる疾患からイヌを防御する方法も提供する。

制限ではなく、開示を明確にするために、本発明の詳細な説明を以下の通りの小区分に分割する。それらは、本発明の特定の特徴、実施形態、または適用を説明または例示するものである。

定義および略語
本明細書で使用される場合、「イヌの病原体によって引き起こされる疾患からイヌを防御する」という用語は、その病原体に感染する危険性を低減または除去すること、感染の症候を寛解もしくは軽減させること、または感染からの回復を加速することを意味する。防御が実現するのは、例えば、ウイルスもしくは細菌の負荷が低減された場合、ウイルスもしくは細菌の散布性が低減された場合、感染の頻度もしくは継続時間が低減された場合、急性期血清タンパク質レベルが低減された場合、直腸温が低下した場合、ならびに／または食物摂取および／もしくは成長が増大した場合である。

「ｐ６８抗原」という用語は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定された分子量が６８ｋＤａであるタンパク質であって、ｐ６８特異的モノクローナル抗体Ｂｏｒｄ ２−７（ＡＴＣＣ＃）によって認識され、かつ配列番号１に記載のアミノ酸配列または配列番号１に実質的に同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。

「実質的に同一」によって、配列同一性の程度が少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％、またはより好ましくは少なくとも約９８％であることを意味する。

本明細書で使用される場合、「単価ワクチン」という用語は、１つの主要な抗原成分を有するワクチンを指す。例えば、ｐ６８単価ワクチンは、ワクチンの主要抗原成分として気管支敗血症菌ｐ６８抗原を含み、上記ワクチンを投与した動物を、気管支敗血症菌によって引き起こされる疾患から防御することができる。単価ワクチンの別の例は、ワクチンの主要抗原成分としてレプトスピラブラティスラバの細胞調製物を含み、上記ワクチンが投与した動物を、レプトスピラブラティスラバによって引き起こされる疾患から防御することができる。

「混合ワクチン」という用語は、イヌで防御免疫応答を誘導できる抗原の二価または多価の組合せを意味する。１つまたは複数の病原体に対する混合ワクチンの防御効果は、通常、動物対象の体内で免疫応答、すなわち細胞性もしくは体液性免疫応答のいずれか、または両方の組合せを誘導することによって実現される。

「免疫原性」によって、特定の病原体に対する免疫応答をイヌで引き起こす組成物の能力を意味する。免疫応答は、主として細胞傷害性Ｔ細胞およびサイトカイン産生Ｔ細胞によって媒介される細胞性免疫応答であるか、あるいは主としてヘルパーＴ細胞によって媒介される体液性免疫応答でありうる。ヘルパーＴ細胞は、その結果としてＢ細胞を活性化し、抗体産生へと導く。

「治療有効量」または「有効量」という用語は、それが投与したイヌで防御免疫反応を誘発するのに十分な、単価ワクチンまたは混合ワクチンの量を指す。免疫応答は、細胞性および／または体液性免疫の誘導を含むが、これに限定されない。治療上有効なワクチンの量は、そのワクチンで使用されている特定の抗原、イヌの年齢および状態、ならびに／または感染の程度に応じて変動しうるものであり、獣医がこれを決定できる。

ｐ６８ワクチン
本発明は、気管支敗血症菌ｐ６８抗原を含有するワクチン組成物が、気管支敗血症菌によって引き起こされる疾患からイヌを効果的に防御したことを初めて実証したものである。本発明のワクチン組成物は、有意なワクチン接種後反応を引き起こさず、子イヌに投与しても安全であり、かつ、長期間継続する防御免疫をイヌで誘導する。

したがって、本発明の一実施形態は、イヌへの投与に適し、かつ気管支敗血症菌によって引き起こされる疾患、例えば感染性気管気管支炎（「ケンネルコフ」）からイヌを防御できる、気管支敗血症菌ｐ６８抗原を含有するワクチン組成物（すなわち「ｐ６８ワクチン」）を対象とする。

本発明の目的においては、「ｐ６８抗原」という用語は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定された分子量が６８ｋＤａであるタンパク質（図５を参照）であって、ｐ６８特異的モノクローナル抗体Ｂｏｒｄ ２−７（ＡＴＣＣ＃）によって認識され、かつ配列番号１に記載のアミノ酸配列または配列番号１に実質的に同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。「実質的に同一」によって、配列同一性の程度が少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％、またはより好ましくは少なくとも約９８％であることを意味する。配列番号１に実質的に同一なアミノ酸配列を有するｐ６８抗原の一例は、国際公開第９２／１７５８７号パンフレットに記載のｐ６８抗原であり、それを配列番号３に示す。本発明のｐ６８特異的モノクローナル抗体は、例えば、天然のｐ６８タンパク質、組換え体ｐ６８タンパク質、および細菌表面のｐ６８タンパク質を認識する。

本発明によれば、本発明での使用に適したｐ６８抗原には、天然のｐ６８タンパク質（すなわち、気管支敗血症菌から精製された天然存在のｐ６８タンパク質）、および組換え産生されたｐ６８タンパク質の両方が含まれる。

気管支敗血症菌からの天然ｐ６８の精製に関しては、例えば、Ｍｏｎｔａｒａｚら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４７：７４４〜７５１（１９８５年）に記載されており、また、本明細書中で下記に示す実施例でも例示する。ｐ６８の組換え産生は、当業者に知られている分子クローニング技法および組換え体発現技法のうちいずれか１つを用いて実施できる。例えば、ｐ６８をコードする核酸分子を、細菌、酵母細胞（例えばピキア（Ｐｉｃｈｉａ）細胞）、昆虫細胞、または哺乳類細胞（例えばＣＨＯ細胞）などの適切な宿主細胞に導入することができる。ｐ６８をコードしている核酸分子を、宿主細胞でのｐ６８抗原の発現をもたらすことができるプロモーターと作用可能に連結させることができる。宿主細胞によって発現されたｐ６８は、通常のタンパク質精製技法を用いて容易に精製することができる。

本発明の好ましい実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を有するｐ６８抗原をコードする、配列番号２に示すヌクレオチド配列を発現ベクターにクローニングし、温度感受性プロモーターと作用可能に連結させる。この発現ベクターを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に導入し、熱誘導でｐ６８抗原を発現させる。これらの細胞を溶解させ、ｐ６８抗原が蓄積している封入体を遠心法によって分離する。封入体中の組換え体ｐ６８は、ＳＤＳ、または尿素、塩酸グアニジン、コール酸ナトリウム、タウロコラート、およびデオキシコール酸ナトリウムなど、当技術分野で知られている他の可溶化剤を用いて可溶化する。本発明によれば、精製された天然または組換え体のｐ６８タンパク質を獣医学的に許容できる担体と併せてｐ６８ワクチン組成物を形成させる。

「獣医学的に許容できる担体」という用語には、すべての溶媒、分散媒、剤皮、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗菌薬、抗真菌薬、等張剤、吸着遅延剤などが含まれる。希釈剤には、水、食塩水、ブドウ糖、エタノール、グリセロールなどが含まれうる。等張剤には、中でも、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが含まれうる。安定化剤には、中でも、アルブミンが含まれる。

本発明による使用に適したアジュバントには、無機質塩、例えば、ミョウバン、水酸化アルミニウム、アルミニウムリン酸塩、およびリン酸カルシウム；界面活性剤およびマイクロ粒子、例えば、非イオン性ブロックポリマー界面活性剤（例えばコレステロール）、ウイロソーム、サポニン（例えば、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ−２１、およびＧＰＩ−０１００）、プロテオソーム、免疫刺激性複合体、コクレエート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）、第４級アミン（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ））、アブリジン、ビタミンＡ、ビタミンＥ；ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｒｉｂｉ社）、チモテ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ）の細胞壁骨格（Ｄｅｔｏｘ（登録商標））、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびトリペプチド（ＭＴＰ）、モノホスホリルリピドＡ、カルメット−ゲラン杆菌、熱不安定性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エンテロトキシン、コレラトキシン、トレハローズジミコレート、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドなどの細菌産物；サイトカインおよびホルモン、例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、デヒドロエピアンドロステロン、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３；ポリアニオン、例えばデキストラン；ポリアクリル酸（例えば、ポリメタクリル酸メチル、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９３４Ｐ）；担体、例えば、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、コレラトキシンＢサブユニット、エンテロトキシン産生大腸菌の変異体熱不安定性エンテロトキシン（ｒｍＬＴ）、熱ショックタンパク質；水中油型乳剤、例えばＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）（Ｈｙｄｒｏｎｉｃｓ社、米国）；ならびに例えばフロイント完全および不完全アジュバントなどの油中水型乳剤など、いくつかのアジュバントクラスが含まれるが、これらに限定されない。

本発明のワクチン中での使用に好ましいアジュバントには、Ｑｕｉｌ Ａおよびコレステロールが含まれる。

ｐ６８抗原および獣医学的に許容できる担体は、ワクチン組成物を形成させるための任意の好都合かつ実際的な方法、例えば、混合、溶解、懸濁、乳化、カプセル化、吸収、および同様の方法によって併せることができ、注射、埋入、吸入、経口摂取、または同様の方法に適した、錠剤、カプセル剤、粉末薬、シロップ、懸濁液などの剤形にすることができる。ワクチンは、約０．１〜５ｍｌ、または好ましくは約０．５〜２．５ｍｌの用量、またはさらにより好ましくは約１ｍｌの用量の注射によってイヌに投与できるように調剤されることが好ましい。それが適切である場合には、本発明の医薬組成物を、よく知られる手順によって無菌化するべきである。

ワクチン中のｐ６８の量は、免疫化に有効な量であるべきであり、通常、１用量あたり０．５〜１０００μｇの範囲にある。ｐ６８の量は、１用量あたり１〜２６０μｇの範囲にあることが好ましい。ｐ６８の量は、１用量あたり１０〜１００μｇの範囲にあることがより好ましい。ｐ６８の量は、１用量あたり約１５から２５μｇであることがさらにより好ましい。

ワクチン中での使用に適したアジュバントの量は、使用されるアジュバントの性質に依存している。例えば、Ｑｕｉｌ Ａおよびコレステロールをアジュバントとして使用する場合、Ｑｕｉｌ Ａの量は、通常、１用量あたり約１〜１０００μｇ、好ましくは１用量あたり３０〜１００μｇ、より好ましくは１用量あたり約５０〜７５μｇであり、コレステロールの量は、通常、１用量あたり約１〜１０００μｇ、好ましくは１用量あたり約３０〜１００μｇ、より好ましくは１用量あたり約５０〜７５μｇである。

別の実施形態では、本発明は、上述の通り、ｐ６８ワクチン組成物をイヌに投与することによって、気管支敗血症菌によって引き起こされる疾患からイヌを防御する方法を提供する。本発明によれば、上記ｐ６８ワクチン組成物は、少なくとも約４カ月、好ましくは少なくとも約６カ月、またはさらに好ましくは約１年間の間、長期免疫をイヌに与える。

本発明によれば、経口、鼻腔内、粘膜、局所、経皮および非経口（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下または筋肉内）経路を含めた任意の知られている経路で、ｐ６８ワクチンをイヌに投与することができる。投与は、無針送達装置を用いて行うこともできる。投与は、複数の経路を併用して、例えば、最初に非経口経路を用いて投与し、それに続いて粘膜経路を用いて投与して行うこともできる。

好ましい投与経路には、皮下投与および筋肉内投与が含まれる。

本発明のｐ６８ワクチン組成物は、少なくとも６週齢、好ましくは少なくとも７週齢、そしてより好ましくは少なくとも８または９週齢のイヌに投与することができる。イヌのワクチン接種は、単回用量または多回用量のｐ６８ワクチンを用いて実施できる。２用量のｐ６８ワクチンを、それら２回の投与の間隔が約２〜４週間、好ましくは約３週間となるようにイヌに投与するのが好ましい。４月齢未満の子イヌでは、移行抗体によって適切な免疫応答の発生が妨げられることがあるので、４月齢になる前にイヌにワクチン接種する場合、４月齢に達した際に単一用量を用いて再接種することが推奨される。また、毎年単一用量でイヌを再度ワクチン接種することもできる。繁殖、寄宿および品評会などの状態にあって、気管支敗血症菌に曝露している可能性が高い場合、これらの事態が生じてから１年以内、または好ましくは６カ月以内にもう一度追加免疫を与えることができる。

混合ワクチン
別の実施形態では、本発明は、そのような混合ワクチンを投与することによって、気管支敗血症菌および／または他の１つもしくは複数の、イヌの病原体からイヌを防御する混合ワクチンおよび方法を提供する。本発明の混合ワクチン組成物は、有効性干渉を示さず、かつ子イヌに投与しても安全である。

本発明の混合ワクチンは、気管支敗血症菌ｐ６８抗原を含み、上述の通り、他のイヌ病原体によって引き起こされる疾病に対する防御免疫応答をイヌで誘導することができるそのような他のイヌ病原体に由来する少なくとも１つの抗原と組み合わせて作製することができる。そのような混合ワクチンは、ｐ６８抗原を含まない２つ以上のそのような他のイヌ病原体の組合せをも含む。

そのような他の病原体には、イヌジステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、イヌヘルペスウイルス、および狂犬病ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。本発明のワクチン組成物中で使用するための、これらの病原体由来の抗原は、改変生ウイルス調製物または不活性化ウイルス調製物の形態にあるものでよい。これらのウイルスの毒性株を弱毒化する方法、および不活性化ウイルス調製物を作製する方法は、当技術分野で知られており、例えば、米国特許第４５６７０４２号および第４５６７０４３号に記載されている。

他の病原体には、レプトスピラブラティスラバ、レプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジア、レプトスピラポモナ、レプトスピラハージョボビス、ポルフィロモナス属全種、バクテロイデス全種、リーシュマニア属全種、ボレリア属全種、エーリキア属全種、マイコプラズマ属全種、およびミクロスポルムカニスも含まれる。本発明のワクチン組成物中で使用するための、これらの病原体由来の抗原は、当技術分野で周知の方法を用いて調製された不活性化全細胞調製物または部分細胞調製物の形態にあるものでよい。例えば、不活性レプトスピラ全細胞調製物または部分細胞調製物を作製する方法が当技術分野で知られており、例えば、Ｙａｎ，Ｋ−Ｔ、「Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ ｓｅｒｏｖａｒ ｈａｒｄｊｏ」、博士論文、Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｉ、１９９６年、Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔｈｅ Ｑｕｅｅｎ’ｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｅｌｆａｓｔ；Ｍａｃｋｉｎｔｏｓｈら、「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｈａｒｄｊｏ−ｐｏｍｏｎａ ｖａｃｃｉｎｅ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｕｒｉａ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｎａｔｕｒａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ Ｌｅｐｔｏｓｐｉａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｈａｒｄｊｏ」、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｖｅｔ．Ｊ ２８：１７４〜１７７、１９８０年；Ｂｏｌｉｎら、「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｐｅｎｔａｖａｌｅｎｔ ｌｅｐｔｏｐｓｉｒａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｏｎ Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｈａｒｄｊｏ ｔｙｐｅ ｈａｒｄｊｏ−ｂｏｉｖｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｃａｔｔｌｅ」Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．５０：１６１〜１６５、１９８９年に記載されている。

本発明によれば、混合ワクチンは、通常、獣医学的に許容できる担体を含む。上述の通り、獣医学的に許容できる担体には、あらゆる溶媒、分散媒、剤皮、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤などが含まれる。希釈剤には、水、食塩水、ブドウ糖、エタノール、グリセロールなどが含まれうる。等張剤には、中でも、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースが含まれうる。安定化剤には、中でも、アルブミンが含まれる。

本発明による使用に適したアジュバントには、無機質塩、例えば、ミョウバン、水酸化アルミニウム、アルミニウムリン酸塩、およびリン酸カルシウム；界面活性剤およびマイクロ粒子、例えば、非イオン性ブロックポリマー界面活性剤（例えばコレステロール）、ウイロソーム、サポニン（例えば、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ−２１、およびＧＰＩ−０１００）、プロテオソーム、免疫刺激性複合体、コクレエート、第４級アミン（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ））、アブリジン、ビタミンＡ、ビタミンＥ；ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｒｉｂｉ社）、チモテ菌の細胞壁骨格（Ｄｅｔｏｘ（登録商標））、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびトリペプチド（ＭＴＰ）、モノホスホリルリピドＡ、カルメット−ゲラン桿菌、熱不安定性大腸菌エンテロトキシン、コレラトキシン、トレハローズジミコレート、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドなどの細菌産物；サイトカインおよびホルモン、例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、デヒドロエピアンドロステロン、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３；ポリアニオン、例えばデキストラン；ポリアクリル酸（例えば、ポリメタクリル酸メチル、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９３４Ｐ）；担体、例えば、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、コレラトキシンＢサブユニット、エンテロトキシン産生大腸菌の変異体熱不安定性エンテロトキシン（ｒｍＬＴ）、熱ショックタンパク質；水中油型乳剤、例えばＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）（Ｈｙｄｒｏｎｉｃｓ社、米国）；ならびに例えばフロイント完全および不完全アジュバントなどの油中水型乳剤など、いくつかのアジュバントクラスが含まれるが、これらに限定されない。

本発明による混合ワクチン中で使用するのに好ましいアジュバントには、１）Ｑｕｉｌ Ａおよびコレステロールと；２）水酸化アルミニウムとが含まれる。上記ワクチン中での使用に適したアジュバントの量は、用いられたアジュバントの性質に依存する。例えば、Ｑｕｉｌ Ａおよびコレステロールをアジュバントとして用いる場合、Ｑｕｉｌ Ａの量は、通常、１用量あたり約１〜１０００μｇ、好ましくは１用量あたり３０〜１００μｇ、より好ましくは１用量あたり約５０〜７５μｇであり；コレステロールの量は、通常、１用量あたり約１〜１０００μｇ、好ましくは１用量あたり約３０〜１００μｇ、より好ましくは１用量あたり約５０〜７５μｇである。水酸化アルミニウムをアジュバントとして用いる場合、その量は、通常、約０．５〜２０％、好ましくは約０．５〜１０％、より好ましくは約１〜２％である。

ｐ６８抗原、他の病原体に由来する１つもしくは複数の抗原、および／または獣医学的に許容できる担体は、混合ワクチン組成物を形成させるための任意の好都合かつ実際的な方法、例えば、混合、溶解、懸濁、乳化、カプセル化、吸収、および同様の方法によって併せることができ、注射、埋入、吸入、経口摂取、または同様の方法に適した、錠剤、カプセル剤、粉末薬、シロップ、懸濁液などの剤形にすることができる。上記ワクチンは、約０．１〜５ｍｌ、または好ましくは約０．５〜２．５ｍｌの用量、またはさらにより好ましくは約１ｍｌの用量の注射によってイヌに投与できるように調剤されることが好ましい。

混合ワクチンは、上記弱毒化ウイルス株の凍結乾燥調製物（または噴霧乾燥もしくは脱水などの他の方法による調製物）およびウイルス調製物を、無菌食塩水中に溶解しているレプトスピラ抗原、ならびにＱｕｉｌ Ａおよびコレステロールのアジュバントから構成されている液体調製物で再水和させることによって調製できる。そのような混合ワクチンは、上記弱毒化ウイルス株およびレプトスピラウイルス調製物の凍結乾燥調製物（または噴霧乾燥もしくは脱水などの他の方法による調製物）を無菌溶液で再水和させるか、あるいは前記凍結乾燥調製物を、ＣＣＶおよび希釈剤で再水和させることによって調製することもできる。

本発明によれば、混合ワクチンは、少なくとも６週齢、好ましくは少なくとも７週齢、そしてより好ましくは少なくとも８または９週齢のイヌに投与することができる。混合ワクチンは、２から４用量、好ましくは２から３用量で投与することができる。各用量の間に２から６週間をおいて、好ましくは各用量の間に２から４週間をおいて、これらの用量を投与することができる。

投与は、経口、鼻腔内、粘膜、局所、経皮および非経口（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下または筋肉内）経路を含めた、任意の既知な経路で実施できる。投与は、無針送達装置を用いて行うこともできる。投与は、複数の経路を併用して、例えば、最初に非経口経路を用いて投与し、それに続いて粘膜経路を用いて投与して行うこともできる。好ましい投与経路には、皮下投与および筋肉内投与が含まれる。

好ましい混合ワクチンおよびワクチン接種方法
本発明の好ましい混合ワクチンには、ＣＤウイルスの弱毒化株、ＣＡＶ−２の弱毒化株、ＣＰＩウイルスの弱毒化株、ＣＰＶの弱毒化株、ＣＣＶ株の不活性化調製物、および気管支敗血症菌ｐ６８抗原が含まれる。

特に好ましい混合ワクチンには、「Ｓｎｙｄｅｒ Ｈｉｌｌ」株と命名された弱毒化ＣＤウイルス株（米国獣医学試験研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、アイオワ州Ａｍｅｓ所在）、「Ｍａｎｈａｔｔａｎ」株と命名された弱毒化ＣＡＶ−２株（米国獣医学試験研究所、アイオワ州Ａｍｅｓ所在）、「ＮＬ−ＣＰＩ−５」と命名された弱毒化ＣＰＩウイルス株（米国獣医学試験研究所、アイオワ州Ａｍｅｓ所在）、「ＮＬ−３５−Ｄ」と命名された弱毒化ＣＰＶ株（米国獣医学試験研究所、アイオワ州Ａｍｅｓ所在）、「ＮＬ−１８」と命名されたＣＣＶ株の不活性化調製物（米国獣医学試験研究所、アイオワ州Ａｍｅｓ所在）、および配列番号１の配列を有する組換え体気管支敗血症菌ｐ６８抗原が含まれる。そのような混合ワクチンは、本明細書では「ｐ６８／５ＣＶ混合ワクチン」とも呼ばれ、好ましくは、上記弱毒化ウイルス株の凍結乾燥調製物およびウイルス調製物を、無菌食塩水中に溶解しているｐ６８抗原、ならびにＱｕｉｌ Ａおよびコレステロールのアジュバントで構成されている液体調製物で再水和させることによって調製される。ｐ６８抗原を含まない場合、本明細書ではこの混合ワクチンを５ＣＶ混合ワクチンと呼ぶ。そのような混合ワクチンは、好ましくは、上記弱毒化ウイルス株の凍結乾燥調製物およびウイルス調製物を、無菌食塩水、ならびにＱｕｉｌ Ａおよびコレステロールのアジュバントで構成されている液体調製物で再水和させることによって調製される。

別の特に好ましい混合ワクチンには、ｐ６８／５ＣＶ混合ワクチンの抗原成分、ならびに５つのレプトスピラ種、すなわち、レプトスピラブラティスラバ（例えばアイオワ州Ａｍｅｓ所在の米国獣医学試験研究所から入手できるレプトスピラブラティスラバ株）、レプトスピラカニコーラ（例えばＣ−５株、米国獣医学試験研究所、アイオワ州Ａｍｅｓ所在）、レプトスピラグリポティフォーサ（例えばＭＡＬ１５４０株、米国獣医学試験研究所、アイオワ州Ａｍｅｓ所在）、レプトスピライクテロヘモリジア、（例えばＮＡＤＬ１１４０３株、米国獣医学試験研究所、アイオワ州Ａｍｅｓ所在）、およびレプトスピラポモナ（例えばＴ２６２株、米国獣医学試験研究所、アイオワ州Ａｍｅｓ所在）の不活性化全細胞調製物が含まれる。そのような混合ワクチンは、本明細書では「ｐ６８／５ＣＶ−レプトスピラ混合ワクチン」とも呼ばれ、好ましくは、上記弱毒化ウイルス株の凍結乾燥調製物（または噴霧乾燥もしくは脱水などの他の方法による調製物）およびウイルス調製物を、無菌食塩水中に溶解しているｐ６８抗原およびレプトスピラ抗原、ならびにＱｕｉｌ Ａおよびコレステロールのアジュバントから構成されている液体調製物で再水和させることによって調製される。ｐ６８抗原を含まない場合、本明細書ではこの混合ワクチンを５ＣＶ−５レプトスピラ混合ワクチンと呼ぶ。ｐ６８抗原もレプトスピラブラティスラバも含まない場合、本明細書ではこの混合ワクチンを５ＣＶ−４レプトスピラ混合ワクチンと呼ぶ。ｐ６８抗原を含まず、かつレプトスピラカニコーラおよびレプトスピライクテロヘモリジアを含む５ＣＶ混合ワクチンを、本明細書では５ＣＶ−２レプトスピラ混合ワクチンと呼ぶ。そのような混合ワクチンは、好ましくは、上記弱毒化ウイルス株の凍結乾燥調製物（または噴霧乾燥もしくは脱水などの他の方法による調製物）およびウイルス調製物を、無菌食塩水中に溶解しているレプトスピラ抗原、ならびにＱｕｉｌ Ａおよびコレステロールのアジュバントから構成されている液体調製物で再水和させることによって調製される。上記弱毒化ウイルス株およびレプトスピラウイルス調製物の凍結乾燥調製物（または噴霧乾燥もしくは脱水などの他の方法による調製物）を無菌溶液で再水和させるか、あるいは前記凍結乾燥調製物を、ＣＣＶおよび希釈剤で再水和させることによって、そのような混合ワクチンを調製することも好ましい。

本発明によれば、ｐ６８／５ＣＶ、ｐ６８／５ＣＶ−レプトスピラ、５ＣＶ、５ＣＶ−５レプトスピラ、５ＣＶ−４レプトスピラ、および５ＣＶ−２レプトスピラ混合ワクチンを４週齢以上、好ましくは６週齢以上の健康なイヌに、好ましくは３用量をそれぞれ約３週間の間隔をおいて投与することができる。毎年単一用量でイヌを再度ワクチン接種できる。繁殖、寄宿および品評会などの状態にあって、気管支敗血症菌および／またはイヌウイルスに曝露している可能性が高い場合、これらの事態が生じてから１年以内、または好ましくは６カ月以内にもう一度追加免疫を与えることができる。

本発明のさらに別の好ましい混合ワクチンには、ＣＤウイルスの弱毒化株、ＣＡＶ−２の弱毒化株、ＣＰＩウイルスの弱毒化株、ＣＰＶの弱毒化株、および組換え体気管支敗血症菌ｐ６８抗原が含まれる。

特に好ましい混合ワクチンには、「Ｓｙｎｄｅｒ Ｈｉｌｌ」株と命名された弱毒化ＣＤウイルス株（米国獣医学試験研究所、アイオワ州Ａｍｅｓ所在）、「Ｍａｎｈａｔｔａｎ」株と命名された弱毒化ＣＡＶ−２株（米国獣医学試験研究所、アイオワ州Ａｍｅｓ所在）、「ＮＬ−ＣＰＩ−５」と命名された弱毒化ＣＰＩウイルス株（米国獣医学試験研究所、アイオワ州Ａｍｅｓ所在）、「ＮＬ−３５−Ｄ」と命名された弱毒化ＣＰＶ株（米国獣医学試験研究所、アイオワ州Ａｍｅｓ所在）、および配列番号１の配列を有する組換え体気管支敗血症菌ｐ６８抗原が含まれる。そのような混合ワクチンは、本明細書では「ｐ６８／ＤＡ_２ＰＰ混合ワクチン」とも呼ばれ、好ましくは、上記弱毒化ウイルス株の凍結乾燥調製物（または噴霧乾燥もしくは脱水などの他の方法による調製物）を、無菌食塩水中に溶解しているｐ６８抗原、ならびにＱｕｉｌ Ａおよびコレステロールのアジュバントから構成されている液体調製物で再水和させることによって調製される。ｐ６８抗原を含まない場合、本明細書ではこの混合ワクチンをＤＡ_２ＰＰ混合ワクチンと呼ぶ。そのような混合ワクチンは、好ましくは、上記弱毒化ウイルス株の凍結乾燥調製物（または噴霧乾燥もしくは脱水などの他の方法による調製物）を、無菌食塩水、ならびにＱｕｉｌ Ａおよびコレステロールのアジュバントから構成されている液体調製物で再水和させることによって調製される。

別の特に好ましい混合ワクチンには、ｐ６８／ＤＡ_２ＰＰ混合ワクチンの抗原成分、ならびに２つのレプトスピラ種、すなわち、レプトスピラカニコーラ（例えばＣ−５１株、米国獣医学試験研究所、アイオワ州Ａｍｅｓ所在）およびレプトスピライクテロヘモリジア（例えばＮＡＤＬ１１４０３株、米国獣医学試験研究所、アイオワ州Ａｍｅｓ所在）の不活性化全細胞調製物が含まれる。別法では、好ましい混合ワクチンには、ｐ６８／ＤＡ_２ＰＰ混合ワクチンの抗原成分ならびに５つのレプトスピラ種、すなわちレプトスピラブラティスラバ、レプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジア、およびレプトスピラポモナの不活性全細胞調製が含まれうる。そのような混合ワクチンは、本明細書では「ｐ６８／ＤＡ_２ＰＰレプトスピラ混合ワクチン」とも呼ばれ、好ましくは、上記弱毒化ウイルス株の凍結乾燥調製物（または噴霧乾燥もしくは脱水などの他の方法による調製物）およびウイルス調製物を、無菌食塩水中に溶解しているｐ６８抗原およびレプトスピラ抗原、ならびにＱｕｉｌ Ａおよびコレステロールのアジュバントから構成されている液体調製物で再水和させることによって調製される。

別法では、別の好ましい混合ワクチンに、ＤＡ_２ＰＰ混合ワクチンの抗原成分、ならびに５つのレプトスピラ種、すなわちレプトスピラブラティスラバ、レプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジア、およびレプトスピラポモナの不活性化全細胞調製物が含まれる。さらに別の好ましい混合ワクチンには、ＤＡ_２ＰＰ混合ワクチンの抗原成分、ならびに４つのレプトスピラ種、すなわちレプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジア、およびレプトスピラポモナの不活性化全細胞調製物が含まれる。そのような混合ワクチンは、本明細書では「ＤＡ_２ＰＰ−レプトスピラ混合ワクチン」とも呼ばれ、好ましくは、上記弱毒化ウイルス株の凍結乾燥調製物（または噴霧乾燥もしくは脱水などの他の方法による調製物）およびウイルス調製物を、無菌食塩水中に溶解しているレプトスピラ抗原、ならびにＱｕｉｌ Ａおよびコレステロールのアジュバントから構成されている液体調製物で再水和させることによって調製される。

本発明によれば、ｐ６８／ＤＡ_２ＰＰ、ｐ６８／ＤＡ_２ＰＰ−レプトスピラ、ＤＡ_２ＰＰ、およびＤＡ_２ＰＰ−レプトスピラ混合ワクチンを６週齢以上、または好ましくは８週齢以上の健康なイヌに、好ましくは２用量をそれぞれ約３週間の間隔をおいて投与することができる。少なくとも１２週齢のイヌに与える場合には、単一用量で十分でありうる。毎年単一用量でイヌを再度ワクチン接種できる。繁殖、寄宿および品評会などの状態にあって、気管支敗血症菌および／またはイヌウイルスに曝露している可能性が高い場合、これらの事態が生じてから１年以内、または好ましくは６カ月以内にもう一度追加免疫を与えることができる。別の好ましい混合ワクチンには、ＣＰＩの弱毒化株と併せたｐ６８抗原、好ましくは配列番号１を有する組換え体ｐ６８抗原が含まれる。

さらに別の好ましい混合ワクチンには、ｐ６８抗原、好ましくは配列番号１を有する組換え体ｐ６８抗原、ＣＰＩの弱毒化株、ならびにレプトスピラカニコーラ（例えばＣ−５１株、米国獣医学試験研究所、アイオワ州Ａｍｅｓ所在）、およびレプトスピライクテロヘモリジア（例えばＮＡＤＬ１１４０３株、米国獣医学試験研究所、アイオワ州Ａｍｅｓ所在）などの少なくとも２つのレプトスピラ種が含まれる。

本発明の混合ワクチン中のｐ６８抗原および他の１つまたは複数の病原体に由来する抗原の量は、免疫化に有効な量であるべきである。通常、混合ワクチン中のｐ６８抗原の量は、１用量あたり少なくとも約０．５μｇであるべきである。上記弱毒化ＣＤウイルスの量は、１用量あたり少なくとも約１０^２から約１０^９ＴＣＩＤ_５０（組織培養で感染を引き起こして５０％の細胞変性効果を有する用量）、好ましくは１用量あたり約１０^４から約１０^６ＴＣＩＤ_５０の範囲にあるべきである。弱毒化ＣＡＶ−２の量は、１用量あたり少なくとも約１０^２ＴＣＩＤ_５０から約１０^９ＴＣＩＤ_５０、好ましくは１用量あたり１０^４．０〜約１０^６．０ＴＣＩＤ_５０の範囲にあるべきである。弱毒化ＣＰＩウイルスの量は、１用量あたり少なくとも１０^２ＴＣＩＤ_５０から約１０^９ＴＣＩＤ_５０、好ましくは１用量あたり１０^６〜約１０^８ＴＣＩＤ_５０の範囲にあるべきである。弱毒化ＣＰＶの量は、１用量あたり少なくとも約１０^２ＴＣＩＤ_５０から約１０^９ＴＣＩＤ_５０、好ましくは１用量あたり１０^７〜約１０^９ＴＣＩＤ_５０の範囲にあるべきである。不活性化ウイルス調製物中のＣＣＶの量は、１用量あたり少なくとも約１００相対単位、好ましくは１用量あたり１０００〜４５００相対単位の範囲にあるべきである。ワクチン中の各レプトスピラ種は、ワクチン１用量あたり約１００〜３５００ＮＵ（濁度単位）の範囲、好ましくは１用量あたり２００〜２０００ＮＵの範囲にあるべきである。

上記混合ワクチンは、０．１ｍｌから５ｍｌ、好ましくは０．５ｍｌから２．５ｍｌの用量、そしてより好ましくは約１ｍｌの用量の注射によってイヌに投与できるように調剤される。

本発明を、以下の実施例によってさらに説明するが、実施例は本発明を制限するものではない。

（実施例１）
イヌボルデテラｐ６８組換え体抗原の用量漸増試験
ワクチン：
実験ワクチン抗原は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＬＷ６８によって産生された気管支敗血症菌組換え体ｐ６８外膜タンパク質（配列番号１）であった。このワクチンは、１ｍＬ用量中に、様々なレベルのＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）可溶化ｐ６８と、５０μｇのＱＡＣ（ＱｕｉｔＡ／５０μｇコレステロール）アジュバントとを含有していた。

攻撃物質：
気管支敗血症菌のイヌ単離株＃８５Ｂ、継代＃３、ロット＃０５１５９７のエアゾールを攻撃物質として用いた。プレート上の平均計数は、１．５９×１０^８ＣＦＵ／ｍｌであった。

動物：
６０匹のオスおよびメスの子イヌを、６つの治療群の１つに無作為に割り振った（１群あたり１０匹の子イヌ）。初回ワクチン接種の４１日前、および初回ワクチン接種の２８日前に再度、子イヌから採血し、気管スワブを採取し、いかなる血清陽性動物も、培養陽性動物も試験から排除した。

動物は、無作為化完備型設計に従って、無作為に治療および部屋に割り当てた。ワクチン接種後の観察は、ワクチン指定群に関する知識なしで行った。

設計：

手順：
ＩＶＰ投与：
０日目にプラセボまたは実験ワクチンのいずれかを動物に接種した。２回目のワクチン接種は２１日目に行った。初回ワクチン接種は右頸部皮下に行い、２回目のワクチン接種は左頸部皮下に行った。

攻撃投与：
２回目のワクチン接種の２８日後に、気管支敗血症菌のエアゾールで、すべての動物に攻撃を行った。攻撃後の２から１４日目（５１から６３日目）に、１日に２回３０分間（午前に１回および午後に１回）動物の咳嗽をモニターした。

観察および試料採集：
各ワクチン接種後の７日間（０から７日目および２１から２８日目）、および各ワクチン接種後の１４日目（１４および３５日目）に、すべての注射部位を触診し、３次元的に測定した。

ワクチン接種当日および各ワクチン接種後の３日間（０から３日目および２１から２４日目）に直腸温を記録した。

ワクチン接種当日（０および２１日目）ならびに４２、５０および６３日目に採血し、気管支敗血症菌から精製されたｐ６８タンパク質に対する特異的抗体に関して、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。４２、４９、５０、５２、５４、５６、および５８日目にも採血し、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）に関して分析した。

ワクチン接種前（供給業者において、４１日目および２８日目）および４９日目に、すべての動物で、気管支敗血症菌を単離するために気管スワブを採取し、気管支敗血症菌の凝集素価測定用に採血した。

ボルデテラＰ６８イヌ抗体およびマウス抗体の力価測定ＤＡＢ ＥＬＩＳＡ
精製された未変性のｐ６８を、０．０１Ｍホウ酸緩衝液で６００ｎｇ／ｍＬに希釈し、１００μｌ／ウェルを各ウェルに添加した。このプレートを４℃で終夜インキュベートした。その後、過剰量のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０でプレートを１回洗浄した。１％の無脂粉乳を含有するＰＢＳを２００μｌ／ウェル、プレートに添加した。その後、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。次いで、過剰量のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０でプレートを１回洗浄した。

ＥＬＩＳＡプレートの最上列に、１：５０希釈のイヌ血清またはマウス血清を添加し、プレートの最下部までずっと、２倍の段階希釈をした血清を添加した。このプレートを３７℃で１時間インキュベートした。続いて、過剰量のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０でプレートを３回洗浄した。

上記のイヌ血清と共にインキュベートしたプレートに、１：２０００希釈のペルオキシダーゼ標識ヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を１００μｌ／ウェル添加した。次いで、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。上記のマウス血清と共にインキュベートしたプレートに、１：４０００希釈のペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を１００μｌ／ウェル添加した。その後、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。次いで、過剰量のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０でプレートを３回洗浄した。

ＡＢＴＳ基質を１００μｌ／ウェル添加した。約２０分後に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製または同等なプレートリーダーを用いて、プレートを４０５〜４９０ｎｍで測定した。

データ分析：
イヌの咳嗽の数における治療による相違は、フィッシャーの正確確率検定を用いて試験した。５％の有意水準を用いた。

ＥＬＩＳＡ力価を対数変換し、その後、一般線型混合モデルを用いて分析した。治療による相違は、９５％の信頼水準を用いて評価した。攻撃の観察を、１日２回、それぞれ３０分間モニターした。

結果：
気管スワブ培養および凝集素価
この試験に登録された動物の気管支敗血症菌状態をモニターするために、気管スワブ培養および凝集素価の評価を行った。多数のイヌが様々な時点で力価の増大を示したが、攻撃前には、１２８を超える増大を示した力価はなかった。

注射部位の観察
初回ワクチン接種後の注射部位反応を表１に示す。最も大きい注射部位反応は、Ｔ０５（６４μｇ）のワクチン接種した動物で観測され、最も大きい平均注射部位反応でも、わずか１４．６９ｃｍ^３と測定された（ワクチン接種の２日後）。Ｔ０３（４μｇ）、Ｔ０４（１６μｇ）、およびＴ０６（２５６μｇ）のワクチン接種した動物は、ワクチン接種の最長７日後まで、様々な注射部位反応を示した。Ｔ０２（１μｇ）のワクチン接種した動物は、ワクチン接種後１日目に反応を示したのみであった。ワクチン接種後７日目までには、治療群相互における注射部位反応の、統計的に有意な差はなくなっていた。１４日目までに、すべての注射部位反応は消散していた。

２回目のワクチン接種後の注射部位反応を表２に示す。２回目のワクチン接種後の最も大きな平均注射部位反応は、Ｔ０６（２５６μｇ）のワクチン接種した動物で観測され、最も大きい平均注射部位反応は、５０．０３ｃｍ^３と測定された（ワクチン接種の１日後）。Ｔ０５（６４μｇ）およびＴ０４（１６μｇ）の動物は、２回目のワクチン接種後、最長７日目まで、注射部位反応を示した。Ｔ０３（４μｇ）およびＴ０２（１μｇ）動物は、ワクチン接種後、最長７日目まで、最小の注射部位反応を示した。Ｔ０２（１μｇ）とＴ０３（４μｇ）は、ワクチン接種後に、プラセボ群と統計的に相違していない注射部位反応を示した。２回目のワクチン接種後の１４日目には、注射部位反応が観測されなかった。

初回ワクチン接種後の注射部位反応の頻度を表３に示す。初回ワクチン接種後の任意な時点に反応を示した注射部位の最も高い総合的ＬＳＭ頻度は、７６％であって、Ｔ０６（２５６μｇ）のワクチン接種によって生じたものであった。次に、最も頻度が高かったものとしては、Ｔ０５（６４μｇ）で初回ワクチン接種を行った後の注射部位の７２％、Ｔ０４（１６μｇ）で初回ワクチン接種を行った後の６９％、そしてＴ０３（４μｇ）で初回ワクチン接種を行った後の６３％が反応を示した。Ｔ０２（１μｇ）で初回ワクチン接種を行った後の頻度が最も低かった（３８％）。

２回目のワクチン接種後の注射部位反応の頻度を表４に示す。各ワクチンの総合的ＬＳＭ頻度は、初回ワクチン接種後に見られたものと一貫したものであった。

ワクチン接種後の注射部位反応の発生頻度および持続時間を表５に要約する。初回および２回目のワクチン接種後の測定可能な注射部位反応の発生頻度（すなわち任意な時点に反応を示したイヌの数）は、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５、およびＴ０６（それぞれ４μｇ、１６μｇ、６４μｇ、および２５６μｇ）では１００％であった。ワクチン接種後の注射部位反応の発生頻度は、Ｔ０２（１μｇ）を投与した動物で最少であった（５７．１％）。

初回および２回目のワクチン接種後の反応の持続時間（反応を伴った日数の最少二乗平均として表５に示す）は、Ｔ０４、Ｔ０５、およびＴ０６（それぞれ１６μｇ、６４μｇ、および２５６μｇ）を用いてワクチン接種した動物のものが、他より長かった（初回ワクチン接種後には２．７から５．１日間、そして２回目のワクチン接種後には６．０から６．７日間）。Ｔ０２およびＴ０３（それぞれ１μｇおよび４μｇ）を用いてワクチン接種した動物は、初回および２回目のワクチン接種後に、注射部位反応を伴った日数が最も少なかった（初回ワクチン接種後には０．３および１．３日間、そして２回目のワクチン接種後には１．９および４．５日間）。

直腸温
直腸温の平均測定値を表６に要約する。Ｔ０２（１μｇ）における１および２４日目、Ｔ０３（４μｇ）における１、２１、および２４日目、Ｔ０４（１６μｇ）における２および２４日目、Ｔ０５（６４μｇ）における２３日目、ならびにＴ０６（２５６μｇ）における０、１、および２４日目のＬＳＭ直腸温は、プラセボと有意に相違していた。２３日目におけるすべての比較は、プラセボから統計的に有意に相違していなかった（Ｐ＞０．０５）。

ｐ６８ＥＬＩＳＡ血清学
ｐ６８ＥＬＩＳＡデータの要約を表７に示す。ワクチン接種前における、ｐ６８ＥＬＩＳＡ特異抗体の相乗平均ウイルス力価は、すべての群で低く（２４．９から２８．９の範囲）、プラセボの力価は、試験期間を通して低いままであった。初回ワクチン接種後の２１日間に、ワクチン接種治療群では、ｐ６８ＥＬＩＳＡ相乗平均力価が増大した（５５．２から４４１１．７の範囲）が、Ｔ０２（１μｇ）の力価はプラセボ（Ｔ０１）と統計的に相違していなかった。２回目のワクチン接種後の４２日間に、すべてのワクチン接種群で相乗平均力価がさらに増大し（６７４．６から４８３８２．０の範囲）、ワクチン接種に対する血清学的応答がよいことが実証された。

血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）血清学
ＳＡＡ力価を表８に要約する。攻撃前には、相乗平均ＳＡＡ力価はすべての治療群で低かった（０．１〜０．５の範囲）。攻撃後には、Ｔ０１ ＧＭＴ力価は１．５から１４６．０の範囲にあり、一方、ｐ６８治療群は０．３から２３．１の範囲にあった。５０、５２、５４、および５６日目では、すべての治療群がプラセボと統計的に相違していた。５２日目のＴ０２（１μｇ）を除いて、ｐ６８ワクチン相互ではいかなる統計的な相違点も示されなかった。５２日目のＴ０２は、他のすべてのｐ６８治療群と統計的に相違した相乗平均を示した。

攻撃反応
攻撃反応データを表９に示す。反応は、攻撃後における咳嗽をモニターすることによって測定し、２通りの方法、すなわち、咳嗽を伴った日数の最小二乗平均数および連続した２日間の咳嗽の数の最小二乗平均数（罹患率）を用いてこの観測を分析した。

咳嗽を伴った平均日数の分析によって、ｐ６８治療群相互では統計的に有意な差がないが、プラセボを接種したイヌは、平均８．６日間咳をし、一方、ｐ６８ワクチンを投与したイヌは、それより有意に少ない、平均２．２から４．７日間の範囲で咳をしたことが実証された。

罹患率を用いてイヌが評価した場合、すべてのＴ０１（プラセボ）は、２日間連続して咳をしている（罹患率１００％）のが観測された。Ｔ０４（１６μｇ）およびＴ０５（６４μｇ）を用いてワクチン接種したイヌは、それぞれ５５．６％および６６．７％の罹患率を示した。Ｔ０２（１μｇ）を用いてワクチン接種したイヌの２８．６％、Ｔ０３（４μｇ）を用いてワクチン接種したイヌの５０％、およびＴ０６（２５６μｇ）を用いてワクチン接種したイヌの３３．３％のみが、２日間連続して咳をしたことが観測された。

考察：
この試験の目的は、イヌにおける抗原用量、免疫応答および防御の間の相関関係を確立することであった。試験されたｐ６８抗原用量は、１μｇ、４μｇ、１６μｇ、６４μｇおよび２５６μｇであった。

注射部位反応測定値の分析は、２回目のワクチン接種後１日目のＴ０６（２５６μｇ）を除外して、ｐ６８治療群における反応が無視できるものであることを実証した。観測された反応は、小さい傾向にあり、通常、観測期間中に大きさが縮小した。これらの反応の大きさは、臨床的に取るに足りないものであり、剪毛していないイヌでは多くの場合目につかないであろう。

ワクチン接種後の直腸温は、すべての群のすべてのイヌにおいて、平凡なものであり、正常な限度内にあった。

ワクチン接種に対する血清学的応答は、Ｔ０３からＴ０６群まで極めて良好であった。これらの治療群は、２１日目から６３日目までのプラセボと比較して、すべてが、有意に高いｐ６８ＥＬＩＳＡ力価を示した。Ｔ０２（１μｇ）は、４２日目から６３日目までのＴ０１（プラセボ）と比較して有意なｐ６８ＥＬＩＳＡ力価を示した。最も高い力価は、Ｔ０５（６４μｇ）およびＴ０６（２５６μｇ）で観測された。

攻撃後におけるＳＡＡ反応試験は、ｐ６８ワクチン接種したイヌすべてで、対照のイヌと比較して、攻撃後のＳＡＡの上昇がはるかに小さいことを示した。５２日目のＴ０２（１μｇ）を除外して、ｐ６８ワクチン用量レベル相互では、攻撃後の相違がないことが実証された。５２日目のＴ０２（１μｇ）は、他のすべてのｐ６８治療群から統計的に相違した相乗平均を示した。

咳嗽を伴った日数の最小二乗平均（ＬＳＭ）または連続した２日間の咳嗽の数の最小二乗平均（罹患率）を用いて、攻撃後の咳嗽観測を分析した。咳嗽の日数のＬＳＭを用いて、プラセボ群と全ｐ６８ワクチン接種群との間の有意差は示されたが、異なるｐ６８ワクチン用量レベル相互の相違は示されなかった。罹患率を用いた場合、Ｔ０２（１μｇ）、Ｔ０３（４μｇ）、およびＴ０６（２５６μｇ）を用いてワクチン接種したイヌは、プラセボのものより有意に咳が少なかった。

結論：
この試験は、イヌにおける抗原用量、免疫応答および防御の間の相関関係を確立するために行われた。試験されたｐ６８抗原用量は、１μｇ、４μｇ、１６μｇ、６４μｇおよび２５６μｇであった。

最小の注射部位反応、正常な直腸温、およびワクチン接種に対する有害反応の欠如によって実証されたように、すべてのワクチンが安全であった。注射部位反応の大きさおよびこれらの反応の持続時間は、抗原性の低い治療群でより小さかった。ＥＬＩＳＡ力価によって測定された、ワクチン接種に対する血清学的応答は、抗原の用量がより高い群で極めて良好であり、より高い血清学的応答を示した。比較の方法として、咳嗽を伴う日数のＬＳＭを用いた場合、すべての治療群は、プラセボと比較して、咳嗽の有意な減少を示した。治療群相互では、いかなる相違も認められなかった。連続した２日間の咳嗽（すなわち罹患率）を比較に用いた場合、Ｔ０２（１μｇ）、Ｔ０３（４μｇ）、およびＴ０６（２５６μｇ）を用いてワクチン接種したイヌは、プラセボより有意に咳が少なかった。

（実施例２）
イヌボルデテラｐ６８免疫原性試験
動物
４５匹のオスおよびメスの雑種イヌを購入した。子イヌが試験地に到着した日に、すべての子イヌにＭＬＶパルボウイルスワクチンを接種した。実験に用いた製品を除いて、他のワクチンは、試験期間中に子イヌに投与しなかった。イヌは、約０日目（初回ワクチン接種の日）に約９週齢（±１週間）であった。

イヌは、攻撃前にボルデテラおよび他のイヌの病原体への曝露を防止するのに必要な隔離施設で管理した。ボルデテラを含むエアゾールで攻撃した後も、他のイヌの病原体への曝露を防止するために隔離を継続した。

ワクチン
治療群のＴ０１およびＴ０２では、無菌食塩水をプラセボワクチンとして用いた。治療群Ｔ０３およびＴ０４には、イヌ組換え体ｐ６８気管支敗血症菌ワクチンを用いた。ｐ６８抗原の構造遺伝子を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）にクローニングし、温度感受性プロモーターによって遺伝子の発現を調節した。細胞を溶解させ、遠心法によって封入体を分離した。封入体中の組換え体ｐ６８をＳＤＳ処理によって可溶化した。無菌食塩水を希釈剤として、その中で組換え体ｐ６８（１ｍＬあたり１５μｇ）を、１ｍＬあたり５０μｇのＱｕｉｌ Ａおよび５０μｇのコレステロールと混合した。各ｍＬ用量は、０．２８％のエタノールおよび０．０１％のチメロサールを含有していた。

抗原接種原
気管支敗血症菌Ｂｉｈｒ Ｃａｔ株は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ−Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙによって現在採用されている方法を用いて、抗原接種原として調製された。Ｂｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎｏｕ寒天プレートに、集密増殖の気管支敗血症菌Ｂｉｈｒ Ｃａｔ株を播種し、３７．５＋／−２．５℃で４８時間インキュベートした。病原性の第１相コロニーを選択し、Ｂｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎｏｕ寒天上に広げ、３７．５＋／−２．５℃で２４時間インキュベートした。インキュベーションの後に、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）食塩水を用いて寒天からコロニーを洗い出し、６００ｎｍにおける光学濃度が０．８０となるように抗原を希釈した。濁度測定値を確認するため、攻撃の前後に細胞の計数を行った。攻撃標的濃度は、約１×１０^９ＣＦＵであった。攻撃前の濃度は２．３７×１０^９ＣＦＵ（１００％第１相）、攻撃後の濃度計測値は１．３５×１０^９ＣＦＵ（１００％第１相）であった。

試験設計
要約表

無作為化／盲検化
ワクチン接種から攻撃の日までの期間、一般化ブロック設計に従って、動物を治療に割り当てた。治療は、無作為に部屋に割り当てた。攻撃の日に、動物は、ブロックによって無作為に攻撃部屋に割り当てた。

割り当てられた治療群に関する認識をもたない有資格の個人が微生物学アッセイおよび血清学アッセイ、注射部位の評価、直腸温の測定、ならびに咳嗽の観測を行った。

データ分析
ワクチン接種後反応の変数は、注射部位データ、直腸温、およびｐ６８ＥＬＩＳＡ力価からなっていた。注射部位データは、以下の事項、すなわち、１）治療および試験日別の、測定可能反応を有する動物の数、２）治療別の、動物が測定可能な反応を有する時点の数、３）治療別の、任意の時点で測定可能反応を有する動物の数に関して要約した。

初回および２回目のワクチン接種に関して別々に、注射部位容積（立方ｃｍ）、直腸温、および自然対数変換したｐ６８ＥＬＩＳＡ力価データを、一般線型混合モデルを用いて分析した。

各観測時点における治療群の相違を試験するため、ならびに各治療における時点の比較をするために、観測時点の最小二乗平均による、治療の先験的線型対比を構築した。すべての比較に、５％の有意水準を用いた。

攻撃後反応の変数は、毎日の咳嗽観測、ｐ６８ＥＬＩＳＡ力価、および血清アミロイドＡ力価からなっていた。攻撃後期間中の咳嗽の日数は、一般線型混合モデルを用いて分析した。

治療群の相違を試験するために、最小二乗平均による治療の先験的対比を構築した。すべての比較に、５％の有意水準を用いた。

初回および２回目のワクチン接種に関して別々に、フィッシャーの正確確率検定を用いて、２日間連続した咳の発生頻度に関して、治療群を比較した。すべての比較に、５％の有意水準を用いた。

攻撃後の血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）力価データは、力価の値に自然対数変換を適用し、その後、一般線型混合モデルを用いて分析した。

各観測時点における治療群の相違を試験するため、ならびに各治療における時点の比較をするために、観測時点の最小二乗平均による、治療の先験的線型対比を構築した。すべての比較に、５％の有意水準を用いた。

試験手順
詳細な動物操作手順
４５匹の血清陰性かつ培養陰性の子イヌを無作為に４つの治療群の１つに割り当てた。合計１５匹の対照イヌは、それぞれ８匹および７匹のイヌを、筋肉内（ＩＭ）または皮下（ＳＣ）対照群に割り当てた。ｐ６８ ＳＣ治療群に１５匹のイヌを割り当て、ｐ６８ ＩＭ治療群に１５匹のイヌを割り当てた。治療群に関しては、上記の試験設計の項に詳述してある。

初回ワクチン接種の日を０日目とした。ワクチン接種は、０日目に行い、２１日後に再度行った。初回ワクチン接種には、頸部の右側を用い、２回目のワクチン接種には、頸部の左側を用いた。それぞれ左右の半膜様筋に筋肉内注射して、初回および２回目のワクチン接種を行った。各ワクチン接種後の７日間、すべての注射部位を３次元的に測定し、ワクチン接種後の１４日間、追跡測定を行った。ワクチン接種当日（ワクチン接種前）および各ワクチン接種後の３日間、直腸温をモニターした。

３５日目に、すべての動物から、気管支敗血症菌培養用に気管スワブを採取し、かつ凝集素価測定用に採血した。すべての動物が、気管スワブに関して陰性であり、ボルデテラに対して血清学的に陰性であり、かつ攻撃に好適であると考えられた。

２回目のワクチン接種の２４日後である４５日目に、すべてのイヌに、気管支敗血症菌のエアゾール攻撃を行った。鎮静剤を投与したイヌに、使い捨てノーズコーンを用いて攻撃を行った。ノーズコーンは、鎮静剤を投与したイヌの鼻口部の上にぴったりと装着された。ノーズコーンは噴霧器に接続され、噴霧器は、５．５から６．０ｐｓｉに設定された真空圧力ポンプに接続されていた。１ｍＬの攻撃物質を噴霧器に入れ、それぞれのイヌにエアロゾル化された攻撃物質を４分間投与した。観測を行った人員は、治療群の割り当てを認知していなかった。

攻撃後の１４日間（４６〜５９日目）、動物の咳嗽をモニターした。毎日ほぼ同時刻に２回、午前に１回、午後に１回、約３０分間観測を行い、結果を記録した。

血液採集
凝集素価測定用の血液は、初回ワクチン接種前および攻撃前に採集した。抗ｐ６８ＥＬＩＳＡ評価用の血液は、０および２１日目のワクチン接種の前、ならびに３５、４５、および５９日目に採集した。血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）アッセイ用の血液は、攻撃当日（４５日目）、ならびに４６、４８、５０、５２、および５４日目に採集した。

試料で実施した試験
気管スワブに気管支敗血症菌が存在するかどうか、培養によって評価した。各気管スワブを、ボルデテラ選択寒天プレート上に広げた。陽性対照および陰性対照が含まれていた。それらのプレートを３７．５±２．５℃で４８±４時間インキュベートした。その結果各プレート上に得られたコロニーを陽性対照と比較し、陽性対照と同じに見えたすべてのコロニーを、気管支敗血症菌の存在を確認するためにさらに試験した。確認試験には、ＴＳＩ培地、クエン酸培地、尿素寒天培地、および硝酸レッド培地の使用が含まれていた。

凝集素価、ｐ６８ＥＬＩＳＡ分析またはＳＡＡ分析に関して、以下の方法を用いて血清を評価した。

凝集素価−ボルデテラ食塩水を用い、マイクロタイタープレート中で血清を連続希釈した。各プレートには陽性対照および陰性対照が含まれていた。気管支敗血症菌株８７（Ｂｏｒｄｅｔ Ｇｅｎｏｕ寒天上で培養され、採集および不活性化され、６３０ｎｍで２０％ Ｔとなるように希釈された）を凝集性抗原として使用し、各ウェルに添加した。プレートを振盪させながら３５±２℃で２時間インキュベートした。２２時間、室温で２回目のインキュベーションをした後、プレートの測定を行った。５０％の凝集を示す最終のウェルを用いて、エンドポイント力価を測定した。

ｐ６８ＥＬＩＳＡ力価−ボルデテラｐ６８抗原に特異的なポリクローナル抗血清でコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレート表面に、組換え体ｐ６８抗原を捕捉した。そのプレートに、イヌ血清の連続二倍希釈を添加し、インキュベートした。各プレートには、１：１０００希釈の陽性対照および陰性対照が含まれていた。ｐ６８抗原に特異的な抗体を検出するために、アフィニティー精製されたペルオキシダーゼ標識ヤギ抗イヌＩｇＧ指示体結合体を用いた。次いで、発色基質であるＡＢＴＳを添加し、陽性対照ウェルのＯ．Ｄ．が１．２＋０．２になったときにプレートの測定を行った。所与の試料の力価は、光学濃度が陰性対照血清希釈の平均に５つの標準偏差を加えた値より大きい最終希釈の逆数として計算した。

ＳＡＡ力価−イヌの血清アミロイドＡ力価は、Ａｃｃｕｐｌｅｘ社（米国ＮＥ６８１９８、Ｏｍａｈａ所在ネブラスカ大学医学センター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｂｒａｓｋａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ））から購入したキットを用いて評価した。簡潔には、モノクローナル抗イヌＳＡＡ抗体でコーティングされたマイクロタイタープレート表面にイヌＳＡＡを捕捉した。そのプレートに、イヌ血清の希釈試料を添加し、それに続いて、ビオチン標識された抗イヌ抗体結合体を添加した。インキュベーションの後、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン発色基質を添加した。そのプレートを３０分後に測定した。

結果
直腸温
直腸温測定値の要約を表１０および１１に示す。

初回ワクチン接種後のいかなる日にも、いずれの群の間にも有意な差は認められなかった。２１日目において、食塩水を投与したイヌと、ｐ６８ワクチン接種したすべてのイヌとの間で有意な差が認められた（Ｔ０１Ｔ０２対Ｔ０３Ｔ０４ではｐ＝０．００５３）。２４日目に、ｐ６８ ＳＣワクチン接種と、ＩＭワクチン接種との間における有意な差（ｐ＝０．０１２４）が実証された。

注射部位反応
注射部位反応を表１２および１３に要約する。技術的な見落としのため、２回目のワクチン接種後１４日目（３５日目）の注射部位観測が行われなかった。

測定可能な注射部位反応がＴ０３（ｐ６８ ＳＣ）で観測されたが、大きさは最小であった。小さな注射部位反応が３日目にＴ０４（ｐ６８ ＩＭ）の１頭のイヌで認められたが、この測定の影響は最小のものであり、その群の全体的平均には反映されていない。

注射部位の測定値における有意な差を表１４に要約する。Ｔ０２（食塩水ＳＣ）対Ｔ０３（ｐ６８ １５μｇ ＳＣ）の間での注射部位測定値の有意な差が、初回ワクチン接種後の６日間に認められた。７日目まで、そして再び１４日目（２週間の再評価観測）には、いかなる治療群の間でも、いかなる相違も認められなかった。

Ｔ０２（食塩水ＳＣ）対Ｔ０３（ｐ６８ １５μｇ ＳＣ）の間での注射部位測定値の有意な差が、２回目のワクチン接種後の７日間に認められた。

ｐ６８ＥＬＩＳＡ力価
ｐ６８ＥＬＩＳＡデータを表１５および図１に要約する。ワクチン接種したイヌにおけるｐ６８に対する力価反応が大きかったため、この試験中の異なった時点で様々な滴定最小値を用いた。０および２１日目の滴定は、５０から開始した。３５、４５、および５９日目の滴定は、２００から開始した。「未満」と報告されているいかなる値も分析前に２で割られた。対照群（Ｔ０１およびＴ０２）で試験の進行中に観測されたｐ６８ＥＬＩＳＡ値の増分増加は、これらの最小滴定値によるものである。凝集素価は＜４に保たれた。

ｐ６８を用いてワクチン接種したすべての動物は、ワクチン接種の１日目から攻撃の当日まで（０日目対４５日目）に、プラセボワクチン接種の動物と比較して少なくとも４倍の力価の増大を示した。

ワクチン接種後および攻撃後のＥＬＩＳＡ力価の最小二乗平均における有意な差を表１６に示す。ワクチン接種が完了した後では、ワクチン接種したｐ６８ ＳＣワクチン接種の動物とｐ６８ ＩＭワクチン接種の動物との間に有意な差は認められなかった。

血清アミロイドＡ力価
ＳＡＡ値は、攻撃後０、１、３、５、７、および９日目に測定した。血清アミロイドＡの値を表１７に示し、そして図２に表した。

ＳＡＡ力価における有意な差を表１８に要約する。食塩水対照は、攻撃後の１、３、および５日目に、ワクチン接種したイヌより高いＳＡＡ力価を示した。食塩水ＳＣ対照は、ワクチン接種したＳＣのイヌと比較して有意に高いＳＡＡ力価を、攻撃後の７および９日目に示し続けた。

咳嗽観察
すべての治療群におけるエアゾール攻撃は２回目のワクチン接種後の２４日目（４５日目）に行った。咳嗽観察は、２つの方法、すなわち連続した２日間の咳嗽に基づく疾患状態（表１９に示す）と、咳を伴った日数のパーセンテージ（表２０および２１に示す）とを用いて試験した。連続した２日間の咳嗽を規準に用いてイヌが評価した際には、ｐ６８ワクチン接種したイヌ（ＳＣとＩＭ）は、それらの８０％が少なくとも２日間連続して咳をしたが、食塩水ＳＣおよび食塩水ＩＭを投与したイヌは、それぞれそれらの１００％および８７．５％が咳をした。咳嗽が観測された日数のパーセンテージを用いてイヌを評価した際には、ｐ６８ＳＣワクチン接種およびＩＭワクチン接種したイヌは、観測した日数のそれぞれ３８．７２％および４１．０５％で咳をした。食塩水ＳＣワクチン接種および食塩水ＩＭワクチン接種のイヌでは、それぞれ６９．０４％および６２．６６％で咳をした。

疾病状態を連続した２日間の咳嗽に基づくものとした場合、食塩水をワクチン接種したイヌと、ｐ６８ワクチン接種したイヌとの間で有意な差は示されなかった。

Ｔ０２（食塩水ＳＣ）とＴ０３（ｐ６８ １５μｇＳＣ）との間で有意な差（ｐ＝０．０１１２）が示された。Ｔ０１（食塩水ＩＭ）とＴ０４（ｐ６８ １５μｇＩＭ）との間では有意な差が示されなかった。

食塩水対照とｐ６８ワクチン接種したイヌとの間で有意な差（ｐ＝０．００２２）が示された。

考察
この試験は、イヌｐ６８ボルデテラ１５μｇ／用量ワクチンの安全性および有効性を実証するために設計された。

安全性は、注射部位および直腸温の観測を用いて試験した。注射部位反応測定値の分析は、ＩＭワクチン接種した群における反応が無視できるものであり、ＳＣワクチン接種した群における反応が最小のものであることを実証した。観測された反応は、小さい傾向にあり、通常、観測期間中に大きさ縮小した。これらの反応の大きさは、剪毛していないイヌでは多くの場合目につかないであろう。２１日目における食塩水とワクチン接種との間、ならびに２４日目におけるＩＭワクチン接種と、ＳＣワクチン接種との間で有意な差が観測されたが、直腸温は、すべての群におけるすべてのイヌで臨床的に平凡なものであり、かつ正常な限度内にあった。

有効性は、ｐ６８ＥＬＩＳＡエンドポイント力価測定値および咳嗽の観測を用いて試験した。投与経路にかかわらず、ｐ６８ワクチン接種群は、３５日目までに良好なｐ６８抗体反応を示した。ワクチン接種したものでは、攻撃後に良好な既往反応が観測された。伝統的には、ＳＣ経路と比較して、血管がより多く、脂肪がより少ないＩＭ経路でより高い抗体反応が得られているが、試験全体を通して、ｐ６８ ＳＣワクチン接種とＩＭワクチン接種との間には有意な差がなかった。

ｐ６８ボルデテラワクチン接種したイヌ、およびワクチン接種していないイヌにおける、攻撃後のＳＡＡ反応の試験は、ワクチン接種した動物群、特に攻撃後の１、３、および５日目におけるＳＡＡ値の上昇がはるかに小さいことを示した。

結論
この試験では、イヌの攻撃モデルを用いて、ワクチン接種の２４日後における、１５μｇ／用量のｐ６８ボルデテライヌワクチンの有効性を試験した。このワクチンは、正常な直腸温および最小の注射部位反応によって安全であったことが実証され、有効性はＩＭ群およびＳＣ群の両方で実証された。ＳＡＡ値の比較は、エアゾール攻撃後の１、３、および５日目に、ｐ６８ワクチン接種したイヌと食塩水ワクチン接種したイヌとの間で有意な差があることを実証した。

（実施例３）
ボルデテラｐ６８イヌワクチンの６カ月間にわたる免疫試験
動物
９０匹のオスおよびメスの雑種イヌを購入した。子イヌの大部分は、初回ワクチン接種の日に９週齢（±１週齢）であった。

試験地に到着した際に、ＭＬＶパルボウイルスワクチンをイヌに投与した。試験に好適であるか判定するため、気管スワブおよび凝集素価によって、動物が気管支敗血症菌に対して陰性であるかどうか判定した。実験に用いた製品を除いて、他のワクチンは、試験期間中に投与しなかった。

イヌは、攻撃前に気管支敗血症菌およびイヌの病原体への曝露を防止するのに必要な隔離施設で管理した。気管支敗血症菌を含むエアゾールで攻撃した後も、他のイヌの病原体への曝露を防止するために隔離を継続した。

ワクチン
治療群のＴ０１およびＴ０２では、無菌食塩水をプラセボワクチンとして用いた。治療群Ｔ０３およびＴ０４には、イヌ組換え体ｐ６８気管支敗血症菌ワクチンを用いた。ｐ６８抗原の構造遺伝子を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）にクローニングし、温度感受性プロモーターによって遺伝子の発現を調節した。細胞を溶解させ、遠心法によって封入体を分離した。封入体中の組換え体ｐ６８をＳＤＳ処理によって可溶化した。無菌Ｌｅｐｔｏ食塩水を希釈剤として、１５μｇのｐ６８および６０μｇのｐ６８を別々に、１ｍＬあたり５０μｇのＱｕｉｌ Ａおよび５０μｇのコレステロールと併せた。併せた成分を、４℃で２４時間混合し、ミクロフルイダイザー中を３回通過させた。各１ｍＬ用量あたり２．７μｌのエタノールと、０．０００１％チメロサールとを含有していた。実験ワクチン中のｐ６８濃度は、ｐ６８ＥＬＩＳＡによって測定した。すべてのアッセイを５つに複製して行った。すべてのワクチンは構築後６カ月以内に用いた。

攻撃種菌
Ｂｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎｏｕ寒天プレートに気管支敗血症菌Ｂｉｈｒ Ｃａｔ株を播種し、３７．５＋／−２．５℃で４８時間インキュベートした。病原性の第１相コロニーを選択し、Ｂｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎｏｕ寒天上に広げ、３７．５＋／−２．５℃で２４時間インキュベートした。インキュベーションの後に、ボルデテラ食塩水を用いて寒天からコロニーを洗い出し、６００ｎｍにおける光学濃度が０．８０となるように細胞を希釈した。濁度測定値を確認するため、攻撃の前後に細胞の計数を行った。攻撃標的濃度は、約１×１０^９ＣＦＵであった。群Ｉでは、攻撃前の濃度計測値が１．９４×１０^９であり、攻撃後の濃度計測値が１．４３×１０^９であった。群ＩＩでは、攻撃前の濃度計測値が２．５５×１０^９であり、攻撃後の濃度計測値が２．１３×１０^９であった。

試験設計
要約表

試験は、群Ｉの４８匹のイヌと、群ＩＩの４２匹のイヌとからなる２つの相もしくは群において行った。ワクチン接種＃１は０日目に各群で行った。ワクチン接種＃２は、その２０日後に行った。群Ｉにおけるイベントは群ＩＩにおけるイベントから約１５日ずらして並置した。最終のワクチン接種の１８１日後に、イヌを気管支敗血症菌にエアゾール攻撃させた。

無作為化／盲検化
動物は、完全無作為化設計に従って、無作為に治療および部屋に割り当てた。

各試験群の中で、ワクチン接種＃１から攻撃の日までの期間、無作為化計画を用いて、動物を無作為に治療および部屋（１部屋あたり３から５匹のイヌ）に割り当てた。

攻撃の日に、一般化ブロック設計を用いて、事前に処置した動物を試験群の中で無作為に攻撃部屋に割り当てた。

割り当てられた治療群に関する認識をもたない有資格の個人が、微生物学アッセイおよび血清学アッセイ、ならびに注射部位および咳嗽の評価を行った。

データ分析
ワクチン接種後反応の変数は、注射部位データ、直腸温、およびｐ６８ＥＬＩＳＡ力価からなっていた。注射部位データは、以下の通り要約した。すなわち、１）治療および試験日別の、測定可能な反応を有する動物の数、２）治療別の、動物が測定可能な反応を有する時点の数、３）治療別の、任意の時点で測定可能な反応を有する動物の数、ならびに４）各動物における測定可能な反応の持続時間である。

初回および２回目のワクチン接種に関して別々に、注射部位容積（立方ｃｍ）、直腸温、自然対数変換したｐ６８ＥＬＩＳＡ力価データを、一般線型混合モデルを用いて分析した。

各観測時点における治療群の相違を試験するため、ならびに各治療における時点の比較をするために、観測時点の最小二乗平均による、治療の先験的線型対比を構築した。対象とする特定の比較は、Ｔ０１対Ｔ０３、Ｔ０１対Ｔ０５、Ｔ０３対Ｔ０５、Ｔ０２対Ｔ０４、Ｔ０２対Ｔ０６、およびＴ０４対Ｔ０６であった。時点に関する対試験群、対治療相関関係がＰ＜０．０５で有意である場合には、各時点における治療群相互の対比および治療群中の時点相互の対比は、各試験群内部のものであり、そうでない場合、これらの対比は、治療対時点の相互作用効果の最小二乗平均に基づいたものであった。すべての比較に、５％の有意水準を用いた。

攻撃後反応の変数は、ｐ６８ＥＬＩＳＡ力価、血清アミロイド力価、および毎日の咳嗽観察からなっていた。攻撃後のｐ６８ＥＬＩＳＡ力価は、前述の通りに分析した。攻撃後の血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）力価データは、力価の値に自然対数変換を適用し、その後、一般線型混合モデルを用いて分析した。

咳嗽の分析は、ＵＳＤＡ規定を反映するように修正した。それぞれのイヌについて、咳が観察された期間のパーセンテージを計算した。分析前に、逆正弦平方根変換を用いて、パーセンテージを変換した。咳嗽の分析には一般線型混合モデルを用いた。

この分析の最小二乗平均をパーセンテージに逆変換し、咳のパーセント減少を下式に従って計算した。
パーセント減少＝１００×（対照群平均−治療群平均）／（対照群平均）

治療群の相違を試験するために、最小二乗平均による治療の先験的線型対比を構築した。対象とする特定の比較は、Ｔ０１対Ｔ０３、Ｔ０１対Ｔ０５、Ｔ０３対Ｔ０５、Ｔ０２対Ｔ０４、Ｔ０２対Ｔ０６、およびＴ０４対Ｔ０６であった。治療に関する対試験群相関関係がＰ＜０．０５で有意である場合には、治療群相互の対比は、各試験群内部のものであり、そうでない場合、治療群相互の対比は、治療を主とする効果の最小二乗平均に基づいたものであった。すべての比較に、５％の有意水準を用いた。

試験手順
詳細な動物操作手順
試験地に到着する前であり、かつ初回ワクチン接種の前に、子イヌから、気管支敗血症菌培養用に気管スワブを採取し、凝集素価測定用に採血した。すべての動物が、気管スワブに関して陰性であり、ボルデテラに対して血清学的に陰性であり、かつこの試験に好適であると考えられた。群Ｉ用に、４８匹の子イヌを、６つの治療群の１つに無作為に割り当てた。群ＩＩ用に４２匹のイヌを用いて、この操作手順を繰り返した。動物は、試験地に少なくとも５日間順応させた。

群および治療については、セクション７．４．Ａに詳述されている。設備上の制約によって、そして攻撃後の咳嗽観測の精度を向上させるために、ワクチン接種およびそれぞれの攻撃期間を１５日間ずらして、２つのイヌの群をつくった。０日目は、群Ｉおよび群ＩＩの両方に関して、ワクチン接種＃１の日を指す。ワクチン接種＃２はその２０日後に行った。治療Ｔ０１、Ｔ０３、およびＴ０５は、皮下経路で行った。治療Ｔ０２、Ｔ０４、およびＴ０６は筋肉内経路で行った。皮下注射は、頸部の側背面に行った。ワクチン接種＃１には、頸部の右側を用い、ワクチン接種＃２には、頸部の左側を用いた。それぞれ左右の半膜様筋に筋肉内注射して、ワクチン接種＃１および＃２を行った。各ワクチン接種後の７日間、すべての注射部位を３次元的に測定し、ワクチン接種後の１４日間、追跡測定を行った。ワクチン接種当日（ワクチン接種前）および各ワクチン接種後の３日間、直腸温をモニターした。ｐ６８のＥＬＩＳＡ力価測定用に、各ワクチン接種の前（−１日目および１９日目）および５０日目に採血した。

気管支敗血症菌の陰性状態を確認するために、毎月、鎮静剤投与下に、気管支敗血症菌培養用の気管スワブをすべてのイヌから採取した。凝集およびＥＬＩＳＡ力価用にも採血した。攻撃の７日前に、各群についてこの操作手順を繰り返した。気管スワブ培養が陽性であるか、あるいは凝集素価が上昇している証跡のある動物は試験から除外した。

ワクチン接種＃２の１８１日後に、イヌに攻撃を行った。鎮静剤を投与したイヌに、使い捨てノーズコーンを用いて攻撃を行った。ノーズコーンは、鎮静剤を投与したイヌの鼻口部の上にぴったりと装着された。ノーズコーンは噴霧器に接続され、噴霧器は、５．５から６．０ｐｓｉに設定された真空圧力ポンプに接続されていた。１ｍＬの攻撃物質を噴霧器に入れ、それぞれのイヌにエアロゾル化された攻撃物質を４分間投与した。

攻撃咳後観測は、攻撃前にＵＳＤＡ推奨に従うように修正した。攻撃後３日目から１０日目までの間、合計８日間、各群のイヌを観察した。１日２回、それぞれの観察時間に約４５分間、咳嗽について動物を観察した。観測時間相互の間隔は約１２時間であった。割り当てられた治療群に関する認識をもたない人員が咳嗽観測を記録した。

血液採集
凝集素価測定用の血液は、各群について、初回ワクチン接種前、毎月、そして攻撃前に採集した。

抗ｐ６６ＥＬＩＳＡ評価用の血液は、ワクチン接種＃１および＃２の前日、５０日目、ならびにその後約３０日おきに各群について、採集した。攻撃の日および攻撃後観察の最終日にも採血した。

血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）アッセイ用の血液は、各群について、攻撃の当日（攻撃の前）ならびに攻撃後の１、３、５、７、および９日目に採取した。

試料で実施した試験
気管スワブに気管支敗血症菌が存在するかどうか、培養によって評価した。各気管スワブを、ボルデテラ選択寒天プレート上に広げた。陽性対照および陰性対照が含まれている。それらのプレートを３７．５±２．５℃で４８±４時間インキュベートした。その結果各プレート上に得られたコロニーを陽性対照と比較し、陽性対照と同じに見えたすべてのコロニーを、気管支敗血症菌の存在を確認するためにさらに試験した。確認試験には、ＴＳＩ培地、クエン酸培地、尿素寒天培地、および硝酸レッド培地の使用が含まれていた。

血清は、以下の方法を用いて、凝集素価、ｐ６８ＥＬＩＳＡ分析またはＳＡＡ分析について評価した。

凝集素価−ボルデテラ食塩水を用い、マイクロタイタープレート中で血清を連続希釈した。各プレートには陽性対照および陰性対照が含まれていた。気管支敗血症菌株８７（Ｂｏｒｄｅｔ Ｇｅｎｏｕ寒天上で培養され、採集および不活性化され、６３０ｎｍで２０％Ｔとなるように希釈された）を凝集性抗原として使用し、各ウェルに添加した。プレートを振盪させながら３５±２℃で２時間インキュベートした。２２時間、室温で２回目のインキュベーションをした後、プレートの測定を行った。５０％の凝集を示す最終のウェルを用いて、エンドポイント力価を測定した。

ｐ６８ＥＬＩＳＡ力価−ボルデテラｐ６８抗原に特異的なポリクローナル抗血清でコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレート表面に、組換え体ｐ６８抗原を捕捉した。そのプレートに、イヌ血清の連続２倍希釈を添加し、インキュベートした。各プレートには、１：１０００希釈の陽性対照および陰性対照が含まれていた。ｒｐ６８抗原に特異的な抗体を検出するために、アフィニティー精製されたペルオキシダーゼ標識ヤギ抗イヌＩｇＧ指示体結合体を用いた。次いで、発色基質であるＡＢＴＳを添加し、陽性対照ウェルのＯ．Ｄ．が１．２±０．２になったときにプレートの測定を行った。所与の試料の力価は、光学濃度が陰性対照血清希釈の平均に５つの標準偏差を加えた値より大きい最終希釈の逆数として計算した。

ＳＡＡ力価−イヌ血清アミロイドＡを、モノクローナル抗イヌＳＡＡ抗体でコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレート表面に捕捉した。そのプレートにイヌ血清の希釈試料を添加し、インキュベートした。０．３１ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌまでの標準曲線が得られように、参照標準を添加した。ビオチン標識抗イヌ抗体結合体を添加した。ビオチン標識抗イヌ抗体のインキュベーションの後、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを添加した。色素基質であるＴＭＢを添加し、そのプレートを３０分後に測定した。血清アミロイドＡの濃度は、試料を標準曲線と比較し、適当な希釈係数をかけることよって決定した。

結果
別段の記述がない限り、結果は、群Ｉおよび群ＩＩから得られたものを結合したデータである。

気管スワブ培養および凝集素価
試験の過程で１１匹のイヌが陽性の気管スワブ培養および／または凝集素価の上昇を示した。これらのイヌ、および陽性のイヌと共に収容されたすべてイヌを試験から除去し、その結果２０匹のイヌを失った。各群から除去されたイヌの数は、Ｔ０１−４匹、Ｔ０２−２匹、Ｔ０３−３匹、Ｔ０４−１匹、Ｔ０５−５匹、Ｔ０６−５匹であった。

注射部位の観察
表２２〜２５に注射部位反応を要約する。２１日目、群Ｉ、イヌ８１５９５の注射部位情報は、技術的見落としのため収集されなかった。２２日目における群ＩＩのイヌの注射部位反応データを収集しないように、プロトコールが修正され、そのため、２２日目からのデータの要約には、群Ｉにおける１治療群あたり８匹のイヌから得られた情報のみが含まれている。ＩＭ治療を受けたいずれのイヌでも注射部位反応は観測されなかった。注射部位の測定値は、両方のＳＣワクチン接種治療群（Ｔ０３およびＴ０５）で最小であった。

注射部位測定値の有意な差を表２６に要約する。Ｔ０１（食塩水ＳＣ）対Ｔ０３（６０μｇ ＳＣ）の間での注射部位測定値の有意な差が、初回ワクチン接種後の７日間に認められた。Ｔ０１（食塩水ＳＣ）およびＴ０５（１５μｇ ＳＣ）との間の有意な差が、初回ワクチン接種後の最初の４日間のみで認められた。３から７日目まで通して、Ｔ０３（６０μｇ ＳＣ）およびＴ０５（１５μｇ ＳＣ）との間の有意な差が見出された。１４日目（２週間の再評価観測）まで、いずれの治療群の間でも、いかなる相違も認められなかった。

Ｔ０１（食塩水ＳＣ）対Ｔ０３（６０μｇ ＳＣ）およびＴ０５（１５μｇ ＳＣ）の間での注射部位測定値の有意な差（Ｐ＝０．０１３８）が、２回目のワクチン接種後の７日間に認められた。２３から２７日目まで通して、Ｔ０３（６０μｇ ＳＣ）およびＴ０５（１５μｇ ＳＣ）との間で有意な差が見出された。３４日目（２週間の再評価観測）まで、いずれの群の間でも、いかなる相違の認められなかった。

直腸温
直腸温の測定値を表２７および２８に要約する。２２日目における群ＩＩのイヌの直腸温データを収集しないように、プロトコールが修正され、そのため、２２日目からのデータの要約には、群Ｉにおける１治療群あたりのイヌから得られた情報のみが含まれている。

初回ワクチン接種後の１日目に、Ｔ０２（食塩水ＩＭ）とＴ０４（６０μｇのＩＭ）との間の直腸温に有意な差が認められた。２回目のワクチン接種後のいかなる日にも、いずれの群も間でも、直腸温に有意な差が見出されなかった。

ｐ６８ＥＬＩＳＡ力価
攻撃前のｐ６８ＥＬＩＳＡデータを表２９に要約する。１９日目、Ｔ０６における群Ｉのイヌの反応により、ｐ６８ＥＬＩＳＡ力価のデータ分析に群による効果が観測された。この効果は小さく、分析された他の時点に影響を与えなかった。したがって、報告の便宜のため、群Ｉおよび群ＩＩからのデータが結合されている。

ワクチン接種したイヌにおけるｐ６８に対する力価反応が大きかったため、この試験中の異なった時点で様々な滴定最小値を用いた。１および１９日目の滴定は、５０から開始した。５０から１９５日目までの滴定は２００から開始した。２０１および２１１日目に採集された試料の滴定は１０００から開始した。「未満」と報告されているいかなる値も分析前に２で割られた。対照群（Ｔ０１およびＴ０２）で試験の進行中に観測されたｐ６８ＥＬＩＳＡ値の増分増加は、これらの最小滴定値によるものである。上述したものを除いて、凝集素価は＜４に保たれていた。

プラセボワクチン接種したすべてのイヌは、５０日目のｐ６８力価が＜２００であった。ｐ６８を用いてワクチン接種したすべての動物は、２回目のワクチン接種の後（０日目対５０日目）に、プラセボワクチン接種した動物と比較して少なくとも４倍の力価の増大を示した。

ワクチン接種後のＥＬＩＳＡ力価の最小二乗平均における有意な差を表３０に示す。ワクチン接種前（１日目）には、ＳＣ対照とＳＣワクチン接種との間またはＩＭ対照とＩＭ予ワクチン接種との間で、ｐ６８ＥＬＩＳＡ力価の有意な差は観測されなかった。

試験過程において測定されたｐ６８ＥＬＩＳＡ力価を表３１に要約し、図３に図示する。

試験の経過中、群Ｉと群ＩＩとの間の活動を協調させるためにあらゆる努力を行った。重要なデータ採取時点（すなわち、ワクチン接種および攻撃前後のイベント）に関しては、これを実現した。試験の合間に、３つの事例で、血液および気管スワブの採集が群相互で１または２日間異なった。この合間のｐ６８ＥＬＩＳＡデータを要約し、報告するために、これらの日のデータを併せた。したがって、７９日目は、７９日目（群Ｉ）および８１日目（群ＩＩ）からの混合データを含有し、１１１日目は１１０日目（群ＩＩ）および１１１日目（群Ｉ）に対応し、１６９日目は１６９日目（群ＩＩ）および１７０日目（群Ｉ）に対応している。プロトコールに従って、５０日目以降にはｐ６８ＥＬＩＳＡデータのデータ分析を行わなかった。

咳嗽観察
両群のエアゾール攻撃は、２回目のワクチン接種後の１８１日目に行った。ＵＳＤＡ推奨に従うために、咳嗽判定規準を、攻撃後の３から８日目における約１２時間離れた約４５分の観察に修正した。咳嗽観察を表３２および３３に要約する。

食塩水対照に比較して、咳嗽のパーセント減少は、１５μｇ／用量群で５１．５５％、６０μｇ／用量群で１１．０９％であった。統計的に有意な差を表３４に要約する。

血清アミロイドＡ
ＳＡＡ値は、攻撃後の０、１、３、５、７、および９日目に測定した。血清アミロイドＡの値を表３５に示し、そして図４に表した。

ＳＡＡ力価における有意な差を表３６に要約する。

考察
この試験は、組換え体ｐ６８ボルデテライヌワクチンの安全性および６カ月の有効性を実証するために設計された。１５μｇ／用量および６０μｇ／用量ワクチンの両方の安全が実証された。この試験において、１５μｇ／用量の有効性および６カ月の期間にわたる免疫が強く支持された。

安全性は、注射部位および直腸温の観測を用いて試験した。注射部位反応測定値の分析は、ＩＭワクチン接種群で反応がないこと、ならびに１５μｇ／用量および６０μｇ／用量のＳＣワクチン接種群両方で反応が最小であることを実証した。観測された反応は、１５μｇ／用量のＳＣワクチン接種したイヌの方が小さい傾向にあった。そのような観察された反応は一過性のものであって、通常、１４日以内に消散した。注射部位が剪毛されていないイヌでは、これらの反応の大きさは、気付かれないことが多いであろう。ワクチン接種後の直腸温は、すべての群のすべてのイヌにおいて、際立ったものではなく、正常な限度内にあった。

咳嗽観察およびｐ６８ＥＬＩＳＡエンドポイント力価の測定を用いて、免疫の有効性および持続時間をワクチン接種から１８１日間試験した。食塩水対照における咳嗽のパーセンテージ（７８．２６％）は、試験動物に行われた攻撃が許容できるものであったことを示した。１５μｇ／用量の群における咳をした時点のパーセント（３７．９２％）は、対照と比較して、５１．５５％の咳嗽の減少があり、ＵＳＤＡによって義務づけられている有効性に関する要件を満たすものであることを示した。６０μｇ／用量群（６９．５８％）では、対照と比較して、イヌの咳の減少が最小しか示されず、防御が示されなかった。

統計的には比較されていないが、ＳＣワクチン接種は、ＩＭワクチン接種と比較して、より高い抗体応答を有する傾向があったことを、表２９および３１から見ることができる。考察を目的として、ＩＭ経路およびＳＣ経路での投与結果に、異なった用量群に関する以下のコメントをさらに加える。

投与経路にかかわらず、両方のワクチン接種群が、５０日目までに極めて良好なｐ６８抗体反応を示し、ワクチン接種した動物は、試験過程全体を通してそれを維持した。攻撃後には、良好な既往応答がワクチン接種した動物で観測された。

試験過程における、１５μｇ／用量および６０μｇ／用量のｐ６８ＥＬＩＳＡ力価の比較によって、６０μｇ／用量群がわずかに高い力価反応を示したことが示された（図３）。この反応は、極めて良好なものであったが、エアゾール攻撃後の防御とは相関していなかった。陽性の気管スワブまたは凝集素価の上昇によって試験から除外されたイヌにおけるｐ６８ＥＬＩＳＡ力価反応は可変的であった。陽性の気管スワブ培養および／または凝集素価の上昇によって試験から除外された６つの対照のうち３つは、ｐ６８ＥＬＩＳＡ力価を＜２００に維持していた。試験から除外されたイヌの気管スワブまたは凝集素価状態とｐ６８ＥＬＩＳＡ力価との間には相関関係がないようである。

ｐ６８ボルデテラワクチン接種したイヌ、およびワクチン接種していないイヌにおける、攻撃後のＳＡＡ反応の試験は、１５μｇ用量群、特に攻撃後の５および７日目におけるＳＡＡ値の上昇がはるかに小さいことを示した。

結論
この試験では、イヌの攻撃モデルを用いて、ワクチン接種の６カ月間後における、１５μｇ／用量および６０μｇ／用量のｐ６８ボルデテライヌワクチンの有効性を試験した。両ワクチンは、正常な直腸温および最小の注射部位反応によって安全であったことが実証された。ｐ６８ＥＬＩＳＡ力価によって測定された際に、１５μｇ／用量および６０μｇ／用量を用いてワクチン接種したイヌは両方とも、ワクチン接種に対し良好な血清学的応答を示したが、この反応は、６０μｇ／用量を用いてワクチン接種したイヌにおける臨床的な防御とは相関していなかった。６０μｇ／用量を用いてワクチン接種したイヌは、ワクチン接種していない対照と比較して、咳嗽に有意な差を示さなかった。１５μｇ／用量のワクチンの良好な有効性は、対照と比較して、咳嗽に５０％を超える減少があったことによって実証された。６０μｇ／用量ワクチン中にある高レベルのＳＤＳが、示された防御の相違をもたらしているのかもしれないと推論されている。ＳＡＡ値の比較は、ワクチン接種した動物と対照との相違を実証した。

（実施例４）
ＶＡＮＧＵＡＲＤ（登録商標）Ｐｌｕｓ ５／ＣＶ−Ｌの安全性および有効性
ＶＡＮＧＵＡＲＤ Ｐｌｕｓ ５／ＣＶ−Ｌは、ＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、およびＣＰＶの弱毒化株の凍結乾燥調製物、ならびにレプトスピラカニコーラおよびレプトスピライクテロヘモリジアの不活性化全培養物に、アジュバントを含む不活性化ＣＣＶの液体調製物を加えたものである。すべてのウイルスを樹立細胞系で増殖させた。ＣＰＶ分画は、イヌ細胞系での低継代によって弱毒化した。そのため、ＣＰＶ分画は、表３８に示すレベルの、移行抗体の干渉を受けずに作用できる免疫特性を有した。上記液体成分を用いて凍結乾燥成分を再水和させた。液体成分は、真空の代わりに不活性ガスと共に包装されていた。

試験室評価は、ＶＡＮＧＵＡＲＤ Ｐｌｕｓ ５／ＣＶ−Ｌが、ＣＤ、ＩＣＨ、ＣＡＶ−２、およびＣＰＩ呼吸器疾患と、ＣＣＶおよびＣＰＶによって引き起こされる小腸炎と、レプトスピラカニコーラおよびレプトスピライクテロヘモリジアによって引き起こされるレプトスピラ症とに対してイヌを免疫化すること、ならびにワクチン分画間で免疫学的干渉が存在しなかったことを実証した。大規模な野外安全性試験は、正常な使用条件下で、このワクチンが６週齢という若いイヌでも安全であり、かつ本質的に反応を引き起こさないことを示した。

ＣＡＶ−２ワクチンが、ＣＡＶ−１によって引き起こされるＩＣＨに対して交差防御することも示された。ＣＡＶ−２は、ＩＣＨに対する防御だけでなく、ＣＡＶ−２呼吸器疾患に対する防御も行うことが研究によって実証された。実施された試験では、抗原投与したイヌアデノウイルス２型ウイルスが、ＣＡＶ−２ワクチン接種したイヌから回収されなかった。

ＶＡＮＧＵＡＲＤ Ｐｌｕｓ ５／ＣＶ−Ｌ中のＣＰＶ分画に関する包括的な安全性および有効性試験を行った。この分画は、試験室試験および野外条件下での臨床試験で、安全であって、かつ本質的に反応を引き起こさないことが示された。多回用量のワクチン株を感受性のイヌに経口投与することを含めたバックパッセージ試験（ｂａｃｋｐａｓｓａｇｅ ｓｔｕｄｙ）によって、製品安全性をさらに実証した。それらのイヌはすべて正常なままであった。

高ＣＰＶウイルス力価を有する３用量のワクチンが、移行抗体に関連した血清中和（ＳＮ）力価を克服できることを、試験は実証した。１：４という低い血清中和力価でも、従来の改変生ワクチンを用いた能動免疫に干渉することが他の研究者によって示された。６週齢の子イヌ５０匹を用いて臨床試験を行った［２５匹のワクチン接種動物（ＳＮ力価範囲〜２５６）および２５匹の非接種対照（ＳＮ力価範囲４〜１０２４）］（表３７）。ワクチン接種動物群には３用量を投与し、ワクチン接種は６週齢で開始し、３週間の間隔をおいて行った。１用量のワクチンを接種した後、１３／２５匹の子イヌが４倍以上のＣＰＶ ＳＮ力価の増大を示した（抗体陽転）（表３８）。これら１３匹の子イヌのうち１２匹は、初回ワクチン接種の時点で、≦１：１６の母性ＳＮ力価を有し、残りの子イヌは１：６４のＳＮ力価を有していた。別の９匹の子イヌでは、初期のＳＮ力価が１：１６と１：２５６との間であり、２回目のワクチン接種の後に抗体陽転した。それらの移行抗体ＳＮ力価は、２回目のワクチン接種の時点では、≦１：６４に低下していた。同様に、最終３匹のワクチン接種動物は、初期のＳＮ力価が１：１２８であり、それらの移行抗体ＣＰＶ力価が≦１：６４に低下した後、３回目のワクチン接種の後に抗体陽転した。したがって、この試験では、３用量のワクチン投与を６週齢に開始して行った際に、２５匹のワクチン接種動物はすべて、移行抗体レベルが最も高かったものでさえ、能動免疫化された（ＧＭ＝１：１１７６、ＳＮ力価１２８〜４０９６の範囲）。５０匹のイヌすべてが、３回目のワクチン接種の３週間後に異種ＣＰＶ攻撃ウイルスに曝露された。２５匹の非接種対照イヌのうち１４匹は、死亡したか、あるいは安楽死させるのに十分なほどに重度な疾病を示し、一方、２５匹のワクチン接種動物すべてが本質的に健康なままであった。したがって、ＶＡＮＧＵＡＲＤ Ｐｌｕｓ ５／ＣＶ−Ｌ中の高力価、抵継代のワクチンウイルスは免疫原性が強く、移行抗体の存在下でも能動免疫を刺激することができる。

ＶＡＮＧＵＡＲＤ Ｐｌｕｓ ５／ＣＶ−ＬのＣＣＶ分画の有効性を、大規模なワクチン接種攻撃試験によって実証した。７〜８週齢の子イヌ１６匹にＶＡＮＧＵＡＲＤ Ｐｌｕｓ ５／ＣＶ−Ｌを用いてワクチン接種し（ワクチン接種動物）、１７匹にＶＡＮＧＵＡＲＤ Ｐｌｕｓ ５／Ｌを用いてワクチン接種した（対照）。すべての子イヌに、１ｍＬの用量を３週間おきに３回投与した。３回目のワクチン接種の３週間後に、ＣＣＶ（ＣＶ−６）の毒性株を用いて子イヌに攻撃した。感染後、２１日間にわたって臨床知見、体温、体重、および血液パラメータをモニターした。ＣＣＶワクチン接種動物は、対照と比較して、下痢発症および病原性ＣＣＶ出芽量の低減を示した。攻撃の２１日後に、小腸切片における病原性ＣＣＶの蛍光抗体染色を行ったところ、ＣＣＶワクチン接種動物と対照との間における、検出可能なＣＣＶ抗原の有意な減少（Ｐ）を示した（表３９）。

結論
この試験では、ＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶ、ならびにレプトスピラカニコーラおよびレプトスピライクテロヘモリジアの不活性化全培養物、ならびにＣＣＶを含有するアジュバント含有混合ワクチンが、子イヌで使用された際に、ワクチンとして安全かつ効果的であることを示した。この混合ワクチンが、移行抗体に関連した血清中和（ＳＮ）力価を克服することも示した。

（実施例５）
イヌにおける未変性ボルデテラｐ６８の免疫原性試験
動物
この試験は、２腹のＳＰＦビーグル犬同腹仔と、２腹の、出自が無作為なイヌ同腹仔とを含んでいた。イヌを、ワクチン接種群または非接種群に無作為に割り付けた。この試験は、合計で１０匹のワクチン接種したイヌと、１１匹の非接種のイヌとを含んでいた。

実験ワクチンの調製
気管支敗血症菌（１１０Ｈ株）を、播種してから４８時間のＢｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎｇｏｕ血液寒天プレートから、５〜１０ｍｌの熱抽出緩衝液でプレート表面を洗い流すことによって採集した。別法では、液体培養（Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ Ｐａｒｋｅｒの合成培地）中の生育細胞を遠心法によって採集し、上清分画を除去した。採取した細胞を、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ８．８に懸濁し、６０℃で１時間インキュベートした。４℃、２００００×ｇ、３０分間の遠心によって細胞片を熱抽出物から分離した。熱抽出された上清画分にアジ化ナトリウム（０．０１％）を添加し、次にそれを、微細孔ろ過によってさらに浄化した。

標準手順を用いて、モノクローナル抗体（Ｂｏｒｄ２−７と名付けられた）をＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂに結合させることによって、モノクローナル抗体親和性樹脂を調製した。約３０．３５ｍｇのモノクローナル抗体を１グラムの親和性樹脂に結合させた。浄化した熱抽出上清分画（上記）およびＢｒｏｄ２−７親和性樹脂を、２０ｍｌの樹脂に対して約１リットルの割合で結合させた。

この混合物を穏やかに震動させながら、外界温度で終夜インキュベートすることによって、樹脂への非変性ｐ６８の結合を促進させ、その後、樹脂を定着させ、上清画分を吸引した。その後、この樹脂を直径２．６ｃｍのカラムに充填し、カラムをｐＨ７．５のＰＢＳおよびｐＨ８．０の１０ｍＭリン酸緩衝液で順次に流速５ｍｌ／分で洗浄した。２８０ｎｍの吸光度がベースラインレベルに達したときに、１００ｍＭトリエチルアミンを用いて結合物質を溶出し、２８０ｎｍの吸光度が大きな単一ピークを示している分画を収集し、ＥＬＩＳＡによってｐ６８の存在を試験した。ｐ６８を含有する分画をプールし、ＰＢＳに対して透析してトリエチルアミンを除去した。

実験ワクチンは、精製されたｐ６８約１００μｇと、１％水酸化アルミニウムゲルとを含有するように連続処方した。保存剤としてホルマリン（０．０１％）を使用し、最終ワクチン用量容積を１ｍｌとした。

抗原接種原
攻撃物質は、本質的に、上記の実施例に記載した通りに調製した。

試験手順
２１匹の血清陰性かつ培養陰性の子イヌを無作為に２つの治療群の１つに割り当てた。１１匹のイヌを非接種対照群に割り付け、１０匹のイヌをワクチン接種群に割り付けた。初回ワクチン接種の日を０日目とした。０日目に、１ｍＬのワクチンを皮下投与し、２１日後にこれを繰り返した。初回および２回目のワクチン接種の前に、血液を血清学的ｐ６８ＥＬＩＳＡ用に採集した。

２回目のワクチン接種の１４日後である３５日目に、上述の通り、すべてのイヌに気管支敗血症菌のエアゾール攻撃を行った。上記の実施例に記載した通り、攻撃後の１４日間、動物の咳嗽をモニターした。

結果
臨床知見およびｐ６８に対する血清学的反応の要約を表４０に示す。

考察
この試験では、１０匹の対照イヌのうち１０匹が少なくとも２日間連続して咳をした。イヌが２日間連続して咳をした場合に、そのイヌは臨床的に病気であるとする。この判定規準で、非接種対照イヌの１００％が病気であった。ワクチン接種群では、１匹のイヌが攻撃後４日目に咳をし、１匹のイヌが攻撃後４日目および６日目に咳をした。２匹のイヌが１４日目に咳をした。ワクチン接種したイヌで、２日間連続して咳をしたイヌはいなかった。したがって、未変性ｐ６８ワクチンを接種したイヌの１００％が攻撃後にも正常なままであったと判定された。

結論
この試験は、未変性ｐ６８ワクチンが気管支敗血症菌疾患に対して防御する能力を実証するものである。

（実施例６）
レプトスピラブラティスラバ攻撃に対する多価イヌワクチンの有効性
この試験の目的は、イヌにおけるレプトスピラブラティスラバ攻撃に対する、レプトスピラ血清型であるブラティスラバ血清型、カニコーラ血清型、グリポティフォーサ血清型、黄だん出血病血清型、およびポモナ血清型の分画を含有するワクチンの有効性を実証することであった。

材料
ワクチン：使用したワクチンは以下の通りであった。
１．イヌジステンパー、アデノウイルス２型、パラインフルエンザ、およびパルボウイルス抗原を含む凍結乾燥ワクチン（ＶＡＮＧＵＡＲＤ ＰＬＵＳ ５）を使用した。このワクチンは放出抗原レベルの抗原を含有していた。製品コード１３Ｄ１．２２。
２．液体希釈製剤（ＦＩＲＳＴＤＯＳＥ（登録商標）ＣＶ）中のイヌコロナウイルスワクチンを使用した。このワクチンは放出抗原レベルの抗原を含有していた。製品コード１４Ｐ５．２０。
３．イヌジステンパー、アデノウイルス２型、パラインフルエンザ、パルボウイルス、ブラティスラバ、カニコーラ、グリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジア、およびポモナ抗原を含有する凍結乾燥ワクチンを使用した。このワクチンは、およそ６００濁度単位（ｎｅｐｈｌｏｓ）の各レプトスピラ血清型と、放出抗原レベルの改変生ウイルス分画（イヌアデノウイルス、ジステンパーウイルス、パラインフルエンザウイルス、パルボウイルス）とを含有していた。製品コード４６３７．２Ａ。

試験動物：いずれかの性別の約５〜６週齢のビーグル犬の子イヌを用いた。子イヌは、ワクチン接種の際に、レプトスピラの血清型であるブラティスラバ血清型、カニコーラ血清型、グリポティフォーサ血清型、イクテロヘモリジア血清型、およびポモナ血清型に対して血清陰性（＜１：８）であった。流通飼料および水道水を、子イヌが自由に（ａｄ ｌｉｂｉｔｕｍ）得られるようにした。

抗原生物：約２ｍＬのレプトスピラブラティスラバ（感染したハムスター肝臓組織の１０^−１希釈）１用量を、各動物に腹腔内注射として投与した。

研究設計

操作手順
ワクチン接種フェーズ：試験０および２１日目に、以下に概説する通りの対照または試験ワクチンを、４つのワクチン接種動物群の４０匹のイヌ（動物１０匹／群）に注射した。
Ｔ１：イヌコロナウイルス希釈剤で再構成された、イヌジステンパー、アデノウイルス２型、パラインフルエンザ、パルボウイルスを含有する対照ワクチン１ｍＬを皮下（ＳＱ）注射した（製品コード１３Ｄ１．２２を製品コード１４Ｐ５．２０で再構成した）。
Ｔ２：イヌコロナウイルス希釈剤で再構成された、イヌジステンパー、アデノウイルス２型、パラインフルエンザ、パルボウイルスを含有する対照ワクチン１ｍＬを筋肉内（ＩＭ）注射した（製品コード１３Ｄ１．２２を製品コード１４Ｐ５．２０で再構成した）。
Ｔ３：イヌコロナウイルス希釈剤で再構成された、イヌジステンパー、アデノウイルス２型、パラインフルエンザ、パルボウイルス、ブラティスラバ、カニコーラ、グリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジア、およびポモナを含有するレプトスピラワクチン１ｍＬをＳＱ注射した（製品コード４６Ｊ７．２Ａ；製品コード４６３７．２Ａおよび１４Ｐ５．２０の組合せ）。
Ｔ４：イヌコロナウイルス希釈剤で再構成された、イヌジステンパー、アデノウイルス２型、パラインフルエンザ、パルボウイルス、ブラティスラバ、カニコーラ、グリポティフォーサ、レプトスピライクテロヘモリジア、およびポモナを含有するレプトスピラワクチン１ｍＬをＩＭ注射した（製品コード４６Ｊ７．２Ａ；製品コード４６３７．２Ａおよび１４Ｐ５．２０の組合せ）。

ワクチン接種の約１時間後および５時間後に、有害な全身性反応のワクチン接種後観察を行った。

レプトスピラ攻撃：試験４９日目に、腹腔内注射によって、試験動物に約２ｍＬ用量のレプトスピラブラティスラバを攻撃した。

血液試料採集：試験０、２１、３５、４８、５０、５２、５５、５８、６１、６４、６７および７０日目に、利用可能な動物から血清試料を採集した。同様に、試験４８、５０、５２、５５、５８、６１、６４、６７および７０日目に血漿試料を採集した。

細菌血清学：試験０、２１、３５、４８、５８、および７０日目に採取した血清試料における、レプトスピラブラティスラバに対する循環抗体の存在を、微細凝集試験によってアッセイした。

スピロヘータ血症：試験４８、５０、５２、５５、５８、６１、６４、６７、および７０日目に採取した血漿試料におけるスピロヘータの存在を、暗視野顕微鏡によって試験し、レプトスピラを再単離するためにそれらの試料の培養を行った。

全血球計算値／血清化学パネル：４８、５０、５２、５５、５８、６１、６４、６７、および７０日目に採取した血漿試料の血小板数および沈降速度をアッセイしたが、アッセイはこれらに限定されない。同じそれらの期間に得られた血清試料における、アミラーゼ、アラニン−アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスアミラーゼ（ＡＳＴ）、およびクレアチニンをアッセイしたが、アッセイはこれらに限定されない。採集された血漿試料が試験の前に凝固したので、ＣＢＣおよび沈降速度は、試験５５日目の２匹の動物（番号ＱＰＨ３、ＲＶＧ３）でも、試験５８日目の１匹の動物（番号ＲＢＨ３）でも、試験６１日目の３匹の動物（番号ＯＬＨ３、ＯＵＨ３、ＰＴＧ３）でも、試験７０日目の１匹の動物（番号ＯＷＧ３）でも完遂されなかった。試験６７日目には、血漿サンプル量が試験に不十分であったので、２匹の動物（番号ＯＵＨ３、ＳＡＧ３）で沈降速度が完遂されなかった。それらの結果は、これらの試験パラメータに影響しなかった。

直腸体温：試験４７〜７０日目に直腸体温を記録した。攻撃後（試験５０日目）に、≧３９．２℃に上昇した体温を、レプトスピラ症を示すものとした。

尿培養：試験４８、５５、および７０日目に採取した尿試料を、レプトスピラ用に培養し、尿分析に用いた。試験４８日目には、採集時における利用可能な尿の量が試験に不十分であったので、１匹の動物（番号ＣＢＣ３）で尿分析が完遂されなかった。試験５５日目には、採集時における利用可能な尿の量が試験に不十分であったので、２匹の動物（番号ＯＰＨ３、ＲＸＧ３）で尿分析が完遂されなかった。試験７０日目には、採集時における利用可能な尿の量が試験に不十分であったので、１０匹の動物（番号ＯＹＧ３、ＰＩＧ３、ＰＵＧ３、ＱＨＧ３、ＱＱＨ３、ＱＳＧ３、ＲＤＧ３、ＲＵＧ３、ＲＶＧ３、ＲＹＧ３）で尿分析が完遂されなかった。それらの結果は、この試験パラメータに影響しなかった。

検死およびレプトスピラの単離：攻撃後期間中、ならびにその終局において安楽死させられた動物の検死を行った。体液および組織（すなわち、肝臓、腎臓、および尿）を採集し、レプトスピラを再単離するために、ＢＣＬに提出した。試験５５日目には、採集時における利用可能な尿の量が試験に不十分であったので、２匹の動物（番号ＯＰＨ３、ＲＸＧ３）で細菌の再単離が完遂されなかった。試験７０日目には、採集時における利用可能な尿の量が試験に不十分であったので、４匹の動物（番号ＯＹＧ３、ＰＵＧ３、ＱＳＧ３、ＲＵＧ３）で細菌の再単離が完遂されなかった。それらの結果は、この試験パラメータに影響しなかった。

健康状態の観察：動物の全体的健康状態を毎日モニターした。

データの要約および分析
データは、混合モデルまたはカテゴリカルプロシージャ（ＳＡＳ／ＳＴＡＴ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｃｈａｎｇｅｓ ａｎｄ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｒｅｌｅａｓｅ ６．１２、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国ノースカロライナ州Ｃａｒｙ所在）を用いて分析した。

一般線型反復測定混合モデル（固定効果モデル項は治療、試験、および治療による試験）を用いて、体温、血清抗体価、血液血小板数、沈降速度、アミラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、およびクレアチニンを分析した。治療または試験による治療の有意な（Ｐ≦０．０５）相互作用効果を検出した後に、対象とする対比を行った。力価の対数変換が分析に適している場合にはそれを実施し、変換を実施した場合には、最小二乗平均を相乗平均に逆変換して提示した。分析されなかった観察（すなわち、検死結果およびワクチン接種後観察）は、要約用のデータベースに入力しなかった。

各治療について、＜２００の血小板数を少なくとも１回有した動物、および３９．２℃以上の直腸温を有した動物の度数分布を計算した。

攻撃した後、試験中毎日、動物を正常なものと、病気のものとに分類した。以下の徴候、すなわち、結膜炎、うつ病、食欲不振、筋肉振戦、鼻水、発熱（≧３９．２℃）または流涙のいずれかが存在した場合に、病気であると分類した。

一般線型混合モデル（固定効果モデル項は治療である）を用いて、攻撃後における、動物が病気として分類された日数を分析した。死亡または安楽死の二項変数をフィッシャーの正確確率検定で分析した。治療群を比較するために、スピロヘータ血症、ならびに尿、腎臓、および肝臓中の細菌の再単離に関して、フィッシャーの正確確率検定を用いて分析した。

投与経路と、治療相互作用による経路との間に有意な差が存在しなかった場合（両側Ｐ≦０．０５）、治療Ｔ１およびＴ２の平均と、治療Ｔ３およびＴ４の平均とを比較するように対比を用いた（片側Ｐ≦０．０５）。分析が反復測定分析であった場合は、データが収集された各時点で比較を行った。そうでない場合は、対比を用い、Ｔ１とＴ３との比較、およびＴ２とＴ４との比較を行った（片側Ｐ≦０．０５）。分析が反復測定分析であった場合はデータが収集された各時点でこれらの比較を行った。

レプトスピラブラティスラバに対するレプトスピラワクチンの有効性は、ワクチン接種した動物における疾患発症率が低いことによって実証された（片側、Ｐ≦０．０５）。以下の変数がレプトスピラワクチンの有効性を支持した。（１）平均血小板数は、ワクチン接種動物の方が有意に（片側、Ｐ≦０．０５）高かった。（２）平均沈降速度は、ワクチン接種動物の方が有意に（片側、Ｐ≦０．０５）と低かった。（３）スピロヘータ血症の発症率は、ワクチン接種動物の方が有意に（片側、Ｐ≦０．０５）低下していた。

結果
攻撃後における臨床的徴候：レプトスピラ症を示す臨床徴候（例えば、結膜炎、うつ病、下痢、血尿、黄だん、食欲不振、瀕死、筋肉振戦、発熱、嘔吐）を試験動物が示した平均日数を表１に示す。攻撃後（試験５０〜７０日目）における、Ｔ１およびＴ２対照が病気であった平均日数は、それぞれ４．３および３．３であった。逆に、Ｔ３およびＴ４ワクチン接種動物の平均は０．７および０．５であり、それらの結果は、Ｔ１〜Ｔ２対照と比較して有意に改善されていた（Ｐ＜０．０５）。攻撃後における、臨床徴候を示した動物のパーセントを表１に示す。Ｔ１〜Ｔ２対照の７５％がレプトスピラ症の徴候を示したが、同様な徴候は、Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物の３０％のみで観測された。試験の攻撃後フェーズ中に安楽死を必要とした感染動物の数も表１に示す。Ｔ１〜Ｔ２対照群のうち５匹の動物（２５％）が、レプトスピラ症の重度な徴候を示し、安楽死させられた。逆に、Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物は、その同じ期間中に、他の点では健康なままでおり、その比較（Ｔ１〜Ｔ２対Ｔ３〜Ｔ４）は、ワクチン接種動物における有意な改善（Ｐ＜０．０５）を示した。攻撃後における平均体温の表を表２に示す。攻撃後の最初９日間（試験５０〜５８日目）における、Ｔ１〜Ｔ２対照の平均体温は３７．８〜３９．４℃の範囲にあった。その同じ期間中、Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物の平均体温は３８．２〜３８．７℃の範囲にあった。注目すべきことに、攻撃の２、３、および５日後における、Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物の平均体温は、Ｔ１〜Ｔ２の平均体温と比較して有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。≧３９．２℃の体温を少なくとも１回有した動物の頻度も表２に示す。≧３９．２℃に上昇した体温は、レプトスピラ感染を示すものとした。攻撃後観測期間の経過中、Ｔ１〜Ｔ２対照の６０〜７０％が≧３９．２℃の体温を示した。逆に、Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物の３０％のみがその臨床徴候を示した。

攻撃後におけるスピロヘータ血症：スピロヘータ血症の頻度を表３に示す。血液中のスピロヘータの存在（細菌培養によって検出した）は、レプトスピラ症を実証する臨床結果である。攻撃後１日目（試験５０日目）に、Ｔ１対照の９０％、Ｔ２対照の６０％、Ｔ３ワクチン接種動物の６０％、およびＴ４ワクチン接種動物の７０％でスピロヘータ血症が確認された。細菌の再単離は、ワクチン接種の状態にかかわらずに、腹腔内注射の２４時間後に血液から行われることが予測されていた。Ｔ１対照におけるスピロヘータ血症は、その後、以下の通り、すなわち、攻撃後の３日目（試験５２日目）に１００％、６日目（試験５５日目）に５６％、９日目（試験５８日目）に３３％と確認された。同様に、Ｔ２対照におけるスピロヘータ血症は、以下の通り、すなわち、攻撃後の３日目に６０％、６日目に５０％、９日目に２９％と確認された。逆に、Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物では、その同じ攻撃後期間中にも、攻撃後期間の残りの期間中（すなわち試験５０〜７０日目）にも確認されなかった。

総合すると、攻撃後の１日目を含めて（試験５０〜７０日目）、スピロヘータ血症に関して陽性であった動物の割合はＴ１〜Ｔ２対照では６０％〜１００％、Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物では６０％〜７０％であった。対照的に、攻撃後１日目を除外した場合（試験５２〜７０日目）、陽性であった動物の割合は、Ｔ１〜Ｔ２対照では６０％〜１００％、Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物では０％であった。

攻撃後における、体液および組織からのレプトスピラの再単離：血液、尿、腎臓、および肝臓試料からのレプトスピラの再単離を表４に示す。血液からのレプトスピラ再単離の結果の要約を以下の部分に示す。攻撃後の３日目から始めて（すなわち攻撃後１日目を除外した）、Ｔ１〜Ｔ２対照の６０〜１００％でスピロヘータ血症が確認され、その同じ期間中、Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物では確認されなかった。注目すべきことに、その比較（Ｔ１〜Ｔ２対Ｔ３〜Ｔ４）は、ワクチン接種動物における有意な改善（Ｐ＜０．０５）を示した。

腎臓試料は、検死で収集した。Ｔ１およびＴ２対照から採取された腎臓試料の５０％からレプトスピラが再単離された。Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物から採取された試料からは、レプトスピラが再単離されなかった。その比較（Ｔ１〜Ｔ２対Ｔ３〜Ｔ４）は、ワクチン接種動物における有意な改善（Ｐ＜０．０５）を示した。

肝臓試料は検死で収集した。Ｔ１およびＴ２対照から採取された肝臓試料のそれぞれ１０％および２０％からレプトスピラが再単離された。Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物から採取された試料からは、レプトスピラが再単離されなかった。その比較（Ｔ１〜Ｔ２対Ｔ３〜Ｔ４）は、ワクチン接種動物における有意な改善（Ｐ＜０．０５）を示した。

尿試料は、攻撃後に２回、間隔をおいて、検死において採集した。レプトスピラは、攻撃後の６日目（試験５５日目）に、２匹のＴ１対照から再単離された。レプトスピラは、Ｔ２対照のいずれの試料からも、Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物からも再単離されなかった。

攻撃後における血小板数：平均血小板数を表５に示す。血液血小板数の減少（血小板減少症）は、レプトスピラ症を示す臨床結果である。Ｔ１〜Ｔ２対照の平均濃度は、６１から９３７の範囲にあった。同じ期間中、Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物の平均数は４００から５６６の範囲にあった。注目すべきことに、攻撃の３、６、および９日後における、Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物の血小板数は、Ｔ１〜Ｔ２対照と比較して有意に改善されていた（Ｐ＜０．０５）。

＜２００の血小板数を少なくとも１回有した動物の頻度も表５に示す。攻撃後期間の経過中、Ｔ１対照の９０％およびＴ２対照の６０％が血小板減少症である（血小板数＜２００）と判定された。逆に、感染後、Ｔ３ワクチン接種動物の１０％のみが血小板減少症になり、Ｔ４ワクチン接種動物はまったく血小板減少症にならなかった。

攻撃後における沈降速度：平均沈降速度を表６に示す。沈降速度の増大は、レプトスピラ症を示す臨床結果である。

Ｔ１〜Ｔ２対照の平均速度は、２．４から１６．０の範囲にあった。同じ期間中、Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物の平均速度は、１．５から６．３の範囲にあった。注目すべきことに、攻撃の３、６、９、１２、１５、１８、および２１日後における、Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物の速度は、Ｔ１〜Ｔ２対照と比較して有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。

攻撃後におけるＡＬＴ濃度：平均アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度を表７に示す。ＡＬＴの増大は、細菌感染を示す臨床結果である（すなわち、肝臓機能が悪化するのに従ってＡＬＴレベルは上昇する）。Ｔ１〜Ｔ２対照の平均濃度は、２２から７９の範囲にあった。同じ期間中、Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物の平均濃度は２１から６１の範囲にあった。注目すべきことに、攻撃の３、６、９、および１２日後における、Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物の濃度は、Ｔ１〜Ｔ２対照と比較して有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。

攻撃後におけるクレアチニン濃度：平均クレアチニン濃度を表８に示す。クレアチニン濃度の増大は細菌感染を示す臨床結果である（すなわち、レプトスピラ症によって腎臓機能が悪化するのに従って、クレアチニンレベルが上昇する）。Ｔ１対照（すなわちＳＱ投与）の平均濃度は、０．３０から０．９９の範囲にあった。同じ期間中、Ｔ３ワクチン接種動物（すなわちＳＱ投与）の平均濃度は０．２６〜０．４０の範囲にあった。注目すべきことに、攻撃の１、６、９、１２、１５、１８、および２１日後における、Ｔ３ワクチン接種動物の濃度は、Ｔ１対照と比較して有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。Ｔ２対照（すなわちＩＭ投与）の平均濃度は０．３０から１．３１の範囲にあった。同じ期間中、Ｔ４ワクチン接種動物（すなわちＩＭ投与）の平均濃度は、０．３２から０．４６の範囲にあった。攻撃後における、Ｔ２およびＴ４の値の間には、有意な差がなかった。

攻撃後におけるアミラーゼ、ＡＳＴ、および尿分析：Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物の平均濃度は、Ｔ１〜Ｔ２対照と比較して、有意な差がなかった。しかし、全般的に、攻撃後の濃度は、Ｔ１〜Ｔ２対照のものより劇的に増大した。概して、攻撃後における、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスアミラーゼ）の変化および尿分析結果は、Ｔ１〜Ｔ４試験動物では観測されなかった。これら３つのパラメータの結果は、ここでは別段に表にしていない。

血清抗体力価：平均血清レプトスピラブラティスラバ抗体力価を表９に示す。この試験のワクチン接種フェーズ中（試験０〜４８日目）、Ｔ１〜Ｔ２対照の平均力価は約２であった（すなわち血清陰性）。これに対応して、Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物の平均は２（ワクチン接種前）から１１８１（ワクチン接種後）の範囲にあった。注目すべきことに、ワクチン接種の２１、３５、および４８日後における、Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物の平均力価は、Ｔ１〜Ｔ２の平均力価と比較して有意に高かった（Ｐ＜０．０５）。

この試験の攻撃後フェーズ中（試験５８および７０日目）、Ｔ１〜Ｔ２対照の平均力価は２１３５から４１１６０の範囲にあった。これに対応して、Ｔ３およびＴ４ワクチン接種動物の平均力価は、７２７から１０８９１の範囲にあり、試験５８日目（すなわち攻撃後の９日目）およびワクチン接種後の７０日目（すなわち攻撃後の２１日目）には、Ｔ１〜Ｔ２対照と比較して有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。その結果、対照は、攻撃後に、レプトスピラブラティスラバに対する劇的な一次応答を示し（すなわち感染の確認）、一方、Ｔ３〜Ｔ４ワクチン接種動物の反応は、それほど活発ではなかった（すなわち典型的な既往反応）。

ワクチン接種後の全身性反応：一次およびブースターワクチン接種の約１時間後および５時間後に評価した際には、Ｔ１〜Ｔ４の試験動物で、ワクチン接種後の全身性反応が観測されなかった。その結果は、ここでは表にしていない。

結論
レプトスピラブラティスラバに対する、ＳＱまたはＩＭ注射で投与した多価レプトスピラワクチンの有効性は、中でも、攻撃後における、対照と比較して（１）有意に低いレプトスピラ関連疾患発症率、（２）有意に低いスピロヘータ血症発症率、（３）有意に高い血小板数、および（４）有意に低い平均沈降速度によって実証された。

ワクチン接種していないイヌおよびボルデテラｐ６８（１５μｇ／用量）をワクチン接種−気管支敗血症菌のエアゾール攻撃−されたイヌにおける、ｐ６８ＥＬＩＳＡエンドポイント力価の相乗平均の要約を示す図である。 気管支敗血症菌をエアゾール攻撃した後における、イヌの血清アミロイドＡ力価の要約を示す図である。 ワクチン接種および気管支敗血症菌のエアゾール攻撃の後における、ワクチン接種していないイヌおよびボルデテラｐ６８をワクチン接種したイヌでの、ｐ６８ＥＬＩＳＡエンドポイント力価の相乗平均の要約を示す図である。 気管支敗血症菌をエアゾール攻撃した後における、イヌの血清アミロイドＡ力価の要約を示す図である。 ｐ６８全細胞溶解物に対する、ｐ６８モノクローナル抗体Ｂｏｒｄ ２−７の反応性を示すウェスタンブロットの図である。

Claims (40)

1. レプトスピラブラティスラバ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）、レプトスピラカニコーラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラグリポティフォーサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、レプトスピライクテロヘモリジア（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｅｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、およびレプトスピラポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｐｏｍｏｎａ）のレプトスピラ細胞調製物ならびに担体を含むイヌ用ワクチン組成物。
2. 担体がサポニンおよび界面活性物質を含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
3. サポニンがＱｕｉｌ Ａであり、界面活性物質がコレステロールである、請求項２に記載のワクチン組成物。
4. Ｑｕｉｌ Ａの量が用量あたり１から１０００μｇの範囲にあり、コレステロールの量が用量あたり１から１０００μｇの範囲にある、請求項３に記載のワクチン組成物。
5. 担体が水酸化アルミニウムを含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
6. 担体がＱｕｉｌ Ａおよびコレステロールを含み、かつレプトスピラブラティスラバおよび担体の量が、レプトスピラブラティスラバからイヌを防御するのに有効な量である、請求項１に記載のワクチン組成物。
7. レプトスピラブラティスラバからイヌを防御する方法であって、イヌに請求項１に記載のワクチン組成物を治療有効量投与するステップを含む方法。
8. 前記ワクチン組成物を静脈内、鼻腔内、経口、筋肉内、または皮下経路で投与する、請求項７に記載の方法。
9. 前記イヌに前記ワクチン組成物を、投与間隔２〜４週間で２回または３回投与する、請求項７に記載の方法。
10. ワクチン中の各レプトスピラ株の量が、ワクチン用量あたり１００〜３５００濁度単位の範囲にある、請求項１に記載のワクチン組成物。
11. ワクチン中の各レプトスピラ株の量が、用量あたり２００〜２０００濁度単位の範囲にある、請求項１に記載のワクチン組成物。
12. イヌの病原体に対してイヌを免疫化するワクチン組成物であって、請求項１に記載の組成物を含み、かつ、イヌジステンパー（ＣＤ）ウイルスの弱毒化株、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）の弱毒化株、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルスの弱毒化株、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）の弱毒化株、および担体をさらに含むワクチン組成物。
13. ワクチン中の各レプトスピラ株の量が、ワクチン用量あたり１００〜３５００濁度単位の範囲にある、請求項１２に記載のワクチン組成物。
14. ワクチン中の各レプトスピラ株の量が、用量あたり２００〜２０００濁度単位の範囲にある、請求項１２に記載のワクチン組成物。
15. 前記ワクチン中の前記ＣＤウイルスの弱毒化株の量が、用量あたり１０^２から１０^９ＴＣＩＤ_５０の範囲にある、請求項１２に記載のワクチン組成物。
16. 前記ワクチン中の前記ＣＡＶ−２の弱毒化株の量が、用量あたり１０^２から１０^９ＴＣＩＤ_５０の範囲にある、請求項１２に記載のワクチン組成物。
17. 前記ワクチン中の前記ＣＰＩウイルスの弱毒化株の量が、用量あたり１０^２から１０^９ＴＣＩＤ_５０の範囲にある、請求項１２に記載のワクチン組成物。
18. 前記ワクチン中の前記ＣＰＶの弱毒化株の量が、用量あたり１０^２から１０^９ＴＣＩＤ_５０の範囲にある、請求項１２に記載のワクチン組成物。
19. 担体がサポニンおよび界面活性物質を含む、請求項１２に記載のワクチン組成物。
20. サポニンがＱｕｉｌ Ａであり、界面活性物質がコレステロールである、請求項１９に記載のワクチン組成物。
21. Ｑｕｉｌ Ａの量が用量あたり１から１０００μｇの範囲にあり、コレステロールの量が用量あたり１から１０００μｇの範囲にある、請求項２０に記載のワクチン組成物。
22. 担体が水酸化アルミニウムを含む、請求項１２に記載のワクチン組成物。
23. イヌの病原体からイヌを防御する方法であって、イヌに請求項１２に記載のワクチン組成物を治療有効量投与するステップを含む方法。
24. 前記ワクチン組成物を静脈内、鼻腔内、経口、筋肉内、または皮下経路で投与する、請求項２３に記載の方法。
25. 前記イヌに前記ワクチン組成物を、投与間隔２〜４週間で２回または３回投与する、請求項２３に記載の方法。
26. イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）株の不活性化全細胞調製物または部分細胞調製物をさらに含む、請求項１２に記載のワクチン組成物。
27. ワクチン中の各レプトスピラ株の量が、ワクチン用量あたり１００〜３５００濁度単位の範囲にある、請求項２６に記載のワクチン組成物。
28. ワクチン中の各レプトスピラ株の量が、用量あたり２００〜２０００濁度単位の範囲にある、請求項２６に記載のワクチン組成物。
29. 前記ワクチン中の前記ＣＤウイルスの弱毒化株の量が、用量あたり１０^２から１０^９ＴＣＩＤ_５０の範囲にある、請求項２６に記載のワクチン組成物。
30. 前記ワクチン中の前記ＣＡＶ−２の弱毒化株の量が、用量あたり１０^２から１０^９ＴＣＩＤ_５０の範囲にある、請求項２６に記載のワクチン組成物。
31. 前記ワクチン中の前記ＣＰＩウイルスの弱毒化株の量が、用量あたり１０^２から１０^９ＴＣＩＤ_５０の範囲にある、請求項２６に記載のワクチン組成物。
32. 前記ワクチン中の前記ＣＰＶの弱毒化株の量が、用量あたり１０^２から１０^９ＴＣＩＤ_５０の範囲にある、請求項２６に記載のワクチン組成物。
33. 前記ワクチン中の前記ＣＣＶ株の細胞調製物の量が、用量あたり少なくとも１００相対単位である、請求項２６に記載のワクチン組成物。
34. 前記担体がサポニンおよび界面活性物質を含む、請求項２６に記載のワクチン組成物。
35. 前記サポニンがＱｕｉｌ Ａであり、前記界面活性物質がコレステロールである、請求項３４に記載のワクチン組成物。
36. Ｑｕｉｌ Ａの量が用量あたり１から１０００μｇの範囲にあり、コレステロールの量が用量あたり１から１０００μｇの範囲にある、請求項３５に記載のワクチン組成物。
37. 担体が水酸化アルミニウムを含む、請求項２６に記載のワクチン組成物。
38. イヌの病原体に対してイヌを免疫化する方法であって、請求項２６に記載のワクチン組成物をイヌに投与するステップを含む方法。
39. 前記ワクチン組成物を静脈内、鼻腔内、経口、筋肉内、または皮下経路で投与する、請求項３８に記載の方法。
40. 前記イヌに前記ワクチン組成物を、投与間隔２から３週間で２回または３回投与する、請求項３８に記載の方法。

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