KR20120031294A - 렙토스피라 브라티슬라바 및 그 밖의 다른 병원체에 대한 다가 개 백신 - Google Patents

렙토스피라 브라티슬라바 및 그 밖의 다른 병원체에 대한 다가 개 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 렙토스피라 브라티슬라바 (Leptospira brastislava)에 의해서 야기된 질병으로부터 개를 보호하는 백신 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 개 병원체에 의해서 야기된 질병 또는 장애, 예를 들어, 보르데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica)에 의해서 야기된 감염성 기관기관지염, 개 디스템퍼 (CD) 바이러스에 의해서 야기된 개 디스템퍼, 개 아데노바이러스 타입 1 (CAV-1)에 의해서 야기된 감염성 개 간염 (ICH), 개 아데노바이러스 타입 2 (CAV-2)에 의해서 야기된 호흡기 병, 개 파라인플루엔자 (CPI) 바이러스에 의해서 야기된 개 파라인플루엔자, 개 코로나바이러스 (CCV) 및 개 파르보바이러스 (CPV)에 의해서 야기된 장염, 및 렙토스피라 브라티슬라바 (Leptospira brastislava), 렙토스피라 캐니콜라 (Leptospira canicola), 렙토스피라 그립포타이포사 (Leptospira grippotyphosa), 렙토스피라 익테로헤모라지에 (Leptospira icterohaemorrhagiae) 또는 렙토스피라 포모나 (Leptospira pomona)에 의해서 야기된 렙토스피라증으로부터 개를 보호하는 배합 백신 및 방법에 관한 것이다.

Description

렙토스피라 브라티슬라바 및 그 밖의 다른 병원체에 대한 다가 개 백신{MULTIVALENT CANINE VACCINES AGAINST LEPTOSPIRA BRATISLAVA AND OTHER PATHOGENS}
본 발명은 보르데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica) p68 항원을 함유하는 백신, 및 보르데텔라 브론키셉티카에 의해서 야기된 감염성 기관기관지염 ("케넬 코프 (kennel cough)")으로부터 개를 보호하기 위한 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원, 및 개 디스템퍼 (distemper)(CD) 바이러스, 개 아데노바이러스 (adenovirus) 타입 2 (CAV-2), 개 파라인플루엔자 (parainfluenza)(CPI) 바이러스, 개 코로나바이러스 (coronavirus)(CCV), 개 파르보바이러스 (parvovirs)(CPV), 렙토스피라 브라티슬라바 (Leptospira brastislava), 렙토스피라 캐니콜라 (Leptospira canicola), 렙토스피라 그립포타이포사 (Leptospira grippotyphosa), 렙토스피라 익테로헤모라지에 (Leptospira icterohaemorrhagiae) 또는 렙토스피라 포모나 (Leptospira pomona)와 같은 또 다른 개 병원체의 하나 또는 그 이상의 항원을 함유하는 배합 백신 (combination vaccine)에 관한 것이다. 배합 백신을 사용하여 개 병원체에 의해서 야기된 질병으로부터 개를 보호하는 방법도 또한 제공된다. 본 발명은 렙토스피라 브라티슬라바를 함유하는 백신, 및 렙토스피라 브라티슬라바에 의해서 야기된 감염으로부터 개를 보호하기 위한 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 렙토스피라 브라티슬라바, 및 개 디스템퍼 (CD) 바이러스, 개 아데노바이러스 타입 2 (CAV-2), 개 파라인플루엔자 (CPI) 바이러스, 개 코로나바이러스 (CCV), 개 파르보바이러스 (CPV), 렙토스피라 캐니콜라, 렙토스피라 그립포타이포사, 렙토스피라 익테로헤모라지에 또는 렙토스피라 포모나와 같은 또 다른 개 병원체의 하나 또는 그 이상의 항원을 함유하는 배합 백신에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 렙토스피라 브라티슬라바를 함유하지 않는 상기 항원의 배합 백신에 관한 것이다. 배합 백신을 사용하여 개 병원체에 의해서 야기된 질병으로부터 개를 보호하는 방법도 또한 제공된다.
현재 시판품으로 이용할 수 있는 개 보르데텔라 브론키셉티카 백신 생성물은 불활성화된 비아쥬번트화 (nonadjuvanted) 보르데텔라 브론키셉티카 전세포 박테린 (whole cell bacterin)으로 구성된다. 이러한 전세포 박테린은 세포 단백질 관련된 백신접종후 반응을 유도할 수 있다. 보르데텔라 브론키셉티카의 p68 단백질은 보르데텔라 퍼튜시스 (B. pertussis)의 외부막 단백질 (Outer Membrane Protein; OMP) 및 보르데텔라 파라퍼튜시스 (B. parapertussis)의 OMP와 항원적으로 유사하다 (Shahin et al., "Characterization of the Protective Capacity and Immunogenicity of the 69-kD Outer Membrane Protein of Bordetella pertussis", J. Exp . Med ., 171:63-73, 1990). 이러한 OMP의 보호적 역할은 마우스 (Shahin et al., supra; Novotny et al., "Biologic and Protective Properties of the 69-kD Outer Membrane Protein of Bordetella pertusssis: A Novel Formulation for a Acellular Pertussis Vaccine", J. Infect . Dis . 164:114-22, 1991), 인간 (He et al., "Protective Role of Immunoglobulin G Antibodies to Filamentous Hemagglutinin and Pertactin of Bordetella pertussis in Bordetella parapertussis infection", Eur . J Clin Microbiol Infect Dis . 10:793-798, 1996) 및 돼지 (Kobisch et al., "Identification of a 68-Kilodalton Outer Membrane Protein as the Major Protective Antigen of Bordetella bronchiseptica by Using Specific-Pathogen-Free Piglets", Infect . Immun . 58(2):352-357, 1990)에 대해서 입증되었다.
본 발명 이전에는 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원이 개에게서 안전하고 효과적인 백신일 수 있음을 나타낸 적이 없었다. 따라서, 개에게서 사용하기에 적합한 p68 항원을 함유하는 보르데텔라 브론키셉티카 백신을 개발하는 것이 필요하다. 만일 이러한 보르데텔라 브론키셉티카 p68 백신이 강아지에게 투여하기에 안전하고, 장기간 보호를 제공한다면 더 더욱 유익할 것이다.
CD는 가변적인 증상을 갖는 전세계적인 높은 사망율의 바이러스성 질병이다. CD 바이러스에 의해서 감염된 백신접종되지 않은 비면역 개의 대략 50%는 임상적 징후를 나타내며, 이들 개 중의 대략 90%는 사망한다.
개 아데노바이러스 타입 1 (CAV-1)에 의해서 야기된 감염성 개 간염성 간염 또는 ICH는 간 및 전신화된 내피 병변을 특징으로 하는 개의 전세계적이며, 때때로 치명적인 바이러스성 질병이다. CAV-2는 중증인 경우에 폐렴 및 기관지폐렴을 포함할 수 있는 호흡기 질병을 야기한다.
CPI는 통상적인 바이러스성 상기도 질병이다. 합병되지 않은 CPI는 경증이거나 무증상적일 수 있으며, 징후는 다른 호흡기 병원체에 의한 병발한 감염증이 존재하는 경우에 더 중증으로 된다.
CPV 감염은 구토 및 설사, 흔히는 출혈의 갑작스런 발병을 특징으로 하는 장 질병을 일으킨다. 백혈구감소증이 임상적 징후와 더불어 나타난다. 어떤 연령의 감수성 개에게서도 발병할 수 있으나, 사망율은 강아지에게서 가장 높다. 4-12 주령의 강아지에게서 CPV는 때때로, 단시간의 눈에 띄지 않는 병이 있은 후에 급성 심부전을 일으킬 수 있는 심근염을 야기할 수 있다. 감염이 있은 후에 다수의 개는 1년 또는 그 이상 동안 이 질병에 대해서 난치성이다. 마찬가지로, 혈청양성 암캐는 그들의 강아지에게 CPV 항체를 전이시킬 수 있으며, 이것은 16 주령까지 내내 강아지의 능동면역화를 저해할 수 있다.
CCV는 또한, 세계적으로 모든 연령의 감수성 개에게서 장 질병을 야기한다. 매우 전염성인 바이러스는 주로 감염성 배설물과의 직접적인 접촉을 통해서 전파되며, 노출시킨 후 1-4일 이내에 임상적인 장염을 야기할 수 있다. 질병의 중증도는 다른 병원체들에 의한 병발한 감염에 의해서 악화될 수 있다. CCV 감염의 일차적인 징후에는 식욕부진, 구토 및 설사가 포함된다. 구토의 빈도는 통상적으로 설사의 발현이 있은 후 1 또는 2일 이내에 감소하지만, 설사는 감염의 과정 내내 오래 계속될 수 있으며, 변은 때때로 혈액의 스트릭 (streak)을 함유할 수 있다. CCV 감염에 의해서 대부분의 개는 무열성인 채로 유지되며, 백혈구감소증은 합병되지 않은 증례에서는 관찰되지 않는다.
렙토스피라증은 일반적으로 급성 감염 후에 광범한 임상적 징후 및 만성 신장염을 가지고 모든 연령의 개에게서 발생한다.
일부의 배합 백신이 개발되었으며, 이것에는 상품명 반구아드 (Vanguard™)로 판매되는 것이 포함된다. 그러나, 본 발명 이전에 보르데텔라 브론키셉티카로, 및 CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스, CPV, CCV, 및 렙토스피라 브라티슬라바, 렙토스피라 캐니콜라, 렙토스피라 그립포타이포사, 렙토스피라 익테로헤모라지에 및 렙토스피라 포모나와 같은 렙토스피라 종과 같은 하나 또는 그 이상의 또 다른 개 병원체로부터 개를 보호하는 효과적인 배합 백신은 없었다. 또한, 보르데텔라 브론키셉티카가 없이, 이들 그 밖의 다른 개 병원체에 대항하여, 렙토스피라 브라티슬라바를 포함하는 효과적인 배합 백신도 없었다. 배합 백신을 개발하는데 있어서의 문제점은 효능 간섭, 즉 배합 조성물 내의 하나 또는 그 이상의 항원이 조성물 내의 다른 항원이 존재함으로 인하여 효능을 유지하거나 획득하는데 실패하는 문제를 수반한다. 이것은 숙주, 예를 들어, 개에게 투여된 조성물 내의 항원에 의하여, 조성물 내에 존재하는 다른 항원으로 인하여 숙주 내에서 유도된 그러한 항원의 면역학적, 항원적, 항체 또는 보호적 반응에서의 간섭의 결과인 것으로 믿어진다. 그러나, 고양이와 같은 다른 숙주의 경우에는 배합 백신이 알려져 있다. 개에게서의 효능 간섭은 개 생물학적 시스템의 약간의 특징에 기인하거나, 개 생물학적 시스템과 항원의 반응에 기인하는 것으로 믿어진다.
따라서, 하나 또는 그 이상의 개 병원체에 대항하여 개에게 투여하기에 적합하며, 개에게서 효능 간섭을 나타내지 않는, 렙토스피라 브라티슬라바 등의 렙토스피라 세포 제제를 포함하는 효과적인 배합 백신을 개발하는 것이 필요하다. 만일 이러한 백신이 강아지에게 투여하기에 안전하고, 장기간 보호를 제공한다면 더 더욱 유익할 것이다.
본 발명은 개에게 투여하는데 적합한 배합 백신을 제공한다. 본 발명의 배합 백신은 렙토스피라 세포 제제와 함께 다른 개 병원체(들)에 의해서 야기된 질병에 대항하여 개에게서 보호적 면역반응을 유도할 수 있는 다른 개 병원체로부터의 적어도 하나의 다른 항원을 포함한다.
본 발명은 렙토스피라 브라티슬라바 (Leptospira brastislava)에 의해서 야기된 질병으로부터 개를 보호하는 백신 및 방법을 개발한 것이다.
도 1은 백신접종되지 않은 개 및 보르데텔라 p68 (15 ㎍/용량) 백신접종된 개에서 보르데텔라 브론키셉티카에 의한 에어로졸 공격에 의한 p68 ELISA 종말점 역가 (endpoint titer)의 기하평균의 요약이다.
도 2는 보르데텔라 브론키셉티카에 의한 에어로졸 공격 이후에 개에게서의 혈청 아밀로이드 A 역가의 요약이다.
도 3은 백신접종 및 보르데텔라 브론키셉티카에 의한 에어로졸 공격 이후에 백신접종되지 않은 개 및 보르데텔라 p68 백신접종된 개에게서의 p68 ELISA 종말점 역가의 기하평균의 요약이다.
도 4는 보르데텔라 브론키셉티카에 의한 에어로졸 공격 이후에 개에게서의 혈청 아밀로이드 A 역가의 요약이다.
도 5는 p68 전세포 용해물에 대한 p68 모노클로날 항체 보드 (Bord) 2-7의 반응성을 나타내는 웨스턴 블럿 (Western blot)이다.
발명의 요약
본 발명은 개 병원체에 의해서 야기된 질병으로부터 개를 보호하는 백신 및 방법을 제공한다.
한가지 구체예에서, 본 발명은 개에게 투여하는데 적합하며 보르데텔라 브론키셉티카에 의해서 야기된 질병으로부터 개를 보호할 수 있는 p68 백신을 제공한다. 본 발명의 이러한 백신은 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원, 및 아쥬번트와 같은 수의과적으로-허용되는 캐리어를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원, 및 아쥬번트와 같은 수의과적으로-허용되는 캐리어를 포함하는 백신을 개에게 투여함으로써 보르데텔라 브론키셉티카에 의해서 야기된 질병으로부터 개를 보호하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 개에게 투여하는데 적합하며, 렙토스피라 브라티슬라바에 의해서 야기된 질병으로부터 개를 보호할 수 있는 렙토스피라 브라티슬라바 백신을 제공한다. 본 발명의 이러한 백신은 렙토스피라 브라티슬라바의 세포 제제, 및 아쥬번트와 같은 수의과적으로-허용되는 캐리어를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 렙토스피라 브라티슬라바의 세포 제제 및 아쥬번트와 같은 수의과적으로-허용되는 캐리어를 포함하는 백신을 개에게 투여함으로써 렙토스피라 브라티슬라바에 의해서 야기된 질병으로부터 개를 보호하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 개에게 투여하는데 적합한 배합 백신을 제공한다. 본 발명의 배합 백신은 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원과 함께, 다른 개 병원체(들)에 의해서 야기된 질병에 대항하여 개에게서 보호적 면역반응을 유도할 수 있는 이러한 다른 개 병원체로부터의 적어도 하나의 다른 항원을 포함한다. 이러한 다른 병원체는 개 디스템퍼 (CD) 바이러스, 개 아데노바이러스 타입 2 (CAV-2), 개 파라인플루엔자 (CPI) 바이러스, 개 파르보바이러스 (CPV), 개 코로나바이러스 (CCV), 개 헤르페스바이러스, 광견병 바이러스, 렙토스피라 브라티슬라바, 렙토스피라 캐니콜라, 렙토스피라 그립포타이포사, 렙토스피라 익테로헤모라지에, 렙토스피라 포모나, 렙토스피라 하르드죠보비스 (Leptospira hardjobovis), 포르파이로모나스 종 (Porphyromonas spp.), 박테리오데스 종 (Bacteriodes spp.), 레이쉬마니아 종 (Leishmania spp.), 보렐리아 종 (Borrelia spp.), 에를리키아 종 (Ehrlichia spp.), 마이코플라즈마 종 (Mycoplasma spp.) 및 마이크로스포룸 캐니스 (Microsporum canis)로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 배합물은 개 병원체(들)에 의해서 야기된 질병에 대항하여 개에게서 보호적 면역반응을 유도할 수 있는, 개 병원체로부터의 두개 또는 그 이상의 항원을 포함한다. 이러한 병원체는 개 디스템퍼 (CD) 바이러스, 개 아데노바이러스 타입 2 (CAV-2), 개 파라인플루엔자 (CPI) 바이러스, 개 파르보바이러스 (CPV), 개 코로나바이러스 (CCV), 개 헤르페스바이러스, 광견병 바이러스, 렙토스피라 브라티슬라바, 렙토스피라 캐니콜라, 렙토스피라 그립포타이포사, 렙토스피라 익테로헤모라지에, 렙토스피라 포모나, 렙토스피라 하르드죠보비스, 포르파이로모나스 종, 박테리오데스 종, 레이쉬마니아 종, 보렐리아 종, 에를리키아 종, 마이코플라즈마 종 및 마이크로스포룸 캐니스로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 배합 백신은 개 디스템퍼 (CD) 바이러스, 개 아데노바이러스 타입 2 (CAV-2), 개 파라인플루엔자 (CPI) 바이러스 및 개 파르보바이러스 (CPV)의 약독화된 스트레인 (strain); 개 코로나바이러스 (CCV)의 스트레인의 불활성화된 제제; 및 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원을 포함한다.
본 발명의 바람직한 배합 백신은 개 디스템퍼 (CD) 바이러스, 개 아데노바이러스 타입 2 (CAV-2), 개 파라인플루엔자 (CPI) 바이러스 및 개 파르보바이러스 (CPV)의 약독화된 스트레인; 및 개 코로나바이러스 (CCV)의 스트레인의 불활성화된 제제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 배합 백신은 개 디스템퍼 (CD) 바이러스, 개 아데노바이러스 타입 2 (CAV-2), 개 파라인플루엔자 (CPI) 바이러스 및 개 파르보바이러스 (CPV)의 약독화된 스트레인; 개 코로나바이러스 (CCV)의 스트레인의 불활성화된 제제; 보르데텔라 브론키셉티카 p68 단백질, 및 5 가지 렙토스피라 혈청형변이주 (serovar) (렙토스피라 브라티슬라바, 렙토스피라 캐니콜라, 렙토스피라 그립포타이포사, 렙토스피라 익테로헤모라지에 및 렙토스피라 포모나)의 불활성화된 세포 제제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 배합 백신은 개 디스템퍼 (CD) 바이러스, 개 아데노바이러스 타입 2 (CAV-2), 개 파라인플루엔자 (CPI) 바이러스 및 개 파르보바이러스 (CPV)의 약독화된 스트레인; 및 개 코로나바이러스 (CCV)의 스트레인의 불활성화된 제제; 및 5 가지 렙토스피라 혈청형변이주 (렙토스피라 브라티슬라바, 렙토스피라 캐니콜라, 렙토스피라 그립포타이포사, 렙토스피라 익테로헤모라지에 및 렙토스피라 포모나)의 세포 제제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 배합 백신은 개 디스템퍼 (CD) 바이러스, 개 아데노바이러스 타입 2 (CAV-2), 개 파라인플루엔자 (CPI) 바이러스 및 개 파르보바이러스 (CPV)의 약독화된 스트레인; 개 코로나바이러스 (CCV)의 스트레인의 불활성화된 제제; 및 5 가지 렙토스피라 혈청형변이주 (렙토스피라 브라티슬라바, 렙토스피라 캐니콜라, 렙토스피라 그립포타이포사, 렙토스피라 익테로헤모라지에 및 렙토스피라 포모나)의 불활성화된 세포 제제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 배합 백신은 CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스, CPV 스트레인의 약독화된 스트레인; 및 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 배합 백신은 CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스, CPV 스트레인의 약독화된 스트레인을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 배합 백신은 CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스, CPV 스트레인의 약독화된 스트레인; 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원; 및 렙토스피라 캐니콜라 및 렙토스피라 익테로헤모라지에의 불활성화된 세포 제제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 배합 백신은 CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스, CPV 스트레인의 약독화된 스트레인; 및 렙토스피라 캐니콜라 및 렙토스피라 익테로헤모라지에의 불활성화된 세포 제제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 배합 백신은 CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스, CPV 스트레인의 약독화된 스트레인, 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원, 및 5 가지 렙토스피라 혈청형변이주 (렙토스피라 브라티슬라바, 렙토스피라 캐니콜라, 렙토스피라 그립포타이포사, 렙토스피라 익테로헤모라지에 및 렙토스피라 포모나)의 불활성화된 세포 제제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 배합 백신은 CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스, CPV 스트레인의 약독화된 스트레인, 및 5 가지 렙토스피라 혈청형변이주 (렙토스피라 브라티슬라바, 렙토스피라 캐니콜라, 렙토스피라 그립포타이포사, 렙토스피라 익테로헤모라지에 및 렙토스피라 포모나)의 불활성화된 세포 제제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 배합 백신은 CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스, CPV 스트레인의 약독화된 스트레인, 및 4 가지 렙토스피라 혈청형변이주 (렙토스피라 캐니콜라, 렙토스피라 그립포타이포사, 렙토스피라 익테로헤모라지에 및 렙토스피라 포모나)의 불활성화된 세포 제제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 배합 백신은 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원 및 약독화된 CPI 바이러스를 포함한다.
또 다른 바람직한 배합 백신은 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원, 약독화된 CPI 바이러스, 및 렙토스피라 캐니콜라 및 렙토스피라 익테로헤모라지에의 불활성화된 세포 제제를 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 배합 백신을 개에게 투여함으로써 개 병원체에 의해서 야기된 질병으로부터 개를 보호하는 방법을 제공한다.
한가지 구체예에서, 본 발명은 보르데텔라 브론키셉티카에 의해서 야기된 질병으로부터 개를 보호할 수 있는, 개에게 투여하는데 적합한 일가 백신을 제공한다. 본 발명의 일가 백신은 재조합적으로 생산된 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원 및 아쥬번트와 같은 수의과적으로-허용되는 캐리어를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 재조합적으로 생산된 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원, 및 아쥬번트와 같은 수의과적으로-허용되는 캐리어를 포함하는 일가 백신을 개에게 투여함으로써 보르데텔라 브론키셉티카에 의해서 야기된 질병으로부터 개를 보호하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 개에게 투여하는데 적합한 배합 백신을 제공한다. 본 발명의 배합 백신은 재조합적으로 생산된 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원과 함께, 다른 항원(들)에 의해서 야기된 질병에 대항하여 개에게서 보호적 면역반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 이러한 다른 항원을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예는 개 병원체(들)에 의해서 야기된 질병에 대항하여 개에게서 보호적 면역반응을 유도할 수 있는, 개 병원체로부터의 두개 또는 그 이상의 항원을 포함한다.
본 발명의 바람직한 배합 백신은 개 디스템퍼 (CD) 바이러스, 개 아데노바이러스 타입 2 (CAV-2), 개 파라인플루엔자 (CPI) 바이러스 및 개 파르보바이러스 (CPV)의 약독화된 스트레인; 개 코로나바이러스 (CCV)의 스트레인의 불활성화된 제제; 및 4 가지 렙토스피라 혈청형변이주 (렙토스피라 캐니콜라, 렙토스피라 그립포타이포사, 렙토스피라 익테로헤모라지에 및 렙토스피라 포모나)의 제제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 배합 백신은 개 디스템퍼 (CD) 바이러스, 개 아데노바이러스 타입 2 (CAV-2), 개 파라인플루엔자 (CPI) 바이러스 및 개 파르보바이러스 (CPV)의 약독화된 스트레인; 개 코로나바이러스 (CCV)의 스트레인의 불활성화된 제제; 및 5 가지 렙토스피라 혈청형변이주 (렙토스피라 브라티슬라바, 렙토스피라 캐니콜라, 렙토스피라 그립포타이포사, 렙토스피라 익테로헤모라지에 및 렙토스피라 포모나)의 제제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 배합 백신은 CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스, CPV 스트레인의 약독화된 스트레인; 및 4 가지 렙토스피라 혈청형변이주 (렙토스피라 캐니콜라, 렙토스피라 그립포타이포사, 렙토스피라 익테로헤모라지에 및 렙토스피라 포모나)의 제제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 배합 백신은 CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스, CPV 스트레인의 약독화된 스트레인; 및 렙토스피라 캐니콜라 및 렙토스피라 익테로헤모라지에의 제제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 배합 백신은 CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스, CPV 스트레인의 약독화된 스트레인, 및 5 가지 렙토스피라 혈청형변이주 (렙토스피라 브라티슬라바, 렙토스피라 캐니콜라, 렙토스피라 그립포타이포사, 렙토스피라 익테로헤모라지에 및 렙토스피라 포모나)의 제제를 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 배합 백신을 개에게 투여함으로써 개 병원체에 의해서 야기된 질병으로부터 개를 보호하는 방법을 제공한다.
제한적인 방식이 아니라 설명을 명확히 하기 위하여, 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 특정한 특징, 구체예 또는 적용을 기술하거나 설명하는 이하의 세부항목 (subsection)으로 구분된다.
정의 및 약어
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "개 병원체에 의해서 야기된 질병으로부터 개를 보호하는"은 병원체에 의한 감염의 위험을 감소 또는 제거하거나, 감염의 증상을 개선 또는 완화시키거나, 감염으로부터의 회복을 가속화시키는 것을 의미한다. 보호는 예를 들어, 바이러스 또는 박테리아 부하 (load)의 감소, 바이러스 또는 박테리아 쉐딩 (shedding)의 감소, 감염의 발생율 또는 지속기간의 감소, 감소된 급성상 혈청 단백질 레벨, 감소된 직장 온도, 및/또는 사료 섭취 및/또는 성장의 증가가 있는 경우에 달성된다.
용어 "p68 항원"은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해서 측정된 것으로 68 kDa의 분자량을 갖는 단백질을 의미하며, p68-특이적 모노클로날 항체 보드 2-7 (ATCC#)에 의해서 인식되고, SEQ ID NO: 1로 기술된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 1과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
"실질적으로 동일한"은 적어도 약 90%, 바람직하게는 적어도 약 95%, 또는 더욱 바람직하게는 적어도 약 98%의 서열 동일성 정도를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것으로 용어 "일가 백신"은 하나의 주요 항원성분을 갖는 백신을 의미한다. 예를 들어, p68 일가 백신은 백신의 주요 항원성분으로서 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원을 포함하며, 보르데텔라 브론키셉티카에 의해서 야기된 질병으로부터 백신이 투여된 동물을 보호할 수 있다. 일가 백신의 또 다른 예는 백신의 주요 항원성분으로서 렙토스피라 브라티슬라바의 세포 제제를 포함하며, 렙토스피라 브라티슬라바에 의해서 야기된 질병으로부터 백신이 투여된 동물을 보호할 수 있다.
용어 "배합 백신"은 개에게서 보호적 면역반응을 유도할 수 있는 항원의 이가 또는 다가 배합물을 의미한다. 병원체 또는 병원체들에 대한 배합 백신의 보호적 효과는 통상적으로 동물 개체에서 면역반응, 세포-매개되거나 체액성인 면역반응 또는 이들 둘 다의 조합을 유도함으로써 달성된다.
"면역원성"은 개에게서 특정의 병원체에 대한 면역반응을 유발시키는 조성물의 능력을 의미한다. 면역반응은 세포독성 T-세포 및 사이토킨-생성 T-세포에 의해서 주로 매개되는 세포성 면역반응, 또는 헬퍼 (helper) T-세포에 의해서 주로 매개되는 체액성 면역반응일 수 있으며, 이것은 다시 항체 생산을 유도하는 B-세포를 활성화시킨다.
용어 "치료학적 유효량" 또는 "유효량"은 백신이 투여되는 개에게서 보호적 면역반응을 유발시키는데 충분한 일가 또는 배합 백신의 양을 의미한다. 면역반응은 세포성 및/또는 체액성 면역성의 유도를 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 치료학적으로 효과적인 백신의 양은 백신에 사용된 특정 항원, 개의 연령 및 상태, 및/또는 감염의 정도에 따라서 달라질 수 있으며, 수의사에 의해서 결정될 수 있다.
p68 백신
본 발명은 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원을 함유하는 백신 조성물이 보르데텔라 브론키셉티카에 의해서 야기된 질병으로부터 개를 효과적으로 보호하였음을 최초로 입증하였다. 본 발명의 백신 조성물은 상당한 백신접종후 반응을 야기하지 않으며, 강아지에게 투여하기에 안전하고, 장기간 동안 지속하는 동물에서의 보호적 면역성을 유도한다.
따라서, 본 발명의 한가지 구체예는 개에게 투여하기에 적합하며, 보르데텔라 브론키셉티카에 의해서 야기된 질병, 예를 들어, 감염성 기관기관지염 ("케넬 코프 (kennel cough)")으로부터 개를 보호할 수 있는, 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원 (또는 "p68 항원")을 함유하는 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 목적에 따르면, 용어 "p68 항원"은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해서 측정된 것으로서 68 kDa의 분자량을 갖는 단백질 (참조 도 5)을 의미하며, p68-특이적 모노클로날 항체 보드 2-7 (ATCC#)에 의해서 인식되고, SEQ ID NO: 1로 기술된 바와 같은 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 1과 실실적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는다. "실질적으로 동일한"은 적어도 약 90%, 바람직하게는 적어도 약 95%, 또는 더욱 바람직하게는 적어도 약 98%의 서열 동일성 정도를 의미한다. SEQ ID NO: 1과 실실적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 p68 항원의 예는 SEQ ID NO: 3으로 기술된 것으로서 WO 92/17587에 기술된 p68 항원이다. 본 발명의 p68 특이적 모노클로날 항체는 예를 들어, 천연 p68 단백질, 재조합체 p68 단백질 및 박테리아의 표면 상의 p68 단백질을 인식한다.
본 발명에 따르면, 본 발명에서 사용하기에 적합한 p68 항원에는 천연 p68 단백질 (즉, 보르데텔라 브론키셉티카로부터 정제된 천연적으로 존재하는 p68 단백질) 및 재조합적으로 생산된 p68 단백질이 포함된다.
보르데텔라 브론키셉티카로부터의 천연 p68의 정제는 예를 들어, 문헌 (Montaraz et al., Infection and Immunity 47: 744-751 (1985))에 기술되어 있으며, 또한 이하에 제시되는 실시예에 설명되어 있다. p68의 재조합체 생산은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 분자 클로닝 및 재조합체 발현기술 중의 어느 하나를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, p68을 코드화하는 핵산 분자를 박테리아, 효모 세포 (예를 들어, 피치아 (Pichia) 세포), 곤충 세포 또는 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)와 같은 적절한 숙주세포 내에 도입시킬 수 있다. p68-코드화 핵산 분자는 숙주세포 내에서 p68 항원의 발현을 일으킬 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 배치될 수 있다. 숙주세포에 의해서 발현된 p68은 일상적인 단백질 정제기술을 사용하여 쉽게 정제될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 p68 항원을 코드화한 SEQ ID NO: 2에 기술된 뉴클레오타이드 서열을 발현벡터 내에서 클로닝하고, 온도 민감성 프로모터에 작동가능하게 연결되어 배치된다. 발현벡터를 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 내에 도입시키고, p68 항원을 열유도 (heat induction)하여 발현시킨다. 세포를 용해시키고, p68 항원이 축적한 봉입체를 원심분리에 의해서 분리시킨다. 봉입체 내의 재조합체 p68을 SDS, 또는 우레아, 구아니딘 하이드로클로라이드, 나트륨 콜레이트, 타우로콜레이트, 및 나트륨 데옥시콜레이트와 같이 본 기술분야에서 공지된 그 밖의 다른 가용화제를 사용하여 가용화시킨다. 본 발명에 따라, 정제된 천연 또는 재조합체 p68 단백질을 수의과적으로-허용되는 캐리어와 배합하여 p68 백신 조성물을 형성시킨다.
용어 "수의과적으로-허용되는 캐리어"에는 모든 용매, 분산매질, 코팅, 아쥬번트, 안정화제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장화제, 흡착지연제 등이 포함된다. 희석제에는 물, 식염수, 덱스트로즈, 에탄올, 글리세롤 등이 포함될 수 있다. 등장화제에는 특히 염화나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 소르비톨 및 락토즈가 포함될 수 있다. 안정화제는 특히 알부민을 포함한다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 아쥬번트에는 다음과 같은 몇가지 아쥬번트 클래스가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다: 무기 염류, 예를 들어, 명반 (Alum), 수산화알루미늄, 인산알루미늄 및 인산칼슘; 표면활성제 및 미립자, 예를 들어, 비이온성 블럭 중합체 계면활성제 (예를 들어, 콜레스테롤), 바이로좀 (virosome), 사포닌 (예를 들어, Quil A, QS-21 및 GPI-0100), 프로테오좀, 면역자극성 컴플렉스, 코클리에이트 (cochleate), 4급 아민 (디메틸 디옥타데실 암모늄 브로마이드 (DDA)) 애브리딘 (avridine), 비타민 A, 비타민 E; RIBI 아쥬번트 시스템 (Ribi Inc.), 마이코박테리움 플레이 (Mycobacterium phlei)의 세포벽 골격 (Detox™), 뮤라밀 디펩타이드 (MDP) 및 트리펩타이드 (MTP), 모노포스포릴 지질 A, 바실루스 칼메트-게랑 (Bacillus Calmete-Guerin), 열불안정성 이. 콜라이 (E. coli) 장독소 (enterotoxin), 콜레라 독소, 트레할로즈 디마이콜레이트, CpG 올리고데옥스뉴클레오타이드와 같은 박테리아 생성물; 사이토킨 및 호르몬, 예를 들어, 인터류킨 (IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18), 과립구-대식세포 콜로니 자극인자, 데하이드로에피안드로스테론, 1,25-디하이드록시 비타민 D3; 다음이온, 예를 들어, 덱스트란; 폴리아크릴릭 (예를 들어, 폴리메틸메타크릴레이트, 카보폴 (Carbool) 934P); 캐리어, 예를 들어, 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 콜레라 독소 B 서브유니트, 장독소생산성 (enterotoxigenic) 이. 콜라이의 돌연변이체 열불안정성 장독소 (rmLT), 열쇼크 단백질; 수중유 에멀젼, 예를 들어, 암피젠 (AMPHIGEN™; Hydronics, USA); 및 예를 들어, 프로인트 (Freund's) 완전 및 불완전 아쥬번트와 같은 유중수 에멀젼.
본 발명의 백신에서 사용하기에 바람직한 아쥬번트에는 퀼 (Quil) A 및 콜레스테롤이 포함된다.
p68 항원 및 수의과적으로-허용되는 캐리어는 백신 조성물을 형성시키는 편리하고 실용적인 어떤 방식으로도, 예를 들어, 혼합, 용해, 현탁, 유화, 캅셀화, 흡수 등에 의해서 배합될 수 있으며, 주사, 이식, 흡입, 섭취 등에 적합한 정제, 캅셀제, 분말, 시럽, 현탁제와 같은 제제로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 백신은 약 0.1 내지 5 ㎖의 용량으로, 바람직하게는 약 0.5 내지 2.5 ㎖, 더 더욱 바람직하게는 약 1 ㎖의 용량으로 주사하여 개에게 투여될 수 있도록 제제화된다. 적절하다면, 본 발명의 약제학적 조성물은 잘 알려진 방법에 의해서 무균 상태로 제조되어야 한다.
백신 중의 p68의 양은 면역화-유효량이어야 하며, 일반적으로 투약량당 0.5-1000 ㎍의 범위이다. 바람직하게는, p68의 양은 투약량당 1-260 ㎍의 범위이다. 더욱 바람직하게는, p68의 양은 투약량당 10-100 ㎍의 범위이다. 더 더욱 바람직하게는, p68의 양은 투약량당 약 15 내지 25 ㎍이다.
백신에서 사용하기에 적합한 아쥬번트의 양은 사용된 아쥬번트의 성질에 따라서 좌우된다. 예를 들어, 퀼 A 및 콜레스테롤이 아쥬번트로 사용되는 경우에, 퀼 A는 일반적으로 투약량당 약 1-1000 ㎍, 바람직하게는 투약량당 30-100 ㎍, 더욱 바람직하게는 투약량당 약 50-75 ㎍의 양으로 사용되며; 콜레스테롤은 일반적으로 투약량당 약 1-1000 ㎍, 바람직하게는 투약량당 30-100 ㎍, 더욱 바람직하게는 투약량당 약 50-75 ㎍의 양으로 사용된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 상술한 바와 같은 p68 백신 조성물을 개에게 투여함으로써 보르데텔라 브론키셉티카에 의해서 야기된 질병으로부터 개를 보호하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 p68 백신 조성물은 적어도 약 4개월 동안, 바람직하게는 적어도 약 6개월 동안, 더 더욱 바람직하게는 약 1년 동안의 장기간 면역성을 개에게 제공한다.
본 발명에 따라, p68 백신은 경구, 비내, 점막, 국소, 경피 및 비경구 (예를 들어, 정맥내, 복강내, 피내, 피하 또는 근육내)를 포함한 공지된 어떤 경로로도 개에게 투여될 수 있다. 투여는 또한, 바늘이 없는 (needle-free) 송달장치를 사용하여서 달성될 수도 있다. 투여는 경로의 조합을 사용하여, 예를 들어, 일차 투여는 비경구적 경로를 사용하고, 후속 투여는 점막 경로를 사용하여 이루어질 수 있다.
바람직한 투여경로에는 피하 및 근육내 투여가 포함된다.
본 발명의 p68 백신 조성물은 적어도 6 주령, 바람직하게는 적어도 7 주령, 더욱 바람직하게는 적어도 8 또는 9 주령의 개에게 투여될 수 있다. 개는 p68 백신의 1 회 투약량에 의해서, 또는 2 회 이상의 투약량에 의해서 백신접종될 수 있다. 바람직하게는 p68 백신의 2 회 투약량을 2 회의 투여 사이에 약 2-4주일, 바람직하게는 약 3주일의 간격을 두고 개에게 투여한다. 4개월 연령이 되기 전에 개를 백신접종하는 경우에는, 모계 항체가 4개월 미만의 강아지에게서 적절한 면역반응의 발현을 저해할 수 있기 때문에 4개월의 연령에 도달할 때까지는 1 회 투약량으로 백신접종하는 것이 추천된다. 개는 또한 매년 1 회 투약량으로 백신접종할 수도 있다. 사육 (breeding), 보딩 (boarding) 및 전시 (showing) 상황과 같이 보르데텔라 브론키셉티카 노출이 있을 것 같은 경우에는 추가의 부스터 (booster)가 이들 상황이 발생한 지 1년 이내에, 바람직하게는 6개월 이내에 제공될 수 있다.
배합 백신
또 다른 구체예에서, 본 발명은 배합 백신 및 이러한 배합 백신을 투여하여 보르데텔라 브론키셉티카 및/또는 하나 또는 그 이상의 다른 개 병원체로부터 개를 보호하는 방법을 제공한다. 본 발명의 배합 백신 조성물은 효능 간섭을 나타내지 않으며, 강아지에게 투여하기에 안전하다.
본 발명의 배합 백신은 상술한 바와 같이 제조될 수 있는 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원과 함께, 다른 개 병원체에 의해서 야기된 질병에 대항하여 개에게서 보호적 면역반응을 유도할 수 있는 다른 개 병원체로부터의 적어도 하나의 항원을 포함한다. 이러한 배합 백신은 또한, p68 항원이 없이 이러한 다른 개 병원체 두개 또는 그 이상의 배합물을 포함한다.
이러한 다른 병원체에는 개 디스템퍼 (CD) 바이러스, 개 아데노바이러스 타입 2 (CAV-2), 개 파라인플루엔자 (CPI) 바이러스, 개 파르보바이러스 (CPV), 개 코로나바이러스 (CCV), 개 헤르페스바이러스 및 광견병 바이러스가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 백신 조성물에서 사용하기 위한 이들 병원체로부터의 항원은 변형된 생바이러스 제제 또는 불활성화된 바이러스 제제의 형태일 수 있다. 이들 바이러스의 독성 스트레인을 약독화시키는 방법 및 불활성화된 바이러스 제제를 제조하는 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제 4,567,042 및 4,567,043 호에 기술되어 있다.
그 밖의 다른 병원체에는 또한 렙토스피라 브라티슬라바, 렙토스피라 캐니콜라, 렙토스피라 그립포타이포사, 렙토스피라 익테로헤모라지에, 렙토스피라 포모나, 렙토스피라 하르드죠보비스, 포르파이로모나스 종, 박테리오데스 종, 레이쉬마니아 종, 보렐리아 종, 에를리키아 종, 마이코플라즈마 종 및 마이크로스포룸 캐니스가 포함된다. 본 발명의 백신 조성물에서 사용하기 위한 이들 병원체로부터의 항원은 본 기술분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 불활성화된 전체 또는 부분적 세포 제제의 형태일 수 있다. 예를 들어, 불활성화된 전체 또는 부분적 렙토스피라 세포 제제를 제조하는 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 (Yan, K-T, "Aspects of Immunity to Leptospira borgpetersenii serovar hardjo", PhD Thesis, Appendix I, 1996. Faculty of Agriculture and Food Science, The Queen's University of Belfast; Mackintosh et al., "The use of a hargjo-pomona vaccine to prevent leptospiruria in cattle xposed to natural challenge with Leptospia interrogans serovar hardjo", New Zealand Vet. J. 28:174-177, 1980; Bolin et al., "Effect of vaccination with a pentavalent leptospiral vaccine on Leptospira interrogans serovar hardjo type hardjo-bovis infection of pregnant cattle", Am. J. Vet. Res. 50:161-165, 1989)에 기술되어 있다.
본 발명에 따라 배합 백신은 일반적으로 수의과적으로-허용되는 캐리어를 포함한다. 상술한 바와 같이, 수의과적으로-허용되는 캐리어에는 모든 용매, 분산매질, 코팅, 아쥬번트, 안정화제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장화제, 흡착지연제 등이 포함된다. 희석제에는 물, 식염수, 덱스트로즈, 에탄올, 글리세롤 등이 포함될 수 있다. 등장화제에는 특히 염화나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 소르비톨 및 락토즈가 포함될 수 있다. 안정화제는 특히 알부민을 포함한다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 아쥬번트에는 다음과 같은 몇가지 아쥬번트 클래스가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다: 무기 염류, 예를 들어, 명반, 수산화알루미늄, 인산알루미늄 및 인산칼슘; 표면활성제 및 미립자, 예를 들어, 비이온성 블럭 중합체 계면활성제 (예를 들어, 콜레스테롤), 바이로좀, 사포닌 (예를 들어, Quil A, QS-21 및 GPI-0100), 프로테오좀, 면역자극성 컴플렉스, 코클리에이트, 4급 아민 (디메틸 디옥타데실 암모늄 브로마이드 (DDA)) 애브리딘, 비타민 A, 비타민 E; RIBI 아쥬번트 시스템 (Ribi Inc.), 마이코박테리움 플레이의 세포벽 골격 (Detox™), 뮤라밀 디펩타이드 (MDP) 및 트리펩타이드 (MTP), 모노포스포릴 지질 A, 바실루스 칼메트-게랑, 열불안정성 이. 콜라이 장독소, 콜레라 독소, 트레할로즈 디마이콜레이트, CpG 올리고데옥스뉴클레오타이드와 같은 박테리아 생성물; 사이토킨 및 호르몬, 예를 들어, 인터류킨 (IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18), 과립구-대식세포 콜로니 자극인자, 데하이드로에피안드로스테론, 1,25-디하이드록시 비타민 D3; 다음이온, 예를 들어, 덱스트란; 폴리아크릴릭 (예를 들어, 폴리메틸메타크릴레이트, 카보폴 934P); 캐리어, 예를 들어, 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 콜레라 독소 B 서브유니트, 장독소생산성 이. 콜라이의 돌연변이체 열불안정성 장독소 (rmLT), 열쇼크 단백질; 수중유 에멀젼, 예를 들어, 암피젠 (AMPHIGEN™; Hydronics, USA); 및 예를 들어, 프로인트 완전 및 불완전 아쥬번트와 같은 유중수 에멀젼.
본 발명에 따르는 배합 백신에서 사용하기에 바람직한 아쥬번트에는 1) 퀼 A + 콜레스테롤; 및 2) 수산화알루미늄이 포함된다. 백신에서 사용하기에 적합한 아쥬번트의 양은 사용된 아쥬번트의 성질에 따라서 좌우된다. 예를 들어, 퀼 A 및 콜레스테롤이 아쥬번트로 사용되는 경우에, 퀼 A는 일반적으로 투약량당 약 1-1000 ㎍, 바람직하게는 투약량당 30-100 ㎍, 더욱 바람직하게는 투약량당 약 50-75 ㎍의 양으로 사용되며; 콜레스테롤은 일반적으로 투약량당 약 1-1000 ㎍, 바람직하게는 투약량당 30-100 ㎍, 더욱 바람직하게는 투약량당 약 50-75 ㎍의 양으로 사용된다. 수산화알루미늄이 아쥬번트로 사용되는 경우에, 이것은 일반적으로 약 0.5-20%, 바람직하게는 약 0.5-10%, 더욱 바람직하게는 약 1-2%의 양으로 사용된다.
p68 항원, 다른 병원체로부터의 하나 또는 그 이상의 항원, 및/또는 수의과적으로-허용되는 캐리어는 배합 백신 조성물을 형성시키는 편리하고 실용적인 어떤 방식으로도, 예를 들어, 혼합, 용해, 현탁, 유화, 캅셀화, 흡수 등에 의해서 배합될 수 있으며, 주사, 이식, 흡입, 섭취 등에 적합한 정제, 캅셀제, 분말, 시럽, 현탁제와 같은 제제로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 백신은 약 0.1 내지 5 ㎖의 용량으로, 바람직하게는 약 0.5 내지 2.5 ㎖, 더 더욱 바람직하게는 약 1 ㎖의 용량으로 주사하여 개에게 투여될 수 있도록 제제화된다.
배합 백신은 약독화된 바이러스 스트레인의 동결-건조된 제제 (또는 스프레이 건조 또는 건조와 같은 다른 방법에 의해서 제조된 제제) 및 바이러스 제제를 액체 제제로 재수화시킴으로써 제조될 수 있으며, 여기에서 액체 제제는 렙토스피랄 항원으로 구성되고, 멸균 식염수에 용해되며, 퀼 A 및 콜레스테롤로 보강된다. 이러한 배합 백신은 또한, 약독화된 바이러스 스트레인의 동결-건조된 제제 및 렙토스피라 바이러스 제제 (또는 스프레이 건조 또는 건조와 같은 다른 방법에 의해서 제조된 제제)를 멸균 용액으로 재수화시키거나, 상기의 동결-건조된 제제를 CCV + 희석제로 재수화시킴으로써 제조될 수도 있다.
본 발명에 따라 배합 백신은 적어도 약 6 주령, 바람직하게는 적어도 7 주령, 더욱 바람직하게는 적어도 8 또는 9 주령의 개에게 투여될 수 있다. 배합 백신은 2 내지 4 회 투약량으로, 바람직하게는 2 내지 3 회 투약량으로 투여될 수 있다. 투약량은 각각의 투약량 사이에 2 내지 6주일, 바람직하게는 각각의 투약량 사이에 2 내지 4주일의 간격을 두고 투여될 수 있다.
투여는 경구, 비내, 점막, 국소, 경피 및 비경구 (예를 들어, 정맥내, 복강내, 피내, 피하 또는 근육내)를 포함한 공지된 어떤 경로로도 수행될 수 있다. 투여는 또한, 바늘이 없는 송달장치를 사용하여서 달성될 수도 있다. 투여는 또한 경로의 조합을 사용하여, 예를 들어, 일차 투여는 비경구적 경로를 사용하고, 후속 투여는 점막 경로를 사용하여 이루어질 수 있다. 바람직한 투여경로에는 피하 및 근육내 투여가 포함된다.
바람직한 배합 백신 및 백신접종방법
본 발명의 바람직한 배합 백신은 CD 바이러스의 약독화된 스트레인, CAV-2의 약독화된 스트레인, CPI 바이러스의 약독화된 스트레인, CPV의 약독화된 스트레인, CCV 스트레인의 불화성화된 제제, 및 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원을 포함한다.
특히 바람직한 배합 백신은 "스나이더 힐 (Snyder Hill)" 스트레인 (National Veterinary Service Laboratory, A,es, IA)로 지정되는 약독화된 CD 바이러스 스트레인, "맨하탄 (Manhattan)" 스트레인 (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA)으로 지정되는 약독화된 CAV-2 스트레인, "NL-CPI-5" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA)의 명칭을 갖는 약독화된 CPI 바이러스 스트레인, "NL-35-D" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA)의 명칭을 갖는 약독화된 CPV 스트레인, "NL-18" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA)의 명칭을 갖는 CCV 스트레인의 불화성화된 제제, 및 SEQ ID NO: 1의 서열을 갖는 재조합체 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원을 포함한다. 본 발명에서 "p68/5CV 배합 백신"으로도 불리는 이러한 배합 백신은 바람직하게는 약독화된 바이러스 스트레인의 동결-건조된 제제 및 바이러스 제제를 액체 제제로 재수화시킴으로써 제조되며, 여기에서 액체 제제는 멸균 식염수에 용해되고 퀼 A 및 콜레스테롤로 보강된 p68 항원으로 구성된다. p68 항원이 없는 이러한 배합물은 본 발명에서 5CV 배합물로 불린다. 이러한 배합 백신은 바람직하게는 약독화된 바이러스 스트레인의 동결-건조된 제제 및 바이러스 제제를 액체 제제로 재수화시킴으로써 제조되며, 여기에서 액체 제제는 멸균 식염수로 구성되고, 퀼 A 및 콜레스테롤로 보강된다.
또 다른 특히 바람직한 배합 백신은 p68/5CV 백신의 항원성 성분 및 5 가지 렙토스피라 종, 즉 렙토스피라 브라티슬라바 (예를 들어, National Veterinary Service Laboratory (Ames, IA)로부터 수득될 수 있는 렙토스피라 브라티슬라바 스트레인), 렙토스피라 캐니콜라 (예를 들어, 스트레인 C-5, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), 렙토스피라 그립포타이포사 (예를 들어, 스트레인 MAL 1540, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), 렙토스피라 익테로헤모라지에 (예를 들어, 스트레인 NADL 11403, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA) 및 렙토스피라 포모나 (예를 들어, 스트레인 T262, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA)의 불활성화된 전세포 제제를 포함한다. 본 발명에서 "p68/5CV-렙토스피라 배합 백신"으로도 또한 불리는 이러한 배합 백신은 바람직하게는 약독화된 바이러스 스트레인의 동결-건조된 제제 (또는 스프레이 건조 또는 건조와 같은 다른 방법에 의해서 제조된 제제) 및 바이러스 제제를 액체 제제로 재수화시킴으로써 제조되며, 여기에서 액체 제제는 p68 항원 및 렙토스피랄 항원으로 구성되고, 멸균 식염수에 용해되며, 퀼 A 및 콜레스테롤로 보강된다. p68 항원이 없는 이 배합물은 본 발명에서 5CV-5렙토스피라 배합물로 불린다. p68 항원이 없고, 렙토스피라 브라티슬라바가 없는 이 배합물은 본 발명에서 5CV-4렙토스피라 배합물로 불린다. p68 항원이 없고 렙토스피라 캐니콜라 및 렙토스피라 익테로헤모라지에가 있는 5CV 배합물은 본 발명에서 5CV-2렙토스피라 배합물로 불린다. 이러한 배합 백신은 바람직하게는 약독화된 바이러스 스트레인의 동결-건조된 제제 (또는 스프레이 건조 또는 건조와 같은 다른 방법에 의해서 제조된 제제) 및 바이러스 제제를 액체 제제로 재수화시킴으로써 제조되며, 여기에서 액체 제제는 렙토스피랄 항원으로 구성되고, 멸균 식염수에 용해되며, 퀼 A 및 콜레스테롤로 보강된다. 이러한 배합 백신은 또한 약독화된 바이러스 스트레인의 동결-건조된 제제 및 렙토스피라 바이러스 제제 (또는 스프레이 건조 또는 건조와 같은 다른 방법에 의해서 제조된 제제)를 멸균 용액으로 재수화시키거나, 상기의 동결-건조된 제제를 CCV + 희석제로 재수화시킴으로써 제조된다.
본 발명에 따라, p68/5CV, p68/5CV-렙토스피라, 5CV, 5CV-5렙토스피라, 5CV-4렙토스피라, 및 5CV-2렙토스피라 배합 백신은 4 주령 또는 그 이상, 바람직하게는 6 주령 또는 그 이상의 건강한 개에게, 바람직하게는 각각 약 3주일의 간격을 두고 투여되는 3 회의 투약량으로 투여될 수 있다. 개는 1 회 용량으로 매년 재백신접종될 수 있다. 사육, 보딩 및 전시상황과 같이 보르데텔라 브론키셉티카 및/또는 개 바이러스 노출이 있을 것 같은 경우에는 추가의 부스터가 이들 상황이 발생한 지 1년 이내에, 바람직하게는 6개월 이내에 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 배합 백신은 CD 바이러스의 약독화된 스트레인, CAV-2의 약독화된 스트레인, CPI 바이러스의 약독화된 스트레인, CPV의 약독화된 스트레인, 및 재조합체 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원을 포함한다.
특히 바람직한 배합 백신은 "스나이더 힐" 스트레인 (National Veterinary Service Laboratory, A,es, IA)로 지정되는 약독화된 CD 바이러스 스트레인, "맨하탄" 스트레인 (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA)으로 지정되는 약독화된 CAV-2 스트레인, "NL-CPI-5" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA)의 명칭을 갖는 약독화된 CPI 바이러스 스트레인, "NL-35-D" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA)로 지정된 약독화된 CPV 스트레인, 및 SEQ ID NO: 1의 서열을 갖는 재조합체 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원을 포함한다. 본 발명에서 "p68/DA2PP 배합 백신"으로도 불리는 이러한 배합 백신은 바람직하게는 약독화된 바이러스 스트레인의 동결-건조된 제제 (또는 스프레이 건조 또는 건조와 같은 다른 방법에 의해서 제조된 제제)를 액체 제제로 재수화시킴으로써 제조되며, 여기에서 액체 제제는 멸균 식염수에 용해되고 퀼 A 및 콜레스테롤로 보강된 p68 항원으로 구성된다. p68 항원이 없는 이러한 배합 백신은 DA2PP 배합 백신으로 불린다. 이러한 배합 백신은 바람직하게는 약독화된 바이러스 스트레인의 동결-건조된 제제 (또는 스프레이 건조 또는 건조와 같은 다른 방법에 의해서 제조된 제제)를 액체 제제로 재수화시킴으로써 제조되며, 여기에서 액체 제제는 멸균 식염수로 구성되고, 퀼 A 및 콜레스테롤로 보강된다.
또 다른 특히 바람직한 배합 백신은 p68/DA2PP 백신의 항원성 성분 및 2 가지 렙토스피라 종, 즉 렙토스피라 캐니콜라 (예를 들어, 스트레인 C-51, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA) 및 렙토스피라 익테로헤모라지에 (예를 들어, 스트레인 NADL 11403, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA)의 불활성화된 전세포 제제를 포함한다. 대용으로, 바람직한 배합 백신은 p68/DA2PP 배합 백신의 항원성 성분 및 5 가지 렙토스피라 종, 즉 렙토스피라 브라티슬라바, 렙토스피라 캐니콜라, 렙토스피라 그립포타이포사, 렙토스피라 익테로헤모라지에 및 렙토스피라 포모나의 불활성화된 전세포 제제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 "p68/DA2PP-렙토스피라 배합 백신"으로도 또한 불리는 이들 배합 백신은 바람직하게는 약독화된 바이러스 스트레인의 동결-건조된 제제 (또는 스프레이 건조 또는 건조와 같은 다른 방법에 의해서 제조된 제제) 및 바이러스 제제를 액체 제제로 재수화시킴으로써 제조되며, 여기에서 액체 제제는 p68 항원 및 렙토스피랄 항원으로 구성되고, 멸균 식염수에 용해되며, 퀼 A 및 콜레스테롤로 보강된다.
대용으로, 또 다른 바람직한 배합 백신은 DA2PP 배합 백신의 항원성 성분 및 5 가지 렙토스피라 종, 즉 렙토스피라 브라티슬라바, 렙토스피라 캐니콜라, 렙토스피라 그립포타이포사, 렙토스피라 익테로헤모라지에 및 렙토스피라 포모나의 불활성화된 전세포 제제를 포함한다. 또 다른 바람직한 배합 백신은 DA2PP 배합 백신의 항원성 성분 및 4 가지 렙토스피라 종, 즉 렙토스피라 캐니콜라, 렙토스피라 그립포타이포사, 렙토스피라 익테로헤모라지에 및 렙토스피라 포모나의 불활성화된 전세포 제제를 포함한다. 본 발명에서 "DA2PP-렙토스피라 배합 백신"으로도 또한 불리는 이들 배합 백신은 바람직하게는 약독화된 바이러스 스트레인의 동결-건조된 제제 (또는 스프레이 건조 또는 건조와 같은 다른 방법에 의해서 제조된 제제) 및 바이러스 제제를 액체 제제로 재수화시킴으로써 제조되며, 여기에서 액체 제제는 렙토스피랄 항원으로 구성되고, 멸균 식염수에 용해되며, 퀼 A 및 콜레스테롤로 보강된다.
본 발명에 따라, p68/DA2PP, p68/DA2PP-렙토스피라, DA2PP 및 DA2PP-렙토스피라 배합 백신은 6 주령 또는 그 이상, 바람직하게는 8 주령 또는 그 이상의 건강한 개에게, 바람직하게는 각각 약 3주일의 간격을 두고 투여되는 2 회의 투약량으로 투여될 수 있다. 적어도 12 주령의 개에게 투여된다면 1 회 용량이 충분할 수 있다. 개는 1 회 용량으로 매년 재백신접종될 수 있다. 사육, 보딩 및 전시상황과 같이 보르데텔라 브론키셉티카 및/또는 개 바이러스 노출이 있을 것 같은 경우에는 추가의 부스터가 이들 상황이 발생한 지 1년 이내에, 바람직하게는 6개월 이내에 제공될 수 있다. 또 다른 바람직한 배합 백신은 p68 항원, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1을 갖는 재조합체 p68 항원과 함께 CPI의 약독화된 스트레인을 포함한다.
또 다른 바람직한 배합 백신은 p68 항원, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1을 갖는 재조합체 p68 항원, CPI의 약독화된 스트레인, 및 렙토스피라 캐니콜라 (예를 들어, 스트레인 C-51, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA) 및 렙토스피라 익테로헤모라지에 (예를 들어, 스트레인 NADL 11403, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA)와 같은 적어도 두개의 렙토스피라 종을 포함한다.
본 발명의 배합 백신 중의 p68 항원 및 하나 또는 그 이상의 다른 병원체로부터의 항원(들)의 양은 면역화-유효량이어야 한다. 일반적으로, 배합 백신 중의 p68 항원은 투약량당 적어도 약 0.5 ㎍의 양이어야 한다. 약독화된 CD 바이러스는 투약량당 적어도 약 102 내지 약 109 TCID50 (투약량당 TCID50은 50% 세포변성효과의 조직배양물 감염성 용량)의 양, 바람직하게는 투약량당 약 104 내지 약 106 TCID50의 범위가 되어야 한다. 약독화된 CAV-2는 투약량당 적어도 약 102 TCID50 내지 약 109 TCID50의 양, 바람직하게는 투약량당 약 104.0 내지 약 106.0 TCID50의 범위가 되어야 한다. 약독화된 CPI 바이러스는 투약량당 적어도 약 102 TCID50 내지 약 109 TCID50의 양, 바람직하게는 투약량당 약 106 내지 약 108 TCID50의 범위가 되어야 한다. 약독화된 CPV는 투약량당 적어도 약 102 TCID50 내지 약 109 TCID50의 양, 바람직하게는 투약량당 약 107 내지 약 109 TCID50의 범위의 양이 되어야 한다. 블활성화된 바이러스 제제 내에서 CCV의 양은 투약량당 적어도 약 100 상대단위 (relative unit), 바람직하게는 투약량당 1000-4500 상대단위의 범위가 되어야 한다. 백신 내의 각각의 렙토스피라 종은 백신 투약량당 약 100-3500 NU (비탁단위 (nephelometric units))의 범위, 바람직하게는 투약량당 200-2000 NU의 범위가 되어야 한다.
배합 백신은 백신이 0.1 ㎖ 내지 5 ㎖, 바람직하게는 0.5 ㎖ 내지 2.5 ㎖, 더욱 바람직하게는 약 1 ㎖의 용량으로 주사하여 개에게 투여될 수 있도록 제제화된다.
본 발명은 이하의 비-제한적 실시예에 의해서 더 설명된다.
[실시예]
실시예 1
개 보르데텔라 p68 재조합체 항원 투약량 역가시험
백신:
실험적 백신 항원은 이. 콜라이 스트레인 LW68에 의해서 생산된 보르데텔라 브론키셉티카의 재조합체 p68 외부막 단백질 (SEQ ID NO: 1)이었다. 백신은 1 ㎖ 투약량 중에 50 ㎍의 QAC (퀼 A/50 ㎍ 콜레스테롤)로 보강된 가변적인 레벨의 SDS (나트륨 도데실 설페이트) 가용화된 p68을 함유하였다.
공격물질:
보르데텔라 브론키셉티카 (개 분리물 #85B, 계대 #3, 롯트 #051597)의 에어로졸이 공격물질로 사용되었다. 평균 평판계수량은 1.59 ×108 CFU/㎖였다.
동물:
60 마리의 수컷 및 암컷 강아지를 무작위적으로 6 개의 처리군 중의 하나에 배치하였다 (10 마리의 강아지/군). 강아지를 출혈시키고, 기관 면봉법 (tracheal swabs)은 최초 백신접종하기 41일 전에 및 다시 최초 백신접종하기 28일 전에 수행하고, 혈청양성 또는 배양물 양성 동물은 시험으로부터 제외시켰다.
동물을 무작위 완전 블럭 디자인 (randomized complete block design)에 따라서 무작위적으로 처리 및 방 (rooms)을 지정하였다. 백신접종-후 관찰은 백신 지정 군에 대한 지식이 없이 수행하였다.
디자인:
Figure pat00001

방법:
IVP 투여:
동물은 0일에 위약 또는 실험용 백신으로 백신접종하였다. 이차 백신접종은 21일에 투여하였다. 일차 백신접종은 오른쪽 목에서 피하로 투여하였으며, 이차 백신접종은 왼쪽 목에서 피하로 투여하였다.
공격투여:
모든 동물들은 이차 백신접종한 지 28일 후에 보르데텔라 브론키셉티카의 에어로졸로 공격하였다. 동물들은 공격한 후 2일부터 14일까지 (51일부터 63일)의 날들에 하루에 두번씩 (한번은 오전, 한번은 오후), 30분의 기간 동안 기침에 대하여 모니터하였다.
관찰 및 샘플 수집:
모든 주사부위는 각각의 백신접종 후의 7일 동안 (0일부터 7일까지 및 21일부터 28일까지) 및 각각의 백신접종 후의 14일째 날 (14일 및 35일)에 촉진하여 삼차원적으로 측정하였다.
직장 온도는 백신접종한 날, 및 각각의 백신접종 후에 3일 동안 (0일부터 3일까지 및 21일부터 24일까지)에 기록하였다.
혈액은 백신접종한 날 (0일 및 21일) 및 42, 50 및 63일에 수집하였으며, 보르데텔라 브론키셉티카로부터 정제된 p68 단백질에 대한 특이적 항체에 대하여 ELISA로 시험하였다. 혈액은 또한 42, 49, 50, 52, 54, 56 및 58일에 수집하였으며, 혈청 아밀로이드 A (SAA)애 대해서 분석하였다.
모든 동물은 보르데텔라 브론키셉티카 분리를 위해서 기관 면봉법을 수행하였으며, 혈액은 백신접종하기 전 (벤더 (vendor)에서, 및 -41일 및 -28일에) 및 49일에 보르데텔라 브론키셉티카 응집반응 역가를 위해서 수집하였다.
보르데텔라 P68 개 및 마우스 항체 역가측정 DAB ELISA
정제된 천연 p68을 0.01 M 보레이트 완충액 중에서 600 ng/㎖로 희석하고, 각각의 웰에 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 배양하였다. 그 후, 플레이트를 과량의 PBS-트윈 20으로 한번 세척하였다. PBS 중의 1% 탈지분유를 200 ㎕/웰로 플레이트에 첨가하였다. 그 후, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 플레이트를 과량의 PBS-트윈 20으로 한번 세척하였다.
개 또는 마우스 혈청을 ELISA 플레이트의 윗줄에 1:50 희석도로 첨가하고, 2 배 계열희석된 혈청을 플레이트 아래쪽으로 모두 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 플레이트를 과량의 PBS-트윈 20으로 3 회 세척하였다.
상기에서 개 혈청과 함께 배양한 플레이트에, 1:2000 희석도로 희석된 퍼옥시다제 표지된 염소 안티-개 IgG (H+L)를 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 그 후, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기에서 마우스 혈청과 함께 배양한 플레이트에, 1:4000 희석도로 희석된 퍼옥시다제 표지된 염소 안티-마우스 IgG (H+L)를 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 그 후, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 플레이트를 과량의 PBS-트윈 20으로 3 회 세척하였다.
ABTS 기질을 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 대략 20분 후에 플레이트를 분자장치 (Molecular Devices) 또는 동등한 플레이트 판독기를 사용하여 405-490 nm에서 판독하였다.
데이타 분석:
개 기침의 횟수에서의 처리 차이를 피셔정밀검정 (Fisher's Exact Test)을 사용하여 시험하였다. 5% 수준의 유의성이 사용되었다.
ELISA 역가는 일반적 선형혼합모델 (general linear mixed model)을 사용하여 분석하기 전에 로그 변환시켰다. 95% 신뢰수준을 사용하여 처리 차이를 평가하였다. 공격 관찰은 하루에 두번, 각각 30분 동안씩 모니터하였다.
결과:
기관 면봉 배양물 및 응집반응 역가
기관 면봉 배양물 및 응집반응 역가를 평가하여 시험에 참가한 동물의 보르데텔라 브론키셉티카 상태를 모니터하였다. 다수의 개는 다양한 시점에서 증가된 역가를 나타내었지만, 역가는 공격하기 전에 128 이상으로 증가하지 않았다.
주사부위 관찰결과
일차 백신접종 후의 주사부위 반응은 표 1에 나타내었다. 가장 큰 주사부위 반응은 T05 (64 ㎍) 백신접종된 동물에서 관찰되었으며, 가장 큰 평균 주사부위 반응은 단지 14.69 ㎤ (백신접종 후 2일)로 측정되었다. T03 (4 ㎍), T04 (16 ㎍) 및 T06 (256 ㎍) 백신접종된 동물은 백신접종 후 7일까지 다양한 주사부위 반응을 나타내었다. T02 (1 ㎍) 백신접종된 동물은 단지 백신접종 후 1일에만 반응을 나타내었다. 백신접종 후 7일째까지 처리군들 사이에서는 주사부위 반응에서 통계학적으로 유의적인 차이는 없었다. 14일까지 모든 주사부위 반응은 사라졌다.
이차 백신접종 후의 주사부위 반응은 표 2에 나타내었다. 이차 백신접종 후에 가장 큰 평균 주사부위 반응은 T06 (256 ㎍)에서 관찰되었으며, 가장 큰 평균 주사부위 반응은 50.03 ㎤ (백신접종 후 1일)로 측정되었다. 주사부위 반응은 T05 (64 ㎍) 및 T04 (16 ㎍) 동물에서 이차 백신접종 후 7일까지 나타났다. 최소 주사부위 반응은 T03 (4 ㎍) 및 T02 (1 ㎍) 동물에서 백신접종 후 7일까지 나타났다. 위약군과 통계학적으로 차이가 없는 주사부위 반응은 백신접종 후에 T02 (1 ㎍) 및 T03 (4 ㎍)에서 나타났다. 이차 백신접종 후의 14일에는 주사부위 반응이 관찰되지 않았다.
일차 백신접종 후의 주사부위 반응의 빈도는 표 3에 나타내었다. 일차 백신접종 후의 어떤 시점에서라도 반응을 나타내는 주사부위의 최고의 전반적 LSM 빈도 76%는 T06 (256 ㎍)에 의한 백신접종으로부터 제공되었다. 그 다음으로 가장 빈번한 것은 T05 (64 ㎍)로 일차 백신접종한 후에 반응을 나타내는 주사부위의 72%, T04 (16 ㎍)로 일차 백신접종한 후의 69%, 및 T03 (4 ㎍)으로 일차 백신접종한 후의 63%였다. 최저 빈도인 38%는 T02 (1 ㎍)의 일차 백신접종 이후에 나타났다.
이차 백신접종한 후의 주사부위 반응의 빈도는 표 4에 나타내었다. 각각의 백신에 대한 전반적 LSM 빈도는 일차 백신접종 후에 나타나는 것과 일치하였다.
백신접종 후의 주사부위 반응의 발생빈도 및 지속시간은 표 5에 요약하였다. 측정가능한 주사부위 반응의 발생빈도 (또는 어떤 시점에서라도 반응을 나타내는 개의 수)는 일차 및 이차 백신접종한 후에 T03, T04, T05 및 T06 (각각 4 ㎍, 16 ㎍, 64 ㎍ 및 256 ㎍)에 대해서 100%였다. T02 (1 ㎍)를 투여한 동물은 백신접종한 후에 주사부위 반응의 최소 발생빈도를 나타내었다 (57.1%).
반응의 지속기간 (표 5에 나타낸 것으로 반응이 있는 날수의 최소자승평균으로 표현됨)은 일차 및 이차 백신접종한 후에 (일차 백신접종한 후 2.7 내지 5.1일 및 이차 백신접종한 후 6.0 내지 6.7일) T04, T05 및 T06 (각각 16 ㎍, 64 ㎍ 및 256 ㎍) 백신접종된 동물에 대해서 더 길었다. T02 및 T03 (각각 1 ㎍ 및 4 ㎍) 백신접종된 동물은 일차 및 이차 백신접종한 후에 (일차 백신접종한 후 0.3 및 1.3일 및 이차 백신접종한 후 1.9 및 4.5일) 주사부위 반응을 갖는 날수의 최소값을 나타내었다.
직장 온도
평균 직장 온도 측정치는 표 6에 요약하여 나타내었다. T02 (1 ㎍)의 경우에 1 및 24일에, T03 (4 ㎍)의 경우에 1, 21 및 24일에, T04 (16 ㎍)의 경우에 2 및 24일에, T05 (64 ㎍)의 경우에 23일에, 및 T06 (256 ㎍)의 경우에는 0, 1 및 24일에 측정된 LSM 직장 온도는 위약군과는 유의적으로 상이하였다. 23일에 모든 비교는 위약과는 통계학적으로 유의적 (P>0.05)이지 않았다.
p68 ELISA 혈청학
p68 ELISA 데이타의 요약은 표 7에 나타내었다. 모든 군에서 p68 ELISA 특이적 항체의 백신접종-전 기하평균 바이러스 역가는 낮았으며 (범위 24.9 내지 28.9), 위약에 대한 역가는 시험의 지속기간 전체에 걸쳐서 낮게 유지되었다. 일차 백신접종한 후 21일에 p68 ELISA 기하평균 역가는 백신접종된 처리에서 증가 (범위 55.2 내지 4,411.7)하였으나, T02 (1 ㎍) 역가는 위약 (T01)과 통계학적으로 상이하지 않았다. 이차 백신접종한 후 42일에 기하평균 역가는 백신접종된 모든 군에서 더 증가하였으며 (범위 674.6 내지 48,382.0), 이것은 백신접종에 대한 우수한 혈청학적 반응을 나타내는 것이다.
혈청 아밀로이드 (SAA) 혈청학
SAA 역가는 표 8에 요약하여 나타내었다. 공격하기 전에, 기하평균 SAA 역가는 모든 처리군에서 낮았다 (범위 0.1 내지 0.5). 공격한 후에, T01 GMT 역가는 1.5에서 146.0까지의 범위였음, 여기에서 p68 처리군은 0.3에서 23.1의 범위였다. 모든 처리군은 50, 52, 54 및 56일에 위약과 통계학적으로 상이하였다. 모든 다른 p68 처리군과 통계학적으로 상이한 기하평균을 나타내었을 때인 52일에 T02 (1 ㎍)를 제외하고는 p68 백신 사이에서 통계학적 차이는 없었다.
공격 반응
공격 반응 데이타는 표 9에 나타내었다. 반응은 공격한 후의 기침을 모니터링함으로써 측정하였으며, 관찰결과는 두가지 방법, 즉 기침이 있는 날의 최소자승평균 일수 및 연속 2일의 기침 (질병의 발생빈도)을 사용하여 분석하였다.
기침이 있는 평균 일수의 분석은 p68 처리군들 사이에서 통계학적으로 유의적인 차이가 없음을 나타내었으며; 그러나 위약으로 백신접종된 개는 평균 8.6일 동안 기침을 한 반면에 p68 백신을 투여한 개는 2.2 내지 4.7일의 범위의 유의적으로 더 적은 평균 일수 동안 기침을 하였다.
개를 질병의 발생빈도를 사용하여 평가하는 경우에, 모든 T01 (위약군)은 연속 2일 동안의 기침을 나타내었다 (100% 질병 발생빈도). T04 (16 ㎍) 및 T05 (64 ㎍) 백신접종된 개는 각각 55.6% 및 66.7%의 질병 발생빈도를 나타내었다. 단지 T02 (1 ㎍) 백신접종된 개의 28.6%, T03 (4 ㎍) 백신접종된 개의 50% 및 T06 (256 ㎍) 백신접종된 개의 33.3%가 연속 2일 동안의 기침을 나타내는 것으로 관찰되었다.
고찰:
본 시험에서 목적은 항원 투약량, 면역반응 및 개에게서의 보호 사이의 관계를 확립하기 위한 것이었다. 시험한 p68 항원 투약량은 1 ㎍, 4 ㎍, 16 ㎍, 64 ㎍ 및 256 ㎍이었다.
주사부위 반응 측정치의 분석은 이차 백신접종한 후 첫째날의 T06 (256 ㎍)을 제외하고는 p68 처리군에서 무시할 수 있은 반응을 나타내었다. 관찰된 반응은 작아지는 경향을 나타내었으며, 일반적으로 관찰기간 중에 크기가 감소하였다. 이들 반응의 크기는 임상적으로 무의미한 것이었으며, 털을 깍지 않은 개에서 거의 눈에 띄지 않을 수 있다.
백신접종한 후의 직장 온도는 현저하지 않았으며, 모든 군의 모든 개에 대해서 정상 범위 이내였다.
백신접종에 대한 혈청학적 반응은 T03 군으로부터 T06 군까지 탁월하였다. 이들 처리군에서는, 모두 21일부터 63일까지 동안에 위약에 비해서 유의적으로 더 큰 p68 ELISA 역가를 나타내었다. T02 (1 ㎍)는 42일부터 63일까지에서 T01 (위약)에 비해서 유의적인 p68 ELISA 역가를 나타내었다. 최고의 역가는 T05 (64 ㎍) 및 T06 (256 ㎍)에서 관찰되었다.
공격한 후에 모든 p68 백신접종된 개에게서 SAA 반응의 검사는 대조군 개와 비교하였을 때에 공격-후의 SAA에서 훨씬 더 적은 상승을 나타내었다. 모든 다른 p68 처리군과 통계학적으로 상이한 기하평균을 나타내는 52일째의 T02 (1 ㎍)를 제외하고는, 공격한 후에 p68 백신 투약량 수준 사이에서 차이는 나타나지 않았다.
공격-후 기침의 관찰결과는 기침이 있는 일수의 최소자승평균 (LSM), 또는 연속 2일의 기침 (질병의 발생빈도)을 사용하여 분석하였다. 기침한 일수의 LSM을 사용하여 위약과 모든 p68 백신접종된 군 사이에서는 유의적인 차이가 나타났으나, 다양한 p68 백신 투약량 수준 사이에서는 차이가 나타나지 않았다. 질병 발생빈도를 사용하면 T02 (1 ㎍), T03 (4 ㎍) 및 T06 (256 ㎍) 백신접종된 개는 위약에 비해서 유의적으로 더 적게 기침을 하였다.
결론:
시험을 수행하여 항원 투약량, 면역반응 및 개에게서의 보호 사이의 관계를 확립하였다. 시험한 p68 항원 투약량은 1 ㎍, 4 ㎍, 16 ㎍, 64 ㎍ 및 256 ㎍이었다.
모든 백신은 최소 주사부위 반응, 정상적인 직장 온도, 및 백신접종에 대한 부작용이 존재하지 않는 것에 의해서 입증되는 바와 같이 안전하였다. 주사부위 반응의 크기 및 이들 반응의 지속기간은 더 소량의 항원 처리군에서 더 적었다. ELISA 역가에 의해서 측정되는 바와 같은 백신접종에 대한 혈청학적 반응은 더 큰 혈청학적 반응을 나타내는 더 큰 항원 투약량 군에서 탁월하였다. 비교방법으로 기침의 LSM 일수를 사용하는 경우에, 모든 처리군은 위약군에 비해 기침에서 유의적인 감소를 나타내었다. 처리군들 사이에서 차이는 나타나지 않았다. 연속 2일의 기침 (또는 질병 발생빈도)이 비교를 위해서 사용되는 경우에, T02 (1 ㎍), T03 (4 ㎍) 및 T06 (256 ㎍) 백신접종된 개는 위약보다 유의적으로 더 적게 기침을 하였다.
Figure pat00002
1 상이한 위첨자로 표시된 값은 통계학적으로 상이하다 (P≤0.05).
Figure pat00003
1 상이한 위첨자로 표시된 값은 통계학적으로 상이하다 (P≤0.05).
Figure pat00004
2 처리당 2 개의 펜 (pens)
3 상이한 위첨자로 표시된 값은 통계학적으로 상이하다 (P≤0.05).
Figure pat00005
2 처리당 2 개의 펜 (pens)
3 상이한 위첨자로 표시된 값은 통계학적으로 상이하다 (P≤0.05).
Figure pat00006
4 상이한 위첨자로 표시된 값은 통계학적으로 상이하다 (P≤0.05).
Figure pat00007
Figure pat00008
1 백신접종은 시험 0일 및 21일에 제공되었다. 상이한 위첨자로 표시된 값은 통계학적으로 상이하다 (P≤0.05).
2 백신접종은 시험 0일 및 21일에 제공되었으며, 공격은 시험 49일에 제공되었다.
3 상이한 위첨자로 표시된 값은 통계학적으로 상이하다 (P≤0.05).
Figure pat00009
1 상이한 위첨자로 표시된 값은 통계학적으로 상이하다 (P≤0.05).
Figure pat00010
8 연속 2일의 기침을 기준으로 함.
1 상이한 위첨자로 표시된 값은 통계학적으로 상이하다 (P≤0.05).
실시예 2
개 보르데텔라 p68 면역원성 시험
동물
45 마리의 수컷 및 암컷 혼합품종 개를 구입하였다. MLV 파르보바이러스 백신을 강아지가 시험장소에 도착한 날에 모든 강아지에게 투여하였다. 시험 중에 실험적 생성물 이외의 다른 백신은 강아지에게 투여하지 않았다. 개는 0일 (일차 백신접종한 날)에 대략 9 주령 (± 1주일)이었다.
개는 공격하기 전에 보르데텔라 및 다른 개 병원체에 대한 노출을 방지하는데 필요한 분리시설에서 유지시켰다. 보르데텔라로 에어로졸 공격한 후에 분리과정을 계속하여 다른 개 병원체에 대한 노출을 방지하였다.
백신
처리군 T01 및 T02에서는 멸균 식염수를 위약 백신으로 사용하였다. 처리군 T03 및 T04에서는 개 재조합체 p68 보르데텔라 브론키셉티카 백신이 사용되었다. p68 항원의 구조유전자는 에스케리키아 콜라이 내에서 클로닝되었으며, 유전자의 발현은 온도 민감성 프로모터에 의해서 조절되었다. 세포를 용해시키고, 봉입체를 원심분리에 의해서 분리하였다. 봉입체 내의 재조합체 p68은 SDS 처리에 의해서 가용화시켰다. 재조합체 p68 (㎖당 15 ㎍)을 희석제로서 멸균 식염수 중에서 ㎖당 50 ㎍의 퀼 A 및 50 ㎍의 콜레스테롤과 배합하였다. 각각의 1 ㎖ 용량은 0.28%의 에탄올 및 0.01% 티메로살을 함유하였다.
공격 접종물
보르데텔라 브론키셉티카 Bihr Cat 스트레인을 현재 바이올로직스 컨트롤 래보래토리즈-마이크로바이올로지 (Biologics Control Laboratories-Microbiology)에 의해서 사용되는 방법을 사용하여 공격 접종물로 제조하였다. 보르데-장구 (Bordet-Gengou) 한천 플레이트를 보르데텔라 브론키셉티카-Bihr Cat 스트레인의 전면생장물로 도말하고, 37.5±2.5℃에서 48시간 동안 배양하였다. 유독상 (virulent phase) I 콜로니를 선택하고, 보르데-장구 한천 상에 스트리킹하여 37.5±2.5℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양한 후에 보르데텔라 식염수를 사용하여 한천으로부터 콜로니를 세척하고, 항원을 600 nm에서 0.80의 광학밀도로 희석하였다. 세포 계수는 비탁계 (nephelometer) 판독치를 확인하기 위하여 공격-전 및 공격-후에 수행하였다. 공격 표적농도는 대략 1×109 CFU였다. 공격-전 농도는 2.37×109 CFU (100% 상 I)였으며, 공격-후 농도수는 1.35×109 CFU (100% 상 I)였다.
시험 디자인
요약표
Figure pat00011

무작위화/맹검
백신접종으로부터 공격일까지의 기간 동안, 동물은 일반화된 블럭 디자인에 따라 각각의 처리에 배당되었다. 처리는 방에 대해 무작위적으로 지정되었다. 공격일에 동물은 블럭에 따라서 무작위적으로 공격방에 대해 지정되었다.
지정된 처리군을 모르는 채로 전문가는 미생물학적 및 혈청학적 시험 및 주사부위의 평가, 직장 온도의 측정 및 기침의 관찰을 수행하였다.
데이타 분석
백신접종 후의 반응 변수는 주사부위 데이타, 직장 온도 및 p68 ELISA 역가로 구성되었다. 주사부위 데이타는 다음의 방식으로 요약되었다: 1) 처리 및 시험일별로 측정가능한 반응을 갖는 동물의 수, 2) 처리별로 측정가능한 반응을 갖는 동물 시점의 수, 3) 처리별로 어떤 시점에서 측정가능한 반응을 갖는 동물의 수.
별도로 일차 및 이차 백신접종에 대해서 주사부위 용적 (㎤), 직장 온도 및 자연대수 변환된 p68 ELISA 역가 데이타를 일반적 선형혼합모델을 사용하여 분석하였다.
관찰시점 최소자승평균별로 처리의 선험적 선형대비 (priori linear contrast)를 구성하여 각각의 관찰시점에서 처리군 차이를 시험하고, 각각의 처리에서 시점을 비교하였다. 모든 비교를 위해서는 5%의 유의성 수준을 사용하였다.
공격-후 반응 변수는 매일의 기침 관찰, p68 ELISA 역가 및 혈청 아밀로이드 A 역가로 구성되었다. 공격-후 기간 동안의 기침 일수는 일반적 선형혼합모델을 사용하여 분석되었다.
처리 최소자승평균의 선험적 대비는 처리군 차이를 시험하기 위하여 구성되었다. 모든 비교를 위해서는 5%의 유의성 수준을 사용하였다.
별도로 일차 및 이차 백신접종에 대해서는 피셔정밀검정을 사용하여 연속 2일 기침의 발생빈도에 대해서 처리군들을 치료하였다. 모든 비교를 위해서는 5%의 유의성 수준을 사용하였다.
공격 후의 혈청 아밀로이드 A (SAA) 역가 데이타의 경우에는, 자연대수 변환을 일반적 선형혼합모델을 사용하여 분석하기 전의 역가 값에 적용하였다.
관찰시점 최소자승평균별로 처리의 선험적 선형대비를 구성하여 각각의 관찰시점에서 처리군 차이를 시험하고, 각각의 처리에서 시점을 비교하였다. 모든 비교를 위해서는 5%의 유의성 수준을 사용하였다.
시험방법
상세한 동물 처리절차
45 마리의 혈청음성 및 배양물 음성 강아지를 4 개의 처리군 중의 하나에 무작위적으로 지정하였다. 총 15 마리의 대조군 개에 대해서 8 마리 및 7 마리의 개를 각각 근육내 (IM) 또는 피하 (SC) 대조군에 배당하였다. 처리군은 상기 시험 디자인 항목에서 상세히 설명하였다.
0일은 일차 백신접종일로 지정되었다. 백신접종은 0일에 수행하고, 21일 후에 반복하였다. 일차 백신접종의 경우에는 목의 오른쪽 편을 사용하고, 이차 백신접종을 위해서는 목의 왼쪽 편을 사용하였다. 근육내 주사는 일차 및 이차 백신접종의 경우에 각각 오른쪽 및 왼쪽 반막양근 내에 투여하였다. 모든 주사부위는 각각의 백신접종 후에 7일 동안 삼차원적으로 측정하였으며, 추적 측정은 백신접종한 후 14일에 수행하였다. 직장 온도는 백신접종일 (백신접종하기 전)에 및 각각의 백신접종 후 3일 동안 모니터하였다.
35일에 모든 동물은 보르데텔라 브론키셉티카 배양을 위해서 기관 면봉법으로 처리하고, 혈액을 응집반응 역가를 위해서 수집하였다. 모든 동물은 기관 면봉법에 의해서 음성이었고, 보르데텔라에 대해서 혈청학적으로 음성이었으며, 공격에 대해서 적절한 것으로 판단되었다.
이차 백신접종 후 24일인 45일에는 보르데텔라 브론키셉티카의 에어로졸 공격을 모든 개에게 제공하였다. 진정된 개를 진정된 개의 주둥이 위쪽에 편안하게 장착된 일회용 노즈콘을 사용하여 공격하였다. 노즈콘은 5.5 내지 6.0 psi로 설정된 진공압력펌프에 부착된 분무기에 부착되었다. 1 ㎖의 공격물질을 분무기 내에 넣고, 에어로졸화된 공격물질을 각각의 개에게 4분 동안 투여하였다. 관찰을 하는 사람들은 처리군 지정을 알지 못하였다.
동물은 공격한 후 14일 동안 (46-59일) 기침에 대해서 모니터하였다. 관찰은 각각의 날에 대략 동일한 시간에 약 30-분씩의 기간 동안 2회 이루어졌는데, 한번은 오전에 수행되고 한번은 오후에 수행되었으며, 결과가 기록되었다.
혈액 수집
응집반응 역가를 위한 혈액은 일차 백신접종하기 전 및 공격하기 전에 수집하였다. 안티-p68 ELISA 평가를 위한 혈액은 0 및 21일의 백신접종하기 전에, 및 35, 45 및 59일에 수집하였다. 혈청 아밀로이드 A (SAA) 시험을 위한 혈액은 공격일 (45일)에, 및 46, 48, 50, 52 및 54일에 수집하였다.
샘플에 대해서 수행된 시험
기관 면봉법은 배양에 의해서 보르데텔라 브론키셉티카의 존재에 대해 평가하였다. 각각의 기관 면봉은 보르데텔라 선택적 한천 플레이트 상에 스트리킹하였다. 양성 및 음성 대조군이 포함되었다. 플레이트를 37.5±2.5℃에서 48±4시간 동안 배양하였다. 각각의 플레이트 상에 생성된 콜로니는 양성 대조군과 비교하였으며, 양성 대조군과 동일한 것으로 보이는 모든 콜로니는 더 시험하여 보르데텔라 브론키셉티카의 존재에 대해서 확인하였다. 확인시험에는 TSI, 시트레이트 및 요소 한천 및 니트레이트 레드 (Nitrate Red) 배지의 사용이 포함되었다.
혈청은 다음의 방법을 사용하여 응집반응 역가, p68 ELISA 분석 또는 SAA 분석에 대해서 평가하였다:
응집반응 역가 - 혈청은 보르데텔라 식염수를 사용하여 미량역가 플레이트 (microtiter plate)에서 계열희석하였다. 양성 및 음성 대조군이 각각의 플레이트 상에 포함되었다. 보르데텔라 브론키셉티카 스트레인 87 (보르데 장구 한천 상에서 성장시키고, 수거하여 불활성화시키고, 630 nm에서 20% T로 희석함)이 응집반응성 항원으로 사용되었으며, 각각의 웰에 첨가되었다. 플레이트를 진탕하고, 35±2℃에서 2시간 동안 배양하였다. 플레이트는 실온에서 22시간 동안 이차 배양한 후에 판독하였다. 종말점 역가는 50% 응집반응을 나타내는 최종 웰을 사용하여 측정하였다.
p68 ELISA 역가 - 재조합체 p68 항원을 보르데텔라 p68 항원에 대해서 특이적인 폴리클로날 항혈청으로 코팅된 96 웰 미량역가 플레이트 상에 포획하였다. 개 혈청의 계열 2-배 희석액을 플레이트에 첨가하고 배양하였다. 1:1000 희석도에서 양성 및 음성 대조군이 각각의 플레이트 상에 포함되었다. 퍼옥시다제 표지된 친화성 정제된 염소 안티-개 IgG 지시제 (indicator) 컨쥬게이트를 사용하여 p68 항원에 대해서 특이적인 항체를 검출하였다. 그 후, 발색성 기질 ABTS를 첨가하고, 플레이트는 양성 대조군 웰이 1.2+0.2의 O.D,를 갖게 되었을 때에 판독하였다. 소정의 샘플의 역가는 음성 대조군 혈청 희석도의 평균 + 5개의 표준편차보다 더 큰 광학밀도를 갖는 최종 희석도의 역수로 계산되었다.
SAA 역가 - 개 혈청 아밀로이드 A 역가는 구입한 키트 (Accuplex Co., University of Nebraska Medical Center, Omaha, NE 68198)를 사용하여 평가되었다. 간략하면, 개 SAA를 모노클로날 안티-개 SAA 항체로 코팅된 미량역가 플레이트 상에 포획시켰다. 개 혈청의 희석된 샘플을 플레이트에 첨가하고, 이어서 바이오틴 표지된 안티-개 항체 컨쥬게이트를 첨가하였다. 배양한 후에 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 스트렙타비딘 발색성 기질을 첨가하였다. 플레이트는 30분 후에 판독하였다.
결과
직장 온도
직장 온도 측정치의 요약은 표 10 및 11에 제시하였다.
식염수 또는 p68 보르데텔라 백신접종 후 (일차 백신접종 후a)에 개에게서 직장 온도 (℃)의 최소자승평균

처리
 직장 온도 (℃)
표준오차
시험일
0 1 2 3
T01 식염수 IM 38.2 38.2 38.2 38.2 0.08
T02 식염수 SC 38.0 38.3 38.2 38.2 0.09
T03 p68 SC 38.1 38.3 38.1 38.0 0.06
T04 p68 IM 38.2 38.4 38.2 38.2 0.06
a 0일에 투여된 일차 백신접종
식염수 또는 p68 보르데텔라 백신접종 후 (이차 백신접종 후a)에 개에게서 직장 온도 (℃)의 최소자승평균

처리
 직장 온도 (℃)
표준오차
시험일
21 22 23 24
T01 식염수 IM 38.1 38.3 38.2 38.2 0.10
T02 식염수 SC 38.5 38.5 38.2 38.2 0.10
T03 p68 SC 38.0 38.3 38.1 38.1 0.08
T04 p68 IM 38.1 38.4 38.4 38.4 0.08
a 21일에 투여된 이차 백신접종
일차 백신접종 후의 어떤 날에도 어떤 군들 사이에서 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 21일에 식염수 백신접종된 개와 모든 p68 백신접종된 개 (T01T02 대비 T03T04의 경우 p=0.0053) 사이에서는 유의적인 차이가 나타났다. p68 SC와 IM 백신접종 사이에서의 유의적인 차이 (p=0.0124)는 24일에 나타났다.
주사부위 반응
주사부위 반응은 표 12 및 13에 요약하여 나타내었다. 기술적인 실수로 인하여 이차 백신접종 이후 14-일 관찰 (35일)에서 주사부위 관찰은 수행되지 않았다.
측정가능한 부위 반응은 T03 (p68 SC)에서 관찰되었으며, 크기는 최소였다. 작은 주사부위 반응은 T04 (p68 IM) 중의 한마리의 개에게서 3일에 나타났으며, 측정의 최소 영향은 군에 대한 전반적 평균에 반영되지 않는다.
식염수 또는 p68 (15 ㎍/투약량) 보르데텔라 백신접종 후 (일차 백신접종 후a)에 개에게서 주사부위 반응의 최소자승평균 (㎤)

처리b 		주사부위 반응의 평균 크기 (㎤)
시험일
1 2 3 4 5 6 7 14
T01 식염수 IM 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
T02 식염수 SC 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
T03 p68 SC 7.4 4.3 6.8 3.4 2.5 2.6 1.9 0.1
T04 p68 IM 0.0 0.0 0.0c 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
a 0일에 투여된 일차 백신접종
b 표준오차 T01 = 0.80, T02 = 0.84, T03 = 0.70, 및 T04 = 0.70
c 한마리의 개는 작은 부위반응 (0.5 ㎠)을 가졌지만, 반올림으로 인하여 값의 최소 영향은 전반적인 평균에 반영되지 않는다.
식염수 또는 p68 (15 ㎍/투약량) 보르데텔라 백신접종 후 (이차 백신접종 후a)에 개에게서 주사부위 반응의 최소자승평균 (㎤)

처리b 		주사부위 반응의 평균 크기 (㎤)
시험일
22 23 24 25 26 27 28
T01 식염수 IM 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
T02 식염수 SC 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
T03 p68 SC 8.6 9.2 9.5 7.3 5.2 4.7 5.1
T04 p68 IM 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
a 21일에 투여된 이차 백신접종
b 표준오차 T01 = 1.12, T02 = 1.19, T03 = 0.92, 및 T04 = 0.92
주사부위 측정치의 유의적인 차이는 표 14에 요약하였다. T02 (식염수 SC) 대비 T03 (p68 15 ㎍ SC) 사이의 주사부위 측정치에서의 유의적인 차이는 일차 백신접종 후에 6일 동안 나타났다. 7일까지, 및 다시 14일에 (2주일 재평가 관찰), 어떤 치료군들 사이에서도 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
T02 (식염수 SC) 대비 T03 (p68 15 ㎍ SC) 사이의 주사부위 측정치에서의 유의적인 차이는 이차 백신접종 후에 7일 동안 나타났다.
Figure pat00012
p68 ELISA 역가
p68 ELISA 데이타는 표 15 및 도 1에 요약하여 나타내었다. 백신접종된 개에서 p68에 대한 상당한 역가 반응으로 인하여, 시험에서는 상이한 시점에서 다양한 적정 최소점을 사용하였다. 0 및 21일을 위한 적정은 50에서 시작되었다. 35, 45 및 59일의 경우에는 200에서 적정이 시작되었다. "미만"으로 보고된 값은 어떤 것이라도 분석하기 전에 2로 나누었다. 시험의 과정 중에 대조군 (T01 및 T02)에 대한 p68 ELISA 값에서 관찰된 점증식 상승은 이들 최소 적정값에 기인하는 것이다. 응집반응 역가는 <4로 유지되었다.
모든 p68 백신접종된 동물은 위약 백신접종된 동물과 비교하여 백신접종한 첫째날부터 공격일까지에 (0일 대 45일) 적어도 4-배의 증가를 나타내었다.
Figure pat00013
백신접종 후 및 공격 후 ELISA 역가의 최소자승평균에 대한 유의적인 차이는 표 16에 열거하였다. 백신접종이 완료된 후에 p68 SC 및 p68 IM 백신접종된 동물 사이에서 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
Figure pat00014
혈청 아밀로이드 A 역가
SAA 값은 공격한 후 0, 1, 3, 5, 7 및 9일에 측정하였다. 혈청 아밀로이드 A 값은 표 17에 제시하였으며, 도 2로 나타내었다.
Figure pat00015
SAA 역가에서의 유의적인 차이는 표 18에 요약하여 나타내었다. 식염수 대조군은 공격한 후 1, 3 및 5일에 백신접종된 개보다 더 큰 SAA 역가를 나타내었다. 식염수 SC 대조군은 공격한 후 7 및 9일에 백신접종된 SC 개와 비교하여 유의적으로 더 높은 SAA 역가를 지속적으로 나타내었다.
Figure pat00016
기침 관찰결과
모든 처리군에 대한 에어로졸 공격은 이차 백신접종 후 24일 (45일)에 수행되었다. 기침 관찰결과는 두가지 방법, 즉 연속 2일의 기침을 기준으로 한 질병 상태 (표 19에 나타냄) 및 기침 일수의 백분율 (표 20 및 21이 나타냄)을 사용하여 검사하였다. 개를 연속 2일의 기침의 판단기준을 사용하여 평가한 경우에 p68 백신접종된 개 (SC 및 IM)의 80%는 적어도 연속 2일의 기침을 한 반면에 식염수 SC 및 식염수 IM 백신접종된 개는 각각 100% 및 87.5%가 기침을 하였다. 개를 기침이 관찰된 일수의 백분율을 사용하여 평가하면, p68 SC 및 IM 백신접종된 개는 각각 관찰한 날들의 38.72% 및 41.05%에서 기침을 하였다. 식염수 SC 및 식염수 IM 백신접종된 개는 각각 69.04% 및 62.66%가 기침을 하였다.
보르데텔라 브론키셉티카에 의한 에어로졸 공격 후의 연속 2일 기침을 기준으로 한 식염수 및 p68 (15 ㎍/투약량) 보르데텔라 백신접종된 개에서의 질병 상태의 요약
처리 번호 개의 수 연속 2일 기침을 한 개의 백분율
T01 식염수 IM
T02 식염수 SC		 8
7		 87.5
100.0
T03 p68 15 ㎍/투약량 SC
T04 p68 15 ㎍/투약량 IM		 15
15		 80.0
80.0
질병 상태를 연속 2일의 기침을 기준으로 하는 경우에, 식염수 백신접종된 개와 p68 백신접종된 개 사이에서 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
보르데텔라 브론키셉티카에 의한 에어로졸 공격 후에 식염수 및 p68 (15 ㎍/투약량) 보르데텔라 백신접종된 개에서 기침 일수의 평균 백분율
처리 개의 수 평균 표준오차
T01 식염수 IM
T02 식염수 SC		 8
7		 62.66%
69.04%		 8.67
8.86
T03 p68 15 ㎍ SC
T04 p68 15 ㎍ IM		 15
15		 38.72%
41.05%		 6.38
6.44
유의적인 차이 (p=0.0112)는 T02 (식염수 SC)와 T03 (p68 15 ㎍ SC) 사이에서 나타났다. T01 (식염수 IM)과 T04 (p68 15 ㎍ IM) 사이에서는 유의적인 차이가 나타나지 않았다.
보르데텔라 브론키셉티카에 의한 에어로졸 공격 후에 식염수 및 p68 (15 ㎍/투약량) 보르데텔라 백신접종된 개에서의 처리에 의한 기침 일수의 평균 백분율
파라메터 평가치 표준오차
식염수 평균 (T01 & T02) 65.89% 1.10
15 ㎍/투약량 평균 (T03 & T04) 39.88% 4.34
유의적인 차이 (p=0.0022)는 식염수 대조군과 p68-백신접종된 개 사이에서 나타났다.
고찰
시험은 개에게서 p68 보르데텔라 15 ㎍/투약량 백신의 안전성 및 효능을 입증하도록 디자인되었다.
안전성은 주사부위 및 직장 온도 관찰을 사용하여 검사되었다. 주사부위 반응 측정치의 분석은 IM 백신접종된 군에서의 미미한 반응 및 SC 백신접종된 군에서의 최소 반응을 나타내었다. 관찰된 반응은 작아지는 경향을 나타내었으며, 일반적으로 관찰기간 중에 크기가 감소하였다. 이들 반응의 크기는 털을 깍지 않은 개에서 거의 눈에 띄지 않을 수 있다. 21일에 식염수와 백신접종군 사이, 및 24일에 IM과 SC 백신접종군 사이에서 유의적인 차이가 관찰되었지만, 직장 온도는 임상적으로 현저하지 않았으며, 모든 군의 모든 개에 대해서 정상 범위 이내였다.
효능은 p68 ELISA 종말점 역가 및 기침의 측정의 관찰결과를 사용하여 검사되었다. 투여의 경로와는 무관하게, 우수한 p68 항체반응이 35일까지 p68-백신접종군에서 나타났다. 우수한 기왕반응이 공격 후 백신접종군에서 관찰되었다. 비록 더 큰 항체반응은 통상적으로, SC 경로에 비해서 더 혈관적이며 덜 지방성인 IM 경로에 의해서 수득되지만, 시험의 과정 전체를 통해서 p68 SC와 IM 백신접종군 사이의 차이는 유의적이지 않았다.
공격한 후에 백신접종 및 백신접종되지 않은 p68 보르데텔라 개에서 SAA 반응의 검사는 특히 공격 후 1, 3 및 5일에, 백신접종된 동물에서의 SAA 값에서 훨씬 더 작은 증가를 시사하였다.
결론
본 시험에서는 15 ㎍/투약량 p68 개 보르데텔라 백신의 효능을 백신접종 후 24일에 개 공격모델을 사용하여 검사하였다. 백신은 정상적인 직장 온도, 최소 주사부위 반응에 의해서 입증되는 바와 같이 안전하였으며, 효능은 배합된 IM 및 SC 군에서 입증되었다. SAA 값의 비교는 에어로졸 공격 후 1, 3 및 5일에 식염수 및 p68 백신접종된 개 사이에서 유의적인 차이를 나타내었다.
실시예 3
개 보르데텔라 p68 백신의 6개월 지속기간의 면역성 시험
동물
90 마리의 수컷 및 암컷 혼합품종 개를 구입하였으며, 대부분의 강아지는 일차 백신접종일에 9 주령 (± 1주일)이었다.
MLV 파르보바이러스 백신은 개가 시험장소에 도착하면 투여하였다. 시험에 적합하도록 동물들은 기관 면봉법 및 응집반응 역가에 의해서 보르데텔라 브론키셉티카에 대해서 음성인 것으로 결정되었다. 실험적 생성물 이외의 어떤 백신도 시험 중에 투여되지 않았다.
개는 공격하기 전에 보르데텔라 브론키셉티카 및 개 병원체에 대한 노출을 방지하는데 필요한 분리시설에서 유지시켰다. 보르데텔라 브론키셉티카로 에어로졸 공격한 후에 분리과정을 계속하여 다른 개 병원체에 대한 노출을 방지하였다.
백신
처리군 T01 및 T02에서는 멸균 식염수를 위약 백신으로 사용하였다. 처리군 T03 및 T04에서는 개 재조합체 p68 보르데텔라 브론키셉티카 백신이 사용되었다. p68 항원의 구조유전자는 에스케리키아 콜라이 내에서 클로닝되었으며, 유전자의 발현은 온도 민감성 프로모터에 의해서 조절되었다. 세포를 용해시키고, 봉입체를 원심분리에 의해서 분리하였다. 봉입체 내의 재조합체 p68은 SDS 처리에 의해서 가용화시켰다. 별도로, 15 ㎍ p68 및 60 ㎍ p68을 희석제로서 멸균 렙토 (Lepto) 식염수 중에서 ㎖당 50 ㎍의 퀼 A 및 50 ㎍의 콜레스테롤과 배합하였다. 배합된 성분은 4℃에서 24시간 동안 혼합시키고, 마이크로플루이다이저 (microfluidizer)를 통해서 3 회 통과시켰다. 각각의 1 ㎖ 용량은 2.7 ㎕의 에탄올 및 0.0001% 티메로살을 함유하였다. 실험적 백신에서 p68 농도는 p68 ELISA에 의해서 측정되었다. 모든 시험은 5 회 반복하였다. 모든 백신은 조합한 후 6개월 이내에 사용되었다.
공격 접종물
보르데-장구 한천 플레이트를 보르데텔라 브론키셉티카-Bihr Cat 스트레인으로 도말하고, 37.5±2.5℃에서 48시간 동안 배양하였다. 유독상 I 콜로니를 선택하고, 보르데-장구 한천 상에 스트리킹하여 37.5±2.5℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양한 후에 보르데텔라 식염수를 사용하여 한천으로부터 콜로니를 세척하고, 세포를 600 nm에서 0.80의 광학밀도로 희석하였다. 세포 계수는 비탁계 판독치를 확인하기 위하여 공격-전 및 공격-후에 수행하였다. 공격 표적농도는 대략 1×109 CFU였다. I 군의 경우에, 공격-전 농도계수는 1.94×109이고, 공격-후 농도계수는 1.43×109이었다. II 군의 경우에, 공격-전 농도계수는 2.55×109이고, 공격-후 농도계수는 2.13×109이었다.
시험 디자인
요약표
Figure pat00017

시험은 I 군의 48 마리의 개 및 II 군의 42 마리의 개로 구성된 두개의 상 및 군으로 수행되었다. 백신접종 #1은 각각의 군에 대해서 0일에 수행하였다. 백신접종 #2는 20일 후에 수행하였다. I 군에서의 이벤트 (event)는 약 15일 까지는 II 군에서의 이벤트와 대등하였다. 개는 마지막 백신접종 후 181일에 보르데텔라 브론키셉티카에 의해서 에어로졸 공격되었다.
무작위화/맹검
동물들은 완전 무작위화 디자인에 따라서 처리 및 방에 대해서 무작위적으로 지정되었다.
각각의 시험군에서 백신접종 #1로부터 공격일까지의 기간 동안, 동물은 무작위화 플랜 (plan)을 사용하여 처리 및 방 (방당 3 내지 5 마리의 개)에 대해 무작위적으로 지정되었다.
공격일에, 이미 처리된 동물은 일반화된 블럭 디자인을 사용하여 시험군 내에서 무작위적으로 공격방에 대해 지정되었다.
지정된 처리군을 모르는 채로 전문가는 미생물학적 및 혈청학적 시험, 및 기침 및 주사부위의 평가를 수행하였다.
데이타 분석
백신접종 후의 반응 변수는 주사부위 데이타, 직장 온도 및 p68 ELISA 역가로 구성되었다. 주사부위 데이타는 다음의 방식으로 요약되었다: 1) 처리 및 시험일별로 측정가능한 반응을 갖는 동물의 수, 2) 처리별로 측정가능한 반응을 갖는 동물 시점의 수, 3) 처리별로 어떤 시점에서 측정가능한 반응을 갖는 동물의 수, 4) 각각의 동물에 대하여 측정가능한 반응의 지속기간.
별도로 일차 및 이차 백신접종에 대해서 주사부위 용적 (㎤), 직장 온도 및 자연대수 변환된 p68 ELISA 역가 데이타를 일반적 선형혼합모델을 사용하여 분석하였다.
관찰시점 최소자승평균별로 처리의 선험적 선형대비를 구성하여 각각의 관찰시점에서 처리군 차이를 시험하고, 각각의 처리에서 시점을 비교하였다. 중요한 구체적인 비교는 T01 대 T03, T01 대 T05, T03 대 T05, T02 대 T04, T02 대 T06, 및 T04 대 T06이었다. 시점-처리별-시험군별 상호작용 관계가 P<0.05에서 유의적이었다면, 각각의 시점에서 처리군들 사이의 대비 및 처리군 내에서의 시점들 사이의 대비는 각각의 시험군 내에서 이루어졌으며, 다른 식으로 이들 대비는 시점-처리별 상호작용 효과 최소자승평균을 기초로 하였다. 모든 비교를 위해서는 5%의 유의성 수준이 사용되었다.
공격-후 반응 변수는 p68 ELISA 역가, 혈청 아밀로이드 A 역가 및 매일의 기침 관찰로 구성되었다. 공격-후 p68 ELISA 역가는 전술한 바와 같이 분석되었다. 공격-후 혈청 아밀로이드 A (SAA) 역가 데이타의 경우에는 일반적 선형혼합모델을 사용한 분석에 앞서서 자연대수 변환이 역가값에 적용되었다.
기침의 분석은 USDA 필요조건을 반영하도록 수정되었다. 각각의 개에 대해서 기침이 관찰된 관찰기간의 백분율이 계산되었다. 분석에 앞서서 백분율은 아크사인 제곱근 변환 (arcsin square root transformation)을 사용하여 변환되었다. 일반적 선형혼합모델이 기침의 분석을 위해서 사용되었다.
이 분석으로부터의 최소자승평균은 백분율로 역변환되었으며, 기침에서의 감소율은 다음과 같이 계산되었다:
Figure pat00018
처리 최소자승평균의 선험적 대비는 처리군 차이를 시험하기 위하여 구성되었다. 중요한 구체적인 비교는 T01 대 T03, T01 대 T05, T03 대 T05, T02 대 T04, T02 대 T06, 및 T04 대 T06이었다. 시점-처리별-시험군별 상호작용 관계가 P<0.05에서 유의적이었다면, 처리군들 사이에서의 대비는 각각의 시험군 내에서 이루어졌으며, 다른 식으로 처리군들 사이에서의 대비는 처리 주효과 최소자승평균을 기초로 하였다. 모든 비교를 위해서는 5%의 유의성 수준이 사용되었다.
시험방법
상세한 동물 처리절차
시험장소에 도달하기 전 및 일차 백신접종하기 전에 강아지는 보르데텔라 브론키셉티카 배양을 위해서 기관 면봉법을 수행하였으며, 응집반응 역가를 위해서 혈액을 수집하였다. 모든 동물은 기관 면봉법에 의해서 음성이고, 보르데텔라에 대해서 혈청학적으로 음성이었으며, 시험에 적합한 것으로 판단되었다. 48 마리의 강아지를 I 군을 위해서 6 개의 처리군 중의 하나에 무작위적으로 지정하였다. 이 과정은 II 군을 위하여 42 마리의 개를 사용하여 반복하였다, 동물들은 적어도 5일 동안 시험장소에 순응시켰다.
군 및 처리는 항목 7.4.A에 상세히 설명하였다. 설비 제한에 기인하고, 공격 후의 기침 관찰의 정확성을 증진시키기 위해서, 백신접종 및 각각의 공격기간은 15일까지 엇갈리게 하여 두개의 개 군을 생성시켰다. 0일은 I 및 II 군 둘 다에 대한 백신접종일 #1을 나타낸다. 백신접종 #2는 20일 후에 수행하였다. 처리 T01, T03 및 T05는 피하 경로를 통해서 투여되었다. 처리 T02, T04 및 T06은 근육내 경로를 통해서 투여되었다. 피하주사는 목의 배측면에서 투여되었다. 백신접종 #1의 경우에는 목의 오른쪽 편이 사용되었고, 백신접종 #2를 위해서는 목의 왼쪽 편이 사용되었다. 근육내 주사는 백신접종 #1 및 백신접종 #2의 경우에 각각 오른쪽 및 왼쪽 반막양근 내에 투여하였다. 모든 주사부위는 각각의 백신접종 후에 7일 동안 삼차원적으로 측정하였으며, 추적 측정은 백신접종한 후 14일에 수행하였다. 직장 온도는 백신접종일 (백신접종하기 전)에 및 각각의 백신접종 후 3일 동안 모니터하였다. 혈액은 각각의 백신접종 전에 (-1일 및 19일) 및 p68 ELISA 역가 측정을 위해서 50일에 수집하였다.
매월에 모든 개는 진정 하에서 보르데텔라 브론키셉티카 배양을 위해 기관 면봉법을 수행하여 보르데텔라 브론키셉티카 음성 상태를 확인하였다. 혈액은 또한 응집반응 및 ELISA 역가를 위해서 수집하였다. 이 과정은 각각의 군에 대해서 공격하기 7일 전에 반복하였다. 양성 기관 면봉 배양물 또는 상승하는 응집반응 역가의 증거는 동물들을 시험으로부터 제외시켰다.
공격은 백신접종 #2로부터 181일 이후에 개에게 제공되었다. 진정된 개를 진정된 개의 주둥이 위쪽에 편안하게 장착된 일회용 노즈콘을 사용하여 공격하였다. 노즈콘은 5.5 내지 6.0 psi로 설정된 진공압력펌프에 부착된 분무기에 부착되었다. 1 ㎖의 공격물질을 분무기 내에 넣고, 에어로졸화된 공격물질을 각각의 개에게 4분 동안 투여하였다.
공격-후의 기침의 분석은 USDA 권고에 부합하도록 공격하기 전에 수정되었다. 공격한 후에 개의 각각의 군은 공격한 후 3일째와 10일째 사이에서 총 8일의 기간 동안 관찰하였다. 동물들은 각각의 관찰기간에서 대략 45분 동안 기침에 대해서 매일 2회씩 관찰하였다. 관찰기간 사이의 간격은 대략 12시간이었다. 지정된 처리군을 알지 못하는 담당자가 기침 관찰결과를 기록하였다.
혈액 수집
응집반응 역가를 위한 혈액은 각각의 군에 대해서 일차 백신접종하기 전, 매달 및 공격하기 전에 수집하였다.
안티-p68 ELISA 평가를 위한 혈액은 각각의 군에 대해서 백신접종 #1 및 #2의 전날에, 50일에, 그리고 그 후 약 30일의 간격을 두고 수집하였다. 혈액은 또한, 공격일 및 공격-후 관찰의 최종일에도 수집되었다.
혈청 아밀로이드 A (SAA) 시험을 위한 혈액은 각각의 군에 대해서 공격일 (공격하기 전에)에, 및 공격한 후 1, 3, 5, 7 및 9일에 수집하였다.
샘플에 대해서 수행된 시험
기관 면봉법은 배양에 의해서 보르데텔라 브론키셉티카의 존재에 대해 평가하였다. 각각의 기관 면봉은 보르데텔라 선택적 한천 플레이트 상에 스트리킹하였다. 양성 및 음성 대조군이 포함된다. 플레이트를 37.5±2.5℃에서 48±4시간 동안 배양하였다. 각각의 플레이트 상에 생성된 콜로니는 양성 대조군과 비교하였으며, 양성 대조군과 동일한 것으로 보이는 모든 콜로니는 더 시험하여 보르데텔라 브론키셉티카의 존재에 대해서 확인하였다. 확인시험에는 TSI, 시트레이트 및 요소 한천 및 니트레이트 레드 배지의 사용이 포함되었다.
혈청은 다음의 방법을 사용하여 응집반응 역가, p68 ELISA 분석 또는 SAA 분석에 대해서 평가하였다:
응집반응 역가 - 혈청은 보르데텔라 식염수를 사용하여 미량역가 플레이트에서 계열희석하였다. 양성 및 음성 대조군이 각각의 플레이트 상에 포함되었다. 보르데텔라 브론키셉티카 스트레인 87 (보르데 장구 한천 상에서 성장시키고, 수거하여 불활성화시키고, 630 nm에서 20% T로 희석함)이 응집반응성 항원으로 사용되었으며, 각각의 웰에 첨가되었다. 플레이트를 진탕하고, 35±2℃에서 2시간 동안 배양하였다. 플레이트는 실온에서 22시간 동안 이차 배양한 후에 판독하였다. 종말점 역가는 50% 응집반응을 나타내는 최종 웰을 사용하여 측정하였다.
p68 ELISA 역가 - 재조합체 p68 항원을 보르데텔라 p68 항원에 대해서 특이적인 폴리클로날 항혈청으로 코팅된 96 웰 미량역가 플레이트 상에 포획하였다. 개 혈청의 계열 2-배 희석액을 플레이트에 첨가하고 배양하였다. 1:1000 희석도에서 양성 및 음성 대조군이 각각의 플레이트 상에 포함되었다. 퍼옥시다제 표지된 친화성 정제된 염소 안티-개 IgG 지시제 컨쥬게이트를 사용하여 rp68 항원에 대해서 특이적인 항체를 검출하였다. 그 후, 발색성 기질 ABTS를 첨가하고, 플레이트는 양성 대조군 웰이 1.2±0.2의 O.D,를 갖게 되었을 때에 판독하였다. 소정의 샘플의 역가는 음성 대조군 혈청 희석도의 평균 + 5개의 표준편차보다 더 큰 광학밀도를 갖는 최종 희석도의 역수로 계산되었다.
SAA 역가 - 개 혈청 아밀로이드 A를 모노클로날 안티-개 SAA 항체로 코팅된 96 웰 미량역가 플레이트 상에 포획시켰다. 개 혈청의 희석된 샘플을 플레이트에 첨가하고, 배양하였다. 참조표준물을 첨가하여 0.31 ng/㎖에서 20 ng/㎖까지의 표준곡선을 수득하였다. 바이오틴 표지된 안티-개 항체 컨쥬게이트를 첨가하였다. 바이오틴 표지된 안티-개 항체의 배양 후에 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 스트렙타비딘을 첨가하였다. 발색성 기질 TMB를 첨가하고, 30분 후에 플레이트를 판독하였다. 혈청 아밀로이드 A의 농도는 샘플을 표준곡선에 대비하고, 적절한 희석율을 곱해줌으로써 결정되었다.
결과
다른 식으로 언급되지 않는 한, 결과는 I 및 II 군으로부터의 조합된 데이타이다.
기관 면봉 배양물 및 응집반응 역가
양성 기관 면봉 배양물 및/또는 상승하는 응집반응 역가는 시험의 과정 중에 11 마리의 개에게서 나타났다. 이들 개 및 양성 개와 함께 수용한 모든 개는 시험으로부터 제외시킴으로써 20 마리의 개를 상실하였다. 각각의 군으로부터 배제된 개의 수는 다음과 같다: T01-4 마리의 개, T02-2 마리의 개, T03-3 마리의 개, T04-1 마리의 개, T05-5 마리의 개, T06-5 마리의 개.
주사부위 반응
주사부위 반응은 표 22-25에 요약하여 나타내었다. 주사부위 정보는 기술적인 실수로 인하여 I 군의 경우, 21일에 개 81595에 대해서는 수집되지 않았다. 프로토콜은 주사부위 반응 데이타가 22일에 II 군의 개에 대해서는 수집되지 않고, 따라서 22일의 데이타에 대한 요약은 I 군에서의 처리군당 8마리의 개로부터의 정보만을 포함하도록 수정되었다. 주사부위 반응은 IM 처리를 받는 어떤 개에 대해서도 관찰되지 않았다. 주사부위 측정치는 SC 백신접종된 처리군 (T03 및 T05) 둘 다에 대해서 최소였다.
식염수 또는 p68 보르데텔라 백신접종 후 (일차 백신접종 후a)에 개에게서 주사부위 반응의 최소자승평균 (㎤)

처리		 평균 크기 (㎤)b
시험일
1 2 3 4 5 6 7 14
T01 식염수 SC 0 0 0 0 0 0 0 0
T02 식염수 IM 0 0 0 0 0 0 0 0
T03 60 ㎍ SC 5.8 6.4 7.3 6.3 5.0 4.9 2.7 0
T04 60 ㎍ IM 0 0 0 0 0 0 0 0
T05 15 ㎍ SC 4.4 4.6 3.1 2.1 1.2 0.9 0.7 0
T06 15 ㎍ SC 0 0 0 0 0 0 0 0
a 0일에 투여된 백신접종 #1
b 모든 평균에 대한 표준오차 = 0.64
식염수 또는 p68 보르데텔라 백신접종 후 (이차 백신접종 후a)에 개에게서 주사부위 반응의 최소자승평균 (㎤)

처리		 평균 크기 (㎤)
시험일
21b 22c 23b 24b 25b 26b 27b 34b
T01 식염수 SC 0 0 0 0 0 0 0 0
T02 식염수 IM 0 0 0 0 0 0 0 0
T03 60 ㎍ SC 5.0 3.2 4.2 5.8 5.9 5.8 4.3 0.1
T04 60 ㎍ IM 0 0 0 0 0 0 0 0
T05 15 ㎍ SC 3.7 2.4 2.2 2.6 2.1 2.0 1.6 0
T06 15 ㎍ SC 0d 0 0 0 0 0 0 0
a 20일에 투여된 백신접종 #2
b 이 날에서 평균에 대한 표준오차 = 0.55
c 이 날에서 평균에 대한 표준오차 = 0.70
d 21일에 T06에 대한 표준오차 = 0.57
식염수 또는 p68 보르데텔라에 의한 백신접종 후 (일차 백신접종 후a)에 측정가능한 주사부위 반응을 갖는 개의 퍼센트

처리		 측정가능한 반응 퍼센트
n 1 2 3 4 5 6 7 14
T01 식염수 SC 15 0 0 0 0 0 0 0 0
T02 식염수 IM 15 0 0 0 0 0 0 0 0
T03 60 ㎍ SC 15 66.7 73.3 73.3 73.3 73.3 73.3 66.7 0
T04 60 ㎍ IM 15 0 0 0 0 0 0 0 0
T05 15 ㎍ SC 15 73.3 73.3 60.0 60.0 53.3 46.7 46.7 0
T06 15 ㎍ SC 15 0 0 0 0 0 0 0 0
a 0일에 투여된 백신접종 #1
식염수 또는 p68 보르데텔라에 의한 백신접종 후 (이차 백신접종 후a)에 측정가능한 주사부위 반응을 갖는 개의 퍼센트

처리		 측정가능한 반응 퍼센트
시험일
n 21 22b 23 24 25 26 27 34
T01 식염수 SC 15 0 0 0 0 0 0 0 0
T02 식염수 IM 15 0 0 0 0 0 0 0 0
T03 60 ㎍ SC 15 80.0 50.0 66.7 66.7 80.0 80.0 80.0 6.7
T04 60 ㎍ IM 15 0 0 0 0 0 0 0 0
T05 15 ㎍ SC 15 73.3 50.0 73.3 73.3 73.3 73.3 66.7 0
T06 15 ㎍ SC 15 0c 0 0 0 0 0 0 0
a 20일에 투여된 백신접종 #2
b 22일에 대해서 n= 8
c 21일에 T06에 대해서 n= 14
주사부위 측정치의 유의적인 차이는 표 26에 요약하였다. T01 (식염수 SC) 대비 T03 (60 ㎍ SC) 사이의 주사부위 측정치에서의 유의적인 차이는 일차 백신접종 후에 7일 동안 나타났다. T01 (식염수 SC)과 T05 (15 ㎍ SC) 사이의 유의적인 차이는 일차 백신접종 후에 단지 처음 4일 동안에만 확인되었다. 유의적인 차이는 3일부터 7일까지에 T03 (60 ㎍ SC)과 T05 (15 ㎍ SC) 사이에서 확인되었다. 14일까지 (2주일 재평가 관찰)는 어떤 군들 사이에서도 차이가 나타나지 않았다.
T01 (식염수 SC) 대비 T03 (60 ㎍ SC) 및 T05 (15 ㎍ SC) 사이의 주사부위 측정치에서의 유의적인 차이는 이차 백신접종 후에 7일 동안 나타났다. 유의적인 차이는 23일부터 27일까지에 T03 (60 ㎍ SC)과 T05 (15 ㎍ SC) 사이에서 확인되었다. 34일까지 (2주일 재평가 관찰)는 어떤 군들 사이에서도 차이가 나타나지 않았다.
Figure pat00019
직장 온도
직장 온도 측정치는 표 27 및 28에 요약하여 제시하였다. 프로토콜은 직장 온도 데이타가 22일에 II 군의 개에 대해서는 수집되지 않고, 따라서 22일의 데이타에 대한 요약은 I 군에서의 처리군 마다의 개로부터의 정보만을 포함하도록 수정되었다.
식염수 또는 p68 보르데텔라 백신접종 후 (일차 백신접종 후a)에 개에게서 직장 온도 (℃)의 최소자승평균

처리
 직장 온도 (℃)b
시험일
0 2 2 3
T01 식염수 SC 38.5 38.4 38.3 38.2
T02 식염수 IM 38.4 38.2 38.4 38.2
T03 60 ㎍ SC 38.4 38.5 38.2 38.3
T04 60 ㎍ IM 38.4 38.5 38.4 38.4
T05 15 ㎍ SC 38.5 38.5 38.2 38.2
T06 15 ㎍ IM 38.5 38.4 38.3 38.4
a 20일에 투여된 백신접종 #1
b 표준오차= 0.09
식염수 또는 p68 보르데텔라 백신접종 후 (이차 백신접종 후a)에 개에게서 직장 온도 (℃)의 최소자승평균

처리
 직장 온도 (℃)
시험일
20b 21b 22c 23b
T01 식염수 SC 38.6 38.5 38.3 38.4
T02 식염수 IM 38.6 38.6 38.3 38.4
T03 60 ㎍ SC 38.7 38.6 38.6 38.4
T04 60 ㎍ IM 38.8 38.7 38.5 38.5
T05 15 ㎍ SC 38.6 38.6 38.5 38.4
T06 15 ㎍ IM 38.7 38.7 38.4 38.5
a 20일에 투여된 백신접종 #2
b 표준오차= 0.08
c 표준오차= 0.11
유의적인 차이는 일차 백신접종 후의 1일에 T02 (식염수 IM)과 T04 (60 ㎍ IM) 사이의 직장 온도에서 나타났다. 유의적인 차이는 이차 백신접종 후의 어떤 날에 어떤 군들 사이에서도 직장 온도에서 나타나지 않았다.
p68 ELISA 역가
공격-전 p68 ELISA 데이타는 표 29에 요약하여 나타내었다. 19일에 T06에서 I 군의 개의 반응으로 인하여 군에 기인한 효과가 p68 ELISA 역가의 데이타 분석에서 관찰되었다. 효과는 작으며, 다른 분석된 시점에 영향을 미치지 않았다. 따라서, 보고를 목적으로 I 군 및 II군으로부터의 데이타를 조합한다.
백신접종된 개에서 p68에 대한 상당한 역가 반응으로 인하여, 시험에서는 상이한 시점에서 다양한 적정 최소점을 사용하였다. -1 및 19일을 위한 적정은 50에서 시작되었다. 50일에서 195일까지 동안에는 적정이 200에서 시작되었다. 201 및 211일에 수집된 샘플에 대한 적정은 1000에서 시작되었다. "미만"으로 보고된 값은 어떤 것이라도 분석하기 전에 2로 나누었다. 시험의 과정 중에 대조군 (T01 및 T02)에 대한 p68 ELISA 값에서 관찰된 점증식 상승은 이들 최소 적정값에 기인하는 것이다. 전술한 것을 제외하고는 응집반응 역가는 <4로 유지되었다.
모든 위약 백신접종된 개는 50일에 <200의 p68 역가를 가졌다. 모든 p68-백신접종된 동물은 위약 백신접종된 동물과 비교하여 이차 백신접종한 후에 (0일 대 50일) 적어도 4-배의 증가를 나타내었다.
Figure pat00020
백신접종 후 ELISA 역가의 최소자승평균에 대한 유의적인 차이는 표 30에 열거하였다. p68 ELISA 역가에서의 유의적인 차이는 백신접종하기 전 (-1일)에 SC 대조군과 SC 백신접종군 또는 IM 대조군과 IM 백신접종군 사이에서 관찰되지 않았다.
Figure pat00021
시험기간 중에 측정된 p68 ELISA 역가는 표 31에 요약하여 나타내었으며, 도 3에 예시되어 있다.
시험의 과정 중에는 I 군과 II 군 사이에서 활성을 통합하기 위한 모든 시도가 이루어졌다. 중추적 데이타 수집 시점 (즉, 백신접종 및 공격 주변의 이벤트)의 경우에 이것이 달성되었다. 시험의 중간시기 중의 3가지 경우에서 혈액 및 기관 면봉 수집은 군들 사이에서 1 또는 2일까지 변화하였다. 이러한 중간기간 동안의 p68 ELISA 데이타를 요약하고 보고하기 위하여, 이들 날로부터의 데이타를 조합하였다. 따라서, 79일은 79일 (I 군) 및 81일 (II 군)로부터의 조합된 데이타를 함유하며, 111일은 110일 (II 군)과 111일 (I 군)에 상응하고, 169일은 169일 (II 군)과 170일 (I 군)에 상응한다. 프로토콜마다, 50일을 지나서는 p68 ELISA 데이타에 대한 데이타 분석이 수행되지 않았다.
Figure pat00022
기침 관찰결과
두가지 군에 대한 에어로졸 공격은 이차 백신접종 후 181일에 수행되었다. USDA 권고에 부합하도록 기침 판단기준은 공격한 후 3일째부터 8일째까지에서 약 12시간의 간격을 두고 약 45-분 관찰하는 것으로 수정되었다. 기침 관찰결과는 표 32 및 33에 요약하여 나타내었다.
보르데텔라 브론키셉티카에 의한 에어로졸 공격 후에 백신접종하지 않은 개 및 p68 보르데텔라 백신접종된 개에서 기침 시점의 평균 백분율
처리 개의 수 평균 표준오차
T01 식염수 SC
T02 식염수 IM		 11
13		 75.44%
80.50%		 7.73
6.64
T03 p68 60 ㎍ SC
T04 p68 60 ㎍ IM		 12
14		 67.30%
71.81%		 8.12
7.32
T05 p68 15 ㎍ SC
T06 p68 15 ㎍ IM		 10
10		 36.30%
39.55%		 9.19
9.18
보르데텔라 브론키셉티카에 의한 에어로졸 공격 후에 백신접종하지 않은 개 및 p68 보르데텔라 백신접종된 개에서의 처리에 의한 기침 시점의 평균 백분율
파라메터 평가치 표준오차
식염수 평균 (T01 & T02) 78.26% 5.28
60 ㎍/투약량 평균 (T03 & T04) 69.58% 5.68
15 ㎍/투약량 평균 (T05 & T06) 37.92% 6.70
식염수 대조군과 비교할 때에 기침의 감소율은 15 ㎍/투약량 군의 경우에는 51.55%이고, 60 ㎍/투약량 군의 경우에는 11.09%였다. 통계학적 유의성 차이는 표 34에 요약하여 나타내었다.에서유의적인 차이 (p=0.0022)는 식염수 대조군과 p68-백신접종된 개 사이에서 나타났다.
Figure pat00023
혈청 아밀로이드 A 역가
SAA 값은 공격한 후 0, 1, 3, 5, 7 및 9일에 측정하였다. 혈청 아밀로이드 A 값은 표 35에 제시하였으며, 도 4로 나타내었다.
Figure pat00024
SAA 역가에서의 유의적인 차이는 표 36에 요약하여 나타내었다.
Figure pat00025
고찰
시험은 개에게서 재조합체 p68 보르데텔라 백신의 안전성 및 6-개월 효능을 입증하도록 디자인되었다. 15 ㎍/투약량 및 60 ㎍/투약량 백신 둘 다의 안전성이 입증되었다. 15 ㎍/투약량의 효능 및 6개월 지속기간의 면역성은 이 시험에서 잘 뒷받침되었다.
안전성은 주사부위 및 직장 온도 관찰을 사용하여 검사되었다. 주사부위 반응 측정치의 분석은 IM 백신접종된 군에서의 무반응 및 15 ㎍/투약량 및 60 ㎍/투약량 SC 백신접종된 군 둘 다에서의 최소 반응을 나타내었다. 관찰된 반응은 15 ㎍/투약량 SC 백신접종된 군에서 더 작아지는 경향을 나타내었다. 나타난 이러한 반응은 일시적이었으며, 일반적으로 14일 또는 그 미만에 해소된다. 이들 반응의 크기는 털을 깍지 않은 개에서 거의 눈에 띄지 않을 수 있다. 백신접종 후의 직장 온도는 현저하지 않았으며, 모든 군의 모든 개에 대해서 정상 범위 이내였다.
효능 및 면역성의 지속기간은 기침의 관찰결과 및 p68 ELISA 종말점 역가의 측정을 사용하여 백신접종으로부터 181일에 검사되었다. 식염수 대조군에서의 기침의 백분율 (78.26%)은 시험동물에게 투여된 공격이 허용가능하였음을 시사하였다. 15 ㎍/투약량 군에 대한 기침 시점의 백분율 (37.92%)은 대조군과 비교할 때 기침에서 51.55%의 감소를 나타내어 USDA에 의해서 지시된 효능 필요조건을 충족시킨다. 60 ㎍/투약량 군 (69.58%)에서는 보호가 입증되지 않았는데, 여기에서 개는 대조군과 비교할 때에 기침에서 최소의 감소를 나타내었다.
비록 통계학적으로 비교하지는 않았지만, SC 백신접종군이 IM 백신접종군에 비해서 더 큰 항체반응을 갖는 경향이 있었음은 표 29 및 31로부터 알 수 있다. 고찰을 목적으로 하여, 상이한 투약량 군에 관한 추가의 설명은 투여의 IM 및 SC 경로의 결과를 합한 것이다.
투여의 경로와는 무관하게, 탁월한 p68 항체반응이 50일까지 백신접종된 군 둘 다에서 나타났으며, 시험의 과정 전체에 걸쳐서 백신접종군에 의해서 유지되었다. 우수한 기왕반응이 공격 후 백신접종군에서 관찰되었다.
시험의 과정 중에 15 ㎍/투약량 및 60 ㎍/투약량의 p68 ELISA 역가의 비교는 60 ㎍/투약량 군이 약간 더 큰 역가반응을 나타내었음을 시사하였다 (도 3). 이 반응은 비록 탁월한 것이지만, 에어로졸 공격 후의 보호와 서로 관련되지는 않았다. p68 ELISA 역가반응은 양성 기관 면봉법 또는 증가하는 응집반응 역가를 가지고 시험으로부터 제외된 개에서는 가변적이었다. 양성 기관 면봉 배양물 및/또는 증가하는 응집반응 역가를 가지고 시험으로부터 제외된 6 마리의 대조군 중의 3 마리는 <200의 p68 ELISA 역가를 유지하였다. 시험으로부터 제외된 동물의 기관 면봉법 또는 응집반응 역가 상태와 p68 ELISA 역가는 서로 관계가 없는 것으로 보인다.
공격한 후에 백신접종 및 백신접종되지 않은 p68 보르데텔라 개에서 SAA 반응의 검사는 특히 공격 후 5 및 7일에, 15 ㎍/투약량 군에서의 SAA 값에서 훨씬 더 작은 증가를 시사하였다.
결론
본 시험에서는 15 ㎍/투약량 및 60 ㎍/투약량의 p68 개 보르데텔라 백신의 효능을 백신접종 후 6개월의 개 공격모델을 사용하여 검사하였다. 두가지 백신은 모두 정상적인 직장 온도 및 최소 주사부위 반응에 의해서 입증되는 바와 같이 안전하였다. 비록 15 ㎍/투약량 및 60 ㎍/투약량 백신접종된 개가 둘 다 p68 ELISA 역가에 의해서 측정되는 바와 같이 백신접종에 대하여 우수한 혈청학적 반응을 나타내었지만, 이 반응은 60 ㎍/투약량 백신접종된 개에서의 임상적 보호와 서로 관련되지는 않았다. 60 ㎍/투약량 백신접종된 개는 백신접종되지 않은 대조군에 비해 기침에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 15 ㎍/투약량 백신의 우수한 효능은 대조군과 비교하였을 때에 기침에서의 50% 이상의 감소에 의해서 입증되었다. 60 ㎍/투약량 백신에서 SDS의 증가된 레벨은 보호에서의 입증된 차이를 제공할 수 있는 것으로 인정된다. SAA 값의 비교는 백신접종군과 대조군 사이에서의 차이를 나타내었다.
실시예 4
반구아드 (VANGUARD™) 플러스 5/CV-L의 안전성 및 효능
반구아드 플러스 5/CV-L은 CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스, CPV의 약독화된 스트레인, 및 렙토스피라 캐니콜라 및 렙토스피라 익테로헤모라지에의 불활성화된 전체 배양물의 동결-건조된 제제와 함께 아쥬번트를 포함하는 불활성화된 CCV의 액체 제제로 이루어진다. 모든 바이러스는 안정된 세포 라인으로 증식되었다. CPV 분획은 표 38에 제시된 레벨에서 모계 항체 간섭을 무효화시킬 수 있는 면역원성 특성을 제공하는, 개 세포 라인에 대한 낮은 계대 (low passage)에 의해서 약독화되었다. 액체 성분을 사용하여 진공 장소에서 불활성 가스에 의해서 충진된 동결-건조된 성분을 재수화시켰다.
실험실 평가는 반구아드 플러스 5/CV-L이 CD, ICH, CAV-2 및 CPI 호흡기 질병, CCV 및 CPV에 의해서 야기된 장염 및 렙토스피라 캐니콜라 및 렙토스피라 익테로헤모라지에에 의해서 야기된 렙토스피라증에 대항하여 개를 면역시켰으며, 백신 분획들 사이에 면역학적 간섭은 존재하지 않았음을 나타내었다. 광범한 현장 안전성 실험은 이것이 안전하며, 정상적인 사용조건 하에서 6 주령 정도의 어린 개에서는 실질적으로 반응이 없음을 나타내었다.
또한, CAV-2 백신은 CAV-1에 의해서 야기된 ICH에 대항하여 교차-보호 (cross-protect)를 하는 것으로 나타났다. 시험은 CAV-2가 ICH에 대항하여 보호할 뿐만 아니라 CAV-2 호흡기 질병에 대해서도 역시 보호함을 나타내었다. 소 아데노바이러스 타입 2 공격 바이러스는 수행된 시험에서 CAV-2-백신접종된 개로부터 회수되지 않았다.
반구아드 플러스 5/CV-L에서 CPV 분획을 포괄적인 안전성 및 효능 시험에 적용하였다. 이것은 실험실 시험에서 및 현장조건 하의 임상실험에서 안전하고, 필수적으로 반응이 없음을 나타내었다. 생성물 안전성은 추가로, 민감성 개에게 백신 스트레인의 수회 용량을 경구 투여하는 것을 포함한 백패세지 시험 (backpassage study)에 의해서 입증되었으며, 여기에서 모든 개는 정상으로 유지되었다.
연구는 증가된 CPV 바이러스 역가를 갖는 백신의 3 가지 투약량이 모계 항체와 연관된 혈청 중화 (SN) 역가를 극복할 수 있음을 입증하였다. 1:4 정도로 낮은 혈청 중화역가는 통상적인 변형된 생백신을 사용한 능동 면역화를 저해하는 다른 것에 의해서 나타났다. 임상실험은 50 마리의 6-주령 강아지를 사용하여 수행되었다 [25 마리 백신접종군 (SN 역가 범위 -256) 및 25 마리 백신접종되지 않은 대조군 (SN 역가 범위 4-1024)] (표 37). 백신접종군에게는 3 가지 투약량이 제공되었으며, 백신접종은 6 주령에서 시작하여 3주일 간격을 두고 투여되었다. 1 회의 백신접종 후에, 13/25 강아지는 CPV SN 역가에서 4-배 또는 그 이상의 증가를 나타내었다 (혈청전환) (표 38). 이들 13 마리의 강아지 중의 12 마리는 일차 백신접종의 시기에 ≤1:16의 모계 SN 역가를 가졌으며, 나머지 강아지는 1:64의 SN 역가를 가졌다. 1:16 내지 1:256의 초기 SN 역가를 갖는 또 다른 9 마리의 강아지는 이차 백신접종 후에 혈청전환하였다. 이들의 모계 항체 SN 역가는 이차 백신접종의 시기에 ≤1:64로 저하하였다. 마찬가지로, 1:128의 초기 SN 역가를 갖는 마지막 3 마리의 백신접종군은 그들의 모계 항체 CPV 역가가 ≤1:64로 저하된 후, 삼차 백신접종 후에 혈청전환하였다. 따라서, 이 시험에서 백신의 3 가지 투약량이 6 주령에서 시작해서 투여되는 경우에 백신접종군의 25 마리 모두는 그들이 최고의 모계 항체 레벨을 갖는 경우라도 능동적으로 면역되었다 (GM= 1:1176; SN 역가의 범위 128-4096). 모두 50 마리의 개를 삼차 백신접종한지 3주일 후에 이종 CPV 공격 바이러스로 공격하였다. 25 마리의 백신접종하지 않은 대조군 개 중의 14 마리는 사망하였거나, 안락사를 인정하기에 충분히 중증의 질병을 나타내었으며, 그 반면에 백신접종군의 25 마리는 모두 필수적으로 건강하게 유지되었다. 따라서, 반구아드 플러스 5/CV-L에서 고역가의 낮은 계대 백신 바이러스는 고도로 면역원성이며, 모계 항체의 존재 하에서 능동면역을 자극할 수 있었다.
반구아드 플러스 5/CV-L의 CCV 분획의 효능은 광범한 백신접종 공격시험에서 입증되었다. 16 마리의 7- 내지 8-주령의 강아지를 반구아드 플러스 5/CV-L (백신접종군) 및 17 ㎖ 반구아드 플러스 5/L (대조군)로 백신접종하였다. 모든 강아지는 3-주일 간격으로 1 ㎖ 투약량을 3 회 투여받았다. 삼차 백신접종한지 3주일 후에 강아지를 CCV의 유독성 스트레인 (CV-6)으로 공격하였다. 임상적 관찰, 온도, 체중 및 혈액 파라메터는 감염시킨 후의 21일 동안 모니터하였다. CCV 백신접종군은 대조군에 비해서 설사의 발생 및 유독성 CCV 쉐드 (shed)의 양에서 감소를 나타내었다. 공격-후 21일에 소장 구역의 유독성 CCV에 대한 형광성 항체 염색은 CCV 백신접종군과 대조군 사이에서 검출가능한 CCV 항원의 유의적인 감소 (P)를 나타내었다 (표 39).
Figure pat00026
Figure pat00027
Figure pat00028
결론
본 시험에서, CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스, CPV, 및 렙토스피라 캐니콜라 및 렙토스피라 익테로헤모라지에의 불활성화된 전배양물 및 CCV를 함유하는 아쥬번트 첨가된 배합 백신은 강아지에게 사용하는 경우에 백신으로서 안전할 뿐만 아니라 효과적이기도 한 것으로 나타났다. 배합 백신은 또한 모계 항체와 연관된 혈청 중화 (SN) 역가를 극복하는 것으로 나타났다.
실시예 5
개 보르데텔라 천연 p68 면역원성 시험
동물
이 시험은 SPF 비글의 한배의 새끼 2 마리 및 무작위 공급원 개의 한배의 새끼 2 마리를 포함하였다. 개는 백신접종되거나 백신접종되지 않은 군으로 무작위 배정되었다. 시험에는 총 10 마리의 백신접종된 개와 11 마리의 백신접종되지 않은 개가 포함되었다.
실험용 백신의 제조
보르데텔라 브론키셉티카 (스트레인 110H)는 48시간 보르데-장구 혈액 한천 확산 플레이트를 5 내지 10 ㎖의 열추출 완충액 (heat extraction buffer)으로 세척함으로써 플레이트로부터 수거하였다. 대신으로, 양 배양물 (Charlotte Parker Defined Medium)에서 성장한 세포는 상등액 분획을 원심분리하여 버림으로써 수거하였다. 수거된 세포를 25 mM 트리스-HCl, pH 8.8 중에 현탁시키고, 60℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세포 파편을 열추출물로부터 4℃에서 30분 동안 20,000×g으로 원심분리함으로써 분리하였다. 열추출된 상등액 분획에 나트륨 아지드 (0.01%)를 첨가한 다음에 미공성 여과에 의해서 더 정제하였다.
모노클로날 항체 친화성 수지는 모노클로날 항체 (Bord 2-7로 지정됨)를 표준방법을 사용하여 CNBr-활성화된 세파로즈 4B에 컨쥬게이트시킴으로써 제조되었다. 약 30.35 ㎎의 모노클로날 항체를 1 그람의 친화성 수지에 컨쥬게이트시켰다. 정제된 열추출된 상등액 분획 (상기 수득됨) 및 보드 (Bord) 2-7 친화성 수지는 20 ㎖ 수지에 대해 1 리터 추출물의 대략적인 비로 배합하였다.
수지에 대한 천연 p68의 결합은 혼합물을 밤새 온화하게 진탕하면서 주위온도에서 배양하고, 이어서 수지를 침강시키고, 상등액 분획을 흡인함으로써 촉진시켰다. 그 후, 수지를 2.6 ㎝ 직경의 칼럼에 충진시키고, 칼럼을 5 ㎖/분의 유속으로 PBS, pH 7.5 및 10 mM 포스페이트 완충액, pH 8.0에 의해서 연속해서 세척하였다. 280 nm에서의 흡광도가 기준선에 도달하면 결합된 물질을 100 mM 트리에틸아민을 사용하여 용출시키고, 280 nm의 하나의 큰 피크 아래의 분획을 수집하여 ELISA에 의해서 p68의 존재에 대해 시험하였다. p68을 함유하는 분획을 모아서 PBS에 대해 투석하여 트리에틸아민을 제거하였다.
제조된 실험용 백신 계열은 100 마이크로그람의 정제된 p68 및 1% 수산화알루니늄 겔을 함유하도록 제제화되었다. 포르말린 (0.01%)이 1 ㎖의 최종 백신 투약용량 내에서 보존제로 사용되었다.
공격 접종물
공격물질은 본질적으로 상기 실시예에 기술한 바와 같이 제조되었다.
시험방법
21 마리의 혈청음성 및 배양물 음성 강아지를 두개의 처리군당 하나에 무작위로 배정하였다. 11 마리의 개를 백신접종되지 않은 대조군에 배정하고, 10 마리의 개는 백신접종군에 배정하였다. 1 ㎖의 백신을 0일에 피하로 투여하고, 21일 후에 반복하였다. 혈액은 일차 및 이차 백신접종하기 전에 혈청학적 p68 ELISA를 위해서 수집하였다.
이차 백신접종한지 14일 후인 35일에 보르데텔라 브론키셉티카의 에어로졸 공격을 상술한 바와 같이 모든 개에게 제공하였다. 동물들은 이전의 실시예에 기술된 바와 같이 공격한 후에 14일 동안 기침에 대해서 모니터하였다.
결과
p68에 대한 임상적 관찰결과 및 혈청학적 반응의 요약은 표 40에 제시하였다.
임상적 관찰결과 및 혈청학적 반응의 요약
군 N 연속 2일의 기침 수 정상/총수 백신접종-전 역가 (GMT) 공격-전 역가 (GMT) 공격-후 역가 (GMT)
백신 10 0 10/10 5.08 348.15 391.30
대조군 11 11 0/11 6.10 6.45 18.81
고찰
본 시험에서, 10 마리의 대조군 개 중의 10 마리는 적어도 연속 2일 동안 기침을 하였다. 개는 만일 연속 2일 동안 기침을 한다면 임상적으로 질병에 걸린 것으로 간주된다. 이 판단기준에 의해서 백신접종되지 않은 대조군 개의 100%는 질병에 걸렸다. 백신접종된 군에서는 한마리의 개가 공격-후 4일에 기침을 하였으며, 한마리의 개는 공격-후 4 및 6일에 기침을 하였다. 두마리의 개는 14일에 기침을 하였다. 백신접종된 개 중의 어떤 것도 연속 2일 동안 기침을 하지는 않았다. 따라서, 천연 p68 백신접종된 군에서 100%의 개는 공격한 후에 정상으로 유지된 것으로 판단되었다.
결론
본 실험은 보르데텔라 브론키셉티카 질병으로부터 보호하는 천연 p68 백신의 능력을 입증하는 것이다.
실시예 6
렙토스피라 브라티슬라바 공격에 대한 다가 개 백신의 효능
본 시험의 목적은 개에게서 렙토스피라 브라티슬라바 공격에 대항하는, 렙토스피라 혈청형변이주 렙토스피라 브라티슬라바, 캐니콜라, 그립포타이포사, 익테로헤모라지에 및 포모나에 대한 분획을 함유하는 백신의 효능을 입증하기 위한 것이었다.
물질
백신: 사용된 백신은 다음과 같았다:
1. 개 디스템퍼, 아데노바이러스 타입 2, 파라인플루엔자, 및 파르보바이러스 항원 (VAGUARD™ PLUS 5)을 포함하는 동결건조된 백신이 사용되었다. 백신은 방출 항원 레벨을 함유하였다. 생성물 코드 13D1.22
2. 액체 희석제 제제 (FIRSTDOSE™ CV) 중의 개 코로나바이러스 백신이 사용되었다. 백신은 방출 항원 레벨을 함유하였다. 생성물 코드 14P5.20
3. 개 디스템퍼, 아데노바이러스 타입 2, 파라인플루엔자, 파르보바이러스, 브라티슬라바, 캐니콜라, 그립포타이포사, 익테로헤모라지에 및 포모나 항원을 포함하는 동결건조된 백신이 사용되었다. 백신은 각각의 렙토스피라 혈청형변이주의 대략 600 네플로 (nephlos); 및 변형된 생바이러스 분획 (소 아데노바이러스, 디스템퍼 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 파르보바이러스) 의 방출 항원 레벨을 함유하였다. 생성물 코드 4637.2A
시험동물: 두가지 성의 약 5-6 주령의 비글 강아지를 사용하였다. 이들은 백신접종 시에 렙토스피라 혈청형변이주 브라티슬라바, 캐니콜라, 그립포타이포사, 익테로헤모라지에 및 포모나에 대해서 혈청음성이었다 (<1:8).
공격 유기체: 각각의 동물은 렙토스피라 브라티슬라바 약 2 ㎖ (감염된 햄스터 간 조직의 10-1 희석액)의 일회 용량을 복강내 주사로 투여하였다.
시험 디자인
Figure pat00029

방법
백신상: 시험일 0 및 21일에 4 개의 백신접종군 (10 마리/군)의 40 마리의 개에게 이하에 개략적으로 나타낸 바와 같이 대조 또는 시험 백신의 주사를 투여하였다.
T1: 개 코로나바이러스 희석제로 재구성되고 피하 (SQ) 주사로 투여되는, 개 디스템퍼, 아데노바이러스 타입 2, 파라인플루엔자, 파르보바이러스 백신을 함유하는 대조 백신 1 ㎖. (생성물 코드 14P5.20으로 재구성된 생성물 코드 13D1.22)
T2: 개 코로나바이러스 희석제로 재구성되고 근육내 (IM) 주사로 투여되는, 개 디스템퍼, 아데노바이러스 타입 2, 파라인플루엔자, 파르보바이러스 백신을 함유하는 대조 백신 1 ㎖. (생성물 코드 14P5.20으로 재구성된 생성물 코드 13D1.22)
T3: 개 코로나바이러스 희석제로 재구성되고 SQ 주사로 투여되는, 개 디스템퍼, 아데노바이러스 타입 2, 파라인플루엔자, 파르보바이러스, 브라티슬라바, 캐니콜라, 그립포타이포사, 익테로헤모라지에 및 포모나 백신을 함유하는 렙토스피라 백신 1 ㎖. (생성물 코드 46J7.2A; 생성물 코드 4637.2A 및 14P5.20의 배합물)
T4: 개 코로나바이러스 희석제로 재구성되고 IM 주사로 투여되는, 개 디스템퍼, 아데노바이러스 타입 2, 파라인플루엔자, 파르보바이러스, 브라티슬라바, 캐니콜라, 그립포타이포사, 익테로헤모라지에 및 포모나 백신을 함유하는 렙토스피라 백신 1 ㎖. (생성물 코드 46J7.2A; 생성물 코드 4637.2A 및 14P5.20의 배합물)
바람직하지 않은 전신반응에 대한 백신접종-후 관찰은 백신접종한지 약 1시간 및 5시간 후에 이루어졌다.
렙토스피라 공격: 시험일 49일에 시험동물을 약 2 ㎖ 용량의 렙토스피라 브라티슬라바를 복강내 주사함으로써 공격하였다.
혈액 샘플 수집: 혈청 샘플은 시험일 0, 21, 35, 48, 50, 52, 55, 58, 61, 64, 67 및 70일에 이용가능한 동물로부터 수집하였다. 마찬가지로, 혈장 샘플은 시험일 48, 50, 52, 55, 58, 61, 64, 67 및 70일에 수집하였다.
박테리아 혈청학: 시험일 0, 21, 35, 48, 58 및 70일에 수득된 혈청 샘플을 렙토스피라 브라티슬라바에 대한 순환항체에 관한 미소응집반응시험을 통해서 분석하였다.
스피로키타혈증: 시험일 48, 50, 52, 55, 58, 61, 64, 67 및 70일에 수득된 혈장 샘플은 스피로키트에 대해서 암시야현미경으로 검사하고, 렙토스피라 재-분리를 위해서 배양하였다.
완전 혈구계산/혈청화학 패널: 시험일 48, 50, 52, 55, 58, 61, 64, 67 및 70일에 수득된 혈장 샘플을 혈소판 수 및 침강율에 대해서 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 분석하였다. 동일한 간격으로 수득된 혈장 샘플은 아밀라제, 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스아미나제 (AST) 및 크레아티닌에 대해서 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 분석하였다. CBC 및 침강율은 시험일 55일에 2 마리 동물 (Nos. QPH3, RVG3)에 대해서도, 시험일 58일에 한마리 동물 (No. RBH3)에 대해서도, 시험일 61일에 3 마리 동물 (Nos. OLH3, OUH3, PTG3)에 대해서도, 시험일 70일에 한마리 동물 (No. OWG3)에 대해서도 완료되지 않았는데, 이는 수집된 혈장 샘플이 시험하기 전에 응고되었기 때문이다. 시험일 67일에 침강율이 2 마리의 동물 (Nos. OUH3, SAG3)에 대해서 완료되지 않았는데, 이는 혈장 샘플의 양이 시험하기에 충분하지 않았기 때문이다. 이들 결과는 본 시험 파라메터에 영향을 미치지 않았다.
직장체 온도: 직장체 온도는 시험일 47-70일에 기록하였다. 공격-후 (시험일 50일)에 ≥39.2℃의 상승된 체온은 렙토스피라증을 나타내는 것으로 간주되었다.
뇨 배양물: 시험일 48, 55 및 70일에 수득된 뇨 샘플을 렙토스피라에 대해서 배양하고, 요검사를 위해서 제출되었다. 수집시에 이용할 수 있는 뇨의 양이 시험에 불충분하였기 때문에 시험일 48일에 요검사는 한마리의 동물 (No. CBC3)에 대해서는 완료하지 못하였다. 수집시에 이용할 수 있는 뇨의 양이 시험에 불충분하였기 때문에 시험일 55일에 요검사는 두마리의 동물 (No. OPH3, RXG3)에 대해서는 완료하지 못하였다. 수집시에 이용할 수 있는 뇨의 양이 시험에 불충분하였기 때문에 시험일 70일에 요검사는 10 마리의 동물 (Nos. OYG3, PIG3, PUG3, QHG3, QQH3, QSG3, RDG3, RUG3, RVG3, RYG3)에 대해서는 완료하지 못하였다. 이들 결과는 본 시험 파라메터에 영향을 미치지 않았다.
부검 및 렙토스피라 분리: 공격-후 기간 중에 또는 공격-후 기간의 마지막에 안락사시킨 동물을 부검하였다. 체액 및 조직 (즉, 간, 신장 및 뇨)을 수집하고, 렙토스피라 재-분리를 위해서 BCL에 제출하였다. 수집시에 이용할 수 있는 뇨의 양이 시험에 불충분하였기 때문에 시험일 55일에 박테리아 재-분리는 두마리의 동물 (No. OPH3, RXG3)에 대해서는 완료하지 못하였다. 수집시에 이용할 수 있는 뇨의 양이 시험에 불충분하였기 때문에 시험일 70일에 박테리아 재-분리는 4 마리의 동물 (Nos. OYG3, PUG3, QSG3, RUG3)에 대해서는 완료하지 못하였다. 이들 결과는 본 시험 파라메터에 영향을 미치지 않았다.
건강 관찰결과: 동물들은 전반적 건강상태에 대해서 매일 모니터하였다.
데이타 요약 및 분석
데이타는 혼합 모델 또는 카테고리적 (categorical) (SAS/STAT Software Changes and Enhancements through Release 6.12, SAS Institute, Cary, North Carolina) 방법으로 분석하였다.
일반적 선형 반복 측정 혼합모델 (고정효과 모델 관점은 처리, 시험일 및 시험일별 처리이다)을 사용하여 온도, 혈청 항체 역가, 혈소판수, 침강율, 아밀라제, 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스아미나제 (AST) 및 크레아티닌을 분석하였다. 중요한 대비는 유의적인 (P≤0.05) 처리 또는 시험일별 처리 상호작용 효과를 검출한 후에 이루어졌다. 역가는 분석을 위한 필요에 따라서 로그-변환되었으며, 변환된 경우에 최소자승평균은 제시를 위해서 기하평균으로 역변환되었다. 분석되지 않은 관찰결과 (즉, 부검 결과 및 백신접종-후 관찰결과)는 요약을 위한 데이타베이스에 포함시키지 않았다.
적어도 한번의 혈소판수 <200을 갖는 동물 및 39.2℃ 이상의 직장 온도를 갖는 동물의 도수분포를 각각의 처리에 대하여 계산하였다.
동물은 시험 중에 공격-후 매일 정상 또는 질병상태로 분류하였다. 다음의 징후 중의 어떤 것이라도 존재하면 잘병상태로 분류하였다: 결막염, 우울증, 식욕부진, 근육 진전, 콧물 분비, 발열 (≥39.2℃) 또는 물기가 있는 눈.
일반적 선형 혼합모델 (고정효과 모델 관점은 처리이다)을 사용하여 동물이 질병상태로 분류된 공격-후 일수를 분석하였다. 사망 또는 안락사시킨 이항변수 (binomial variable)를 피셔정밀검정에 의해서 분석하였다. 스피로키타혈증, 및 뇨, 신장 및 간에서의 박테리아 재-분리는 피셔정밀검정을 사용해서 분석하여 처리군을 비교하였다.
투여경로와 처리별 경로 상호작용 사이의 유의적인 차이가 존재하지 않는 경우에 (P≤0.05 two-sided), 대비를 사용하여 처리 T1 및 T2의 평균을 처리 T3 및 T4의 평균에 대해서 비교하였다 (P≤0.05 one-sided). 분석이 반복된 측정치 분석이었다면, 비교는 데이타가 수집된 각각의 시점에서 이루어졌다. 다른 식으로, 대비를 사용하여 T1과 T3 및 T2와 T4를 비교하였다 (P≤0.05 one-sided). 이들 비교는 분석이 반복된 측정이었다면 각각의 시점에서 이루어졌다.
렙토스피라 브라티슬라바에 대한 렙토스피라 백신의 효능은 백신접종된 동물에서 질병상태의 더 낮은 발생빈도 (P≤0.05, one-sided)에 의해서 입증되었다. 다음의 변수들은 렙토스피라 백신의 효능을 지지하였다: (1) 평균 혈소판수는 백신접종군에 대해서 유의적으로 (P≤0.05, one-sided) 더 컸다; (2) 평균 침강율은 백신접종군에 대해서 유의적으로 (P≤0.05, one-sided) 더 낮았다; (3) 스피로키타혈증의 발생빈도는 백신접종군에 대해서 유의적으로 (P≤0.05, one-sided) 감소되었다.
결과
공격-후 임상적 징후: 시험동물이 렙토스피라증을 시사하는 임상적 징후 (예를 들어, 결막염, 우울증, 설사, 혈뇨, 황달, 식욕부진, 빈사, 근육 진전, 발열, 구토)를 나타낸 평균 일수는 표 1에 나타내었다. 공격-후 (시험일 50-70일)에 T1 및 T2 대조군이 질병상태인 평균 일수는 각각 4.3 및 3.3이었다. 반대로, T3 및 T4 백신접종군에 대한 평균은 0.7 및 0.5였으며, 이들 결과는 T1-T2 대조군과 비교할 때 현저하게 개선된 것이었다 (P<0.05). 공격-후에 임상적 징후를 나타내는 동물의 퍼센트도 또한 표 1에 제시되었다. 렙토스피라증의 징후는 T1-T2 대조군의 75%까지 나타난 반면에, 유사한 징후는 T3-T4 백신접종군의 단지 30%에서 관찰되었다. 시험의 공격상 중에 안락사를 필요로 하는 감염된 동물의 수도 또한 표 1에 제시되어 있다. T1-T2 대조군에서 5 마리의 동물 (25%)은 렙토스피라증의 중증 징후를 나타내어 안락사시켰다. 반대로, T3-T4 백신접종군은 동일한 기간 중에 그렇지 않고 건강하게 유지되었으며, 그의 비교 (T1-T2 대 T3-T4)는 백신접종군에 대해서 유의적으로 개선되었다 (P<0.05). 공격-후 평균 체온의 표시는 표 2에 나타내었다. 공격-후 처음 9일 동안 (시험일 50-58일), T1-T2 대조군의 평균 체온은 37.8 내지 39.4℃의 범위였다. 동일한 기간 중에 T3-T4 백신접종군에 대한 평균 체온은 38.2 내지 38.7℃의 범위였다. 특히, T3-T4 백신접종군에 대한 평균 체온은 T1-T2 평균 체온와 비교할 때 공격-후 2, 3 및 5일에 현저하게 더 낮았다 (P<0.05). 적어도 하나의 온도 ≥39.2℃를 갖는 동물의 빈도도 또한 표 2에 나타내었다. ≥39.2℃의 상승된 체온은 렙토스피라 감염을 시사하는 것으로 간주되었다. 공격-후 관찰기간의 과정 중에, T1-T2 대조군의 60-70%는 ≥39.2℃의 체온을 나타내었다. 반대로, T3-T4 백신접종군의 단지 30%만이 이러한 임상적 징후를 나타내었다.
공격-후 스피로키타혈증: 스피로키타혈증의 빈도는 표 3에 나타내었다. 혈액 중에 스피로키트의 존재 (박테리아 배양에 의해서 검출됨)는 렙토스피라증을 나타내는 임상적 결과이다. 공격-후 1일 (시험일 50일)에, 스피로키타혈증은 T1 대조군의 90%, T2 대조군의 60%, T3 백신접종군의 60%, 및 T4 백신접종군의 70%에서 확정되었다. 박테리아 재-분리는 백신접종의 상태와는 무간하게 복강내 주사한 지 24시간 후에 혈액으로부터 예상되었다. 그 후, 스피로키타혈증은 T1의 경우에 다음과 같이 확정되었다: 공격-후 3일 (시험일 52일)에 100%, 6일 (시험일 55일)에 56%, 및 9일 (시험일 58일)에 33%. 마찬가지로, 스피로키타혈증은 T2 대조군에 대해서 다음과 같이 확정되었다: 공격-후 3일에 60%, 6일에 50%, 및 9일에 29%. 반대로, 스피로키타혈증은 T3-T4 백신접종군에서 동일한 공격-후 기간 중에도, 공격-후 기간의 나머지 (즉, 시험일 50-70일) 중에도 확정되지 않았다.
전반적으로, 공격-후 1일을 포함한 기간에 (시험일 50-70일) 스피로키타혈증에 대해서 양성인 동물의 백분율은 T1-T2 대조군의 경우는 60%-100%이고, T3-T4 백신접종군의 경우는 60%-70%였다. 반대로, 공격-후 1일을 제외한 기간에 (시험일 52-70일) 양성인 동물의 백분율은 T1-T2 대조군의 경우는 60%-100%이고, T3-T4 백신접종군의 경우는 0%였다.
공격-후 체액 및 조직으로부터 렙토스피라 재-분리: 혈액, 뇨, 신장 및 간 샘플로부터 렙토스피라 재-분리는 표 4에 나타내었다. 혈액으로부터의 렙토스피라 재-분리 결과의 요약은 이전의 항목에 제시되어 있다. 공격-후 3일에 시작하여 (즉, 공격-후 1일은 제외함) 스피로키타혈증은 T1-T2 대조군의 60-100%에서 확정되었으며, 동일한 기간 중에 T3-T4 백신접종군에서는 확정되지 않았다. 특히, 그의 비교 (T1-T2 대 T3-T4)는 백신접종군에 대해서 현저하게 개선되었다 (P<0.05).
신장 샘플은 부검 시에 수집되었다. 렙토스피라는 T1 및 T2 대조군으로부터 수득된 신장 샘플의 50%로부터 재-분리되었다. 이것은 T3-T4 백신접종군으로부터 유도된 샘플로부터는 재-분리되지 않았다. 그의 비교 (T1-T2 대 T3-T4)는 백신접종군에 대해서 현저하게 개선되었다 (P<0.05).
간 샘플은 부검 시에 수집되었다. 렙토스피라는 T1 및 T2 대조군으로부터 수득된 간 샘플의 10% 및 20%로부터 각각 재-분리되었다. 이것은 T3-T4 백신접종군으로부터 유도된 샘플로부터는 재-분리되지 않았다. 그의 비교 (T1-T2 대 T3-T4)는 백신접종군에 대해서 현저하게 개선되었다 (P<0.05).
뇨 샘플은 공격-후 2시간 간격으로 및 부검 시에 수집되었다. 렙토스피라는 공격-후 6일 (시험일 55일)에 2 마리의 T1 대조군으로부터 재-분리되었다. 렙토스피라는 T2 대조군에 대한 샘플로부터도, T3-T4 백신접종군에 대한 샘플로부터도 재-분리되지 않았다.
공격-후 혈소판수: 평균 혈소판수는 표 5에 나타내었다. 혈소판의 수에 있어서의 감소 (혈소판감소증)는 렙토스피라증을 시사하는 임상적 결과이다. T1-T2에 대조군에 대한 평균 농도는 61 내지 937의 범위였다. 동일한 기간 중에 T3-T4 백신접종군에 대한 평균 계수는 400 내지 566의 범위였다. 특히, T3-T4 백신접종군에 대한 혈소판수는 T1-T2 대조군과 비교할 때에 공격-후 3, 6 및 9일에 현저하게 개선되었다 (P<0.05).
적어도 하나의 혈소판수 <200을 갖는 동물의 빈도도 또한 표 5에 제시하였다. 공격-후 기간 중에 T1 대조군의 90% 및 T2 대조군의 60%는 혈소판감소증 (혈소판수 <200)인 것으로 측정되었다. 반대로, T3 백신접종군의 단지 10%만이 감염-후 혈소판감소증이었으며, T4 백신접종군 중의 어떤 것도 이를 나타내지 않았다.
공격-후 침강율: 평균 침강율은 표 6에 나타내었다. 침강율의 증가는 렙토스피라증을 시사하는 임상적 결과이다.
T1-T2 대조군에 대한 평균 침강율은 2.4 내지 16.0의 범위였다. 동일한 기간 중에, T3-T4 백신접종군을 위한 평균 침강율은 1.5 내지 6.3의 범위였다. 특히, T3-T4 백신접종군에 대한 침강율은 T1-T2 대조군과 비교할 때 공격-후 3, 6, 9, 12, 15, 18 및 21일에 현저하게 더 낮았다 (P<0.05).
공격-후 ALT 농도: 평균 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 농도는 표 7에 제시하였다. ALT의 증가는 박테리아 감염을 나타내는 임상적 결과이다 (즉, 간 기능이 나빠짐에 따라서 ALT 레벨은 상승한다). T1-T2 대조군에 대한 평균 농도는 22 내지 79의 범위였다. 동일한 기간 중에, T3-T4 백신접종군에 대한 평균 농도는 21 내지 61의 범위였다. 특히, T3-T4 백신접종군에 대한 농도는 T1-T2 대조군과 비교할 때 공격-후 3, 6, 9 및 12일에 현저하게 더 낮았다 (P<0.05).
공격-후 크레아티닌 농도: 평균 크레아티닌 농도는 표 8에 제시하였다. 크레아티닌 농도의 증가는 박테리아 감염을 나타내는 임상적 결과이다 (즉, 간 기능이 렙토스피라증으로 인하여 나빠짐에 따라서 크레아티닌 레벨은 상승한다). T1 대조군 (즉, SQ 투여)에 대한 평균 농도는 0.30 내지 0.99의 범위였다. 동일한 기간 중에, T3 백신접종군 (즉, SQ 투여)에 대한 평균 농도는 0.26 내지 0.40의 범위였다. 특히, T3 백신접종물에 대한 농도는 T1 대조군과 비교할 때 공격-후 1, 6, 9, 12, 15, 18 및 21일에 현저하게 더 낮았다 (P<0.05). T2 대조군 (즉, IM 투여)에 대한 평균 농도는 0.30 내지 1.31의 범위였다. 동일한 기간 중에, T4 백신접종군 (즉, IM 투여)에 대한 평균 농도는 0.32 내지 0.46의 범위였다. 공격-후에 T2와 T4 값 사이에는 유의적인 차이가 없었다.
공격-후 아밀라제, AST 및 요검사: T1-T2 대조군과 비교할 때에 T3-T4 백신접종군에 대한 평균 농도에서 유의적인 차이는 없었다. 그러나, 일반적으로 공격-후 농도는 T1-T2 대조군의 경우에 더 극적으로 증가하였다. 대체로, AST (아스파르테이트 아미노트랜스아미나제) 및 요검사 결과에서 공격-후 변화는 T1-T4 시험동물에 대해서 관찰되지 않았다. 이들 3 가지 파라메터에 대한 결과는 달리 표로 표시되지는 않았다.
혈청 항체 역가: 평균 혈청 렙토스피라 브라티슬라바 항체 역가는 표 9에 제시하였다. 연구의 백신접종기 (시험일 0-48일) 중에, T1-T2 대조군에 대한 평균 역가는 약 2였다 (즉, 혈청음성). 상응하게, T3-T4 백신접종군에 대한 평균은 2 (백신접종-전) 내지 1181 (백신접종-후)의 범위였다. 특히, T3-T4 백신접종군에 대한 평균 역가는 평균 T1-T2 역가와 비교할 때 공격-후 21, 35 및 48일에 현저하게 더 높았다 (P<0.05).
연구의 공격기 (시험일 58 및 70일) 중에, T1-T2 대조군에 대한 평균 역가는 2135 내지 41160의 범위였다. 상응하게, T3-T4 백신접종군에 대한 평균 역가는 727 내지 10891의 범위였으며, T1-T2 대조군과 비교할 때 시험일 58일 (즉, 백신접종-후 9일) 및 백신접종-후 70일 (즉, PC 21일)에 현저하게 더 낮았다 (P<0.05). 결과적으로, 대조군은 공격-후에 렙토스피라 브라티슬라바에 대하여 극적인 일차 반응을 나타내었으며 (즉, 감염이 확정됨), 그 반면에 T3-T4 백신접종군에 대한 반응은 덜 확고하였다 (즉, 전형적인 기왕반응).
백신접종-후 전신적 반응: 일차 및 추가 백신접종 후 약 1 및 5시간에 평가할 때에 T1-T4 시험동물에서 백신접종-후 전신적 반응은 관찰되지 않았다. 이 결과는 본 명세서에서 표로 나타내지 않았다.
결론
SQ 또는 IM 주사에 위해서 제공된 다가 렙토스피라 백신의 렙토스피라 브라티슬라바에 대한 효능은 그 중에서 특히, 대조군과 비교하여 (1) 렙토스피라-연관된 질병상태의 현저하게 더 낮은 발생빈도, (2) 스피로키타혈증의 현저하게 더 낮은 발생빈도, (3) 현저하게 더 높은 혈소판수, 및 (4) 현저하게 더 낮은 평균 침강율에 의해서 공격-후에 입증되었다.
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<서열목록>
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SEQUENCE LISTING <110> Frantz, Joseph C. Tucker, Cassius M. Newby, Thomas J. <120> CANINE VACCINES AGAINST BORDETELLA BRONCHISEPTICA <130> PC32220 <140> 60/443,418 <141> 2003-01-29 <160> 3 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 602 <212> PRT <213> Bordetella bronchiseptica <400> 1 Asp Pro Asn Thr Val Ser Ile Ile Lys Ala Gly Glu Arg Gln His Gly 1 5 10 15 Ile His Ile Lys Gln Ser Asp Gly Ala Gly Val Arg Thr Ala Thr Gly 20 25 30 Thr Thr Ile Lys Val Ser Gly Arg Gln Ala Gln Gly Val Leu Leu Glu 35 40 45 Asn Pro Ala Ala Glu Leu Arg Phe Gln Asn Gly Ser Val Thr Ser Ser 50 55 60 Gly Gln Leu Phe Asp Glu Gly Val Arg Arg Phe Leu Gly Thr Val Thr 65 70 75 80 Val Lys Ala Gly Lys Leu Val Ala Asp His Ala Thr Leu Ala Asn Val 85 90 95 Ser Asp Thr Arg Asp Asp Asp Gly Ile Ala Leu Tyr Val Ala Gly Glu 100 105 110 Gln Ala Gln Ala Ser Ile Ala Asp Ser Thr Leu Gln Gly Ala Gly Gly 115 120 125 Val Arg Val Glu Arg Gly Ala Asn Val Thr Val Gln Arg Ser Thr Ile 130 135 140 Val Asp Gly Gly Leu His Ile Gly Thr Leu Gln Pro Leu Gln Pro Glu 145 150 155 160 Asp Leu Pro Pro Ser Arg 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720 cccggcggct tcggccccct ccttgacggc tggtatggcg tggatgtatc ggactccacc 780 gtggacctcg ctcagtcgat cgtcgaggcg ccgcagctgg gcgccgcgat ccgggcgggc 840 cgcggcgcca gggtgacggt gtcgggcggc agcttgtccg caccgcacgg caatgtcatc 900 gagaccggcg gcggtgcgcg tcgcttcccg cctccggcct cgcccctgtc gatcaccttg 960 cgggcgggcg cacgggcgca ggggagggcg ctgctgtacc gggtcctgcc ggagcccgtg 1020 aagctgacgc tggcgggcgg cgcccagggg cagggcgaca tcgtcgcgac ggagctgcct 1080 cccattccag gcgcgtcgag cgggccgctc gacgtggcgc tggccagcca ggcccgatgg 1140 acgggcgcta cccgcgcggt cgactcgctg tccatcgaca acgccacctg ggtcatgacg 1200 gacaactcga acgtcggcgc gctgcggctg gccagcgacg gcagcgtcga tttccagcag 1260 ccggccgaag ctgggcggtt caaggtcctg atggtcgata cgctggcggg ttcggggctg 1320 ttccgcatga atgtcttcgc ggacctgggg ctgagcgaca agctggtcgt catgcgggac 1380 gccagcggcc agcacaggct gtgggtccgc aacagcggca gcgagccggc cagcgccaac 1440 accatgctgc tggtgcagac gccacgaggc agcgcggcga cctttaccct tgccaacaag 1500 gacggcaagg tcgatatcgg tacctaccgc tatcgattgg ccgccaacgg caatgggcag 1560 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Claims (1)

  1. 렙토스피라 브라티슬라바의 렙토스피라 세포 제제 및 캐리어를 포함하는 백신 조성물.
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