PT1799253E - Vacinas caninas multivalentes contra leptospira bratislava e outros patogénios - Google Patents

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Thomas Newby
Cassius Mcallister Tucker
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Description

1
DESCRIÇÃO
"VACINAS CANINAS MULTIVALENTES CONTRA LEPTOSPIRA BRATISLAVA E OUTROS PATOGÉNIOS"
CAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção refere-se a vacinas que contêm Leptospira bratislava e a utilização das mesmas para proteger cães contra infecções causadas por Leptospira bratislava. Esta invenção também se refere a vacinas de combinação que contêm Leptospira bratislava e um ou mais antigénios de outro patogénio canino tal como virus da esgana canina (CD), adenovirus canino tipo 2 (CAV-2), virus da parainfluenza canina (CPI), coronavirus canino (CCV), parvovirus canino (CPV), Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae ou Leptospira pomona. Esta invenção refere-se ainda a vacinas de combinação dos ditos antigénios sem Leptospira bratislava. Proporciona-se também métodos para proteger cães contra doenças causadas por patogénios caninos utilizando as vacinas de combinação.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 presente produto de vacina canina de Bordetella bronchiseptica comercialmente disponível é constituído por uma bacterina de célula inteira de Bordetella bronchiseptica sem adjuvantes inactivada. Tal bacterina de célula inteira pode levar a reacções de pós-vacinação relacionadas com proteína celulares. A proteína p68 de B. bronchiseptica é antigenicamente similar à Proteína de
Membrana Externa (OMP) de B. pertussis e à OMP de B. parapertussis (Shahin etal., "Characterization ofthe Protective Capacity and Imunogenicity of the 69-kD Protein of Outer Membrane of Bordetella pertussis", J. Exp. Med., 171: 63-73, 1990) . Um papel protector desta OMP foi demonstrado para ratinhos (Shahin et al., supra; Novotny et 2 al., "Biologic and Protective Properties of the 69-kD Outer Membrane Protein of Bordetella pertussis: A Novel Formulation for a Acellular Pertussis vaccine", J. Infect. Dis. 164:114-22, 1991), seres humanos (He et al., "Protective Role of Immunoglobulin G Antibodies to Filamentous Hemagglutinin and Pertactin of Bordetella pertussis in Bordetella parapertussis Infection", Eur. J Clin Microbiol Infect Dis. 10:793-798, 1996) e suinos (Kobisch et al., "Identification of a 68-Kilodalton Outer Membrane Protein as the Major Protective Antigen of Bordetella bronchiseptica by Using Specific-Pathogen-Free Piglets", Infect. Immun. 58(2):352-357, 1990). CD é uma doença virai com alta mortalidade universal com manifestações variáveis. Aproximadamente 50 % de cães não imunes não vacinados infectados com virus de CD desenvolvem sinais clínicos, e aproximadamente 90 % daqueles cães morreram.
Hepatite canina infecciosa ou ICH, causada pelo adenovírus canino tipo 1 (CAV-1), é uma doença virai universal, algumas vezes fatal, de cães caracterizada por lesões endoteliais generalizadas e hepáticas. CAV-2 causa doença respiratória, que, em casos graves, pode incluir pneumonia e broncopneumonia. CPI é uma doença virai respiratória superior comum. CPI não complicada pode ser média ou subclínica, com sinais que se tornam mais graves se há infecção concomitante com outros patogénios respiratórios. A infecção por CPV resulta em doença entérica caracterizada por súbito aparecimento de vómito e diarreia, com frequência hemorrágica. Leucopenia comummente acompanha sinais clínicos. Cães susceptiveis de qualquer idade podem ser afectados, mas a mortalidade é maior em cachorros. Em cachorros de 4-12 semanas de idade, CPV pode causar ocasionalmente miocardite que pode resultar em insuficiência cardíaca aguda após uma doença breve e 3 discreta. Em seguida à infecção muitos cães são refractários à doença durante um ano ou mais. De maneira similar, as cadelas seropositivas podem transferir às crias anticorpos contra CPV que podem interferir com a imunização activa dos cachorros até 16 semanas de idade. CCV também causa doença entérica em cães susceptíveis de todas as idades no mundo inteiro. Altamente contagioso, o virus é transmitido primariamente através de contacto directo com fezes infectadas, e pode causar enterite clinica no espaço de 1-4 dias após a exposição. A gravidade da doença pode ser exacerbada por infecção concomitante com outros agentes. Os sinais primários de infecção por CCV incluem anorexia, vómito, e diarreia. A frequência de vómito usualmente diminui dentro de um dia ou 2 após o aparecimento de diarreia, mas a diarreia pode persistir durante o curso de infecção, e as evacuações ocasionalmente podem conter vestigios de sangue. Com infecção por CCV a maioria dos cães permanece livre de febre e leucopenia não é observada em casos não complicados. A leptospirose ocorre em cães de todas as idades, com uma ampla variedade de sinais clínicos e nefrite crónica geralmente em seguida à infecção aguda.
Algumas vacinas de combinação foram desenvolvidas, incluindo aquelas vendidas sob o nome comercial Vanguard®. 0 documento WO 2004/067031 descreve vacinas de combinação que protegem cães contra Bordetella bronchiseptica e um ou mais de outros patogénios caninos tais como vírus de CD, CAV-2, virus de CPI, CPV, CCV, e uma espécie de Leptospira tal como L. bratislava, L. canicola, L. grippotyphosa, L. icterohaemorrhagiae e L. pomona. No entanto, não há, vacinas de combinação eficazes que compreendem L. bratislava contra estes outros patogénios caninos, mas sem Bordetella bronchiseptica. Um problema no desenvolvimento de vacinas de combinação envolve a interferência de eficácia, a saber a incapacidade de um ou mais antigénios 4 numa composição de combinação para manter ou alcançar eficácia por causa da presença dos outros antigénios na composição. Acredita-se que isto seja um resultado de interferência com um antigénio presente na composição administrada a um hospedeiro, por exemplo, um cão, na resposta imunológica, antigénica, de anticorpo ou protectora que tal antigénio induz no hospedeiro por causa dos outros antigénios presentes na composição. No entanto, para outros hospedeiros, tais como gatos, existem vacinas de combinação. Acredita-se que a interferência de eficácia em cães se deve a alguma peculiaridade do sistema biológico canino ou à reacção dos antigénios com o sistema biológico canino.
Existe uma necessidade, portanto, de desenvolver uma vacina de combinação adequada para administração a cães contra Leptospira bratislava e um ou mais outros patogénios caninos, que não exiba interferência de eficácia em cães sem Bordetella bronchiseptica. Seria ainda mais vantajoso se tais vacinas de combinação fossem seguras para administração a cachorros e proporcionassem protecção a longo prazo.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona vacinas e métodos para proteger cães contra doenças causadas por patogénios caninos. A presente invenção proporciona vacinas de Leptospira bratislava adequadas para administração a cães e capazes de proteger cães contra a doença causada pela Leptospira bratislava. Tais vacinas incluem uma preparação de células de Leptospira bratislava e um adjuvante veterinário aceitável tal como um adjuvante.
Os métodos de protecção de cães contra a doença causada pela Leptospira bratislava por meio da administração a um cão de uma vacina que inclui uma preparação de células de Leptospira bratislava e um 5 adjuvante veterinário aceitável tal como um adjuvante, são também pelo presente documento descritos.
Uma combinação preferida inclui dois ou mais antigénios de patogénios caninos, capazes de induzir uma resposta imune protectora em cães contra a doença causada por tal(is) patogénio(s) . Tais patogénios podem ser seleccionados de virus da esgana canina (CD) , adenovirus canino tipo 2 (CAV-2), virus da parainfluenza canina (CPI), parvovírus canino (CPV), coronavírus canino (CCV), herpesvírus canino, virus da raiva, Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira hardjobovis, Porphyromonas spp., Bacteriodes spp., Leishmania spp., Borrelia spp., Ehrlichia spp., Mycoplasma spp. e Microsporum canis.
Outra vacina de combinação preferida inclui estirpes atenuadas de vírus da esgana canina (CD), adenovirus canino tipo 2 (CAV-2), vírus da parainfluenza canina (CPI), e parvovírus canino (CPV); e uma preparação inactivada de uma estirpe de coronavírus canino (CCV); e uma preparação de células de cinco Leptospira serovars (Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae e Leptospira pomona).
Outra vacina de combinação preferida inclui estirpes atenuadas de vírus da esgana canina (CD), adenovirus canino tipo 2 (CAV-2), vírus da parainfluenza canina (CPI), e parvovírus canino (CPV); uma preparação inactivada de uma estirpe de coronavírus canino (CCV); e uma preparação inactivada de células de quatro Leptospira serovars (Leptospira canicola, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae e Leptospira pomona).
Ainda outra vacina de combinação preferida inclui estirpes atenuadas de vírus de CD, CAV-2, vírus de CPI, uma estirpe de CPV. 6
Outra vacina de combinação preferida inclui estirpes atenuadas de vírus de CD, CAV-2, vírus de CPI, uma estirpe de CPV; e uma preparação inactivada de células de Leptospira canicola e Leptospira icterohaemorrhagiae.
Ainda outra vacina de combinação preferida inclui estirpes atenuadas de vírus de CD, CAV-2, vírus de CPI, uma estirpe de CPV; e uma preparação inactivada de células de cinco Leptospira serovars (Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae e Leptospira pomona) .
Ainda outra vacina de combinação preferida inclui estirpes atenuadas de vírus de CD, CAV-2, vírus de CPI, uma estirpe de CPV, e uma preparação inactivada de células de quatro Leptospira serovars (Leptospira canicola, Lepitospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae e Leptospira pomona).
Assim num primeiro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição de vacina para utilização na imunização de cães contra a infecção causada pela Leptospira bratislava que compreende uma preparação de células de Leptospira de Leptospira bratislava e um adjuvante. Preferentemente, a dita preparação de células de Leptospira compreende ainda uma preparação de células de pelo menos um de Leptospira canicola, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, ou Leptospira pomona, em que a quantidade de cada estirpe de Leptospira na composição de vacina é no intervalo de aproximadamente 100-3500 unidades nefelométricas por dose de vacina.
Num segundo aspecto, a presente invenção proporciona uma vacina de combinação para utilização na imunização de cães contra patogénios caninos que compreende a composição do primeiro aspecto, e que compreende ainda estirpe atenuada de vírus da esgana canina (CD), uma estirpe atenuada de adenovírus canino tipo 2 (CAV-2), uma estirpe atenuada de vírus da parainfluenza canina (CPI), uma 7 estirpe atenuada de parvovírus canino (CPV), e um adjuvante, em que a quantidade de cada estirpe atenuada de vírus na dita vacina é no intervalo de 10 a 10 TCDI50 por dose. Preferentemente, a dita vacina de combinação compreende ainda uma preparação de células inteiras ou parciais inactivadas de uma estirpe de coronavírus canino (CCV). Mais preferentemente, a quantidade da preparação de células da dita estirpe de CCV na dita vacina é pelo menos aproximadamente 100 unidades relativas por dose.
Num terceiro aspecto, a presente invenção proporciona uma vacina de combinação para utilização na imunização de cães contra patogénios caninos que compreende uma preparação de células de Leptospira de Leptospira canicola, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, e Leptospira pomona, e que compreende ainda uma estirpe atenuada de vírus da esgana canina (CD), uma estirpe atenuada de adenovirus canino tipo 2 (CAV-2), uma estirpe atenuada de vírus da parainfluenza canina (CPI), uma estirpe atenuada de parvovírus canino (CPV), e um adjuvante. Preferentemente, a dita vacina de combinação compreende ainda uma preparação de células inteiras ou parciais inactivadas de uma estirpe de coronavírus canino (CCV). Mais preferentemente, a quantidade da preparação de células da dita estirpe de CCV na dita vacina é pelo menos aproximadamente 100 unidades relativas por dose.
Preferentemente, no primeiro ou terceiro aspecto da presente invenção, a quantidade de cada estirpe de Leptospira é no intervalo de aproximadamente 100-3500 unidades nefelométricas por dose.
Preferentemente, no primeiro, segundo, ou terceiro aspecto da presente invenção a quantidade de cada estirpe de Leptospira é no intervalo de aproximadamente 200-2000 unidades nefelométricas por dose.
Preferentemente, no terceiro aspecto da presente invenção a quantidade da dita estirpe atenuada para o vírus 2 9 de CD na dita vacina é no intervalo de 10 a 10 TCID50 por dose, a quantidade da dita estirpe atenuada de CAV-2 na dita vacina é no intervalo de 10 a 10 TCID5o por dose, a quantidade da dita estirpe atenuada de virus de CPI na dita vacina é no intervalo de 102 a 109 TCID5o por dose, e/ou a quantidade ou a dita estirpe atenuada de CPV na dita vacina é no intervalo de 102 a 109 TCID50 por dose.
Proporciona-se também a composição de vacina de acordo com qualquer do primeiro, segundo, ou terceiro aspecto da presente invenção, em que o adjuvante compreende saponina e tensioactivo. Preferentemente, a saponina é Quil A e o tensioactivo é colesterol. Mais preferentemente, a quantidade de Quil A é no intervalo de 1 a 1000 pg por dose.
Proporciona-se também a composição de vacina de acordo com qualquer do primeiro, segundo, ou terceiro aspecto da presente invenção, em que o adjuvante compreende hidróxido de alumínio.
Proporciona-se ainda adicionalmente a composição de vacina de acordo com qualquer do primeiro, segundo, ou terceiro aspecto da presente invenção, em que a dita composição é administrada por uma via intravenosa, intranasal, oral, intramuscular ou subcutânea.
Proporciona-se adicionalmente a composição de vacina de acordo com qualquer do primeiro, segundo, ou terceiro aspecto da presente invenção, em que o dito cão recebe a dita composição duas ou três vezes com um intervalo de aproximadamente 2-4 semanas entre as administrações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1. Sumário da média geométrica de títulos de diluição limite de ELISA de p68 em desafio por aerossol em cães vacinados com p68 de Bordetella (15 pg/dose) e não vacinados com Bordetella bronchiseptica. 9
Figura 2. Sumário de Títulos de Amilóide A no soro em cães em seguida ao desafio por aerossol com Bordetella bronchiseptica.
Figura 3. Sumário da média geométrica de títulos de diluição limite de ELISA de p68 em cães vacinados com p68 de Bordetella e não vacinados em seguida à vacinação e desafio por aerossol com Bordetella bronchiseptica.
Figura 4. Sumário de Títulos de Amilóide A no soro em cães em seguida ao desafio por aerossol com Bordetella bronchiseptica.
Figura 5. Western blot que mostra a reactividade de anticorpo monoclonal de p68 Bord 2-7 a lisado de célula inteira de p68.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Numa forma de realização, o presente pedido descreve vacinas monovalentes adequadas para administração a cães que são capazes de protecção de cães contra a doença causada pela Bordetella bronchiseptica. As vacinas monovalentes incluem um antigénio de p68 de Bordetella bronchiseptica recombinantemente produzido e um adjuvante veterinário aceitável tal como um adjuvante.
Em outra forma de realização, o presente pedido descreve métodos de protecção de cães contra a doença causada pela Bordetella bronchiseptica por meio da administração a um cão de uma vacina monovalente que inclui um antigénio de p68 de Bordetella bronchiseptica recombinantemente produzido e um adjuvante veterinário aceitável tal como um adjuvante.
Em ainda outra forma de realização, o presente pedido descreve vacinas de combinação adequadas para administração a cães. As vacinas de combinação da presente invenção incluem um antigénio de p68 de Bordetella bronchiseptica recombinantemente produzido em combinação com pelo menos um outro antigénio capaz de induzir uma resposta imune protectora em cães contra a doença causada por tal outro 10 antigénio. Outra forma de realização inclui dois ou mais antigénios de patogénios caninos, capazes de induzir uma resposta imune protectora em cães contra a doença causada por tal(is) patogénio(s).
Uma vacina de combinação preferida inclui estirpes atenuadas de vírus da esgana canina (CD), adenovírus canino tipo 2 (CAV-2), vírus da parainfluenza canina (CPI) e parvovírus canino (CPV); uma preparação inactivada de uma estirpe de coronavirus canino (CCV); e uma preparação de quatro Leptospira serovars (Leptospira canicola, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, e Leptospira pomona) .
Outra vacina de combinação preferida inclui estirpes atenuadas de vírus da esgana canina (CD), adenovírus canino tipo 2 (CAV-2), vírus da parainfluenza canina (CPI) e parvovírus canino (CPV); uma preparação inactivada de uma estirpe de coronavirus canino (CCV); e uma preparação de cinco Leptospira serovars (Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae e Leptospira pomona).
Ainda outra vacina de combinação preferida inclui estirpes atenuadas de vírus de CD, CAV-2, vírus de CPI, uma estirpe de CPV; e uma preparação de quatro Leptospira serovars (Leptospira canicola, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae e Leptospira pomona).
Outra vacina de combinação preferida inclui estirpes atenuadas de vírus de CD, CAV-2, vírus de CPI, uma estirpe de CPV, uma estirpe de CCV; e uma preparação de Leptospira canicola e Leptospira icterohaemorrhagiae.
Ainda outra vacina de combinação preferida inclui estirpes atenuadas de vírus de CD, CAV-2, vírus de CPI, uma estirpe de CPV e uma preparação de cinco Leptospira serovars (Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae e Leptospira pomona). 11
Para a clareza da descrição, e não por meio de limitação, a descrição detalhada da invenção é dividida nas seguintes subsecções que descrevem ou ilustram certas caracteristicas, formas de realização ou aplicações da invenção.
Definições e Abreviações 0 termo "proteger um cão contra uma doença causada por um patogénio canino" como é utilizado no presente documento significa reduzir ou eliminar o risco de infecção pelo patogénio, melhorando ou aliviando os sintomas de uma infecção, ou acelerando a recuperação de uma infecção. A protecção é alcançada se existe uma redução na carga virai ou bacteriana, uma redução no derrame bacteriano ou virai, uma diminuição na incidência ou duração das infecções, níveis de proteína de fase aguda no soro reduzidos, temperaturas rectais reduzidas, e/ou aumento na absorção de alimento e/ou crescimento, por exemplo. 0 termo "antigénio de p68" refere-se a uma proteína com um peso molecular de 6 8 kDa como determinado por electroforese em gel de poliacrilamida SDS, é reconhecido pelo anticorpo monoclonal específico a p68 Bord 2-7 (número de ATCC), e tem uma sequência de aminoácidos como é estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou sequência que é substancialmente idêntica a SEQ ID NO: 1.
Por "substancialmente idêntica" pretende-se que signifique um grau de identidade de sequência de pelo menos aproximadamente 90 %, preferentemente pelo menos aproximadamente 95 %, ou mais preferentemente, pelo menos aproximadamente 98 %. O termo "vacina monovalente" como é utilizado no presente documento refere-se a uma vacina que tem um componente antigénico principal. Por exemplo, uma vacina monovalente de p68 inclui um antigénio de p68 de Bordetella bronchiseptica como o componente antigénico principal da vacina e é capaz de proteger o animal ao qual a vacina é 12 administrada contra doenças causadas pela Bordetella bronchiseptica. Outro exemplo de uma vacina monovalente inclui uma preparação de células de Leptospira bratislava como o componente antigénico principal da vacina e é capaz de proteger o animal ao qual a vacina é administrada contra doenças causadas pela Leptospira bratislava. 0 termo "vacina de combinação" significa uma combinação de antigénios bivalentes ou multivalentes que são capazes de induzir uma resposta imune protectora em cães. Os efeitos protectores de uma vacina de combinação contra um patogénio ou patogénios são normalmente alcançados por meio da indução no sujeito animal de uma resposta imune, ou uma resposta imune mediada por células ou uma humoral ou uma combinação de ambas.
Por "imunogénico" pretende-se que signifique a capacidade de uma composição para provocar uma resposta imune em cães contra um patogénio particular. A resposta imune pode ser uma resposta imune celular mediada primariamente por células T citotóxicas e células T que produzem citocina, ou uma resposta imune humoral mediada primariamente por células T auxiliares, que por sua vez activa células B levando a produção de anticorpos. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade de uma vacina monovalente ou de combinação suficiente para provocar uma resposta imune protectora no cão ao qual é administrada. A resposta imune pode compreender, sem limitação, a indução de imunidade celular e/ou humoral. A quantidade de uma vacina que é terapeuticamente eficaz pode variar dependendo do antigénio particular utilizado na vacina, a idade e condição do cão, e/ou o grau de infecção, e pode ser determinada por um médico veterinário.
Vacinas de p68 0 presente pedido revela que uma composição de vacina que contém um antigénio de p68 de Bordetella bronchiseptica 13 protegeu efectivamente cães contra a doença causada pela Bordetella bronchiseptica. A composição de vacina não causa reacções pós-vacinação significativas, é segura para administração a cachorros, e induz imunidade protectora em cães que dura por um período de tempo estendido.
Consequentemente, o pedido revela uma composição de vacina que contém um antigénio de p68 de Bordetella bronchiseptica (ou "uma vacina de p68"), que é adequada para administração a cães e é capaz de protecção de cães contra a doença causada pela Bordetella bronchiseptica, por exemplo, traqueobronquite infecciosa ("tosse do canil").
Para o propósito da presente invenção, o termo "antigénio de p68" refere-se a uma proteína (veja-se a Figura 5) com um peso molecular de 68 kDa como determinado por electroforese em gel de poliacrilamida SDS, é reconhecida pelo anticorpo monoclonal específico a p68 Bord 2-7 (número de ATCC) , e tem uma sequência de aminoácidos como é exposta na SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos que é substancialmente idêntica a SEQ ID NO: 1. Por "substancialmente idêntica" pretende-se que signifique um grau de identidade de sequência de pelo menos aproximadamente 90 %, preferentemente pelo menos aproximadamente 95 %, ou mais preferentemente, pelo menos aproximadamente 98 %. Um exemplo de um antigénio de p68 que tem uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica a SEQ ID NO: 1 é o antigénio de p68 descrito no documento WO 92/17587, que é exposto na SEQ ID NO: 3. O anticorpo monoclonal especifico a p68 da presente invenção reconhece proteínas de p68 nativas, proteínas de p68 recombinantes e proteínas de p68 na superfície de bactérias, por exemplo.
Os antigénios de p68 adequados para utilização incluem tanto as proteínas de p68 nativas (isto é, proteínas de p68 de ocorrência natural purificadas de Bordetella bronchiseptica) e proteínas de p68 recombinantemente produzidas. 14 A purificação de p68 nativa de Bordetella bronchiseptica é descrita, por exemplo, em Montaraz et ai., Infection and Immunity 47: 744-751 (1985), e é também ilustrada nos exemplos proporcionados no presente documento a seguir. A produção recombinante de p68 pode ser alcançada utilizando qualquer uma das técnicas de expressão recombinante e clonagem molecular conhecidas por aqueles peritos na especialidade. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que codifica p68 pode ser introduzida numa célula hospedeira apropriada, tal como uma bactéria, uma célula de levedura (por exemplo, uma célula de Pichia), uma célula de insecto ou uma célula de mamífero (por exemplo, célula CHO) . A molécula de ácido nucleico que codifica p68 pode ser ligada de forma funcional a um promotor capaz de realizar a expressão do antigénio de p68 na célula hospedeira. A p68, que é expressa pela célula hospedeira, pode ser purificada rapidamente utilizando técnicas de purificação de proteínas de rotina.
Numa forma de realização preferida, a sequência de nucleótidos como é exposta na SEQ ID NO: 2 que codifica o antigénio de p68 que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, é clonada num vector de expressão e ligada de forma funcional a um promotor sensível à temperatura. 0 vector de expressão é introduzido em Escherichia coli e o antigénio de p68 é expresso após indução por calor. As células são lisadas e os corpos de inclusão onde o antigénio de p68 se acumula são separados por centrifugação. A p68 recombinante nos corpos de inclusão é solubilizada utilizando SDS ou outros agentes de solubilização conhecidos na técnica tais como ureia, cloridrato de guanidina, colato de sódio, taurocolato, e desoxicolato de sódio. De acordo com a presente invenção, uma proteína de p68 recombinante ou nativa purificada é combinada com um adjuvante veterinário aceitável para formar uma composição de vacina de p68. 15 0 termo "um adjuvante veterinário aceitável" inclui quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, adjuvantes, agentes estabilizantes, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardantes de adsorção, e similares. Os diluentes podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol, e similares. Os agentes isotónicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol, e lactose, entre outros. Os estabilizantes incluem albumina, entre outros.
Os adjuvantes adequados para utilização de acordo com a presente invenção incluem, mas não são limitados a diversas classes de adjuvante tais como; sais minerais, por exemplo, Alúmen, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio e fosfato de cálcio; micropartículas e agentes tensioactivos, por exemplo, tensioactivos de polímero em bloco não iónico (por exemplo, colesterol), virossomas, saponinas (por exemplo, Quil A, QS-21 e GPI-0100), proteossomas, complexos de estimulação imune, cocleatos, aminas quaternárias (brometo de amónio de dimetil diocatadecilo (DDA)), avridina, vitamina A, vitamina E; produtos bacterianos tais como o sistema de adjuvante RIBI (Ribi Inc.), esqueleto de parede celular de Mycobacterum phlei (Detox®), tripéptidos (MTP) e dipéptidos de muramilo (MDP), lípido A de monofosforilo, Bacillus Calmete-Guerin, enterotoxinas de E. coli lábeis ao calor, toxina da cólera, dimicolato de trealose, oligodesoxinucleótidos CpG; citocinas e hormonas, por exemplo, interleucinas (IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18), factor de estimulação de colónias de macrófago e granulócito, desidroepiandrosterona, 1,25-dihidroxi vitamina D3; polianiões, por exemplo, dextrano; poliacrílicos (por exemplo, polimetilmetacrilato, Carbopol 934P); adjuvantes, por exemplo, toxóide do tétano, toxóide da difteria, subunidade da toxina da cólera B, enterotoxina lábil ao 16 calor mutante de E. coli enterotoxigénica (rmLT), proteínas de choque térmico; emulsões óleo em água, por exemplo, AMPHIGEN® (Hydronics, USA); e emulsões água em óleo tais como, por exemplo, adjuvantes de Freund completo e incompleto.
Os adjuvantes preferidos para utilização nas vacinas da presente invenção incluem Quil A e colesterol. 0 antigénio de p68 e o adjuvante veterinário aceitável podem ser combinados de qualquer maneira conveniente e prática para formar uma composição de vacina, por exemplo, por mistura, solução, suspensão, emulsificação, encapsulação, absorção e similares, e podem ser feitos em formulações tais como comprimidos, cápsulas, pó, xarope, suspensões que são adequadas para injecções, implantações, inalações, ingestões ou similares. Preferentemente, a vacina é formulada tal que pode ser administrada a cães por injecção numa dose de aproximadamente 0,1 a 5 ml, ou preferentemente aproximadamente 0,5 a 2,5 ml, ou ainda mais preferentemente, numa dose de aproximadamente 1 ml. Quando for apropriado, as composições farmacêuticas da presente invenção devem ser feitas estéreis por procedimentos bem conhecidos. A quantidade de p68 nas vacinas deve ser eficaz para imunização e é geralmente no intervalo de 0,5 - 1000 pg por dose. Preferentemente, a quantidade de p68 é no intervalo de 1 - 260 pg por dose. Mais preferentemente, a quantidade de p68 é no intervalo de 10 - 100 pg por dose. Ainda mais preferentemente, a quantidade de p68 é aproximadamente 15 -25 pg por dose. A quantidade de adjuvantes adequados para utilização nas vacinas depende da natureza do adjuvante utilizado. Por exemplo, quando Quail A e colesterol são utilizados como adjuvante, Quail A é geralmente numa quantidade de aproximadamente 1 - 1000 pg por dose, preferentemente 30 -100 pg por dose, e mais preferentemente, aproximadamente 50 17 - 75 pg por dose; e colesterol é geralmente numa quantidade de aproximadamente 1 - 1000 pg por dose, preferentemente aproximadamente 30 - 100 pg por dose, e mais preferentemente, aproximadamente 50 - 75 pg por dose.
Em outra forma de realização, o pedido descreve métodos de protecção de cães contra a doença causada pela Bordetella bronchiseptica por meio da administração a um cão de uma composição de vacina de p68, como é descrito no presente documento acima. A composição de vacina de p68 proporciona cães com uma imunidade a longo prazo durante pelo menos aproximadamente 4 meses, preferentemente durante pelo menos aproximadamente 6 meses, ou ainda mais preferentemente, durante aproximadamente um ano, a vacina de p6 8 pode ser administrada a um cão por quaisquer vias conhecidas, incluindo a oral, intranasal, mucosa, tópica, transdérmica, e parentérica (por exemplo, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutânea ou intramuscular). A administração também pode ser alcançada utilizando dispositivos de administração livre de agulha. A administração pode ser alcançada utilizando uma combinação de vias, por exemplo, primeira administração utilizando uma via parentérica e subsequente administração utilizando uma via mucosa.
As vias de administração preferidas incluem administrações subcutânea e intramuscular. A composição de vacina de p68 pode ser administrada a cães de pelo menos 6 semanas de idade, preferentemente pelo menos 7 semanas de idade, e mais preferentemente, pelo menos 8 ou 9 semanas de idade. Os cães podem ser vacinados com uma dose ou com mais de uma dose de uma vacina de p68. Preferentemente, duas doses de uma vacina de p68 são administradas a cães com um intervalo de aproximadamente 2-4 semanas, preferentemente aproximadamente 3 semanas, entre as duas administrações. Se os cães forem vacinados antes da idade de 4 meses, recomenda-se que sejam revacinados com 18 uma dose única após alcançar 4 meses de idade, porque os anticorpos maternos podem interferir com o desenvolvimento de uma resposta imune adequada em cachorros com menos de 4 meses de idade. Os cães também podem ser revacinados anualmente com uma dose única. Onde a exposição de B. bronchiseptica é provável, tal como criação, alimentação, e situações de exibição, um reforço adicional pode ser dado dentro de 1 ano, ou preferentemente 6 meses, da ocorrência destes eventos.
Vacinas de Combinação
Em outra forma de realização, o presente pedido descreve vacinas de combinação e métodos para proteger cães contra Bordetella bronchiseptica e/ou um ou mais outros patogénios caninos por meio da administração de tais vacinas de combinação. As composições de vacina de combinação da presente invenção não exibem interferência de eficácia e são seguras para administração a cachorros.
As vacinas de combinação incluem um antigénio de p68 de Bordetella bronchiseptica, que pode ser feito como é descrito no presente documento acima, em combinação com pelo menos um antigénio de outros patogénios caninos capazes de induzir uma resposta imune protectora em cães contra a doença causada por tais outros patogénios. Tais vacinas de combinação também incluem combinações de dois ou mais tais outros patogénios caninos sem o antigénio de p68.
Tais outros patogénios incluem, mas não são limitados a, vírus da esgana canina (CD) , adenovírus canino tipo 2 (CAV-2), vírus da parainfluenza canina (CPI), parvovirus canino (CPV), coronavírus canino (CCV), herpesvírus canino, e vírus da raiva. Os antigénios destes patogénios para utilização nas composições de vacina podem ser na forma de uma preparação virai viva modificada ou uma preparação virai inactivada. Os métodos de atenuação de estirpes virulentas destes vírus e métodos de fabrico de uma preparação virai inactivada são conhecidos na técnica e são 19 descritos, por exemplo, nas Patentes US N° 4.567.042 e 4.567.043.
Outros patogénios também incluem Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira canicola,
Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira hardjobovis, Porphyromonas spp., Bacteriodes spp., Leishmania spp., Borrelia spp., Ehrlichia spp., Mycoplasma ssp. e Microsporum canis. Os antigénios destes patogénios para utilização nas composições de vacina podem ser na forma de uma preparação de células inteiras ou parciais inactivadas, utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os métodos de fabrico de uma preparação de células inteiras ou parciais inactivadas de Leptospira são conhecidos na técnica e são descritos em, por exemplo, Yan, K-T, "Aspects of Immunity to Leptospira borgpetersenii serovar hardjo", tese de PhD, Apêndice I, 1996. Faculty of Agriculture and Food Science, The Queen's University of Belfast; Mackintosh et al., "The use of a hardjo-pomona vaccine to prevent leptospiruria in cattle exposed to natural challenge with Leptospia interrogans serovar hardjo", New Zealand Vet. J. 28:174-177, 1980;Bolin et. al. , "Effect of vaccination with a pentavalent leptopsiral vaccine on Leptospira interrogans serovar hardjo type hardjo-boivs infection of pregnant cattle", Am. J. Vet. Res. 50:161-165, 1989.
De acordo com a presente invenção, as vacinas de combinação geralmente incluem um adjuvante veterinário aceitável. Como é descrito no presente documento acima, um adjuvante veterinário aceitável inclui quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, adjuvantes, agentes estabilizantes, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardantes de adsorção, e similares. Os diluentes podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol, e similares. Os agentes isotónicos podem incluir cloreto de 20 sódio, dextrose, manitol, sorbitol, e lactose, entre outros. Os estabilizantes incluem albumina, entre outros.
Os adjuvantes adequados para utilização de acordo com a presente invenção incluem, mas não são limitados a diversas classes de adjuvante tais como; sais minerais, por exemplo, Alúmen, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio e fosfato de cálcio; micropartícuias e agentes tensioactivos, por exemplo, tensioactivos de polímero em bloco não iónico (por exemplo, colesterol), virossomas, saponinas (por exemplo, Quil A, QS-21 e GPI-0100), proteossomas, complexos de estimulação imune, cocleatos, aminas quaternárias (brometo de amónio de dimetil diocatadecilo (DDA)), avridina, vitamina A, vitamina E; produtos bacterianos tais como o sistema de adjuvante RIBI (Ribi Inc.), esqueleto de parede celular de Mycobacterum phlei (Detox®), tripéptidos (MTP) e dipéptidos de muramilo (MDP), lipido A de monofosforilo, Bacillus Calmete-Guerin, enterotoxinas de E. coli lábeis ao calor, toxina da cólera, dimicolato de trealose, oligodesoxinucleótidos CpG; citocinas e hormonas, por exemplo, interleucinas (IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18), factor de estimulação de colónias de macrófago e granulócito, desidroepiandrosterona, 1,25-dihidroxi vitamina D3; polianiões, por exemplo, dextrano; poliacrílicos (por exemplo, polimetilmetacrilato, Carbopol 934P); adjuvantes, por exemplo, toxóide do tétano, toxóide da difteria, subunidade da toxina da cólera B, enterotoxina lábil ao calor mutante de E. coli enterotoxigénica (rmLT), proteínas de choque térmico; emulsões óleo em água, por exemplo, AMPHIGEN® (Hydronics, USA); e emulsões água em óleo tais como, por exemplo, adjuvantes de Freund completo e incompleto.
Os adjuvantes preferidos para utilização na vacinas de combinação de acordo com a presente invenção incluem 1) Quil A mais colesterol; e 2) hidróxido de alumínio. A 21 quantidade de adjuvantes adequados para utilização nas vacinas depende da natureza do adjuvante utilizado. Por exemplo, quando Quil A e colesterol são utilizados como adjuvante, Quil A é geralmente numa quantidade de aproximadamente 1 - 1000 pg por dose, preferentemente 30 -100 pg por dose, e mais preferentemente, aproximadamente 50 - 75 pg por dose; e colesterol é geralmente numa quantidade de aproximadamente 1 - 1000 pg por dose, preferentemente aproximadamente 30 - 100 pg por dose, e mais preferentemente, aproximadamente 50 - 75 pg por dose. Quando hidróxido de alumínio é utilizada como adjuvante, é geralmente numa quantidade de aproximadamente 0,5-20 %, preferentemente aproximadamente 0,5-10 %, e mais preferentemente aproximadamente 1-2 %. O antigénio de p68, um ou mais antigénios de outros patogénios, e/ou o adjuvante veterinário aceitável pode ser combinado de qualquer maneira conveniente e prática para formar uma composição de vacina de combinação, por exemplo, por mistura, solução, suspensão, emulsificação, encapsulação, absorção e similares, e pode ser feito em formulações tais como comprimidos, cápsulas, pó, xarope, suspensões que são adequadas para injecções, implantações, inalações, ingestões ou similares. Preferentemente, a vacina é formulada tal que pode ser administrada a cães por injecção numa dose de aproximadamente 0,1 a 5 ml, ou preferentemente aproximadamente 0,5 a 2,5 ml, ou ainda mais preferentemente, numa dose de aproximadamente 1 ml.
As vacinas de combinação podem ser preparadas por meio de reidratação de uma preparação liofilizada das estirpes virais atenuadas (ou uma preparação feita por outros métodos tais como liofilização ou dessecação) e preparação virai com uma preparação líquida, cuja preparação líquida está constituída dos antigénios de Leptospira, dissolvida em solução salina estéril e preparada com adjuvantes como Quil A e colesterol. Tal vacina de combinação pode também 22 ser preparada por meio de reidratação de uma preparação liofilizada das estirpes virais atenuadas e preparação virai de Leptospira (ou uma preparação feita por outros métodos tais como liofilização ou dessecação) com uma solução estéril, ou reidratação da dita preparação liofilizada com CCV mais diluente.
De acordo com a presente invenção, as vacinas de combinação podem ser administradas a um cão de pelo menos 6 semanas de idade, preferentemente pelo menos 7 semanas de idade, e mais preferentemente, pelo menos 8 ou 9 semanas de idade. As vacinas de combinação podem ser administradas em 2 a 4 doses, preferentemente em 2 a 3 doses. As doses podem ser administradas com 2 a 6 semanas entre cada dose, preferentemente com 2 a 4 semanas entre cada dose. A administração pode ser feita por quaisquer vias conhecidas, incluindo a oral, intranasal, mucosa, tópica, transdérmica, e parentérica (por exemplo, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutânea ou intramuscular). A administração também pode ser alcançada utilizando dispositivos de administração livre de agulha. A administração também pode ser alcançada utilizando uma combinação de vias, por exemplo, primeira administração utilizando uma via parentérica e subsequente administração utilizando uma via mucosa. As vias de administração preferidas incluem administrações subcutânea e intramuscular.
Vacinas de combinação Preferidas e Métodos de Vacinação
Uma vacina de combinação preferida inclui uma estirpe atenuada de virus de CD, uma estirpe atenuada de CAV-2, uma estirpe atenuada de virus de CPI, uma estirpe atenuada de CPV, uma preparação inactivada de uma estirpe de CCV, e um antigénio de p68 de Bordetella bronchiseptica.
Uma vacina de combinação especialmente preferida inclui a estirpe de CD de virus atenuado designada como a estirpe "Snyder Hill" (National Veterinary Service 23
Laboratory, Ames, IA) , a estirpe de CAV-2 atenuada designada como a estirpe "Manhattan" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA) , a estirpe de CPI de vírus atenuado que tem a designação de "NL- CPI-5" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA) , a estirpe de CPV atenuada que tem a designação de "NL- 3 5-D" (National Veterinary Service Laboratory, Ames , IA) , uma preparação inactivada de a estirpe de CCV que tem a designação de "NL-18" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), e o antigénio de p68 de Bordetella bronchiseptica recombinante que tem a sequência da SEQ ID NO: 1. Tal vacina de combinação, também denominada no presente documento como "a vacina de combinação de p68/5CV", é preparada preferentemente por meio de reidratação de uma preparação liofilizada das estirpes virais atenuadas e preparação virai com uma preparação líquida, cuja preparação líquida está constituída do antigénio de p68 dissolvida em solução salina estéril e preparada com adjuvantes como Quil A e colesterol. Esta combinação sem o antigénio de p68 é denominada no presente documento como a combinação de 5CV. Tal vacina de combinação é preparada preferentemente por meio de reidratação de uma preparação liofilizada das estirpes virais atenuadas e preparação virai com uma preparação líquida, cuja preparação líquida está constituída de solução salina estéril e com adjuvante com Quil A e colesterol.
Outra vacina de combinação especialmente preferida inclui os componentes antigénicos da vacina de combinação de p68/5CV bem como preparações de célula inteira inactivada de cinco espécies de Leptospira: Leptospira bratislava (por exemplo, uma estirpe de Leptospira bratislava que pode ser obtida de National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA) , Leptospira canicola (por exemplo, estirpe C-5, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA) , Leptospira canicola (por exemplo, 24 estirpe MAL 1540, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA.), Leptospira icterohaemorrhagiae (por exemplo, estirpe NADL 11403, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA) e Leptospira pomona (por exemplo, estirpe T262, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA). Tal vacina de combinação, também denominada no presente documento como "a vacina de combinação de p68/5CV-Leptospira", é preparada preferentemente por meio de reidratação de uma preparação liofilizada das estirpes virais atenuadas (ou uma preparação feita por outros métodos tais como liofilização ou dessecação) e preparação virai com uma preparação liquida, cuja preparação liquida está constituída do antigénio de p68 e antigénios de Leptospira, dissolvida em solução salina estéril e preparada com adjuvantes como Quil A e colesterol. Esta combinação sem o antigénio de p68 é denominada no presente documento como a combinação de 5CV-5Leptospira. Esta combinação sem o antigénio de p68 e sem Leptospira bratislava é denominada no presente documento como a combinação de 5CV-4Leptospira. A combinação de 5CV sem o antigénio de p68 e com Leptospira canicola e Leptospira icterohaemorrhagiae é denominada no presente documento como a combinação 5CV-2Leptospira. Tais vacinas de combinação são preferentemente preparados por meio de reidratação de uma preparação liofilizada das estirpes virais atenuadas (ou uma preparação feita por outros métodos tais como liofilização ou dessecação) e preparação virai com uma preparação líquida, cuja preparação liquida está constituída dos antigénios de Leptospira, dissolvida em solução salina estéril e preparada com adjuvantes como Quil A e colesterol. Tais vacinas de combinação são também preferentemente preparados por meio de reidratação de uma preparação liofilizada das estirpes virais atenuadas e preparação virai de Leptospira (ou uma preparação feita por outros métodos tais como liofilização ou dessecação) com 25 uma solução estéril, ou reidratação da dita preparação liofilizada com CCV mais diluente.
As vacinas de combinação de p68/SCV, p68/5CV-Leptospira, 5CV, 5CV-5Leptospira, 5CV-4Leptospira, e 5CV-2Leptospira podem ser administradas a cães saudáveis de 4 semanas de idade ou mais velhos, preferentemente 6 semanas ou mais velhos, e preferentemente em 3 doses, cada uma administrada aproximadamente 3 semanas de intervalo. Os cães podem ser revacinados anualmente com uma dose única. Onde a exposição a B. bronchiseptica e/ou vírus canino é provável, tal como criação, alimentação, e situações de exibição, um reforço adicional pode ser dado dentro de 1 ano, ou preferentemente 6 meses, da ocorrência destes eventos.
Ainda outra vacina de combinação preferida inclui uma estirpe atenuada de vírus de CD, uma estirpe atenuada de CAV-2, uma estirpe atenuada de vírus de CPI, uma estirpe atenuada de CPV, e um antigénio de p68 de Bordetella bronchiseptica recombinante.
Uma vacina de combinação especialmente preferida inclui a estirpe de CD de vírus atenuado designada como a estirpe "Synder Hill" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA) , a estirpe de CAV-2 atenuada designada como a estirpe "Manhattan" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA) , a estirpe de CPI de virus atenuado que tem a designação de "NL- CPI-5" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA) , a estirpe de CPV atenuada designada como "NL-35-D" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), e o antigénio de p68 de Bordetella bronchiseptica recombinante que tem a sequência da SEQ ID NO: 1. Tal vacina de combinação, também denominada no presente documento como "a vacina de combinação de p68/DA2PP", é preparada preferentemente por meio de reidratação de uma preparação liofilizada das estirpes virais atenuadas (ou uma preparação feita por 26 outros métodos tais como liofilização ou dessecação) com uma preparação líquida, cuja preparação líquida está constituída do antigénio de p68 dissolvida em solução salina estéril e preparada com adjuvantes como Quil A e colesterol. Esta vacina de combinação sem o antigénio de p6 8 é denominada como a vacina de combinação de DA2PP. Tal vacina de combinação é preparada preferentemente por meio de reidratação de uma preparação liofilizada das estirpes virais atenuadas (ou uma preparação feita por outros métodos tais como liofilização ou dessecação) com uma preparação líquida, cuja preparação líquida está constituída de solução salina estéril e com adjuvante com Quil A e colesterol.
Outra vacina de combinação especialmente preferida inclui os componentes antigénicos da vacina de combinação de p68/DA2PP bem como preparações de célula inteira inactivada de duas espécies de Leptospira: Leptospira canicola (por exemplo, estirpe C-51, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA) , e Leptospira icterohaemorrhagiae (por exemplo, estirpe NADL 11403, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA). Alternativamente, uma vacina de combinação preferida pode incluir os componentes antigénicos da vacina de combinação de p68/DA2PP bem como preparações de célula inteira inactivada de cinco espécies de Leptospira: Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae e Leptospira pomona. Estas vacinas de combinação, também denominadas no presente documento como "as vacinas de combinação de p68/DA2PP-Leptospira", são preferentemente preparadas por meio de reidratação de uma preparação liofilizada das estirpes virais atenuadas (ou uma preparação feita por outros métodos tais como liofilização ou dessecação) e preparação virai com uma preparação líquida, cuja preparação líquida está constituída do antigénio de p68 e antigénios de 27
Leptospira, dissolvida em solução salina estéril e preparada com adjuvantes como Quil A e colesterol.
Alternativamente, outra vacina de combinação preferida inclui os componentes antigénicos da vacina de combinação de DA2PP bem como preparações de célula inteira inactivada de cinco espécies de Leptospira: Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae e Leptospira pomona. Ainda outra vacina de combinação preferida inclui os componentes antigénicos da vacina de combinação de DA2PP bem como preparações de célula inteira inactivada de quatro espécies de Leptospira: Leptospira canicola, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae e Leptospira pomona. Estas vacinas de combinação, também denominadas no presente documento como "a vacinas de combinação de DA2PP-Leptospira", são preferentemente preparadas por meio de reidratação de uma preparação liofilizada das estirpes virais atenuadas (ou uma preparação feita por outros métodos tais como liofilização ou dessecação) e preparação virai com uma preparação liquida, cuja preparação líquida está constituída dos antigénios de Leptospira, dissolvida em solução salina estéril e preparada com adjuvantes como Quil A e colesterol.
De acordo com a presente descrição, as vacinas de combinação de p68/DA2PP, p68/DA2PP-Leptospira, DA2PP, e DA2PP-Leptospira podem ser administradas a cães saudáveis de 6 semanas ou mais velhos, ou preferentemente 8 semanas de idade ou mais velhos, e preferentemente em 2 doses, cada uma administrada aproximadamente 3 semanas em separado. Uma dose única pode ser suficiente se for dada a um cão de pelo menos 12 semanas de idade. Os cães podem ser revacinados anualmente com uma dose única. Onde a exposição a B. bronchiseptica e/ou vírus canino é provável, tal como criação, alimentação, e situações de exibição, um reforço adicional pode ser dado dentro de 1 ano, ou preferentemente 28 6 meses, da ocorrência destes eventos. Outra vacina de combinação preferida inclui um antigénio de p68, preferentemente o antigénio de p68 recombinante que tem a SEQ ID NO: 1, em combinação com uma estirpe atenuada de CPI.
Ainda outra vacina de combinação preferida inclui um antigénio de p68, preferentemente o antigénio de p68 recombinante que tem a SEQ ID NO: 1, uma estirpe atenuada de CPI, e pelo menos duas espécies de Leptospira tais como Leptospira canicola (por exemplo, estirpe C-51, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), e Leptospira icterohaemorrhagiae (por exemplo, estirpe NADL 11403, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA). A quantidade do antigénio de p68 e o(s) antigénio(s) de um ou mais outros patogénios na vacinas de combinação deve ser eficaz para imunização. Em geral, o antigénio de p6 8 numa vacina de combinação deve ser numa quantidade de pelo menos aproximadamente 0,5 pg por dose. O virus de CD atenuado deve ser numa quantidade de pelo menos aproximadamente 102 a aproximadamente 109 TCID50 por dose TCID50 (dose infecciosa em cultura de tecido para 50 % de efeito citopático) por dose, e preferentemente no intervalo de aproximadamente 104 a aproximadamente 106 TCID50 por dose. O CAV-2 atenuado deve ser numa quantidade de pelo menos aproximadamente 10 TCID50 a aproximadamente 10 TCID50 por dose, preferentemente no intervalo de 1040 a aproximadamente IO60 TCID50 por dose. O virus de CPI atenuado deve ser numa quantidade de pelo menos aproximadamente 102 TCID50 a aproximadamente 109 TCID50 por dose, e preferentemente no intervalo de 106 a aproximadamente 108 TCID50 por dose. O CPV atenuado deve ser numa quantidade de pelo menos aproximadamente 102 TCID50 a aproximadamente 108 TCID50 por dose, preferentemente, uma quantidade no intervalo de 107 a aproximadamente 109 TCID50 por dose. A quantidade de CCV numa preparação virai 29 inactivada deve ser pelo menos aproximadamente 100 unidades relativas por dose, e preferentemente no intervalo de 1000-4500 unidades relativas por dose. Cada espécie de
Leptospira na vacina deve ser no intervalo de aproximadamente 100-3500 NU (unidades nefelométricas) por dose de vacina, e preferentemente no intervalo de 200-2000 NU por dose.
As vacinas de combinação são formuladas tal que as vacinas podem ser administradas a cães por injecção numa dose de 0,1 ml a 5 ml, preferentemente desde 0,5 ml até 2,5 ml, e mais preferentemente, aproximadamente 1 ml. A presente invenção é ilustrada ainda pelos seguintes exemplos não limitativos. EXEMPLO 1
ESTUDO DE TITULAÇÃO DE DOSE DE ANTIGÉNIO RECOMBINANTE DE
p68 DE BORDETELLA CANINA VACINA: O antigénio de vacina experimental foi uma proteína de membrana externa de p6 8 recombinante (SEQ ID NO: 1) de B. bronchiseptica produzida pela estirpe LW68 de E. coli. A vacina continha níveis variados de p68 solubilizado em SDS (dodecil sulfato de sódio), com adjuvante com 50 pg de QAC (Quil A/50 pg de colesterol) numa dose de 1 mL. MATERIAL DE DESAFIO:
Um aerossol de Bordetella bronchiseptica, isolado de cão N° 85B, passagem N° 3, lote N° 051597, foi utilizado como o material de desafio. A contagem de placa média foi 1,59 X 108 CFU/ml. ANIMAIS:
Sessenta cachorros machos e fêmeas foram aleatoriamente alocados a um de seis grupos de tratamento (10 cachorros por grupo). Sangraram-se os cachorros e as zaragatoas de traqueia foram tomadas 41 dias antes da primeira vacinação e de novo 28 dias antes da primeira 30 vacinação e quaisquer animais seropositivos ou de cultura positiva foram retirados do estudo.
Os animais foram aleatoriamente designados a tratamentos e salas de acordo com um desenho de bloco completo aleatorizado. As observações pós-vacinação foram feitas sem conhecimento dos grupos de designação de vacina. DESENHO:
GrupoNível de Dose Via1 Número de Animais T01 Controlo de Solução salina SC 9 (0,9 % de solução salina como uma dose de 1 mL) T02 1 pg de p68 SC 8 T03 4 pg de p68 SC 8 TO 4 16 pg de p68 SC 9 T05 64 pg de p68 SC 9 T06 256 pg de p68 SC 9 SC = subcutânea PROCEDIMENTO: Administração IVP: Os animais foram vacinados no Dia 0 com o placebo ou vacina experimental. Uma segunda vacinação foi administrada no Dia 21. A primeira vacinação foi administrada subcutaneamente no lado direito do pescoço e a segunda vacinação foi administrada subcutaneamente no lado esquerdo do pescoço.
Administração do Desafio:
Todos os animais foram desafiados 28 dias após a segunda vacinação com um aerossol de Bordetella bronchispetica. Os animais foram monitorizados para tosse 31 durante um período de 30 minutos, duas vezes ao dia (uma vez na manhã e uma vez na tarde) nos dias dois até catorze em seguida ao desafio (Dias 51 até 63).
Observações e Colheita de Amostras:
Todos os locais de injecção foram palpados e medidos tridimensionalmente durante sete dias em seguida a cada vacinação (Dias 0 até 7 e 21 até 28) e no 14° dia após cada vacinação (Dias 14 e 35).
As temperaturas rectais foram registadas no dia de vacinação e durante três dias em seguida a cada vacinação (Dias 0 até 3 e 21 até 24). 0 sangue foi colhido nos dias de vacinação (Dias 0 e 21) e nos dias 42, 50, e 63 e ensaiado por meio de ELISA para anticorpos específicos contra a proteína p68 purificada de B. bronchispetica. O sangue foi também colhido nos dias 42, 49, 50, 52, 54, 56 e 58 e analisado para Amilóide A no Soro (SAA).
Passou-se zaragatoa de traqueia em todos os animais para isolamento de B. bronchispetica e o sangue foi colhido para títulos de aglutinação de B. bronchispetica antes da vacinação (na máquina automática, no Dia 41 e Dia 28) e no Dia 49 . ELISA DAB de Titulação de Anticorpo de P68 de Bordetella de Ratinho e Cão p68 nativa purificada foi diluída até 600 ng/mL em 0,01 M Tampão Borato e foi adicionada a cada poço em 100 mL/ poço. As placas foram incubadas durante a noite a 4 °C. As placas foram então lavadas uma vez com PBS em excesso-Tween 20,1 % de leite em pó magro em PBS foi adicionado às placas em 200 mL/poço. As placas foram então incubadas durante 1 hora a 37 °C. As placas foram então lavadas uma vez com PBS em excesso-Tween 20. O soro de cão ou ratinho foi adicionado numa diluição 1:50 à fila superior das placas de ELISA e soro diluído serialmente duas vezes foi adicionado profundamente por 32 toda a placa. As placas foram incubadas durante 1 hora a 37 °C. Subsequentemente, as placas foram lavadas 3 vezes com PBS-Tween 20 em excesso. Às placas incubadas com o soro de cão anterior, IgG anti-cão de cabra marcada com peroxidase (H + L) , diluída numa diluição 1:2000, foi adicionada em 100 mL/poço. As placas foram então incubadas durante 1 hora a 37 °C. Às placas incubadas com o soro de ratinho anterior, IgG anti-ratinho de cabra marcada com peroxidase (H + L) , diluída numa diluição 1:4000, foi adicionada em 100 mL/poço. As placas foram então incubadas durante 1 hora a 37 °C. As placas foram então lavadas 3 vezes com PBS em excesso-Tween 20 . O substrato ABTS foi adicionado em 100 mL/poço. Aproximadamente 20 minutos depois, as placas foram lidas com um leitor de placa de Molecular Devices ou um leitor de placa equivalente em 405-490 nm. ANÁLISE DE DADOS:
As diferenças de tratamento no número de cães que estão a tossir foram testadas utilizando Teste Exacto de Fisher. O nível de significância de 5 % foi utilizado.
Os títulos de ELISA foram transformados em log antes da análise utilizando um modelo misturado linear geral. O nível de confidência de 95 % foi utilizado para avaliar as diferenças de tratamento. As observações de desafio foram monitorizadas duas vezes ao dia durante 30 minutos cada. RESULTADOS:
Cultura de Zaragatoa de Traqueia e Títulos de Aglutinação
As culturas de zaragatoa de traqueia e títulos de aglutinação foram avaliados para monitorizar o estado de B. bronchiseptica de animais inscritos no estudo. Um número de cães demonstrou títulos aumentados em vários pontos no tempo, mas nenhum título aumentou acima de 128 antes do desafio.
Observações do Local de Injecção 33
As reacções do local de injecção em seguida à primeira vacinação são apresentadas no Quadro 1. As maiores reacções do local de injecção foram observadas em animais vacinados T05 (64 pg) , com a maior reacção do local de injecção média medindo somente 14,69 cm3 (dois dias após a vacinação). Os animais vacinados T03 (4 pg) , T04 (16 pg) e T06 (256 pg) demonstraram reacções do local de injecção variadas até 7 dias após a vacinação. Os animais vacinados T02 (1 pg) somente demonstraram reacções no Dia 1 após a vacinação. Pelo sétimo dia após a vacinação, não houve diferença estatisticamente significativa nas reacções do local de injecção entre os grupos de tratamento. Pelo Dia 14, todas as reacções do local de injecção tinham dissipado.
As reacções do local de injecção em seguida à segunda vacinação são apresentadas no Quadro 2. Em seguida à segunda vacinação as maiores reacções do local de injecção médias foram observadas em T06 (256 pg) , com a maior reacção do local de injecção média medindo 50,03 cm3 (um dia após a vacinação) . As reacções do local de injecção foram demonstradas em animais T05 (64 pg) e T04 (16 pg) até 7 dias após a segunda vacinação. Reacções do local de injecção mínimas foram demonstradas em animais T03 (4 pg) e T02 (1 pg) até 7 dias após a vacinação. As reacções do local de injecção que não foram estatisticamente diferentes do grupo placebo foram demonstradas em T02 (1 pg) e T03 (4 pg) após a vacinação. Catorze dias após a segunda vacinação nenhuma reacção do local de injecção foi observada. A frequência das reacções do local de injecção em seguida à primeira vacinação é apresentada no Quadro 3. A mais alta frequência LSM global, 76 %, de locais de injecção que exibem uma reacção em qualquer tempo após a primeira vacinação resultou da vacinação com T06 (256 pg). As próximas mais frequentes foram 72 % dos locais de injecção que mostram uma reacção em seguida à primeira vacinação com T05 (64 pg) , 69 % em seguida à primeira 34 vacinação com T04 (16 pg) , e 63 % em seguida à primeira vacinação com T03 (4 pg) . A mais baixa frequência, 38 %, seguida da primeira vacinação de TO2 (1 pg) . A frequência das reacções do local de injecção em seguida à segunda vacinação é apresentada no Quadro 4. A frequência LSM global para cada vacina foi consistente com essa vista após a primeira vacinação. A incidência e duração das reacções do local de injecção em seguida à vacinação são resumidas no Quadro 5. A incidência (ou o número de cães que mostram uma reacção em qualquer tempo) de uma reacção do local de injecção mensurável foi 100 % para T03, T04, T05 e T06 (4 pg, 16 pg, 64 pg, e 256 pg, respectivamente) em seguida à primeira e segunda vacinação. Os animais que receberam T02 (1 pg) demonstraram a menor incidência das reacções do local de injecção após a vacinação (57,1 %). A duração da reacção (expressa como uma média de minimos quadrados de dias com uma reacção mostrada no Quadro 5) foi mais longa para os animais vacinados T04, T05 e T06 (16 pg, 64 pg, e 256 pg, respectivamente) em seguida às primeira e segunda vacinações (2,7 a 5,1 dias após a primeira vacinação e 6,0 a 6,7 dias após a segunda vacinação) . Os animais vacinados T02 e T03 (1 pg e 4 pg, respectivamente) demonstraram o menor número de dias com uma reacção do local de injecção em seguida às primeira e segunda vacinações (0,3 e 1,3 dias após a primeira vacinação e 1,9 e 4,5 dias após a segunda vacinação). Temperaturas rectais
As medições de temperatura rectal médias são resumidas no Quadro 6. A temperatura rectal de LSM para T02 (1 pg) no Dia 1 e 24, para T03 (4 pg) no Dia 1,21, e 24, para T04 (16 pg) no Dia 2 e 24, para T05 (64 pg) no Dia 23, e para T06 (256 pg) no Dia 0,1, e 24 foram significativamente diferentes do placebo. No Dia 23 nenhuma das comparações 35 foram estatisticamente significativas (P>0,05) com o placebo.
Serologia de ELISA de p68 0 sumário de dados de ELISA de p68 é apresentado no Quadro 7. Os títulos de média geométrica de vírus pré-vacinação de anticorpos específicos a ELISA de p68 em todos os grupos foram baixos (intervalo 24,9 a 28,9) e títulos para o placebo permaneceram baixos ao longo da duração do estudo. Vinte e um dias em seguida à primeira vacinação, os títulos de média geométrica de ELISA de p68 tinham aumentado no tratamento vacinado (intervalo 55,2 a 4,411,7), no entanto o título de T02 (1 pg) não foi estatisticamente diferente do placebo (T01). Quarenta e dois dias após a segunda vacinação, os títulos de média geométrica aumentaram ainda em todos os grupos vacinados (intervalo 674,6 a 48,382,0) o que demonstra boa resposta serológica à vacinação.
Serologia de Amilóide A no soro (SAA)
Os títulos de SAA são resumidos no Quadro 8. Antes do desafio, os títulos de SAA de média geométrica foram baixos em todos os grupos de tratamento (intervalo 0,1 a 0,5) . Após o desafio, os títulos de GMT de T01 variaram desde 1,5 até 146,0, onde grupos de tratamento de p68 variaram desde 0,3 até 23,1. Todos os grupos de tratamento foram estatisticamente diferentes do placebo nos dias 50, 52, 54, e 56. Nenhuma diferença estatística foi demonstrada entre as vacinas de p68 com a excepção de T02 (1 pg) no Dia 52 quando demonstrou uma média geométrica estatisticamente diferente de todos os outros grupos de tratamento de p68. Resposta ao Desafio
Os dados de resposta ao desafio são apresentados no Quadro 9. A resposta foi determinada por meio da monitorização da tosse em seguida ao desafio e as observações foram analisadas utilizando dois métodos: número de média dos mínimos quadrados de dias com tosse e 36 dois dias consecutivos de que estão a tossir (Incidência de Doença) .
Análise do número médio de dias de tosse não demonstrou diferença estatisticamente significativa entre os grupos de tratamento de p68; mas nos cães vacinados com placebo tossiram uma média de 8,6 dias ao passo que os cães em que se administrou vacinas de p68 tossiram significativamente menos, médias variando entre 2,2 a 4,7 dias.
Quando os cães foram avaliados utilizando Incidência de Doença, observou-se que todos os T01 (placebo) que estavam a tossir durante dois dias consecutivos (100 % de Incidência de Doença). Os cães vacinados T04 (16 pg) e T05 (64 pg) , demonstraram uma Incidência de Doença de 55,6 % e 66,7 %, respectivamente. Somente 28,6 % de cães vacinados T02 (1 pg) , 50 % de T03 (4 pg) , e 33,3 % de T06 (256 pg) foram observados que estão a tossir durante dois dias consecutivos. DISCUSSÃO:
Neste estudo, o objectivo foi estabelecer uma relação entre a dose de antigénio, resposta imune, e protecção em cães. As doses de antigénio de p68 examinadas foram 1 pg, 4 pg, 16 pg, 64 pg, e 256 pg. A análise das medidas de reacção do local de injecção demonstrou uma reacção insignificativa nos grupos de tratamento de p68, com a excepção de 106 (256 pg) no primeiro dia após a segunda vacinação. As reacções que foram observadas tenderam a ser pequenas, geralmente diminuindo em tamanho durante os períodos de observação. O tamanho destas reacções foi clinicamente insignificativos e o mais provável passariam desapercebidos em cão não tosquiados.
As temperaturas rectais após a vacinação foram habituais e estavam dentro de limites normais para todos os cães em todos os grupos. 37 A resposta serológica à vacinação foi excelente nos grupos T03 a T06. Nestes grupos de tratamento, todos demonstraram significativamente títulos de ELISA de p68 maiores quando em comparação com o placebo desde o Dia 21 até o Dia 63. T02 (1 pg) demonstrou significativos títulos de ELISA de p68 em comparação com ο T01 (placebo) desde o Dia 42 até o Dia 63. Os títulos mais altos foram observados em T05 (64 pg) e T06 (256 pg). A examinação da resposta de SAA em todos os cães vacinados com p68 em seguida ao desafio indicou um aumento muito menor no SAA pós-desafio quando em comparação com cães de controlo. Nenhuma diferença foi demonstrada entre os níveis de dose de vacina de p68 pós-desafio com a excepção de T02 (1 pg) no Dia 52 que demonstrou uma média geométrica estatisticamente diferente de todos os outros grupos de tratamento de p68.
As observações de tosse após o desafio foram analisadas utilizando média de mínimos quadrados (LSM) do número de dias com tosse ou dois dias consecutivos de tosse (incidência de doença). Utilizando LSM de dias de tosse, uma diferença significativa foi demonstrada entre placebo e todos os grupos vacinados com p68 embora nenhuma diferença tenha sido demonstrada entre os níveis de dose de vacina de p68 diferentes. Utilizando a incidência de Doença, cães vacinados T02 (1 ug) , T03 (4 ug) e T06 (256 ug) tossiram significativamente menos que o placebo. CONCLUSÕES: 0 estudo foi conduzido para estabelecer uma relação entre dose de antigénio, resposta imune, e protecção em cães. As doses de antigénio de p68 examinadas foram 1 pg, 4 pg, 16 pg, 64 pg, e 256 pg.
Todas as vacinas eram seguras como foi demonstrado pelas reacções do local de injecção mínimas, temperaturas rectais normais e ausência de resposta adversa à vacinação. 0 tamanho das reacções do local de injecção e a duração 38 destas reacções foram menores nos grupos de tratamento antigénico mais baixos. A resposta serológica à vacinação como medida por meio de títulos de ELISA foi excelente com os grupos de dose antigénica mais alta o que demonstra respostas serológicas mais altas. Ao utilizar LSM de dias de tosse como um método de comparação, todos os grupos de tratamento demonstraram uma redução significativa na tosse quando em comparação com placebo. Nenhuma diferença foi notada entre os grupos de tratamento. Quando dois dias consecutivos de tosse (ou Incidência de Doença) foram utilizados para comparação, cães vacinados T02 (1 pg) , T03 (4 pg) e T06 (256 pg) tossiram significativamente menos que o placebo. 39
Quadro 1. Volume da reacção do local de injecção em Cães ei seguida à primeira vacinação com antigénio de p68 ou Placebo
O
Tamanho médio de LS (cm ) de reacções do local de injecção após a primeira vacinação por dia de estudo1
Tratamento (N) 0 1 2 3 4 5 6 7 14 T01 Placebo (9) 0,00a 0,00a 0,00a 0,00a 0,00a 0,00a 0,00a 0,00a 0,00a T02 p68, 1 pg Π) 0,00a 4,00b 0,00a'b 0,00a 0,00a 0,00a 0,00e'b 0,00a 0,00a 103 p68, 4 pg (8) 0,00a 0,00ac 0,64 a'b 4,56b 1,14a,b 0,39a 0,00 a 0,00 a 0,00a 104 ' 1 oo Q-, 0,00a 0,00a 3,56b 4,28b 1,32a,b l,79a,b 2,36a,b 0,38a 0,00a T05 p68, 64 pg (9) 0,00a 10,44b 14,69c 10,56c 4,01b,c 4,40b 2,82a,b 1,15a 0,00a T06 p68, 256 pg (9) 0,00a 7,00e 8,53d 7,50b'c 5,62c 4,36b 3,56b 1,24a 0,00a 40
Quadro 2. Volume da reacção do local de injecção em seguida à segunda vacinação com antigénio de p68 ou placebo
Tamanho médio de LS (cm3) de reacções do local de injecção após a segunda vacinação por dia de estudo1 Tratamento 0 (21) (N) 1 (22) (23) 3 (24) 4 (25) (26) 6 (27) 7 (28) 14 (35) 101 Placebo (9) 0,00a 0,00a 0,00a 0,00a 0,00a 0,00a 0,00a 0,00a 0,00a 102 p68, 1 pg (7) 0,00a 0,54a 2,36a, b 1,14a 0,45a 0,61a 0,50a 0,16a 0,00a 103 p68, 4 pg (8) 0,00a 0,00a 5,33a,b,c 4,20a 2,59a'11 2,89a,b 1,53a 1,23a,b 0,00a 104 p68, 16 pg (9) 0,00a 0,00a 7,58b|C 10,67b 7,25b|C 7,28c 7,97b 5,14a,b 0,00a 105 p68, 64 pg (9) 0,00a 2,89a 10,99c 14,28b 9,79c 9,75c 11,14b 6,50b 0,00a T06 p68f 256 1 pg(9) 0,00a 50,03b 8,58b,c 13,44b 11,32c 7,42b,c 9,51b 2,69a,b 0,00a
Valores com diferentes sobrescritos são estatisticamente diferentes (P < 0,05) 41
Quadro 3. Volume da reacção do local de injecção em cães em seguida à primeira vacinação com antigénio de p68 ou Placebo_
Percentagem de LS médio de cães por caneta com reacção após a primeira vacinação por dia de estudo3
Tratamento (N) _0 1 2 3 4 5 6 7 14 T01 Placebo (9) 0,00a 0,00a 0,00a 0,00a 0,00a 0,00a 0,00a 0,00a 0,00 um 102 P68, 1 yg (7) 0,00a 100,00b 83,33b 50,00b 25,00a 12,50a 37,50b 37,50b 0,00a 103 p68, 4 pg (8) 0,00a 90,00b,c 80,00b 90,00 0 80,00b 63,33b 80,00c 80,00c 0,00a 104 p68, 16 yg (9) 0,00a 62,50c 87,50b 100,00c 100, 00b 77,50b,c 87,50c 100,00c 10,00a 105 p68, 64 yg (9) 0,00a 90,00b,c 100,00b 100,00c 90, 00b 90,00b,c 90, 00c 90, 00c 0,00a 106 p68, 256 yg (9) 0,00a 100,00 b,d 100,00b 100,00c 100, 00b 100,00c 87, 50° 100,00c 0,00a 42
Quadro 4. Volume da reacção do local de injecçâo em cães em seguida à primeira vacinação com antigénio de p68 ou Placebo_
Percentagem de LS médio de cães por caneta com reacção após a segunda vacinação por dia de estudo2
Tratamento (N) 0 (21) 1 (22) 2 (23) 3 (24) 4 (25) 5 (26) 6 (27) 7 (28) 14 (35) T01 Placebo (9) 0,00a 0,00a 20,00a 10,00a 0,00a 0,00a 0,00a 0,00a 0,00a T02 p68, i pg Π) 0,00a 58,33b 58,33b 58,33b 45,83b 41,67b 41,67b 29,17b 0,00b T03 OO 4 pg (8) 0,00a 83,33c 100,00c 100,00c 90,00c 73,33c 73,33c 73,33c 0,00a T04 TU CTi OO 16 pg (9) 0,00a 90,00c,d 100,00c 100,00c 100,00c 100, 00d 100, 00d 100,00d 0,00a T05 TU OO 64 pg (9) 0,00a 100, 00d 100,00c 100,00c 100,00c 100, 00d 100, 00d 100,00d 0,00a TOO TU OO 256 pg (9) 0,00a 100, 00d 100,00c 100,00c 100,00c 100, 00d 100, 00d 87,50c,d 0,00a 2 Duas canetas por tratamento 3 Valores com diferentes sobrescritos são estatisticamente diferentes (P < 0,05) 43 Quadro 5. seguida à Placebo
Duração da reacção do local de injecção primeira vacinação com antigénio de p68 ou em
Reacção Mensurável Média de LS de dias com Média de LS de dias
Tratamento (N) (em qualquer momento) Reacçao4 (após a primeira vacinação) com Reacçao1 (após a segunda vacinação) T01 Placebo (9) 0/9 (0 %) 0, 0a -0, 0a T02 p68, 1 pg (7) 4/7 (57,1 %) 0, 3a 1, 9b T03 p68, 4 pg (8) 8/8 (100 %) 1, 3a,b 4,5C TO 4 p68, 16 pg (9) 9/9 (100 %) 2, 7b V O ΚΩ T05 p68, 64 pg (9) 9/9 (100 %) 4, 9C 6,3d T06 p68, 256 pg (9) 9/9 (100 %) 5, lc 6, 7d 4Valores com diferentes sobrescritos são estatisticamente diferentes (P < 0,05)
Quadro 6. Temperaturas rectais médias para cães em seguida à vacinação com antigénio de p68 ou Placebo_ Média de LS de temperatura rectal por dia de estudo5
Tratamento (N) 0 1 2 3 21 22 23 24 TOi Placebo (9) 38, 9a, b 38, 9 a 38,9 a,b 39,0 a 39,0a 38,8a 38,9a,b 39,0a T02 p68, l pg (7) 39, 0a, b 38, 5b 38,8a 38,4b 38, 7a 38,6a 38, 7a,b 38,6b,c T03 p68, 4 pg (8) 39, 0a 38, 7a,b 38,6a 39,0a 38,6b 38,6a 38,6 ura 38,4° T04 p68, 16 pg (9) 39, 0a 39, 0a 38,9b 38,7a,b 38, 7a 38,8a 38,7a,b 38,6b'° T05 p68, 64 pg (9) 38, 9a,b 38, 9a 38,9a,b 38,8a 38, 7a 38, 7a 39,0b 38,7a,b T06 p6 8, 256 pg (9) 38, 7b 39, 3C 38,8a,b 39,0a 38,8a 38,8a 38,9a,b 38,6b,c
Quadro 7. Títulos de Serologia de ELISA de p68 DAB em cães em seguida à vacinação com antigénio de p68 ou Placebo_ Média geométrica de Títulos de Vírus para ELISA de Tratamento (N) p6 8 por Dia de Estudo2: 0 21 42 49 63 TOI Placebo (9) 25,2a 48,3a 30,0a 28,2a 230,4a T02 p6 8, 1 pg (7) 25,5a 55,2a 674,6b 294,4b 1301,7b T03 p68, 4 pg (8) 25,3a 310,9b 7865,0C 4414,8C 10580,1° TO 4 p68,16 pg (9) 28, 9a 515,4b 12180,4° 5824,4C 11429,3° T05 p6 8, 6 4 pg (9) 25,3a 1699,5C 36460,6d 17593,9d 22689,3 °'d 44 (cont.)
Tratamento (N) Média geométrica de Títulos de Vírus para ELISA de p68 por Dia de Estudo1 2: 0 21 42 49 63 T06 p68, 256 pg (9) 24,9a 4411,7d 48382,0d 25980, 9d 30594,3d 1 As vacinações foram administradas nos Dias de Estudo 0 e 21.
Valores com diferentes sobrescritos são estatisticamente diferentes (P < 0, 05) 6 Vacinações foram administradas nos Dias de Estudo 0 e 21 e o desafio foi administrado no Dia de Estudo 49. 2 Valores com diferentes sobrescritos são estatisticamente diferentes (P < 0,05)_
Quadro 8. Títulos de Amilóide A sérica (SAA) em Cães em seguida ao desafio de Cães Vacinados com antigénio de p68 ou Placebo
Tratamento (N) Média geométrica de Títulos de Amilóide A no soro por Dia de Estudo após o desafio7: 49 50 52 T0i Placebo (9) 0,2a 146, 0S T02 ρβ 8, 1 pg 0,2a 8,3b (7) T03 p68, 4 pg 0,2a 9, 9b (8) T0 4 p68,16 pg 0, Ia 16,3b (9) T05 p68, 64 pg 0,5a 11, 4b (9) T06 p68, 256 pg 0,5a 23, lb 54 153,6a 56 14, 7a 58 1,5a 87,2a 1,2b 0, 7b 0,6b 0, 3 6, 4C 2,3b 1,2b 1,8 11,6C 3, 0b 1,6b 1,4 co o Q 3, 4b 1,3 b 1,2 16, 4C 3, 8b 1, lb 0,4 1
Valores com diferentes sobrescritos são estatisticamente diferentes (P < 2 0, 05)____ 45
Quadro 9. Incidência e Duração da tosse em cães em seguida ao desafio de cães Vacinados com Antigénio de p68 ou Placebo
Tratamento (N) Média Incidência de Doença8, de LS de dias com tosse2 T01 Placebo (9) 9/9* 8,6a (100 %) T02 p68, 1 pg (7) 2/ 7b 2,2b (28,6 %) T03 p68, 4 pg (8) 4/ 8b 3,8b (50 %) T04 p68, 16 pg (9) 5/9a,b 3, 7b (55,6 %) T05 p68, 64 pg (9) 6/9a,b 4, 7b (66,7 %) p68, 256 pg T06 (9) 3/9b 3,0b (33,3 %)
Com base em dois dias consecutivos que estão a tossir. 2 Valores com diferentes sobrescritos são estatisticamente diferentes (P < 0,05)__ EXEMPLO 2 ESTUDO DE IMUNOGENICIDADE de p68 DE BORDETELLA CANINA Animais
Quarenta e cinco cães criados misturados machos e fêmeas foram comprados. Uma vacina de parvovirus de MLV foi administrada a todos os cachorros no dia em que os cachorros chegaram ao local de estudo. Nenhuma outra vacina, diferente dos produtos experimentais, foi administrada aos cachorros durante o estudo. Os cães tinham aproximadamente 9 semanas de idade (± 1 semana) no Dia 0 (dia da primeira vacinação).
Os cães foram mantidos numa instalação de isolamento necessária para prevenir a exposição à Bordetella e outros patogénios caninos antes do desafio. Após desafio por 46 aerossol com Bordetella, os procedimentos de isolamento foram continuados para prevenir a exposição a outros patogénios caninos.
Vacinas
Solução salina estéril foi utilizada como uma vacina placebo em grupos de tratamento T01 e T02. Vacina de Bordetella bronchiseptica recombinante de p68 canina foi utilizada em grupos de tratamento T03 e T04. 0 gene estrutural do antigénio de p68 foi clonado em Escherichia coli e expressão do gene foi regulada por um promotor sensivel à temperatura. As células foram lisadas e os corpos de inclusão foram separados por centrifugação. A p68 recombinante nos corpos de inclusão foi solubilizada por tratamento em SDS. A p68 recombinante (15 pg por mL) foi combinada com 50 pg de Quil A e 50 pg de colesterol por mL em solução salina estéril como o diluente. Cada dose de um mL continha 0,28 % de etanol e 0,01 % de timerosal.
Inoculo do Desafio A estirpe Bihr Cat de Bordetella bronchiseptica foi preparada como o inoculo do desafio utilizando o método actualmente utilizado por Biologics Control Laboratories-Microbiology. As placas de agar Bordet-Genou foram preparadas com um crescimento confluente de estirpe de Bordetella bronchiseptica - Bihr Cat e incubadas durante 48 horas a 37,5 +/- 2,5 °C. As colónias virulentas de fase I foram seleccionadas e esgotadas em agar Bordet-Genou e incubadas durante 24 horas a 37,5 +/- 2,5 °C. Após a incubação, a solução salina de Bordetella foi utilizada para lavar colónias do agar e o antigénio foi diluído a uma densidade óptica de 0,80 em 600 nm. Uma contagem de células foi realizada pré- e pós-desafio para a confirmação da leitura do nefelómetro. A concentração alvo do desafio foi aproximadamente 1 X 109 CFU. A concentração de pré-desafio foi 2,37 x 108 CFU (100 % Fase I) e a contagem de 47 concentração de pós-desafio foi 1,35 x 109 CFU (100 % Fase I) ·
Desenho de Estudo
Quadro de Sumário
Grupo de Tratamento Via Número de Tratamento Animais T01 Controlo com solução Intramuscular 8 salina T02 Controlo com solução Subcutânea 7 salina Grupo de Tratamento Via Número de Tratamento Animais T03 p68 15 μρ/άοεβ Subcutânea 15 TO 4 p68 15 μρ/άοεβ Intramuscular 15 AI eatorização/Ocultação
Durante o período de tempo desde a vacinação até o dia de desafio, os animais foram designados a tratamentos de acordo com um desenho de bloco generalizado. Os tratamentos foram aleatoriamente designados a salas. No dia do desafio, os animais foram aleatoriamente designados a salas de desafio por bloco.
Indivíduos qualificados, sem conhecimento dos grupos de tratamento designados, conduziram ensaios microbiológicos e serológicos e avaliações de locais de injecção, medidas de temperaturas rectais, e observações de tosse.
Análise de Dados
As variáveis de resposta após a vacinação consistiram nos dados do local de injecção, temperaturas rectais e títulos de ELISA de p68. Os dados do local de injecção foram resumidos das seguintes formas: 1) número de animais que tem reacção imensurável por tratamento e dia de estudo, 2) número de pontos no tempo do animal que tem uma reacção 48 mensurável por tratamento, 3) número de animais que tem uma reacção mensurável em qualquer ponto no tempo por tratamento.
Os dados de título de ELISA de p68 transformados em log natural, temperaturas rectais e injecção local volume (cm cúbicos) foram analisados separadamente para as primeira e segunda vacinações utilizando um modelo misturado linear geral.
Os contrastes lineares a priori do tratamento por média de mínimos quadrados de ponto no tempo de observação foram construídos para testar diferenças de grupo de tratamento em cada ponto no tempo de observação e para comparar pontos no tempo dentro de cada tratamento. 0 nível de significância de 5 % foi utilizado para todas as comparações.
As variáveis de resposta após o desfio consistiram em observações diárias de tosse, titulos de ELISA de p68 e títulos de Amilóide A no soro. 0 número de dias de tosse durante o período após o desafio foi analisado utilizando um modelo misturado linear geral.
Os contrastes a priori média de mínimos quadrados do tratamento foram construídos para testar diferenças de grupo de tratamento. 0 nível de signif icância de 5 % foi utilizado para todas as comparações.
Separadamente para as primeira e segunda vacinações, o teste Exacto de Fisher foi utilizado para comparar grupos de tratamento para a incidência de dois dias de tosse consecutiva. 0 nível de significância de 5 % foi utilizado para todas as comparações.
Para os dados de título de Amilóide A no Soro (SAA) após o desafio, a transformação de log natural foi aplicada aos valores de título antes da análise utilizando um modelo misturado linear geral.
Os contrastes lineares a priori do tratamento por média de mínimos quadrados de ponto no tempo de observação 49 foram construídos para testar diferenças de grupo de tratamento em cada ponto no tempo de observação e para comparar pontos no tempo dentro de cada tratamento. 0 nível de significância de 5 % foi utilizado para todas as comparações.
Procedimento de Estudo Procedimentos Detalhados com Animais
Quarenta e cinco (45) cachorros seronegativos e de cultura negativa foram aleatoriamente designados a um de 4 grupos de tratamento. Oito e sete cães foram alocados aos grupos de controlo intramuscular (IM) ou subcutâneo (SC) respectivamente, para um total de 15 cães de controlo. Quinze cães foram alocados ao grupo de tratamento SC de p68 e 15 cães foram alocados ao grupo de tratamento IM de p68. Os grupos de tratamento são detalhados na secção de desenho de estudo acima. 0 dia 0 foi designado como o dia da primeira vacinação. As vacinações foram administradas no Dia 0 e repetidas 21 dias depois. Para a primeira vacinação, o lado direito do pescoço foi utilizado e para a segunda vacinação, o lado esquerdo do pescoço foi utilizado. As injecções intramusculares foram administradas no músculo semimembranoso direito e esquerdo para as primeira e segunda vacinações, respectivamente. Todos os locais de injecção foram medidos tridimensionalmente durante sete dias em seguida a cada vacinação com uma medição de acompanhamento conduzida 14 dias em seguida à vacinação. Temperaturas rectais foram monitorizadas no dia de vacinação (antes da vacinação) e durante três dias em seguida a cada vacinação.
No Dia 35, passou-se zaragatoa de traqueia em todos os animais para cultura de B. bronchiseptica e o sangue foi colhido para títulos de aglutinação. Todos os animais eram negativos por zaragatoa de traqueia e serologicamente 50 negativos à Bordetella e considerados elegíveis para o desafio.
No Dia 45, vinte e quatro dias após a segunda vacinação, um desafio por aerossol de B. bronchiseptica foi administrado a todos os cães. Cães sedados foram desafiados utilizando um cone veterinário descartável, que foi encaixado perfeitamente sobre o focinho do cão sedado. O cone veterinário foi unido a um nebulizador que foi unido a um conjunto de bomba de pressão a vácuo em 5,5 a 6,0 psi. Um mL de material de desafio foi colocado no nebulizador e o material de desafio aerossolizado foi administrado a cada cão durante 4 minutos. O pessoal que faz as observações não tinha conhecimento das designações do grupo de tratamento.
Os animais foram monitorizados para tosse durante 14 dias em seguida ao desafio (Dias 46-59). As observações foram feitas em 2 (dois) períodos de aproximadamente 30 minutos aproximadamente ao mesmo tempo cada dia, um conduzido na manhã e um na tarde e os resultados foram registados.
Colheita de sangue O sangue para títulos de aglutinação foi colhido antes da primeira vacinação e antes do desafio. 0 sangue para a avaliação de ELISA anti-p68 foi colhido antes da vacinação nos dias 0 e 21 e nos dias 35, 45, e 59. O sangue para ensaio de Amilóide A no Soro (SAA) foi colhido no dia de desafio (Dia 45) e nos dias 46, 48, 50, 52 e 54.
Testes Realizados nas Amostras
As zaragatoas de traqueia foram avaliadas para a presença de B. bronchiseptica por cultura. Cada zaragatoa de traqueia foi esgotada sobre uma placa de agar selectivo de Bordetella. Controlos positivo e negativo foram incluídos. As placas foram incubadas a 37,5 ± 2,5 °C durante 48 ± 4 horas. As colónias resultantes sobre cada placa foram em comparação com o controlo positivo e qualquer colónia que pareceu idêntica ao controlo positivo 51 foi testada adicionalmente para confirmar a presença de B. bronchiseptica. Os testes de confirmação incluíram a utilização de meios TSI, Citrato e Agar Ureia e Nitrato Vermelho.
Os soros foram avaliados para Títulos de Aglutinação, análise de ELISA de p68 ou análise de SAA utilizando os seguintes métodos: Títulos de Aglutinação - Soros foram serialmente diluídos em placas de microtitulação utilizando solução salina de Bordetella. Controlos positivo e negativo foram incluídos sobre cada placa. Estirpe 87 de B. bronchiseptica (crescida em agar Bordet Genou, colhida, inactivada e diluída até 20 % T em 630 nm) foi utilizada como o antigénio de aglutinação e foi adicionada a cada poço. As placas foram agitadas e incubadas em 35 ± 2 °C durante 2 horas. As placas foram lidas após uma segunda incubação a temperatura ambiente durante 22 horas. O título de diluição limite foi determinado utilizando o último poço para mostrar 50 % de aglutinação.
Titulos de ELISA de p68 - 0 antigénio de p68 recombinante foi capturado numa placa de microtitulação de 96 poços revestida com um anti-soro policlonal específico ao antigénio de p68 de Bordetella. Diluições seriadas duplas do soro canino foram adicionadas à placa e incubadas. Controlos positivo e negativo numa diluição 1:1000 foram incluídos em cada placa. Um conjugado indicador de IgG anti-cão de cabra purificado de afinidade marcada com peroxidase foi utilizado para detectar anticorpos específicos para o antigénio de p68. Um ABTS de substrato cromogénico foi então adicionado e a placa lida quando os poços de controlo positivo tinham uma O.D. de 1,2 + 0,2. O título de uma dada amostra foi calculado como o recíproco da última diluição com uma densidade óptica maior que a média da diluição de soro de controlo negativo mais cinco desvios padrão. 52 Títulos de SAA - Os títulos de Amilóide A no soro canino foram avaliados utilizando um kit comprado de Accuplex Co., University of Nebraska Medicai Center, Omaha, NE 68198. De maneira breve, SAA canino foi capturado numa placa de microtitulação revestida com um anticorpo monoclonal anti-SAA canino. Amostras diluídas do soro canino foram adicionadas à placa seguido por um conjugado de anticorpo anti-canino marcado com biotina. Em seguida à incubação, um substrato cromogénico de estreptavidina conjugada com peroxidase foi adicionado. A placa foi lida após 30 minutos.
Resultados
Temperaturas rectais O sumário de medições de temperatura rectal é apresentado nos Quadros 10 e 11.
Quadro 10: Média de minimos quadrados de temperaturas rectais (C) em cães em seguida a vacinação com solução salina ou p68 de Bordetella (após a primeira vacinação3)
Tratamento Temperaturas rectais (C°) 0 Dia de Estudo 3 Erro padrão 1 2 T01 solução salina IM38,2 38,2 38,2 38,2 0, 08 T02 solução salina SC38,0 38,3 38,2 38,2 0, 09 T03 p68 SC 38,1 38,3 38,1 38, 0 0, 06 TO4 p68 IM 38,2 38,4 38,2 38,2 0,06 aPrimeira vacinação administrada no dia 0
Quadro 11: Média de minimos quadrados de temperaturas rectais (C) em cães em seguida a vacinação com solução salina ou p68 de Bordetella (após a segunda vacinação3)
Temperaturas rectais (C°)
Tratamento Dia de Estudo Erro 21 22 23 24 T01 solução salina IM 38,1 38,3 38,2 38,2 0,10 T02 solução salina SC 38,5 38,5 38,2 38,2 0,10 T03 p68 SC 38,0 38,3 38,1 38, 1 0,08 53 T04 p68 IM 38,1 38,4 38,4 38,4 0,08 aSegunda vacinação administrada no dia 21
Nenhuma diferença significativa foi notada entre quaisquer grupos em qualquer dia em seguida à primeira vacinação. Uma diferença significativa foi notada entre cães vacinados com solução salina e todos os cães vacinados com p68 (p = 0,0053 para T01T02 v T03T04) no Dia 21. Uma diferença significativa (p = 0,0124) entre vacinados IM e SC com p68 foi demonstrada no Dia 24.
Reacções do Local de Injecção
As reacções do local de injecção são resumidas nos Quadros 12 e 13. Devido a omissão técnica, nenhuma observação do local de injecção foi conduzida no dia 14 de observação em seguida à segunda vacinação (Dia 35).
Reacções do local mensuráveis foram observadas em T03 (p68 SC) e foram minimas em tamanho. Uma reacção do local de injecção pequena foi notada num cão em T04 (p68 IM) no
Dia 3, mas o impacto mínimo da medição não é reflectido na média global para o grupo.
Quadro 12: Média de mínimos quadrados (cm cúbicos) das reacções do local de injecção em cães em seguida a vacinação com solução salina ou p68 (15 ug/dose) de
Bordetella (após a primeira vacinação3)_
Tamanho médio (cm cúbico) de reacções do local de
Tratamento b injecção Dia de estudo 1 2 3 4 5 6 7 14 T01 solução salina IM 0, 0 0, 0 0, 0 0,0 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 T02 solução salina SC 0, 0 0, 0 0, 0 0,0 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 54 _(cont. )__
Tamanho médio (cm cúbico) de reacções do local de
Tratamento b __injecção__
Dia de estudo 1 2 3 4 5 6 7 _14 T03 p68 SC 7, 4 4, 3 6, 8 3,4 2, 5 2, 6 1, 9 0,1 TO4 p68 IM_0, 0 0, 0 0,QC Q, Q 0, 0 0, 0 0, 0 0,0 aPrimeira vacinação administrada no dia 0 bErro padrão para T01 = 0,80, T02 = 0,84, T03 = 0,70 e T04 = 0,70 cum cão teve uma pequena reacção do local (0,5 cm2), mas devido ao arredondamento, o impacto mínimo do valor não está reflectido na média global Quadro 13. Média de mínimos quadrados (cm cúbicos) das reacções do local de injecção em cães em seguida a vacinação com solução salina ou p68 de (15 ug/ dose) Bordetella (após a segunda vacinação9)_
Tamanho médio (cm cúbicos) das reacções do local de _injecção_
Tratamento13 Dia de Estudo 22 23 24 25 26 27 28 T01 solução salina IM 0,0 0,0 0,0 0, 0 0,0 0,0 0,0 T02 solução salina SC 0,0 0,0 0,0 0, 0 0,0 0,0 0,0 T03 p68 SC 8,6 9,2 9,5 7,3 5,2 4,7 5,1 T04 p68 IM 0,0 0,0 0,0 0, 0 0,0 0,0 0,0 aSegunda vacinação administrada no dia 21 bErro padrão para T01 = 1,12, T02 = 1,19, T03 = 0,92 e T06 = 0,96
Diferenças significativas em medições de locais de injecção são resumidas no Quadro 14. Uma diferença significativa no local de injecção medida entre T02 (solução salina SC) versus T03 (15 pg SC de p68) foi notada durante seis dias em seguida à primeira vacinação. Pelo Dia 7 e de novo no Dia 14 (a observação de reavaliação de duas semanas), nenhuma diferença significativa foi notada entre qualquer grupo de tratamento. 55
Uma diferença significativa no local de injecção medida entre T02 (solução salina SC) versus T03 (15 pg SC de ρβθ) foi notada durante sete dias em seguida à segunda vacinação.
Quadro 14. Valores de significância para contrastes a priori entre média de mínimos quadrados da medidas de reacção do local de injecção.
Dia de Estudo Contrastes (tratamento v. tratamento) valor de p 1 T02v T03 0,0001 T03 v T04 0,0001 T01T02vT03T04 0,0001 2 T02 v T03 0,0007 T03 v T04 0,0008 T0lT02vT03T04 0,0101 3 T02 v T03 0,0001 T03 v T04 0,0001 T01T02vT03T04 0,0002 4 T02 v T03 0,0044 T03 v T04 0,0042 T01T02vT03T04 0,0339 5 T02 v T03 0,0313 T03 v T04 0,0253 22 T02 v T03 0,0001 T03 v T04 0,0001 T01T02vT03T04 0,0002 23 T02v T03 0,0001 T03 v T04 0,0001 T01T02vT03T04 0,0001 24 T02 v T03 0,0001 56 (cont.)
Dia de Estudo Contrastes (tratamento v. tratamento) valor de p T03 v TO4 0,0001 ΤΟ1T02vT03T0 4 0,0001 25 T02 v T03 0,0001 T03 v TO4 0,0001 ΤΟ1Τ02νΤ03Τ0 4 0,0013 26 T02 v T03 0,0013 T03 v T04 0,0007 ΤΟ1Τ02νΤ03Τ0 4 0,0172 27 T02 v T03 0, 0035 T03 v TO4 0,0019 ΤΟ1Τ02νΤ03Τ0 4 0,0313
Somente contrastes significativos (P<0,05) são apresentados. Títulos de ELISA de p68
Os dados de ELISA de p68 são resumidos no Quadro 15 e na Figura 1. Devido à resposta de título considerável a p68 nos cães vacinados, vários mínimos de titulação foram utilizados em diferentes pontos no tempo no estudo. Titulações para os Dias 0 e 21 foram iniciadas em 50. Para os Dias 35, 45 e 59, titulações começaram em 200. Qualquer valor observado como "inferior a" foi dividido por 2 antes da análise. A subida incremental observada em valores de ELISA de p68 para grupos de controlo (T01 e T02) durante o curso do estudo é devido a estes valores de titulação mínimos. Títulos de Aglutinação permaneceram <4.
Todos os animais vacinados com p68 demonstraram pelo menos um aumento de quatro vezes em títulos desde o primeiro dia de vacinação ao dia de desafio (Dia 0 vs. Dia 45) quando em comparação com animais vacinados com placebo. Quadro 15. Média geométrica e erros padrão de p68 (15 57 μ9/άθΞβ) títulos de diluição limite de ELISA3 em cães em seguida a vacinação com solução salina ou p68 (15 μ9/άοεο) e em seguida a desafio por aerossol de B. bronchiseptica.
Tratamento Dia de Estudob 0 Erro 21 Erro 35 Erro 45 Erro 59 Erro padrão padrão padrão padrão padrão T01 solução25,0 4, 78 25, 0 4, 78 125, 4 23,96 100,0 18,14 130,0 32,24 salina IM T02 solução 25,0 5, 06 25,0 5,06 113,5 23,00 100,0 19,39 100,0 26,50 salina SC T03 p68 25,0 3, 93 189,5 29, 77 10688, 7 1679,20 4555,1 603,43 8796,0 1592,43 SC TO4 p68 25,0 3, 93 121,4 19, 08 11023, 7 1731,85 4419,2 585,44 13718,12483,54 IM a As titulações para os Dias 0 e 21 foram iniciadas em 50. As titulações para os
Dias 35, 45 e 59 foram iniciadas em 200. Qualquer valor observado como "inferior a" foi dividido por 2 antes da análise. b A primeira vacinação ocorreu no Dia 0; a segunda vacinação ocorreu no Dia 21 e o desafio foi administrado no Dia 45._
Diferenças significativas para média de mínimos quadrados de títulos de ELISA após a vacinação e após o desafio são colocados em lista no Quadro 16. Nenhuma diferença significativa foi notada entre os animais vacinados SC com p68 e IM com p68 após a vacinação ter sido completada.
Quadro 16: valores de significância para contrastes a priori entre média dos mínimos quadrados de títulos diluição limite de ELISA de p68 após a vacinação e após o desafio. 58
Dia de estudo Contraste valor de p 21 TOlv T04 0,0001 T02 v T03 0,0001 T03 v T04 0,0491 35 TOlv T04 0,0001 T02v T03 0,0001 45 TOlv T04 0,0001 T02 v T03 0,0001 59 TOlv T04 0,0001 T02 v T03 0,0001
Somente contrastes significativos (P<0,05) são apresentados. Títulos de Amilóide A no soro
Os valores de SAA foram determinados nos dias 0, 1, 3, 5, 7 e 9 em seguida ao desafio. Os valores de Amilóide A no soro são apresentados no Quadro 17 e representados na Figura 2 .
Quadro 17: Média geométrica e erros padrão de Títulos de Amilóide A no soro em cães vacinados com solução salina e p68 (15 μ9/άοββ) de Bordetella em seguida ao desafio por aerossol com Bordetella bronchiseptica Média geométrica e erros padrão de Amilóide A no soro Dia de Estudo3 45 46 48 50 52 54 TRT Média Erro padrão Média Erro padrão Média Erro padrão Média Erro padrão Média Erro padrão Média Erro padrão T01 0,1 0, 02 277, 3 125,30 82, 4 42, 17 69,8 28, 60 6, 0 2,24 1,2 0, 33 T02 0,4 0, 06 384, 5 185,63 128,9 70, 46 215, 9 94, 56 28, 0 11, 23 3, 7 1, 11 T03 0, 5 0, 05 31, 7 10,51 6, 0 2,25 2,3 0, 68 0,8 0,23 1,3 0, 27 T04 0, 3 0, 04 50, 0 16,58 8, 6 3,22 5, 0 1, 50 2,4 0, 65 0,7 0, 14 aDesafio administrado no dia 45 59
Diferenças significativas em títulos de SAA são resumidas no Quadro 18. Controlos de solução salina demonstraram títulos de SAA mais altos que cães vacinados nos dias 1, 3 e 5 em seguida ao desafio. Controlos SC de solução salina continuaram a demonstrar títulos de SAA significativamente mais altos quando em comparação com cães vacinados SC no Dia 7 e 9 em seguida ao desafio.
Quadro 18. valores de significância para contrastes a priori entre média dos mínimos quadrados de títulos de Amilóide A no soro após o desafio
Dia de estudo Contraste (tratamento v tratamento) valor de p 4 6 TOlv T04 0,0025 T02 v T03 0,0001 48 TOlv T04 0,0007 T02 v T03 0, 0001 50 TOlv T04 0,0001 T02 v T03 0,0001 52 TOlv T02 0,0093 T02 v T03 0,0001 54 T02 v T03 0,0493
Somente contrastes significativos (P<0,05) são apresentados.
Observações de Tosse
Desafio por aerossol para todos os grupos de tratamento ocorreu 24 dias em seguida à segunda vacinação (Dia 45). As observações de tosse foram examinadas utilizando dois métodos - estado da doença com base em dois dias consecutivos de tosse (apresentados no Quadro 19) e percentagem de dias de tosse (apresentada nos Quadros 20 e 21). Quando os cães foram avaliados utilizando critérios de 60 dois dias consecutivos de tosse, 80 % dos cães vacinados com p68 (SC e IM) tossiram pelo menos dois dias consecutivos ao passo que os cães vacinados com solução salina SC e solução salina IM tossiram 100 % e 87,5 %, respectivamente. Quando os cães foram avaliados utilizando percentagem de dias em que se observou tosse, cães vacinados SC e IM com p68 tossiram 38,72 % e 41,05 % dos dias observados, respectivamente. Os cães vacinados com solução salina SC e solução salina IM tossiram 69,04 % e 62,66 %, respectivamente.
Quadro 19. Sumário de estado da doença em cães vacinados com solução salina e p68 (15 μ9/Μθ3β) de Bordetella com base em dois dias consecutivos de tosse em seguida ao desafio por aerossol com Bordetella bronchiséptica Número de Tratamento N° de Cães
Percentagem de cães com dois dias consecutivos de tosse T01 Solução salina IM 8 87,5 T02 Solução salina SC 7 100, 0 T03 p68 15 μρΜοβθ SC 15 80,0 T04 p68 15 ug/dose IM 15 80,0
Nenhuma diferença significativa foi demonstrada entre cães vacinados com solução salina e cães vacinados com p68 quando o estado da doença foi com base em dois dias consecutivos de tosse.
Tratamento Número de Caes Média Erro padrão T01 Solução salina IM 8 62,66 % 8, 67 T02 Solução salina SC 7 69,04 % 00 00 T03 p68 15 mg SC 15 38, 72 % 6,38 O H p6815 mg IM 15 41,05 % 6, 44
Quadro 20. Percentagem média de dias de tosse em cães vacinados com solução salina e p68 (15 pg/dose)de Bordetella em seguida ao desafio por aerossol com Bordetella bronchiseptica_ 61
Uma diferença significativa (p = 0,0112) foi demonstrada entre T02 (solução salina SC) e T03 (15 pg SC com p68) . Nenhuma diferença significativa foi demonstrada entre T01 (solução salina IM) e T04 (15 pg IM com p68).
Parâmetro Estimativa Erro padrão Média de Solução salina (T01 & T02) 65,89 % 1,10 Média de 15 pg/dose (T03 & T04) 39,88 % 4,34
Quadro 21. Percentagem média de dias de tosse por tratamento de cães vacinados com solução salina e p68 (15 pg/dose) de Bordetella em seguida ao desafio por aerossol com Bordetella bronchiséptica_
Uma diferença significativa (p = 0,0022) foi demonstrada entre os controlos de solução salina e cães vacinados com p68.
Discussão 0 estudo foi desenhado para demonstrar a segurança e eficácia de uma vacina de p68 de Bordetella de 15 pg/dose em cães. A segurança foi examinada utilizando observações de local de injecção e temperatura rectal. A análise das medições de reacção do local de injecção demonstrou uma reacção insignificante no grupo vacinado IM e reacções mínimas no grupo vacinado SC. As reacções que foram observadas tenderam a ser pequenas, geralmente diminuindo em tamanho durante os períodos de observação. 0 tamanho destas reacções seria mais provável de não serem notadas em cão não tosquiado. Embora uma diferença significativa tenha sido observada entre solução salina e vacinados no Dia 21 e entre vacinados IM e SC no Dia 24, temperaturas rectais foram clinicamente pouco notáveis e estavam dentro de limites normais para todos os cães em todos os grupos. A eficácia foi examinada utilizando observações de medição de títulos de diluição limite de ELISA de p68 e de tosse. Independentemente da via de administração, uma boa resposta de anticorpo de p68 foi demonstrada em grupos 62 vacinados com p68 pelo Dia 35. Uma boa resposta anamnéstica foi observada em vacinados após o desafio. Embora respostas mais altas de anticorpo tenham sido obtidas tradicionalmente com a via IM mais vascular e menos gorda que em comparação com a via SC, a diferença entre vacinados IM e SC com p68 não foi significativa durante o curso do estudo. A examinação da resposta de SAA em cães vacinados e não vacinados com p68 de Bordetella em seguida ao desafio indicou uma subida muito menor nos valores de SAA nos grupos de animais vacinados especialmente nos dias 1, 3 e 5 dias pós- desafio.
Conclusões
Neste estudo, a eficácia de uma vacina de p68 de Bordetella canina de 15 yg/dose foi examinada utilizando um modelo de desafio canino 24 dias após vacinação. A vacina era segura como foi demonstrado por temperaturas rectais normais, reacções do local de injecção mínimas e a eficácia foi demonstrada em grupos IM e SC combinados. A comparação de valores de SAA demonstrou uma diferença significativa entre solução salina e cães vacinados com p68 nos dias 1, 3 e 5 em seguida ao desafio por aerossol. EXEMPLO 3 DURAÇÃO DE SEIS MÊS DE ESTUDO DE IMUNIDADE DE VACINA de p68
DE BORDETELLA CANINA
Animais
Noventa cães criados misturados machos e fêmeas foram comprados e a maioria dos cachorros tinham 9 semanas (±1 semana) no dia da primeira vacinação.
Uma vacina de parvovírus de MLV foi administrada aos cães após a chegada no local de estudo. Para serem elegíveis para o estudo, determinou-se que os animais eram negativos a B. bronchiseptica por zaragatoa de traqueia e título de aglutinação. Nenhuma vacina, diferente dos produtos experimentais, foi administrada durante o estudo. 63
Os cães foram mantidos numa instalação de isolamento necessária para prevenir a exposição a B. bronchiseptica e patogénios caninos antes do desafio. Após o desafio por aerossol com B. bronchiseptica, os procedimentos de isolamento foram continuados para prevenir a exposição a outros patogénios caninos.
Vacinas
Solução salina estéril foi utilizada como uma vacina placebo em grupos de tratamento 101 e T02. Vacina de Bordetella bronchiseptica recombinante de p68 canina foi utilizada em grupos de tratamento T03 e T04. O gene estrutural do antigénio de p68 foi clonado em Escherichia coli e expressão do gene foi regulada por um promotor sensível à temperatura. As células foram lisadas e os corpos de inclusão foram separados por centrifugação. A p68 recombinante nos corpos de inclusão foi solubilizada por tratamento em SDS. Separadamente, 15 pg de p68 e 60 pg de p68 foram combinados com 5 0 pg de Quil A e 50 pg de colesterol por mL em solução salina Lepto estéril como o diluente. Os componentes combinados foram misturados a 4 °C durante 24 horas e passados três vezes através de um microf luidif icador. Cada dose de um mL continha 2,7 ml de etanol e 0,0001 % de timerosal. As concentrações de p68 em as vacinas experimentais foram medidas por ELISA de p68. Todos os ensaios foram feitos em cinco (5) repetições. Todas as vacinas foram utilizadas dentro de 6 meses de montagem.
Inoculo do Desafio
As placas de agar Bordet-Genou foram preparadas com estirpe Bihr Cat de Bordetella bronchiseptica e incubadas durante 48 horas a 37,5 +/- 2,5 °C. As colónias virulentas de fase I foram seleccionadas e esgotadas em agar Bordet-Genou e incubadas durante 24 horas a 37,5 +/- 2,5 °C. Após a incubação, a solução salina de Bordetella foi utilizada para lavar colónias de agar e as células diluídas a uma 64 densidade óptica de 0,80 em 600 nm. Uma contagem de células foi realizada pré- e pós-desafio para a confirmação da leitura do nefelómetro. A concentração alvo do desafio foi aproximadamente 1 X 109 CFU. Para o Grupo I, a contagem de concentração pré-desafio foi 1,94 X 109 e a contagem de concentração pós-desafio foi 1,43 X 109. Para o Grupo II, a contagem de concentração pré-desafio foi 2,55 X 109 e a contagem de concentração pós-desafio foi 2,13 X 109.
Desenho de estudo
Quadro de Sumário
Grupo de Tratamento Via Número de Animais no Dia da primeira vacinação tratamento Dia 0 (Grupo I) Dia 20 (Grupo II) Número Total de Animais T01 Controlo de Solução salina Subcutânea 8 7 15 T02 Controlo de Solução salina Intramuscular 8 7 15 T03 p68 60 pg/dose Subcutânea 8 7 15 T04 p68 60 pg/dose Intramuscular 8 7 15 T05 p68 15 pg/dose Subcutânea 8 7 15 T06 p68 15 pg/dose Intramuscular 8 7 15 0 estudo foi conduzido em duas fases ou grupos que consistem em 48 cães no grupo I e 42 cães no grupo II. Vacinação N° 1 ocorreu no Dia 0 para cada Grupo. Vacinação N° 2 ocorreu 20 dias depois. Eventos no grupo 1 foram desviados dos eventos no grupo II em aproximadamente 15 dias. Os cães foram desafiados por aerossol com B. bronchiseptica 181 dias após a última vacinação. AI eatorização/Ocultação
Os animais foram aleatoriamente designados a tratamentos e salas de acordo com um desenho aleatorizado completo.
Durante o período de tempo desde a vacinação N° 1 até o dia de desafio dentro de cada grupo de estudo, os animais 65 foram aleatoriamente designados a tratamentos e salas (3 a 5 cães por sala) utilizando um plano de aleatorização.
No dia de desafio, os animais tratados previamente foram aleatorizados a salas de desafio dentro de grupo de estudo utilizando um desenho de bloco generalizado.
Indivíduos qualificados, sem conhecimento dos grupos de tratamento designados, conduziram ensaios microbiológicos e serológicos e avaliações de locais de injecção e de tosse.
Análise de dados
As variáveis de resposta após a vacinação consistiram nos dados do local de injecção, temperaturas rectais e títulos de ELISA de p68. Os dados do local de injecção foram resumidos como segue: 1) número de animais que tem uma reacção mensurável por tratamento e dia de estudo, 2) número de pontos no tempo do animal que tem uma reacção mensurável por tratamento, 3) número de animais que tem uma reacção mensurável em qualquer ponto no tempo por tratamento, 4) duração de uma reacção mensurável para cada animal.
Os dados de título de ELISA de p68 transformados em log natural, temperaturas rectais e local de injecção volume (cm cúbicos) foram analisados separadamente para as primeira e segunda vacinações utilizando um modelo misturado linear geral.
Os contrastes lineares a priori do tratamento por média de mínimos quadrados do ponto no tempo de observação foram construídos para testar diferenças de grupo de tratamento em cada ponto no tempo de observação e para comparar pontos no tempo dentro de cada tratamento as comparações especificas de interesse foram T01 vs. T03, T01 vs. T05, 103 vs. T05, T02 vs. T04, T02 vs. T06, e T04 vs. TO6 . Se o termo de interacção do ponto no tempo por tratamento por grupo de estudo fosse significativo em P<0,05, contrastes entre grupos de tratamento em cada ponto 66 no tempo e entre pontos no tempo dentro de grupos de tratamento estariam dentro de cada grupo de estudo, de outra maneira estes contrastes seriam com base na média de mínimos quadrados do efeito de interacção de ponto no tempo por tratamento. 0 nível de significância de 5 % foi utilizado para todas as comparações.
As variáveis de resposta após o desfio consistiram em títulos de ELISA de p68, títulos de Amilóide A no soro e observações diárias de tosse. Após o desafio titulos de ELISA de p68 foram analisados como foi descrito anteriormente. Para os dados de título de Amilóide A no Soro (SAA) após o desafio, a transformação de log natural foi aplicada aos valores de título antes da análise utilizando um modelo misturado linear geral. A análise de tosse foi modificada para reflectir os requisitos de USDA. Para cada cão, a percentagem de períodos de observação durante os quais tosse foi observada foi calculada. Antes da análise, a percentagem foi transformada utilizando a transformação do arco-seno da raiz quadrada. Um modelo misturado linear geral foi utilizado para a análise de tosse. A média de mínimos quadrados desta análise foram transformadas de volta a percentagens e a redução percentual na tosse foi calculada como:
Redução percentual = 100 X (média de grupo de controlo - média de grupo de tratamento) média de grupo de controlo
Os contrastes lineares a priori da média de mínimos quadrados do tratamento foram construídos para testar diferenças de grupo de tratamento. As comparações específicas de interesse foram T01 vs. T03, T01 vs. T05, T03 vs. T05, T02 vs. T04, T02 vs. T06, e T04 vs. T06. Se o termo de interacção de tratamento por grupo de estudo fosse significativos em P<0,05, contrastes entre grupos de tratamento estariam dentro de cada grupo de estudo de outra 67 maneira os contrastes entre grupos de tratamento seriam com base na média de mínimos quadrados do efeito principal de tratamento. 0 nível de significância de 5 % foi utilizado para todas as comparações.
Procedimento de Estudo Procedimentos Detalhados em Animais
Antes da chegada nas instalações de estudo e antes da primeira vacinação, passou-se zaragatoa de traqueia dos cachorros para cultura de B. bronchiseptica e o sangue foi colhido para títulos de aglutinação. Todos os animais eram negativos por zaragatoa de traqueia e serologicamente negativos à Bordetella e considerados elegíveis para o estudo. Quarenta e oito cachorros foram aleatoriamente designados a um de seis grupos de tratamento para o Grupo I. 0 procedimento foi repetido utilizando quarenta e dois cães para o Grupo II. Os animais foram aclimatados ao local de estudo durante pelo menos cinco dias.
Grupos e tratamentos são detalhados na Secção 7.4.A. Devido a restrições da instalação e para aumentar a acurácia das observações de tosse em seguida ao desafio, a vacinação e os respectivos períodos de desafio foram repartidos em 15 dias para gerar os dois grupos de cães. Dia 0 refere-se ao dia de vacinação N° 1 para ambos o Grupo I e ο II. Vacinação N° 2 ocorreu 20 dias depois. Os tratamentos T01, T03, e T05 foram administrados por meio da via subcutânea. Os tratamentos T02, T04, e T06 foram administrados por meio da via intramuscular. As injecções subcutâneas foram administradas na orientação dorsolateral do pescoço. Para a vacinação N° 1, o lado direito do pescoço foi utilizado e para a vacinação N° 2, o lado esquerdo do pescoço foi utilizado. As injecções intramusculares foram administradas no músculo semimembranoso direito e esquerdo para a vacinação N° 1 e vacinação N° 2, respectivamente. Todos os locais de injecção foram medidos tridimensionalmente durante sete 68 dias em seguida a cada vacinação com uma medição de acompanhamento feita 14 dias em seguida à vacinação. As temperaturas rectais foram monitorizadas no dia de vacinação (antes da vacinação) e durante três dias em seguida a cada vacinação. 0 sangue foi colhido antes de cada vacinação (no Dia 1 e Dia 19) e no Dia 50 para a determinação do titulo de ELISA de p68. A cada mês, passou-se zaragatoa de traqueia em todos os cães para cultura de B. bronchiseptica sob sedação para confirmar o estado negativo de B. bronchiseptica. O sangue foi também colhido para aglutinação e títulos de ELISA. O procedimento foi repetido 7 dias antes do desafio para cada grupo. Evidência de uma cultura de zaragatoa de traqueia positiva ou um título de aglutinação crescente excluiu o animal do estudo. O desafio foi administrado a cães 181 dias após vacinação N° 2. Os cães sedados foram desafiados utilizando um cone veterinário descartável, que foi encaixado perfeitamente sobre o focinho do cão sedado. O cone veterinário foi unido a um nebulizador que foi unido a um conjunto de bomba de pressão a vácuo em 5,5 a 6,0 psi. Um mL de material de desafio foi colocado no nebulizador e o material de desafio aerossolizado foi administrado a cada cão durante 4 minutos.
As observações de tosse após o desafio foram modificadas antes do desafio para cumprir com recomendações de USDA. Após desafio, cada grupo de cães foi observado entre o terceiro e décimo dia em seguida ao desafio, para um total de 8 dias. Os animais foram observados duas vezes ao dia para tosse durante aproximadamente 45 minutos em cada período de observação. 0 intervalo entre períodos de observação foi aproximadamente 12 horas. 0 pessoal sem conhecimento dos grupos de tratamento designados registou observações de tosse.
Colheita de Sangue 69 0 sangue para títulos de aglutinação foi colhido antes da primeira vacinação, mensalmente e antes do desafio para cada grupo. 0 sangue para a avaliação de ELISA anti-p68 foi colhido no dia antes da vacinação N° 1 e N° 2, no Dia 50 e em aproximadamente intervalos de 30 dias depois disso para cada grupo. O sangue foi também colhido no dia de desafio e no dia final de observação após o desafio. O sangue para ensaio de Amilóide A no Soro (SAA) foi colhido no dia de desafio (antes do desafio) e nos dias 1, 3, 5, 7, e 9 após o desafio para cada grupo.
Testes Realizados nas Amostras
As zaragatoas de traqueia foram avaliadas para a presença de B. bronchiseptica por cultura. Cada zaragatoa de traqueia foi esgotada sobre uma placa de agar selectivo de Bordetella. Controlos positivo e negativo são incluídos. As placas foram incubadas a 37,5 ± 2,5 °C durante 48 ± 4 horas. As colónias resultantes sobre cada placa foram em comparação com o controlo positivo e qualquer colónia que pareceu idêntica ao controlo positivo foi testada adicionalmente para confirmar a presença de B. bronchiseptica. Os testes de confirmação incluíram a utilização de meios de TSI, Citrato e Agar Ureia e Vermelho de Nitrato.
Os soros foram avaliados para Títulos de Aglutinação, análise de ELISA de p68 ou análise de SAA utilizando os seguintes métodos:
Titulos de Aglutinação - Soros foram serialmente diluídos em placas de microtitulação utilizando solução salina de Bordetella. Controlos positivo e negativo foram incluídos em cada placa. Estirpe 87 de B. bronchiseptica (crescida em agar Bordet Genou, colhida, inactivada e diluída até 20 %T em 630 nm) foi utilizada como o antigénio de aglutinação e foi adicionada a cada poço. As placas foram agitadas e incubadas em 35 ± 2 °C durante 2 horas. As 70 placas foram lidas após uma segunda incubação a temperatura ambiente durante 22 horas. O titulo de diluição limite foi determinado utilizando o último poço para mostrar 50 % de aglutinação. Títulos de ELISA de p68 - O antigénio de p68 recombinante foi capturado numa placa de microtitulação de 96 poços revestida com um anti-soro policlonal específico ao antigénio de p68 de Bordetella. Diluições seriadas duplas do soro canino foram adicionadas à placa e incubadas. Controlos positivo e negativo numa diluição 1:1000 foram incluídos em cada placa. Um conjugado indicador de IgG anti-cão de cabra purificado de afinidade marcada com peroxidase foi utilizado para detectar anticorpos específicos para o antigénio de rp68. Um ABTS de substrato cromogénico foi então adicionado e a placa lida quando os poços de controlo positivo tinham uma O.D. de 1,2 ± 0,2. O titulo de uma dada amostra foi calculado como o recíproco da última diluição com uma densidade óptica maior que a média da diluição de soro de controlo negativo mais cinco desvios padrão. Títulos de SAA - O Amilóide A canino no soro foi capturado numa placa de microtitulação de 96 poços revestida com um anticorpo monoclonal anti-SAA canino. Amostras diluídas do soro canino foram adicionadas à placa e incubadas. Um padrão de referência foi adicionado para obter uma curva padrão desde 0,31 ng/ml até 2 0 ng/ml. Um conjugado de anticorpo anti-canino marcado com biotina foi adicionado. Em seguida à incubação do anticorpo anti-canino marcado com biotina, uma estreptavidina conjugada com peroxidase foi adicionada. Um TMB de substrato cromogénico foi adicionado e a placa foi lida após 30 minutos. A concentração de Amilóide A no soro foi determinada por comparação da amostra com a curva padrão e multiplicação pelo factor de diluição apropriado.
Resultados 71 A não ser que de outra maneira indicado, os resultados são os dados combinados do Grupo I e II.
Cultura de Zaragatoa de Traqueia e Títulos de Aglutinação Culturas de zaragatoa de traqueia positivas e/ou títulos de aglutinação crescentes foram demonstrados em onze cães durante o curso do estudo. Estes cães e qualquer cão alojado com os cães positivos foram retirados do estudo, resultando numa perda de 20 cães. O número de cães retirado de cada grupo foi: T01-4 cães, T02-2 cães, T03-3 cães, 104-1 cão, T05-5 cães, T06-5 cães.
Observações do Local de Injecção Reacções do local de injecção são resumidas nos Quadros 22-25. Informação do local de injecção não foi colhida para o Cão 81595 no Dia 21 para o Grupo I devido a omissão técnica. O protocolo foi modificado de modo que dados de reacção do local de injecção não foi colhido para os cães no grupo II no Dia 22 portanto, sumário de dados do Dia 22 contém somente informação de oito cães por grupo de tratamento no grupo I. As reacções do local de injecção não foram observadas para qualquer cão que recebe um tratamento IM. Medições do local de injecção foram mínimas para ambos os grupos de tratamento vacinados SC (T03 e T05) .
Quadro 22. Média de minimos quadrados (cm cúbicos) das reacções do local de injecção em cães em seguida a vacinação com solução salina ou p68 de Bordetella (após a primeira vacinação3) _Tamanho médio ( cm cúbico)b_
Tratamento Dia de estudo 1 2 3 4 5 6 7 14 T01 solução salina SC 0 0 0 0 0 0 0 0 T02 solução salina IM 0 0 0 0 0 0 0 0 T03 60 pg SC 5, 8 6, 4 7,3 6, 3 5, 0 4, 9 2, 7 0 T04 60pg IM 0 0 0 0 0 . 0 0 0 T05 15 pg SC 4,4 4,6 3,1 2,1 1,2 0,9 0, 7 0 T06 15 pg IM 0 0 0 0 0 0 0 0 72 aVacinação n° 1 foi administrada no Dia 0 bErro padrão para todas as médias = 0,64
Quadro 23. Média de minimos quadrados (cm cúbicos) das reacções do local de injecção em cães em seguida a vacinação com solução salina ou p68 de Bordetella (após a segunda vacinação9)
Tamanho médio ( cm cúbico) tratamento Dia de estudo 21b 22c 23b 24b 25b 26b 27b 34b T01 solução salina SC 0 0 0 0 0 0 0 0 T02 solução salina IM 0 0 0 0 0 0 0 0 T03 60 pg SC 5.0 3.2 4.2 5.8 5.9 5.8 4.3 0.1 T04 60 pg IM 0 0 0 0 0 0 0 0 T0515 pg SC 3.7 2.4 2.2 2.6 2.1 2.0 1.6 0 T06 15 pg IM 0d 0 0 0 0 0 0 0 aVacinação n° 2 foi administrada no Dia 20 bErro padrão para as médias neste dia = 0,55 cErro padrão para as médias neste dia = 0,70 dErro padrão para as médias neste dia = 0,57
Quadro 24. Percentagem de cães que têm uma reacção do local de injecção mensurável em seguida à vacinação com solução salina ou p68 Bordetella (após a primeira vacinação3)_
Tratamento _Percentagem de Reacção mensurável n 1 2 3 4 5 6 7 14 T01 solução salina SC 15 0 0 0 0 0 0 0 0 T02 solução salina IM 15 0 0 0 0 0 0 0 0 T03 60 pg SC 15 66,7 73,3 73,3 73,3 73,3 73,3 66, 7 0 T04 60 pg IM 15 0 0 0 0 0 0 0 0 T05 15 pg SC 15 73,3 73,3 60, 0 60, 0 53,3 46, 7 46, 7 0 T06 15 pg IM 15 0 0 0 0 0 0 0 0 aVacinação N° 1 administrada no Dia 0 73
Quadro 25. Percentagem de cães que têm uma reacção do local de injecção mensurável em seguida à vacinação com solução salina ou p68 de Bordetella (após a segunda vacinação3)_ _Percentagem de Reacção mensurável
Tratamento
Dia de Estudo n 21 22b 23 24 25 26 27 34 T01 solução salina SC 15 0 0 0 0 0 0 0 0 T0 2 solução salina IM 15 0 0 0 0 0 0 0 0 T03 60 pg SC 15 00 o o 50,0 66,7 66,7 80, 0 80, 0 80, 0 6,7 T0 4 60 pg IM 15 0 0 0 0 0 0 0 0 T05 15 pg SC 15 73,3 50,0 73,3 73,3 73,3 73,3 66, 7 0 T06 15 pg IM 15 0C 0 0 0 0 0 0 0 dVacinação N° 2 administrada no Dia 0 bn = 8 para o Dia 22 cn = 14 para T06 no Dia 21
Diferenças significativas em medições de locais de injecção são resumidas no Quadro 26. Uma diferença significativa em medições de locais de injecção entre T01 (solução salina SC) versus T03 (60 mg SC) foi notada durante sete dias após a primeira vacinação. Uma diferença significativa entre T01 (solução salina SC) e T05 (15 mg SC) foi notada para somente os primeiros quatro dias após a primeira vacinação. Uma diferença significativa foi encontrada entre T03 (60 mg SC) e T05 (15 mg SC) nos dias 3 até 7. Pelo Dia 14 (a observação de reavaliação de duas semanas), nenhuma diferença foi notada entre quaisquer dos grupos.
Uma diferença significativa (P = 0,0138) em medições de locais de injecção entre T01 (solução salina SC) versus T03 (60 mg SC) e T05 (15 mg SC) foi notada durante sete dias após a segunda vacinação. Uma diferença significativa foi encontrada entre T03 (60 mg SC) e T05 (15 mg SC) nos dias 23 até 27. Pelo Dia 34 (a observação de reavaliação de 74 duas semanas), nenhuma diferença foi notada entre quaisquer dos grupos
Quadro 26. Valores de significância para priori entre média de minimos quadrados das reacção do local de injecção. contrastes a medições de Dia de Estudo Contrastes (tratamento v. tratamento) valor de p 1 TO1v T03 0,0001 TO1v T05 0,0001 2 TOlv T03 0,0001 TO1v T05 0,0001 3 TOlv T03 0,0001 TOlv T05 0,0006 T03 v T05 0,0001 4 T01 v.T03 0,0001 TOlv T05 0,0214 T03 v T05 0,0001 5 TOlv T03 0,0001 T03v T05 0,0001 6 TOlv T03 0,0001 T03 v T05 0,0001 7 TOlv T03 0,0031 T03 v T05 0,0258 21 TOlv T03 0,0001 TOlv T05 0,0001 22 TOlv T03 0,0010 TOlv T05 0,0166 23 TOlv T03 0,0001 TOlv T05 0,0055 T03 v T05 0,0113 24 TOlv T03 0,0001 TOlv T05 0,0008 T03 v T05 0,000 25 T01 v T03 0,0001 T01 v T05 0,0067 T03 v T05 0,0001 75 (cont.) Dia de Estudo Contrastes (tratamento v. tratamento) valor de p 26 T01 v T03 0,0001 T01 v T05 0,0104 T03 v T05 0,0001 27 T01 v T03 0,0001 T01 v T05 0,0475 T03 v T05 0,0004
Somente contrastes significativos (P<0,05) são apresentados.
Temperatura Rectal
Medições de temperatura rectal são resumidas nos Quadros 27 e 28. 0 protocolo foi modificado de modo que dados de temperatura rectal não foram colhidos para os cães do Grupo II no Dia 22, portanto, sumário de dados do Dia 22 contém somente informação dos cães por grupo de tratamento no grupo I.
Quadro 27. Média de mínimos quadrados de temperatura rectal (aC)em cães em seguida a vacinação com solução salina ou p68 de Bordetella (após a primeira vacinação3)
Temperatura rectal ( °C)b Tratamento Dia do estudo 0 1 2 3 T01 solução salina SC 38, 5 38,4 38,3 38,2 T02 solução salina IM 38, 4 38,2 38,4 38,2 T03 60 pg SC 38, 4 38,5 38,2 38,3 T04 60 pg IM 38, 4 38,5 38,4 38,4 T05 15 pg SC 38,5 38,5 38,2 38,2 T06 15 pg IM 38,5 38,4 38,3 38,4 aVacinação n° 1 administrada no dia 20 b erro padrão = 0,09
Quadro 28. Média de mínimos quadrados de temperatura rectal (sC)em cães em seguida a vacinação com solução salina ou p68 de Bordetella (após a segunda vacinação3) 76
Temperatura Rectal ( °C)
Tratamento Dia de Estudo 20b 2 lb 22c 23b T01 solução salina SC 38,6 38,5 38,3 38,4 T02 solução salina IM 38,6 38,6 38,3 38,4 T03 60 pg SC 38,7 38,6 38,6 38,4 T0 4 60 pg IM 38,8 38,7 38,5 38,5 T05 15 pg SC 38,6 38,6 38,5 38,4 T06 151 pg IM 38,7 38,7 38,4 38,5 a vacinação N° 2 administrada no Dia 20 b erro padrão = 0,08 c erro padrão = 0,11_
Uma diferença significativa foi notada em temperaturas rectais entre T02 (solução salina IM) e T04 (60 mg IM) no
Dia 1 após a primeira vacinação. Nenhuma diferença significativa foi encontrada em temperaturas rectais entre qualquer grupo em qualquer dia após a segunda vacinação. Títulos de ELISA de p68
Os dados de ELISA de p68 pré-desafio são resumidos no Quadro 29. Devido à resposta de cães do Grupo I em T06 no Dia 19, um efeito devido ao grupo foi observado na análise de dados de títulos de ELISA de p68. O efeito foi pequeno e não influenciou outros pontos no tempo analisados. Portanto, os dados do Grupo I e II são combinados para propósitos de observação.
Devido à resposta de título considerável a p68 nos cães vacinados, vários mínimos de titulação foram utilizados em diferentes pontos no tempo no estudo. Titulações para os Dias -1 e 19 foram iniciadas em 50. Para os Dias 50 até 195, titulações começaram em 200. Titulações para amostras colhidas no Dia 201 e 211 foram iniciadas em 1000. Qualquer valor observado como "inferior a" foi dividido por 2 antes da análise. A subida incremental observada em valores de ELISA de p68 para grupos de controlo (T01 e T02) durante o curso do estudo é devido a 77 estes valores de titulação mínimos. Títulos de Aglutinação, excepto como foi indicado anteriormente, permaneceram <4.
Todos os cães vacinados com placebo tiveram títulos de p68 <200 no Dia 50. Todos os animais vacinados com p68 demonstraram pelo menos um aumento de quatro vezes em títulos após a segunda vacinação (Dia 0 vs. Dia 50) quando em comparação com animais vacinados com placebo.
Quadro 29. Média geométrica e erros padrão de titulos de diluição limite de ELISA de p68 em cães em seguida vacinação com p68 de Bordetella no Dia 0 e Dia 20._
Tratamento Dia de Estudo -Ia 19a 50b Média erro padrão Média erro padrão Média erro padrão T01 Solução salina SC 31,4 5, 06 30,5 4, 92 100,0 16, 14 T0 2 Solução salina IM 27, 7 4, 47 25,0 4, 03 100,0 16, 14 T03 P68 60 pg SC 29,8 4, 80 507,6 81,92 10633,5 1715,94 T0 4 P68 60 pg IM 26,7 4,31 249,7 40,29 4722,2 762,02 T05 P6815 pg SC 25,0 4, 03 268, 7 43,36 5622,8 907,35 T06 P6815 pg IM 33, 4 5, 40 91,8 14, 81 3528,9 569,46 aTítulos para os dias -1 e 19 iniciaram em 50. Qualquer valor observado como "inferior a" foi dividido por 2 antes da análise. bTítulos para o dia 50 iniciaram em 200. Qualquer valor observado como "inferior a" foi dividido por 2 antes da análise._
Diferenças significativas para média de mínimos quadrados de títulos de ELISA após a vacinação são colocados em lista no Quadro 30. Nenhuma diferença significativa em títulos de ELISA de p68 foi observada entre controlos SC e vacinados SC ou controlos IM e vacinados IM antes da vacinação (Dia -D · 78
Quadro 30. Valores de significância para contrastes a priori entre média dos minimos quadrados de títulos de diluição limite de ELISA de p68 após a vacinação._
Dia de estudo Contraste Valor de p 19 TOlv T03 0,0001 TOlv T05 0,0001 TO2 v TO4 0, 0001 T02 v T06 0,0001 T03 v T05 0,0061 TO4 v T06 0,0001 50 TOlv T03 0, 0001 TOlv T05 0,0001 T02 v T04 0,0001 T02 v T06 0,0001 T03 v T05 0,0059 Somente contrastes significativos (P < 0,05) são apresentados.
Os títulos de ELISA de p68 medidos durante o curso do estudo são resumidos no Quadro 31 e ilustrados na Figura 3.
Durante o curso do estudo, toda tentativa foi feita para coordenar actividades entre Grupos I e II. Para pontos no tempo de colheita de dados principais (isto é, eventos que circundam vacinação e desafio), isto foi alcançado. Em três exemplos durante o ínterim do estudo, a colheita de sangue e zaragatoa de traqueia variou em 1 ou 2 dias entre grupos. Com a finalidade de resumir e observar dados de ELISA de p68 para este período de ínterim, os dados destes dias foram combinados. Portanto, Dia 79 contém dados combinados do Dia 79 (Grupo I) e Dia 81 (Grupo II), Dia 111 corresponde ao dia 110 (Grupo II) e Dia 111 (Grupo I) e Dia 169 corresponde ao dia 169 (Grupo II) e Dia 170 (Grupo I). Pelo protocolo, análise de dados não foi realizada nos dados de ELISA de p68 além do Dia 50.
Quadro 31. Sumário de média geométrica de títulos de diluição limite de ELISA de p68 em cães não vacinados e 79 vacinados com p68 de Bordetella em seguida à vacinação e desafio por aerossol com Bordetella bronchiséptica Média geométrica de títulos de diluição limite de ELISA de p6 8a Tratamento Dias de estudob' 0 79 110 140 169 195 201 211 T01 Solução salina 100,00 154,92 106,00 108,59 117,18 109,14 500,0 SC T02 Solução salina 112,85 145,33 130,61 115,51 113,43 112,37 500,0 IM T03 60 gg SC 3434,24 2884,97 1861,64 1895,56 3097,24 2408,61 81564,79 T0 4 60 gg IM 1508,60 1164,81 933,12 987,64 1142,01 1547,87 59940,47 T0 5 15 gg SC 1699,20 1511,80 1229,35 1312,62 2248,63 2244,47 29869,29 T06 15 gg IM 974,18 916,21 573,51 876,15 1505,01 1458,16 11503,28 a Titulações Dias 50 até 195 , foram iniciadas em 200. Titulações para amostras colhidas no Dia 201 e 211 foram iniciadas em 1000. Qualquer valor observado como " inferior a" foi dividido por 2 antes da análise. b Vacinação N° 1 e N° 2 foi administrada no Dia 0 e 20, respectivamente. 0 desafio foi administrado no Dia 201. c Durante o curso do estudo, cada tentativa foi feita para coordenar actividades entre os Grupos I e II. Em três casos, a colheita de sangue para os grupos variou em 1 ou 2 dias. Os dados destes dias foram combinados para sumário de dados. A análise não foi feita em valores de ELISA de p68 de título colhidas além do Dia 50. Dia 79 corresponde aos dias 79 e 81, Dia 110 corresponde aos dias 110 e 111, Dia 169 corresponde aos dias 169 e 170.___
Observações de Tosse
Desafio por aerossol para ambos grupos ocorreu 181 dias em seguida à segunda vacinação. Para cumprir com recomendações de USDA, critérios de tosse foram modificados para observações aproximadamente em 45 minutos, aproximadamente doze horas em separado do terceiro até o oitavo dia em seguida ao desafio. As observações de tosse são resumidas nos Quadros 32 e 33. 80
Quadro 32. Percentagem média de pontos no tempo de tosse em cães não vacinados e vacinados com p68 Bordetella em seguida ao desafio por aerossol com Bordetella bronchiseptica__
Tratamento Número de Cães Média Erro padrão T01 Solução salina SC 11 75,44 o, “0 7, 73 T02 Solução salina IM 13 80,50 o, “0 6,64 T03 p68 60 pg SC 12 67,30 o, 0 8,12 T04 p68 60 pg IM 14 71,81 O "0 7,32 T05 p68 15 pg SC 10 36,30 o 0 9,19 T06 p68 15 pg IM 10 39,55 o 0 9,18
Quadro 33. Percentagem média de pontos no tempo de tosse por tratamento em cães não vacinados e vacinados com p68 de Bordetella em seguida ao desafio por aerossol com Bordetella bronchiseptica_
Parâmetro Estimativa Erro padrão média de Solução salina (T01 & T02) 78, 26 o o 5, 28 média de 60 pg/dose (T03 & T04) 69, 58 o 0 5, 68 média de 15 pg/dose (T05 & T06) 37, 92 o o 6, 70 A redução percentual na tosse quando em comparação com o controlo com solução salina foi 51,55 % para os grupos de 15 pg/dose e 11,09 % para os grupos de 60 pg/dose. Diferenças significativas estatísticas são resumidas no Quadro 34. 81
Quadro 34. Valores de significância para contrastes a priori entre média de minimos quadrados para percentagem de pontos no tempo de tosse
Contraste valor de p T01 V T05 0, 0041 T03 V T05 0, 0199 TO 2 V T06 0, 0019 TO 4 V T06 0, 0119 T01 & T02 V T05 & T06 0, 0001 (Somente contrastes significativos (P < 0,05) são apresentados.)
Amilóide A no soro
Os valores de SAA foram determinados nos dias 0, 1, 3, 5, 7 e 9 em seguida ao desafio. Os valores de Amilóide A no soro são apresentados no Quadro 35 e representados na Figura 4.
Quadro 35: Média geométrica e erros padrão de Titulos de Amilóide A no soro em cães não vacinados e vacinados com p68 Bordetella em seguida ao desafio por aerossol com Bordetella bronchiséptica TX 201 Média qeométrica e erros padrão de Títulos de Amilóide A a Dia de Estudo 202 204 206 208 210 Média Erro Média Erro Média Erro Média Erro Média Erro Média Erro padrão padrão padrao padrão padrao padrão T01 1, 1 0, 33 257,3 84,61 371, 6 116,44 548, 7 171, 93 68, 0 21, 31 9,4 2, 95 T02 1,0 0, 28 114,0 32,83 111,9 32,21 108,9 31,36 15, 6 4, 48 1, 7 0, 49 T03 0, 8 0, 25 135,7 40,55 119, 7 35, 75 74,5 22,25 10, 9 3,38 1,0 0, 30 T04 0, 8 0, 23 134, 7 39, 20 156, 0 43,59 174,8 48,86 34, 6 9,67 1,9 0, 54 T05 0, 8 0, 28 68,4 22,85 88,3 29,50 9,3 3,12 1,9 0, 64 2, 0 0, 66 T06 0, 8 0, 27 45,7 14,94 54,0 17,67 9,4 3,07 1,9 0, 63 0, 8 0, 27 adesafio administrado no dia 201, 82
Diferenças significativas em títulos de SAA sao resumidas no Quadro 36.
Quadro 36. Valores de slgnificância para contrastes a priori entre a média dos minimos quadrados de Titulos de Amilóide A no soro após o desafio.
Dia de estudo Contraste (tratamento v tratamento) valor de p 202 T01 v T05 0,0054 T02 v T06 0,0393 T04 v T06 0,0154 204 T01 v T03 0,0097 T01 v T05 0,0020 T04 v T06 0,0154 206 T01 v T03 0,0001 T01 v T05 0,0001 T02 v T06 0,0001 T03 v T05 0,0001 T04 V T06 0,0001 208 T01 v T03 0,0001 T01 v T05 0,0001 T02 v T06 0,0001 T03 v T05 0,0023 T04 v T06 0,0001 210 T01 v T03 0,0002 T01 v T05 0,0068
Somente contrastes significativos (P < 0,05) sao apresentados. 83
Discussão 0 estudo foi desenhado para demonstrar a segurança e eficácia de seis meses de uma vacina de p68 recombinante de Bordetella em cães. A segurança de ambas as vacinas de 15 pg/dose e 60 pg/dose foi demonstrada. A eficácia e duração de 6 meses de imunidade de 15 pg/dose foram bem suportadas no estudo. A segurança foi examinada utilizando observações de local de injecção e temperatura rectal. A análise das medições de reacção do local de injecção não demonstrou reacções nos grupos vacinados IM e reacções mínimas em ambos os grupos vacinados SC de 15 pg/dose e 60 pg/dose. As reacções que foram observadas tenderam a ser menores nos cães vacinados SC com 15 pg/dose. Tais reacções que foram vistas foram transitórias, geralmente resolvendo em 14 dias ou menos. 0 tamanho destas reacções seria mais provável de não serem notadas nos cães onde locais de injecção não foram tosquiados. As temperaturas rectais após a vacinação foram pouco notáveis e foram dentro de limites normais para todos os cães em todos os grupos. A eficácia e duração de imunidade foram examinadas 181 dias desde a vacinação utilizando observações de tosse e medição de títulos de diluição limite de ELISA de p68. A percentagem de tosse nos controlos de solução salina (78,26 %) indicou que o desafio administrado aos animais de estudo foi aceitável. Percentagem de pontos no tempo de tosse para o grupo de 15 pg/dose (37,92 %) demonstrou uma redução de 51,55 % na tosse quando em comparação com os controlos, satisfazendo os requisitos de eficácia impostos pela USDA. Nenhuma protecção foi demonstrada no grupo de 60 pg/dose (69,58 %) com cães o que demonstra redução mínima na tosse quando em comparação com os controlos.
Embora não tenha sido comparado estatisticamente, pode ser visto a partir dos Quadros 29 e 31 que vacinados SC tenderam a ter respostas mais altas de anticorpo quando em 84 comparação com vacinados IM. Para os propósitos da discussão, comentários adicionais em relação aos grupos de dose diferente combinam os resultados das vias de administração IM e SC.
Independentemente da via de administração, uma excelente resposta de anticorpo de p68 foi demonstrada em ambos os grupos vacinados pelo Dia 50 e foi mantida pelos vacinados ao longo do curso do estudo. Uma boa resposta anamnéstica foi observada em vacinados após o desafio.
Comparação da titulos de ELISA de p68 de 15 pg/dose e 60 pg/dose durante o curso do estudo indicou que o grupo de 60 pg/dose mostrou uma resposta de titulo ligeiramente mais alta (Figura 3). Esta resposta, embora excelente, não correlacionou-se com protecção em seguida ao desafio por aerossol. Respostas de titulo de ELISA de p68 foram variáveis em cães retirados do estudo com zaragatoas de traqueia positivas ou titulos de aglutinação crescentes. Três dos seis controlos retirados do estudo com culturas de zaragatoa de traqueia positivas e/ou titulos de aglutinação crescentes mantinham titulos de ELISA de p68 de <200. Parece não haver correlação de titulos de ELISA de p68 à zaragatoa de traqueia ou estado de titulo de aglutinação de cães retirados do estudo. A examinação da resposta de SAA em cães vacinados e não vacinados com p68 de Bordetella em seguida ao desafio indicou uma subida muito menor nos valores de SAA nos grupos de 15 pg/dose especialmente nos dias 5 e 7 pós-desafio.
Conclusões
Neste estudo, a eficácia de 15 pg/dose e 60 pg/dose de uma vacina de p68 de Bordetella canina foi examinada utilizando um modelo de desafio canino 6 meses após vacinação. Ambas as vacinas eram seguras como foi demonstrado pelas temperaturas rectais normais e reacções do local de injecção mínimas. Embora ambos os cães 85 vacinados com 15 pg/dose e 60mg/dose mostraram boa resposta serológica à vacinação como medida pelos títulos de ELISA de p68, a resposta não correlacionou-se com protecção clínica nos cães vacinados com 60 pg/dose. Os cães vacinados com 60 pg/dose não demonstraram diferença significativa na tosse quando em comparação com controlos não vacinados. Boa eficácia da vacina de 15 pg/dose foi demonstrada por uma redução 50 % maior na tosse quando em comparação com controlos. Postula-se que níveis aumentados de SDS na vacina de 60 pg/dose podem resultar na diferença demonstrada em protecção. A comparação de valores de SAA demonstrou uma diferença entre vacinados e controlos. EXEMPLO 4
Segurança e Eficácia de VANGUARD® Mais 5/CV-L VANGUARD@ Mais 5/CV-L é uma preparação liofilizada de estirpes atenuadas de vírus de CD, CAV-2, vírus de CPI, CPV, e culturas completas inactivadas de L. canicola e L. icterohaemorrhagiae, mais uma preparação líquida de CCV inactivada com um adjuvante. Todos os vírus foram propagados em linhas celulares estabelecidas. A fracção CPV foi atenuada por baixa passagem na linha celular canina que deu à mesma propriedades imunogénicas capazes de anular a interferência do anticorpo maternal nos níveis indicados no Quadro 38. O componente líquido foi utilizado para reidratar o componente liofilizado, que foi empacotado com gás inerte ao invés de vácuo. A avaliação de laboratório demonstrou que cães imunizados com VANGUARD® Mais 5/CV-L contra CD, ICH, CAV-2 e doença respiratória CPI, enterite causada por CCV e CPV, e leptospirose causada por L. canicola e L. icterohaemorrhagiae, e que não existiu interferência imunológica entre as fracções de vacina. Ensaios de segurança de campo extensivos mostrara que é segura e essencialmente livre de reacção em cães tão jovens quanto 6 semanas de idade sob condições normais de utilização. 86
Também demonstrou-se que vacina contra CAV-2 protege de forma cruzada contra ICH causadas por CAV-1. Estudos demonstraram que CAV-2 não somente protege contra ICH, mas contra doença respiratória CAV-2 também. Vírus de desafio Adenovírus canino tipo 2 não foi recuperado de cães vacinados contra CAV-2- em testes conduzidos. A fracção de CPV em VANGUARD® Mais 5/CV-L foi submetida a teste abrangente de segurança e eficácia. Foi mostrado que é segura e essencialmente livre de reacção em testes de laboratório e em ensaios clínicos sob condições de campo. A segurança do produto foi adicionalmente demonstrada por um estudo de retropassagem que incluiu a administração oral de múltiplas doses da estirpe da vacina a cães susceptíveis, todos dos quais permaneceram normais.
Investigação demonstrou que 3 doses da vacina com título de vírus CPV aumentado podem superar títulos de neutralização em soro (SN) associados a anticorpo maternal. Títulos de neutralização em soro tão baixos quanto 1:4 foram mostrados por outros que interferem com imunização activa utilizando vacinas vivas modificadas convencionais. Um ensaio clínico foi conduzido com cinquenta cachorros de 6 semanas de idade [25 vacinados (intervalo de título de SN -256) e 25 controlos não vacinados (intervalo de título de SN 4-1024)] (Quadro 37) . O grupo de vacinados recebeu 3 doses, com vacinações administradas com intervalo de 3 semanas começando com 6 semanas de idade. Após 1 vacinação, 13/25 cachorros exibiram um aumento de 4 vezes ou superior em título de SN de CPV (seroconversão) (Quadro 38). Doze destes 13 cachorros tinham títulos de SN maternais <1:16 no momento da primeira vacinação com o cãozinho restante a ter um título de SN de 1:64. Outros 9 cachorros com títulos de SN iniciais entre 1:16 e 1:256 seroconverteram após a segunda vacinação. Seus títulos de SN de anticorpo maternal declinaram até <1:64 no momento da segunda vacinação. De maneira similar, os últimos 3 vacinados, com títulos de SN 87 iniciais de 1:128, seroconverteram após a terceira vacinação, após seu titulo de CPV de anticorpo maternal cair a <1:64. Portanto, neste estudo, quando 3 doses de vacina foram administradas começando em 6 semanas de idade, todos os 25 vacinados, mesmo aqueles com os níveis mais altos de anticorpo maternal, tornaram-se activamente imunizados (GM = 1: 1176; intervalo de títulos de SN 128-4096) . todos os 50 cães foram desafiados 3 semanas após a terceira vacinação com um virus de desafio de CPV heterólogo. Catorze de 25 cães não vacinados de controlo morreram ou mostraram enfermidade grave o suficiente para justificar eutanásia, enquanto todos os 25 vacinados permaneceram essencialmente saudáveis. O vírus de vacina de alto título, baixa passagem em VANGUARD® Mais 5/CV-L foi portanto altamente imunogénico e capaz de estimular imunidade activa na presença de anticorpos maternos. A eficácia da fracção de CCV de VANGUARD® Mais 5/CV-L foi demonstrada num estudo de desafio de vacinação extensiva. Dezasseis cachorros de 7 a 8 semanas de idade foram vacinados com VANGUARD® Mais 5/CV-L (vacinados) e 17 com Vanguard® Mais 5/L (controlos). Todos os cachorros receberam três doses de 1 ml em intervalos de 3 semanas. Três semanas em seguida a terceira vacinação, os cachorros foram desafiados com uma estirpe virulenta de CCV(CV-6). Observações clínicas, temperaturas, pesos, e parâmetros de sangue foram monitorizados durante 21 dias em seguida a infecção. Vacinados CCV demonstraram uma redução na ocorrência de diarreia e quantidade de cobertura de CCV virulento quando em comparação com controlos. Em 21 dias após o desafio, a coloração fluorescente de anticorpo para CCV virulento de secções intestinal pequenas demonstraram uma redução significativa (P) em antigénio de CCV detectável entre vacinados contra CCV e controlos (Quadro 39) .
Quadro 37 Títulos Iniciais de Neutralização de soro (SN) de Vacinados e controlos Títulos de SN N° Vacinados Incluídos N° de Controlos Incluídos <1:2 3 0 1: 4 4 3 1: 8 1 3 1:16 4 1 1:32 2 5 1: 64 3 1 1:128 6 3 1:256 2 3 1:512 0 5 1:1024 0 1
Quadro 38. Média geométrica de Títulos de Neutralização de soro após a vacinação (SN) (Intervalo)3_
Grupos N Pré- vacinação Após a vacinação 1 2 3b Todos os cães 25 1:24 1:108 1:605 1:1176 vacinados (<2-256) (8-1024) (8-4096) (12 8->40 96) Respondedores 13 1:6 1:460 1:1745 1:1410 Após a Ia (<2—64) (64-1024) (256-4096) (256-4096) Vacinação Grupos N Pré- Após a vacinação vacinação 1 2 3b Respondedores 9 1:87 1: 20 1:376 1:1625 Após a 2a (16-256) (8-64) (256-1024) (256-4096) Vacinação Respondedores 3 1:128 1:32 1: 25 1:203 Após a 3a (128) (16-64) (8-64) (128-256 Vacinação 89 (cont.) Cães de 25 1:64 1:9 1:3 <1:2 controlo não (4-1024) (<2-64) (<2 6 4) «2-4) vacinados aos cães foram vacinados com 6, 9, e 12 semanas de idade. b títulos de SN Pré-desafio
Quadro 39. Coloração Fluorescente de Anticorpo de Pequenas Secções Intestinais 21 Dias Em seguida ao desafio
Secção de intestino % de Anticorpos de Caes Fluorescentes Positivos Vacinados Controlos Duodeno Je juno íleo 1 0 89 2 0 100 3 0 100 4 0 89 5 0 100 6 12,5 56 7 0 78 8 12,5 78 9 0 67 10 12,5 56
Conclusões
Neste estudo, um vacina de combinação com adjuvante que contém virus de CD, CAV-2, virus de CPI, CPV e culturas completas inactivadas de L. canicola e L. icterohaemorrhagiae e CCV, mostrou que era tanto segura como eficaz como uma vacina quando foi utilizada em cachorros. A vacina de combinação também mostrou que superava aos títulos de neutralização em soro (SN) associados a anticorpo maternal. EXEMPLO 5
ESTUDO DE IMUNOGENICIDADE de P68 DE BORDETELLA CANINA NATIVA
Animais 90 O estudo incluiu duas ninhadas de beagles SPF e duas ninhadas de cães de fonte aleatória. Os cães foram designados aleatoriamente a grupos vacinados ou não vacinados. O estudo incluiu um total de 10 cães vacinados e 11 não vacinados.
Preparação de Vacina experimental B. bronchispetica (estirpe 110H) foi colhida de placas de espalhamento de agar sangue Bordet-Gengou de 48 horas por lavagem da superfície da placa com 5 a 10 ml de tampão de extracção a quente. Alternativamente, as células crescida em ambas as culturas (meio definido de Charlotte Parker) foram colhidas por centrifugação descartando a fracção de sobrenadante. As células colhidas foram suspensas em 25 mM de Tris-HCL, pH 8,8 e incubadas em 60 °C durante 1 hora. Os detritos de células foi separado do extracto a quente por centrifugação em 20, 000 xg em 4 °C durante 30 minutos. Azida de sódio (0,01 %) foi adicionada à fracção de sobrenadante extraída a quente que foi então clarificada adicionalmente por meio de filtração microporosa. A resina de afinidade de anticorpo monoclonal foi preparada por meio de conjugação de anticorpo monoclonal (designada Bord 2-7) a Sepharose 4B activada com CNBr utilizando procedimentos padrão. Aproximadamente 30,35 mg de anticorpo monoclonal foi conjugado a 1 grama de resina de afinidade. A fracção de sobrenadante extraída a quente clarificada (acima) e resina de afinidade Bord 2-7 foram combinadas numa razão aproximada de 1 litro de extracto para 20 ml de resina.
Ligação da p68 nativa à resina foi facilitada pela incubação da mistura a temperatura ambiente, com agitação suave, durante a noite, seguido por sedimentação da resina e aspiração da fracção de sobrenadante. A resina foi então empacotada numa coluna de 2,6 cm de diâmetro e a coluna lavada sequencialmente com PBS, pH 7,5 e tampão fosfato a 91 10 mM, pH 8,0 numa taxa de fluxo de 5 ml/min. Quando absorbância em 280 nm alcançou um nível de linha de base, o material ligado foi eluído utilizando 100 mM de trietilamina e as fracções sob o único pico largo de 280 nm de absorbância foram colhidas e testadas para a presença de p68 por meio de ELISA. As fracções que contêm p68 foram agrupadas e submetidas a diálise contra PBS para retirar trietilamina.
Uma vacina experimental serial formulada foi formuladas para conter aproximadamente 100 microgramas de p68 purificada e 1 % de gel de hidróxido de alumínio. Formalina (0,01 %) foi utilizada como um conservante num volume de dose final de vacina de 1 mL.
Inoculo do desafio O material de desafio foi preparado essencialmente como é descrito nos exemplos anteriores.
Procedimento de Estudo
Vinte e um (21) cachorros seronegativos e de cultura negativa foram aleatoriamente designados a um de dois grupos de tratamento. Onze cães foram designados ao grupo controlo não vacinado, e dez cães ao grupo vacinado. O dia 0 foi designado como o dia da primeira vacinação. Um mL de vacina foi administrado subcutaneamente no Dia 0 e repetido 21 dias depois. O sangue foi colhido para ELISA serológico de p68 antes da primeira e segunda vacinação.
No Dia 35, catorze dias após a segunda vacinação, um desafio por aerossol de B. bronchiseptica foi administrado a todos os cães como foi descrito anteriormente. Os animais foram monitorizados para tosse durante 14 dias em seguida ao desafio como é descrito em exemplos anteriores. Resultados 0 sumário de observações clínicas e respostas serológicas a p68 são apresentadas no Quadro 40.
Quadro 40: Sumário de Clinica Observações e Respostas serológicas 92 GRUPO N NÚMERO TOSSE NORMAU TÍTULO TÍTULO TÍTULO EM DOIS DIAS TOTAL (GMT) (GMT) (GMT) CONSECUTIVOS PRÉ-VAX PRÉ- APÓS 0 DESAFIO DESAFIO VACINA 10 0 10/10 5, 08 348,15 391,30 CONTROLO 11 11 0/11 6, 10 6, 45 18,81
Discussão
Neste estudo, 10 de 10 cães de controlo tossiram em pelo menos dois dias consecutivos. Um cão é considerado clinicamente doente se tosse durante dois dias consecutivos. Por este critério, 100 % dos cães de controlo não vacinados estavam doentes. No grupo vacinado, um cão tossiu no dia 4 pós-desafio e um cão tossiu nos dias 4 e 6 pós-desafio. Dois cães tossiram no dia 14. Nenhum dos cães vacinados tossiram durante dois dias consecutivos. Portanto, 100 % dos cães no grupo vacinado com p68 nativa foram julgados que permaneceram normais em seguida ao desafio.
Conclusões
Este ensaio demonstra a habilidade de um vacina de p68 nativa proteger contra doença de B. bronchiseptica. EXEMPLO 6
Eficácia de vacinas caninas multivalentes contra desafio de Leptospira bratislava O propósito de este estudo foi demonstrar a eficácia de vacinas que contêm fracções a Leptospira serovars bratislava, canicola, grippotyphosa, icterohaemorrhagiae e pomona contra desafio de L. bratislava em cães.
MATERIAIS
Vacinas: as vacinas utilizadas foram as seguintes: 1. Uma vacina liofilizada que compreende antigénios de esgana canina, adenovirus tipo 2, parainfluenza, e parvovirus (VANGUARD ® MAIS 5) foi utilizada. A vacina continha niveis de antigénio de libertação. Código de produto 13D1.22 93 2. Uma vacina de coronavírus canino numa formulação de diluente liquido (FIRSTDOSE® CV) foi utilizada. A vacina continha níveis de antigénio de libertação. Código de produto 14P5.20
3. Uma vacina liofilizada que compreende antigénios de esgana canina, adenovírus tipo 2, parainfluenza, parvovírus, bratislava, canicola, grippotyphosa, icterohaemorrhagiae e pomona foi utilizada. A vacina contida aproximadamente 600 nephlos de cada Leptospira serovar; e níveis de antigénio de libertação das fracções de vírus vivos modificados (adenovírus canino, vírus da esgana, vírus parainfluenza, parvovírus). Código de produto 4637.2A
Animais de estudo: cachorros Beagle de aproximadamente 5-6 semanas de idade de qualquer sexo foram utilizados. Eles era seronegativos (< 1:8) a Leptospira serovars bratislava, canicola, grippotyphosa, icterohaemorrhagiae e Pomona em vacinação. Foram alimentados com ração comercial e água canalizada ad libitum.
Organismo de desafio: Cada animal foi administrado com uma dose de aproximadamente 2 mL (diluição 1CT1 de tecido de fígado de hamster infectado) de Leptospira bratislava como uma injecção intraperitoneal.
Desenho de estudo
Tit. N° . Descr. da Vacina* Via N°. de cães Dia de vac. Leptospir a Desafio** Dias de Amostra de colheita de sangue Dia Dose Diluição TI Controlo SQ 10 0 & 21 49 2 mL 1 O \—1 0, 21, 35, 48, 50, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70 94 (cont.)
Tit. N° . Descr. da Vacina* Via N°. de cães Dia de vac. Leptospir a Desafio** Dias de Amostra de colheita de sangue Dia Dose Diluição T2 Controlo IM 10 0 & 21 49 2 mL 10"1 0, 21, 35, 48, 50, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70 T3 Leptospira SQ 10 0 & 21 49 2 mL 10"1 0, 21, 35, 48, 50, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70 T4 Leptospira IM 10 0 & 21 49 2 mL 10_1 0, 21, 35, 48, 50, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70
PROCEDIMENTOS
Fase de vacinação: nos Dias de estudo 0 e 21, 40 cães em 4 grupos vacinados (10 animais/grupo) foram administrados com uma injecção do controlo ou vacinas de teste como resumido a seguir:
Tl: 1 mL de vacina de controlo que contém vacina contra esgana canina, adenovirus tipo 2, parainfluenza, parvovírus reconstituída com diluente de coronavírus canino e administrada por meio de injecção subcutânea (SQ). (Código de produto 13D1.22 reconstituída com Código de produto 14P5.20) T2: 1 mL de vacina de controlo que contém vacina contra esgana canina, adenovirus tipo 2, parainfluenza, parvovírus reconstituída com diluente de coronavírus canino e administrada por meio de injecção intramuscular 95 (ΙΜ). (Código de produto 13D1.22 reconstituída com Código de produto 14P5.20) T3: 1 mL de vacina de Leptospira que contém vacina contra esgana canina, adenovírus tipo 2, parainfluenza, parvovírus, bratislava, canicola, grippotyphosa, icterohaemorrhagiae e pomona reconstituída com diluente de coronavírus canino e administrada por meio de injecção SQ. (Código de produto 46J7.2A; uma combinação de Código de produtos 4637.2A e 14P5.20) T4: 1 mL de vacina de Leptospira que contém vacina contra esgana canina, adenovírus tipo 2, parainfluenza, parvovírus, bratislava, canicola, grippotyphosa, icterohaemorrhagiae e pomona reconstituída com diluente de coronavírus canino e administrada por meio de injecção IM. (Código de produto 46J7.2A; uma combinação de Código de produtos 4637.2A e 14P5.20)
As observações pós-vacinação para reacções adversas sistémicas foram feitas em aproximadamente 1 hora e 5 horas em seguida à vacinação.
Desafio de Leptospira: Nos Dias de estudo 49, os animais de teste foram desafiados via uma dose aproximada de 2 mL de L. bratislava by intraperitoneal injecção.
Amostra de colheita de sangue: As amostras de soro foram colhidas dos animais disponíveis nos Dias de estudo 0, 21, 35, 48, 50, 52, 55, 58, 61, 64, 67 e 70. De maneira similar, as amostras plasma foram colhidas nos Dias de estudo 48, 50, 52, 55, 58, 61, 64, 67 e 70.
Serologia bacteriana: Amostras de soro obtidas nos Dias de estudo 0, 21, 35, 48, 58 e 70 foram ensaiadas via um teste de microaglutinação para anticorpos em circulação contra L. bratislava.
Espiroquetemia: As amostras de plasma obtidas nos Dias de estudo 48, 50, 52, 55, 58, 61, 64, 67 e 70 foram examinadas por meio de microscopia de campo escuro para espiroquetas e cultivadas para re-isolamento de Leptospira. 96
Painel de Contagem de sangue completo / Química de soro: Amostras de plasma obtidas nos Dias de estudo 48, 50, 52, 55, 58, 61, 64, 67 e 70 foram ensaiadas para, mas não limitado a, contagens de plaqueta e taxa de sedimentação. As amostras de soro, obtidas em aqueles mesmos intervalos foram ensaiadas para, mas não limitado a, amilase, alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransaminase (AST) e creatinina. Um CBC e taxa de sedimentação não foi completado durante 2 animais (Nos. QPH3, RVG3) no Dia de estudo 55, para um animal (No. RBH3) no Dia de estudo 58, para 3 animais (Nos. OLH3, OUH3, PTG3) no Dia de estudo 61, nem para um animal (No. OWG3) no Dia de estudo 70 porque a amostra de plasma colhida coagulou antes do teste. No Dia de estudo 67, uma taxa de sedimentação não foi completada para 2 animais (Nos. OUH3, SAG3) porque a quantidade de amostra de plasma foi insuficiente para o teste. Esses inconvenientes não tiveram impacto nestes parâmetros de estudo.
Temperaturas corporais rectais: As temperaturas corporais rectais foram registadas nos Dias de estudo 47-70. Após o desafio (Dia de estudo 50), um temperaturas corporal elevada de > 39,2 C foi considerada indicativa de leptospirose.
Culturas de urina: As amostras de urina obtidas nos Dias de estudo 48, 55 e 70 foram cultivados para Leptospira, e submetidas a uroanálise. No Dia de estudo 48, uma uroanálise não foi completada para um animal (No. CBC3) já que a quantidade de urina disponível na colheita foi insuficiente para o teste. No Dia de estudo 55, uma uroanálise não foi completada para 2 animais (No. OPH3, RXG3) já que a quantidade de urina disponíveis na colheita foi insuficiente para o teste. No Dia de estudo 70, uma uroanálise não foi completada para 10 animais (Nos. OYG3, PIG3, PUG3, QHG3, QQH3, QSG3, RDG3, RUG3, RVG3, RYG3) já que as quantidades de urina disponíveis na colheita foram 97 insuficientes para o teste. Esses inconvenientes não tiveram impacto neste parâmetro de estudo.
Autópsia e Isolamento de Leptospira: Os animais submetidos a eutanásia durante ou na conclusão do período pós-desafio foram submetidos a autópsia. Fluidos corporais e tecidos (isto é, fígado, rim e urina) foram colhidas e submetidas a BCL para re-isolamento de Leptospira. No Dia de estudo 55, o re-isolamento bacteriano não foi completado para 2 animais (No. 0PH3, RXG3) já que a quantidade de urina disponível na colheita foi insuficiente para o teste. No Dia de estudo 70, o re-isolamento bacteriano não foi completado para 4 animais (Nos. 0YG3, PUG3, QSG3, RUG3) já que as quantidades de urina disponíveis na colheita foram insuficientes para o teste. Esses inconvenientes não tiveram impacto neste parâmetro de estudo.
Observações de saúde: os animais foram monitorizados diariamente para o estado de saúde geral.
SUMÁRIO DE DADOS E ANÁLISE
Os dados foram analisados com um modelo misto ou de categoria (SAS/STAT Software Changes and Enhancements através de disponibilização 6.12, SAS Institute, Cary, North Carolina) procedimento.
Um modelo misto de medidas repetidas linear geral (termos de modelo de efeito fixo são tratamento, dia de estudo, e tratamento por dia de estudo) foi utilizado para analisar temperatura, títulos de anticorpo em soro, contagem de plaquetas em sangue, taxa de sedimentação, amilase, alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransaminase (AST) e creatinina. Contrastes de interesse foram feitas após detectar um efeito de interacção tratamento ou tratamento por dia de estudo significativo (P < 0,05). Títulos foram transformados com log conforme foi apropriado para análise, e quando foram transformadas, as médias dos mínimos quadrados foram transformadas de volta a médias geométricas para 98 apresentação. As observações não analisadas (isto é, resultados de autópsia e observações pós-vacinação) não foram introduzidas na base de dados para sumário.
As distribuições de frequência de animais com contagens de plaqueta <200 pelo menos uma vez e animais com temperaturas rectais maior que ou igual a 39,2 C foram calculadas para cada tratamento.
Os animais foram classificados como normal ou doentes em cada dia pós-desafio durante o estudo. A presença de quaisquer dos seguintes sinais resultou numa classificação de doente: conjuntivite, depressão, inapetência, tremores musculares, descarga nasal, pirexia (> 39,2 C) ou olhos lacrimejantes.
Um modelo misto linear geral (termo de modelo de efeito fixo é tratamento) foi utilizado para analisar o número de dias pós-desafio que um animal foi classificado como doente. A variável binomial morto ou submetido a eutanásia foi analisada com Teste Exacto de Fisher. A espiroquetemia, e o re-isolamento de bactérias na urina, rim e fígado foram analisados utilizando Teste Exacto de Fisher para comparar grupos de tratamento.
Na ausência de uma diferença significativa entre as vias de administração e via por interacção de tratamento (P(>0,05 bilateral), contrastes foram utilizados para comparar a média de tratamentos TI e T2 com a média de tratamentos T3 e T4 (P < 0,05 unilateral). Se a análise foi um análise de medidas repetidas, então a comparação foi feita em cada ponto no tempo dado foi colhida. De outra maneira, contrastes foram utilizados para comparar TI com T3 e T2 com T4 (P < 0,05 unilateral). Estas comparações foram feitas em cada ponto no tempo se a análise foi uma de medições repetidas. A eficácia da vacina de Leptospira contra L. bratislava foi demonstrada por uma baixa incidência (P < 0,05, unilateral) de enfermidade nos animais vacinados. As 99 seguintes variáveis suportaram a eficácia da vacina de
Leptospira: (1) A média de contagem de plaquetas foi significativamente (P < 0,05, unilateral) maior para os vacinados; (2) A média de taxa de sedimentação foi significativamente (P < 0,05, unilateral) menor para os vacinados; (3) A incidência de espiroquetemia foi significativamente (P < 0,05, unilateral) reduzida para os vacinados.
RESULTADOS
Sinais clínicos Pós-Desafio: O número médio de dias que os animais de teste mostraram sinais clínicos indicativa de leptospirose (por exemplo, conjuntivite, depressão, diarreia, hematúria, icterícia, inapetência, estar moribundo, tremores musculares, pirexia, vómito) é apresentada no Quadro 1. Após o desafio (Dias de estudo 50-70), o número médio de dias que os controlos de TI e T2 estavam doentes foi de 4,3 e 3,3, respectivamente. De modo inverso, as médias para os vacinados T3 e T4 foram 0,7 e 0,5, e esse resultados foram significativamente melhorados (P < 0,05) quando em comparação com os controlos T1-T2. A percentagem de animais que apresentam sinais clínicos pós-desafio é também proporcionada no Quadro 1. Os sinais de Leptospirose foi mostrados em 75 % dos controlos T1-T2, enquanto sinais similares foram observadas para somente 30 % dos vacinados T3-T4. O número de animais infectados que necessitaram eutanásia durante o fase do estudo de desafio é também apresentado no Quadro 1. Cinco animais (25 %) nos grupos de controlo T1-T2 mostraram sinais graves de leptospirose e foram submetidos a eutanásia. De modo inverso, os vacinados T3-T4 permaneceram de outra maneira saudáveis durante o mesmo intervalo, e essa comparação (Tl-T2vs T3-T4) foi significativamente melhorada (P < 0,05) para os vacinados. Um representação de temperaturas corporais médias pós-desafio é apresentada no Quadro 2. Durante os 9 dias iniciais após o desafio (Dias de estudo 100 50-58), as temperaturas médias para os controlos T1-T2 variaram desde 37,8 a 39,4 °C. Durante o mesmo intervalo, as temperaturas médias para os vacinados T3-T4 variaram desde 38,2 a 38,7 C. De maneira notável, as temperaturas médias para os vacinados T3-T4 foram significativamente menores (P < 0,05) em 2, 3 e 5 dias pós-desafio quando em comparação com as temperaturas médias de T1-T2. A frequência de animais com pelo menos ums temperatura > 39,2 C é também apresentads no Quadro 2. Ums temperatura corporal elevada de > 39,2 C foi considerada indicativa de infecção por Leptospira. Durante o curso do período de observação pós-desafio, 60-70 % dos controlos T1-T2 apresentou uma temperatura de > 39,2 C. De modo inverso, somente 30 % dos vacinados T3-T4 apresentou esse sinal clínico.
Espiroquetemia Pós-Desafio: A frequência de espiroquetemia é apresentada no Quadro 3. A presença de espiroquetas no sangue (detectada via cultura bacteriana) é um resultado clínico que demonstra leptospirose. Um dia após o desafio (Dia de estudo 50), a espiroquetemia foi estabelecida em 90 % dos controlos Tl, 60 % dos controlos T2, 60 % dos vacinados 13 e 70 % dos vacinados T4. O re-isolamento bacteriano foi esperado do sangue em 24 horas após as injecções intraperitoneal independentemente do estado de vacinação. Depois disso, espiroquetemia foi estabelecida para os controlos Tl como segue: 100 % no Dia 3 pós-desafio (Dia de estudo 52), 56 % no Dia 6 (Dia de estudo 55) e 33 % no Dia 9 (Dia de estudo 58) . De maneira similar, a espiroquetemia foi estabelecida para os controlos T2 como segue: 60 % no Dia 3 pós-desafio, 50 % no Dia 6 e 29 % no Dia 9. De modo inverso, a mesma não foi estabelecida nos vacinados T3-T4 durante o mesmo período pós-desafio nem durante o restante do período pós-desafio (isto é, Dias de estudo 50-70). 101
Em geral, a percentagem de animais que foram positivos para espiroquetemia incluindo um dia pós-desafio (Dias de estudo 50-70) foi de 60 % -100 % para os controlos T1-T2 e de 60 %-70 % para os vacinados T3-T4. Em contraste, a percentagem de animais que foram positivos excluindo um dia pós-desafio (Dias de estudo 52-70) foi de 60 % - 100 % para os controlos T1-T2 e de 0 % ara os vacinados T3-T4.
Leptospira Re-Isolamento de Fluidos corporais e Tecidos Pós-Desafio: o re-isolamento de Leptospira a partir de amostras de sangue, urina, rim e fígado é apresentada no Quadro 4. Um sumário dos resultados de re-isolamento de Leptospira a partir do sangue é proporcionado na secção anterior. Começando em 3 dias pós-desafio (isto é, excluindo o dia 1 pós-desafio), a espiroquetemia foi estabelecida em 60-100 % dos controlos T1-T2, e não foi estabelecida nos vacinados T3-T4 durante o mesmo período. De maneira notável, essa comparação (T1-T2 vs T3-T4) foi significativamente melhorada (P < 0,05) para os vacinados.
As amostras de rim foram colhidas na autópsia. Leptospira foi re-isolada de 50 % das amostras de rim obtida dos controlos TI e T2. A mesma não foi re-isolada a partir de amostras derivadas dos vacinados T3-T4. Essa comparação (T1-T2 vs T3-T4) foi significativamente melhorada (P < 0,05) para os vacinados.
As amostras de fígado foram colhidas na autópsia. Leptospira foi re-isolada de 10 % e 20 % das amostras de fígado obtidas dos controlos TI e T2, respectivamente. A mesma não foi re-isolada a partir da amostras derivadas dos vacinados T3-T4. Essa comparação (T1-T2 vs T3-T4) foi significativamente melhorada (P<0,05) para os vacinados.
As amostras de urina foram colhidas em 2 intervalos pós-desafio e na autópsia. Leptospira foi re-isolada de 2 controlos TI em 6 dias pós-desafio (Dia de estudo 55) . Leptospira não foi re-isolada de qualquer amostra para os controlos T2 nem vacinados T3-T4. 102
Contagens de plaqueta Pós-Desafio: As médias de contagens de plaqueta são apresentadas no Quadro 5. Uma diminuição no número de plaquetas no sangue (trombocitopenia) é um resultado clinico indicativo de leptospirose. As concentrações médias para os controlos Tl-T2 variaram entre 61 e 937. Durante o mesmo intervalo, a média de contagens para os vacinados T3-T4 variou entre 400 e 566. De maneira notável, as contagens de plaqueta para os vacinados T3-T4 foram significativamente melhoradas (P < 0,05) em 3, 6 e 9 dias pós-desafio quando em comparação com os controlos T1-T2. A frequência de animais com pelo menos uma contagem de plaquetas < 200 é também apresentada no Quadro 5. Durante o curso do período pós-desafio, 90 % dos controlos Tl e 60 % dos controlos T2 foram determinados como sendo trombocitopénicos (contagem de plaquetas < 200). De modo inverso, somente 10 % dos vacinados T3 e nenhum dos vacinados T4 eram trombocitopénicos pós-infecção.
Taxas de sedimentação Pós-Desafio: As médias de taxas de sedimentação são apresentadas no Quadro 6. Um aumento em taxa de sedimentação é um resultado clínico indicativo de leptospirose.
As taxas médias para os controlos T1-T2 variaram entre 2,4 e 16,0. Durante o mesmo intervalo, as taxas médias para os vacinados T3-T4 variaram entre 1,5 e 6,3. De maneira notável, as taxas para os vacinados T3-T4 foram significativamente menores (P<0,05) em 3, 6, 9, 12, 15, 18 e 21 dias pós-desafio quando em comparação com os controlos T1-T2.
Concentrações de ALT Pós-Desafio: As concentrações de alanina aminotransferase (ALT) médias são apresentadas no Quadro 7. Um aumento em ALT é um resultado clínico indicativo de infecção bacteriana (isto é, à medida que a função hepática deteriora, os níveis de ALT elevam-se). As concentrações médias para os controlos T1-T2 variaram entre 103 22 e 79. Durante o mesmo intervalo, As concentrações médias para os vacinados T3-T4 variaram entre 21 e 61. De maneira notável, as concentrações para os vacinados T3-T4 foram significativamente menores (P < 0,05) em 3, 6, 9 e 12 dias pós-desafio quando em comparação com os controlos T1-T2.
Concentrações de creatinina Pós-Desafio: As concentrações de creatinina médias são apresentadas no Quadro 8. Um aumento em concentrações de creatinina é um resultado clinico indicativo de infecção bacteriana (isto é, à medida que a função renal deteriora devido a leptospirose, os níveis de creatinina níveis elevam-se). As concentrações médias para os controlos TI (isto é, administração SQ) variaram entre 0,30 e 99. Durante o mesmo intervalo, as concentrações médias para os vacinados T3 (isto é, administração SQ) variaram entre 0,26 e 0,40. De maneira notável, as concentrações para os vacinados T3 foram significativamente menores (P < 0,05) em 1, 6, 9, 12, 15, 18 e 21 dias pós-desafio quando em comparação com os controlos Tl. As concentrações médias par aos controlos T2 (isto é, administração IM) variaram entre 0,30 e 1,31. Durante o mesmo intervalo, as concentrações médias para os vacinados T4 (isto é, administração IM) variaram entre 0,32 e 0,46. Não existiram diferenças significativas entre os valores pós-desafio de T2 e T4.
Amilase, AST e Uroanálise Pós-Desafio: Não existiram diferenças significativas nas concentrações médias para os vacinados T3-T4 em comparação com os controlos T1-T2. No entanto, em geral as concentrações pós-desafio foram mais drasticamente aumentadas para os controlos T1-T2. De modo geral, as mudanças pós-desafio em resultados de AST (aspartato aminotransaminase) e uroanálise não foram observadas para os animais de teste Tl- T4. Os resultados para estes 3 parâmetros não são de outra maneira tabulados no presente documento. 104 Títulos de anticorpo em soro: Títulos de anticorpo em soro médios contra L. bratislava são apresentados no Quadro 9. Durante a fase de vacinação da investigação (Dias de estudo 0-48), os títulos médios para os controlos T1-T2 eram aproximadamente 2 (isto é, seronegativos). De modo correspondente, as médias para os vacinados T3-T4 variaram entre 2 (pré-vacinação) e 1181 (pós-vacinação). De maneira notável, os títulos médios para os vacinados T3-T4 foram significativamente maiores (P < 0,05) em 21, 35 e 48 dias pós-vacinação quando em comparação com os títulos médios para ΤΙ- T2.
Durante a fase de desafio da investigação (Dias de estudo 58 & 70), os títulos médios para os controlos T1-T2 variaram entre 2135 e 41160. De modo correspondente, os títulos médios para os vacinados T3 e T4 variaram entre 727 e 10891, e foram significativamente menores (P < 0,05) nos Dias de estudo 58 (isto é, 9 dias pós-desafio) e 70 dias pós- vacinação (isto é, Dia 21 PC) quando em comparação com o controlos T1-T2. Como um resultado, os controlos demonstraram um resposta primária drástica contra L. bratislava pós-desafio (isto é, infecção estabelecida), enquanto a resposta para os vacinados T3-T4 foi menos robusta (isto é, resposta anamnéstica típica).
Reacções Sistémicas Pós-Vacinação: Nenhuma reacção sistémica pós-vaccinal foi observada nos animais de teste T1-T4 quando foram avaliados em aproximadamente 1 e 5 horas após as vacinações primárias e de reforço. Esse resultado não é tabulado no presente documento.
CONCLUSÃO A eficácia de uma vacina multivalente de Leptospira administrada por meio de injecção SQ ou IM contra L. bratislava foi demonstrada pós-desafio por, entre outros: (1) uma incidência significativamente menor de enfermidade associada a Leptospira, (2) uma incidência significativamente menor de espiroquetemia, (3) contagens 105 significativamente maiores de plaquetas, e (4) taxas de sedimentação médias significativamente menores, quando em comparação com controlos.
Grupo de Tratamento (Vacinado) No. de Animais Desafiados Número de Dias que mostram Sinais clínicos de Leptospirose Pós- Desafio Percentagem de Animais com Sinais clínicos Pós- Desafio 1 Percentagem de Animais Infectados que necessitam Eutanásia médiat Mínimo Máximo TI CONTROLO (SQ) 10 4,3 0 9 90 % N = 9/10 10 % N = 1/10 T2 CONTROLO (IM) 10 3,3 0 10 60 % N = 6/10 40 % N = 4/10 T3 LEPTO VACINA (SQ) 10 O 0 4 30 % N = 3/10 0 % N 0/10 T4 LEPTO VACINA (IM) 10 LO O 0 3 30 % N = 3/10 0 % N 0/10
Quadro 41: Sumário de sinais clinicos após o desafio com L. bratislava para os cães imunizados com uma vacina de controlo ou multivalente de Leptospira_
Percentagem ou médias dos mínimos quadrados do tratamento. A média dos controlos (T1-T2) é significativamente diferente (P < 0,05) da média dos vacinados (T3-T4)_ 106
Quadro 42: Temperatura corporal média após o desafio com L. bratislava para os cães imunizados com uma vacina de controlo ou multivalente Leptospira
Frequência ( %) com Temperaturas médias Por dia de estudo** (dia pós-desafio) Grupo de Tratamento (Vacinado) uma 49 (0) 50(1) 51 (2)‘ 52 (3)1 53 (4) 54 (5)' 55 (6) 56 (7) 57 (8) 58 (9) Temperatura > 39,2 °C 38,1 1 38,6 39,4 38,9 38,5 38,8 38,6 38,2 38,2 38,3 70 TI CONTROLO (SQ) H = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 9 N = 9 N = 9 N = 9 N = 9 H = 7/10 38,3 38,5 39,4 38,9 38,7 38,6 38,3 37,8 38,2 38,1 60 T2 CONTROLO (IM) H = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 8 N = 8 N = 8 N = 7 N = 7 N = 6/10 38,2 38,4 38,5 38,3 38,7 38,5 38,5 38,2 38,5 38,4 30 T3 LEPTO VACINA (SQ) N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 3/10 38,2 38,5 38,5 38,3 38,5 38,5 38,3 38,3 38,4 38,6 30 T4 LEPTO VACINA (IM) H = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 3/10 ** média de mínimos quadrados de tratamento. N = número de animais, ou número com uma temperaturas pós-desafio > 39,2 C / número de animais. média dos controlos (T1-T2) é sígníficativamente diferente (P < 0,05) da média dos vacinados (T3-T4). w
Quadro 43: Frequência de espiroqueteiia após o desafio coi L, bratislava para os cães imunizados com uma vacina de controlo ou multivalente de Leptospira
Grupo de Tratamento Frequência ( %) de Espiroquetemia Por dia de estudo** (dia pós-desafio) Vacinado) 48 (-1) 50 (1) 52 (3) 55 (6) 58 (9) 61 (12) 64(15) 67 (18) 70 (21) TI C0NIR0L0 (SO) 0 N = 0/10 50 N = 9/10 100 N = 10/10 56 N = 5/9 33 N = 3/9 0 N = 0/9 0 N = 0/9 0 N = 0/9 0 N = 0/9 12 C0NIR0L0 (IM) 0 N = 0/10 00 N = 6/10 60 N = 6/10 50 N = 4/8 29 N = 2/7 0 N = 0/6 0 N = 0/6 0 N = 0/6 0 N = 0/6 13 LEP10 VACINA (SO) 0 N = 0/10 60 N = 6/10 0 N = 0/10 0 N = 0/10 0 N = 0/10 0 N = 0/10 0 N = 0/10 0 N = 0/10 0 N = 0/10 14 LEPTO VACINA (IM) 0 N = 0/10 00 N = 7/10 0 N = 0/10 0 N = 0/10 0 N = 0/10 0 N = 0/10 0 N = 0/10 0 N = 0/10 0 N = 0/10 **N = número positivo para espiroquetemia / número de animais. 108
Quadro 44: Frequência de re-isolamento de Leptospira a partir de fluidos corporais e tecidos após o desafio com L. Bratislava para os cães imunizados com uma vacina de controlo ou multivalente de Leptospira
Frequência (%) de Re-Isolamento de Leptospira a partir de fluidos corporais e tecidos** Grupo de Tratamento (Vacinado) Sangue1 Urina Rim11 Fígado11 Incluindo Dia+1 pós-desafio Excluindo Dia+1 pós-desafio 11 Tl CONTROLO (SQ) 100 N = 10/10 100 N = 10/10 22 N = 2/9 50 N = 5/10 10 N = 1/10 T2 CONTROLO (IM) 60 N = 6/10 60 N = 6/10 0 N = 0/7 50 N = 5/10 20 N = 2/10 T3 LEPTO VACINA (SQ) 60 N = 6/10 0 N = 0/10 0 N = 0/10 0 N = 0/10 0 N = 0/10 T 4 LEPTO VACINA (IM) 70 N = 7/10 0 N = 0/10 0 N = 0/10 0 N = 0/10 0 N = 0/10 **N = número positivo para espiroquetemia / número de animais tBactérias esperadas na corrente sanguínea em 24 após a injecção intraperitoneal independentemente do estado de vacinação. Portanto, os dados de re-isolamento também são resumidos excluindo os resultados obtidos a 1 dia pós-desafio (estudo do dia 50) lfcA média dos controlos (Tl - T2) é significativamente diferente (P < 0,05) da média dos vacinados (T3-T4).
Quadro 45: Média da contagem de plaquetas após o desafio com L. bratislava para os cães imunizados com um controlo ou vacina multivalente de Leptospira 109 109 Grupo de Tratamento (Vacinado) Média de Contagem de plaquetas Por dia de estudo** (dia pós-desafio) Frequência ( %) com uma Contagem de plaquetas <200 48 (D 50 (1) 52 (3)t 55 (6) 58 (9)1 61 (12) 64 (15) 67 (18) 70 (21) TI CONTROLO (SQ) 534 N = 10 426 N = 10 61 N = 10 128 N = 8 499 N = 8 937 N = 9 724 N = 9 586 N = 9 490 N = 8 90 N = 9/10 T2 CONTROLO (IM) 549 N = 10 451 N = 10 174 N = 10 204 N = 8 480 N = 7 738 N = 5 735 N = 6 604 N = 6 498 N = 6 60 N = 6/10 T3 LEPTO VACINA (SQ) 557 N = 10 450 N = 10 463 N = 10 560 N = 10 538 N = 10 506 N = 9 490 N = 10 458 N = 10 465 N = 10 10 N = 1/10 T 4 LEPTO VACINA (IM) 521 N = 10 442 N = 10 400 N = 10 552 N = 9 566 N = 10 483 N = 9 478 N = 10 472 N = 10 472 N = 10 0 N = 0/10 ** Média de mínimos quadrados do tratamento. N = número de animais, ou número com uma
Contagem de plaquetas pós-desafio <200 / número de animais. la média dos controlos (T1-T2) é significativamente diferente (P < 0,05) da média dos vacinados (T3-T4) ,_
Quadro 46: Taxas de sedimentação após o desafio com L. bratislava para os cães imunizados com uma vacina de controlo ou multivalente de Leptospira
Grupo de Tratamento (Vacinado) Média das taxas de Sedimentação Por dia de estudo** (dia pós-desafio) 48 (-1) 50 (1) 52 (3)t 55 (6)t 58 (9)fc 61 (12)t 64 (15)t 67 (18)1 70 (21)1 τι CONTROLO (SQ) 1,3 N = 10 6,7 N = 10 10,4 N = 10 9,0 N = 8 6, 8 N = 8 4,5 N = 9 4,6 N = 9 3, 0 N = 9 2,4 N = 8 T2 CONTROLO (IM) 1,2 N = 10 5,7 N = 10 10,2 N = 10 9,7 N = 8 16,0 N = 7 5,9 N = 5 5,1 N = 6 3, 6 N = 6 3, 3 N = 6 110 (cont.)
Grupo de Tratamento (Vacinado) Média das taxas de Sedimentação Por dia de estudo** (dia pós-desafio) 48 (-1) 50 (1) 52 (3)t 55 (6)1 58 (9)1 61 (12)1 64 (15)1 67 (18)1 70 (21)1 T3 LEPTO VACINA (SQ) 1, 1 N = 10 5, 3 N = 10 2, 9 N = 10 3, 0 N = 10 3, 3 N = 10 2,3 N = 9 2, 1 N = 10 1, 9 N = 9 1, 5 N = 10 T4 LEPTO VACINA (IM) 1, 3 N = 9 6,3 N = 10 3, 8 N = 10 4, 3 N = 9 3, 9 N = 10 2, 0 N = 9 2, 4 N = 10 2, 5 N = 9 2, 1 N = 10 ** Média de mínimos quadrados do tratamento. N = número de animais. tA média dos controlos (T1-T2) é significativamente diferente (P < 0,05) da média dos vacinados (T3-T4).
Quadro 47: Média de concentrações de ALT (alanina aminotransferase) após o desafio com L. bratislava para os cães imunizados com uma vacina de controlo ou multivalente de Leptospira
Grupo de Tratamento (Vacinado) Concentrações de ALT Por dia de estudo** (dia pós-desafio) 48 (-1) 50 (1) 521 (3) 551 (6) 581 (9) 611 (12) 64 (15) 67 (18) 70 (21) TI CONTROLO (SQ) 33 N = 10 66 N = 10 79 N = 10 32 N = 9 34 N = 9 26 N = 9 24 N = 9 22 N = 9 24 N = 9 T2 CONTROLO (IM) 35 N = 10 60 N = 10 63 N = 10 30 N = 8 32 N = 7 34 N = 6 26 N = 6 24 N = 6 24 N = 6 T3 LEPTO VACINA (SQ) 30 N = 10 57 N = 10 27 N = 10 22 N = 10 23 N = 10 22 N = 10 23 N = 10 21 N = 10 22 N = 10 T 4 LEPTO VACINA (IM) 32 N = 10 61 N = 10 30 N = 10 22 N = 10 25 N = 10 26 N = 10 26 N = 10 24 N = 10 25 N = 10 ** Média de mínimos quadrados do tratamento. N = número de animais. 1 A média dos controlos (T1-T2) é significativamente diferente (P < 0,05) da média dos vacinados (T3-T4) 111 Quadro 48: Média de Concentrações de creatinina após o desafio com L. Bratislava para os cães imunizados com uma vacina de controlo ou multivalente de Leptospira
Grupo de Tratamento Média de Concentrações de creatinina desafio) Por dia de estudo** (dia pós- (Vacinado) 48 (-1) 50 (1) 52 (3) 55 (6) 58 (9) 61 (12) 64 (15) 67 (18) 70 (21) TI CONTROLO 0,32a 0,33a 0, 30a 0, 80a 0, 99a 0, 70a 0, 63a 0, 52a 0, 39a (SQ) N = 10 N = 10 N = 10 N = 9 N = 9 N = 9 N = 9 N = 9 N = 9 T3 LEPTO 0,31a 0,26b 0, 32a 0, 37b 0, 39b 0, 33b 0, 40b 0, 36b 0, 27b VACINA (SQ) N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 T2 CONTROLO 0,31a 0,33a 0, 30a 1, 318 1, 08a 0, 51a 0, 51a 0, 42a 0, 30a (IM) N = 10 N = 10 N = 10 N = 8 N = 7 N = 6 N = 6 N = 6 N = 6 T 4 LEPTO 0,33a 0,32a 0, 33a 0, 41a 0, 43a 0, 36a 0, 46a 0, 39a 0, 32a VACINA (IM) N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 ** Média de mínimos quadrados do tratamento. N = número de animais. a,bValores em colunas (para TI vs T3 e T2 vs T4) com diferentes sobrescritos são significativamente diferentes (P < 50,05)._
Quadro 49: Média de soro de títulos de anticorpo contra L. bratislava para os cães imunizados com uma vacina de controlo ou multivalente de Leptospira_
Grupo de Tratamento (Vacinado) Média de títulos de anticorpo contra L. bratislava ** pós-vacinação) (estudo dia 0 21b 35b 48b 58b 70b TI CONTROLO (SQ) 2 N = 10 3 N = 10 2 N = 10 2 N = 10 41160 N = 9 4770 N = 9 T2 CONTROLO (IM) 2 N = 10 2 N = 10 2 N = 10 3 N = 10 22571 N = 7 2135 N = 6 LEPTO 2 56 1032 159 10891 1106 T3 VACINA (SQ) N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 LEPTO 2 97 1181 257 8819 727 T4 VACINA (IM) N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 N = 10 112 ** Médias geométricas do tratamento. N = número de animais. tA média dos controlos (T1-T2) é significativamente diferente (P < 0,05) da média dos vacinados (T3-T4) LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Frantz, Joseph C. Tucker, cassius M. Newby, Thomas J.
<120> VACINAS CANINAS CONTRA BORDETELLA BRONCHISÉPTICA
<130> PC32220A <140> 60/443.418 <141> 2003-01-29 <16 0>3
<170> Patentln versão 3.2 <210> 1 <211>6 0 2 <212> PRT <213> Bordetella bronchiseptica <400> 1 113
Asp Pro Asn Thr vai ser Ile Ile Lys Ala Gly Glu Arg Gin His Gly 15 10 15
Ile His Ile Lys Gin Ser Asp Gly Ala Gly Vai Arg Thr Ala Thr Gly 20 25 30
Thr Thr ile Lys vai Ser Gly Arg Gin Ala Gin Gly vai Leu Leu Glu 35 40 45
Asn Pro Ala Ala Glu Leu Arg Phe Gin Asn Gly ser vai Thr ser Ser 50 55 60
Gly Gin Leu Phe Asp Glu Gly vai Arg Arg Phe Leu Gly Thr vai Thr 65 70 75 80 val Lys Ala Gly Lys Leu vai Ala Asp His Ala Thr Leu Ala Asn vai 85 90 95 ser Asp Thr Arg Asp Asp Asp Gly Ile Ala Leu Tyr val Ala Gly Glu 100 105 110
Gin Ala Gin Ala Ser Ile Ala Asp ser Thr Leu Gin Gly Ala Gly Gly 115 120 125
Val Arg val Glu Arg Gly Ala Asn val Thr val Gin Arg Ser Thr Ile 130 135 140
Val Asp Gly Gly Leu His Ile Gly Thr Leu Gin Pro Leu Gin Pro Glu 145 150 155 160
Asp Leu Pro pro ser Arg val val Leu Gly Asp Thr ser val Thr Ala 165 170 175 val Pro Ala ser Gly Ala Pro Ala Ala Val Ser val Phe Gly Ala Asn 114
ISO 1S5 ISO
Glu LêU Thr Vai ASp Gly Gly HÍS lie Thr Gly Gly Arg Ala Ala Gly 195 200 205 Vai Ala Ala Met ASp Gly Ala lie val «is Leu Glo Arg Ala thr Ile 210 215 220 Arg 225 Arg Gly Asp Ala Pro 230 Ala Gly Gly Ala val 235 Pro Gly Gly Ala val 240 Pro Gly Gly Phe φι Pro Leu teu Asp Gly Trp Tyr Gly val ASP val 245 2$Q 255 ser Asp Ser Thr Val ASp Leu Ala Gin ser ile val Glu Ala pro Gin 260 265 270 teu Gly Ala 2?S Ala Ile Arg Ala Gly 280 Arg Gly Ala Arg val 285 Thr val ser Gly Gly 290 Ser teu Ser Ala Pro 295 His Gly Asn Val Xle 300 Glu Thr Gly Gly Gly Ala Arg Arg Phe Pro Pro Pro Ala Ser Pro Leu Ser Ile Thr Leu 305 310 315 320 Arg Ala sly Ala Arg 325 Ala Gllt Gly Arg Ala 330 teu teu Tyr Arg val 335 Leu pro Glu pro vai t.ys teu Thr Leu Ala Gly Gly Ala Gin Gly Gin Gly 340 345 350 Asp ile Vai Ala Thr Glu Leu Pro Pro lie Pro Gly Ala Ser Ser Gly 355 360 365 pro teu ASp vai Ala Leu Ala Ser Gin Ala Arg Trp Thr Gly Ala Thr 370 375 380 Arg 385 Ala Vai Asp Sér teu 390 Ser Ile Asp Asn Ala 395 Thr Trp val Met Thr 400 ASp Asn Ser Asn Vai Gly Al a Leu Arg teu Ala Ser Asp Gly Ser Val 405 410 41S ASp Phe Gin Gin Pro Ala Gl u Ala Gly Arg Phe Lys Val Leu Met val 420 425 430 Asp Thr teu Ala Gly ser Gly Léu Phe Arg Mêt ASfi Vâ1 Phe Ala Asp 435 440 445 Leu Gly teu ser Asp tys teu val val Met Arg Asp Ala Ser Gl y Gin 450 455 460 115 H1S 465 Arg Leu Trp vai Arg 470 Asn ser Gly ser Glu 475 Pro Ala Ser Ala Asn 480 Thr Met Leu Leu vai Gin Thr Pro Arg Gly Ser Ala Ala Thr Phe Thr 485 490 495 Leu Ala Asn Lys 500 Asp Gly Lys vai Asp 505 lie Gly Thr Tyr t;s Tyr Arg Leu Ala Ala Asn Gly Asn Gly Gin Trp ser Leu vai Gly Ala Lys Ala 515 520 525 Pro Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Gin Pro Gly pro Gin Pro Gly Pro 530 535 540 Gin Pro Gly Pro Gin Pro Pro Gin Pro Pro Gin pro Pro Gin Pro Pro 560 545 550 555 Gin Arg Gin Pro Glu Ala pro Ala Pro Gin Pro pro Ala Gly Arg 575 Gl u 565 570 Leu Ser Ala Ala Ala Asn Ala Ala Vai Asn Thr Gly Gly vai 590 Gly Leu 580 585 Ala Ser Thr Leu Trp Tyr Ala Glu Ser Asn 595 600
<210>2 <211> 1806 <212> ADN <213> Bordetella bronchiseptica <400>2 116 gatccaaaca ctgtgtcaat catcaaggcc ggcgagcgcc agcacggcat ccacatcaag 60 caaagcgatg gcgccggcgt acggaccgcc accggaacga ccatcaaggt aagcggtcgt 120 caggcccagg gcgtcctgct ggaaaatccc gcggccgagc tgcggttcca gaacggcagc 180 gtcacgtctt cgggacagct gttcgacgaa ggcgtccggc gctttctggg caccgtcacc 240 gtcaaggccg gcaagctggt cgccgatcac gccacgctgg ccaacgtcag cgacacccgg 300 gacgacgacg gcatcgcgct ctatgtggcc ggcgagcagg cccaggccag catcgccgac 360 agcaccctgc agggcgcggg cggcgtgcgg gtcgagcgcg gcgccaatgt cacggtccaa 420 cgcagcacca tcgttgacgg gggcttgcat atcggcaccc tgcagccgct gcagccggaa 480 gaccttccgc ccagccgggt ggtgctgggc gacaccagcg tgaccgccgt gcccgccagc 540 ggcgcgcccg cggcggtgtc tgtattcggg gccaatgagc ttacggttga tggcgggcac 600 atcaccgggg ggcgggcagc gggggtggcg gccatggacg gggcgatcgt gcatctgcag 660 cgcgcgacga tacggcgggg ggacgcgcct gccggcggtg cggttccagg cggtgcggtt 720 cccggcggct tcggccccct ccttgacggc tggtatggcg tggatgtatc ggactccacc 780 gtggacctcg ctcagtcgat cgtcgaggcg ccgcagctgg gcgccgcgat ccgggcgggc 840 cgcggcgcca gggtgacggt gtcgggcggc agcttgtccg caccgcacgg caatgtcatc 900 gagaccggcg gcggtgcgcg tcgcttcccg cctccggcct cgcccctgtc gatcaccttg 960 cgggcgggcg cacgggcgca ggggagggcg ctgctgtacc gggtcctgcc ggagcccgtg 1020 aagctgacgc tggcgggcgg cgcccagggg cagggcgaca tcgtcgcgac ggagctgcct 1080 cccattccag gcgcgtcgag cgggccgctc gacgtggcgc tggccagcca ggcccgatgg 1140 acgggcgcta cccgcgcggt cgactcgctg tccatcgaca acgccacctg ggtcatgacg 1200 gacaactcga acgtcggcgc gctgcggctg gccagcgacg gcagcgtcga tttccagcag 1260 ccggccgaag ctgggcggtt caaggtcctg atggtcgata cgctggcggg ttcggggctg 1320 ttccgcatga atgtcttcgc ggacctgggg ctgagcgaca agctggtcgt catgcgggac 1380 gccagcggcc agcacaggct gtgggtccgc aacagcggca gcgagccggc cagcgccaac 1440 accatgctgc tggtgcagac gccacgaggc agcgcggcga cctttaccct tgccaacaag 1500 gacggcaagg tcgatatcgg tacctaccgc tatcgattgg ccgccaacgg caatgggcag 1560 tggagcctgg tgggcgcgaa ggcgccgccg gcgcccaagc ccgcgccgca gcccggtccc 1620 cagcccggtc cccagcccgg tccccagccg ccgcagccgc cgcagccgcc gcagccgcca 1680 cagaggcagc cggaagcgcc ggcgccgcaa ccgccggcgg gcagggagtt gtccgccgcc 1740 gccaacgcgg cggtcaacac gggtggggtg ggcctggcca gcacgctctg gtacgccgaa 1800 agcaat 1806
<210>3 <211> 599 <212> PRT <213> Bordetella bronchiseptica 117 <400>3
Asp Trp Asn Asn Gin Ser Ile Ile Lys Ala Gly Glu Arg Gin His Gly 15 10 15 lie His ile Lys Gin ser Asp Gly Ala Gly vai Arg Thr Ala Thr Gly 20 25 30
Thr Thr Ile Lys Vai Ser Gly Arg Gin Ala Gin Gly Vai Leu Leu Glu 35 40 45
Asn pro Ala Ala Glu Leu Arg Phe Gin Asn Gly Ser vai Thr ser Ser 50 55 60
Gly Gin Leu Phe Asp Glu Gly vai Arg Arg Phe Leu Gly Thr Vai Thr 65 70 75 80 val Lys Ala Gly Lys Leu Vai Ala Asp His Ala Thr Leu Ala Asn Vai 85 90 95 118
Ser Asp Thr Arg 100 ASp ASp ASp Gly lie 105 Ala Leu Tyr val Ala 110 Gly Glu Gin Ala Gin 115 Ala ser lie Ala A$p 120 ser Thr Leu Gin Glv 125 Ala Gl y 61 y Vai Ara 130 vai Glu Arg Gly Ala 135 ASA Val Thr val Gin 140 Arg Ser Thr Ile vai 145 ASp dy Gly Leu His 150 ile Gly Thr ueu Gin 15 S pro teu Gin pro GlU 160 Asp Leu pro pro ser 165 Arg val val Leu Gly 170 ASp Thr ser val Thr 175 Ala vai Pro Ala Ser ISO Gly Ala Pro Ala Ala 185 val Ser val Phe Gly 190 Ala Asn Glu Leu Thr 195 Val Asp Gly Gly His 200 Ile Thr Gly Gly Arg 205 Ala Ala Gly vai Ala 210 Ala Met ASp Gly Ala 215 Ile val HÍS Leu Glrt 220 Arg Ala Thr Ile Aro 225 Arg Gly ASP Ala pro 230 Ala Gl y Gly Ala val 235 pro Gly Gly Ala val 240 pro Gly Gly phe Gly 245 PfO teu Leu ASp Gly 250 xrp Tyr Gly val ASp 255 val ser ASP ser Thr 26Q val ASp Leu Ala Gin 265 Ser ile val Glu Ala 270 pro Gin lsu Gly Ala 275 Ala ile Arg Ala Gly 280 Arg Gly Ala Arg val 285 Thr val Ser Gly Gly 290 ser teu ser Ala pro 295 His Gly Asn val Ile 300 Glu Thr Gly Gly Gly 305 Ala Arg Arg phe Pro 310 pro Pro Ala Ser pro 315 Leu Ser Ile Thr Leu 320 Gin Ala Gly Ala Arg 325 Ala Glrt cly Arg Ala 330 Leu Leu Tyr Arg val 335 Leu Pro Glu Pro Val 340 Lys Leu Thr Leu Ala 345 Gly Gly Ala Gin Gly 350 Gin Gly Asp lie Val 355 Ala Thr Glu teu Pro 360 Pro Ile Pro Gly Ala 365 ser Ser Gly Pro Leu Asp val Ala teu Ala Ser Gin Ala Arg Trp Thr Gly Ala Thr 119 370 375 Arg Ala Vai Asp Ser Leu Ser lie 385 390 Asp Asn Ser Asn vai 405 Gly Ala Leu Asp Phe Gin Gin Pro Ala Glu Ala 420 ASp Thr Leu Ala Gly Ser Gly Leu 435 440 ASP Leu 450 Gly Leu Ser Asp 81 Leu Gin HÍS Arg Leu Leu Vai Arg Asn 465 470 Asn Thr Met Leu Leu Vai Gin Thr 485 Thr Leu Ala Asn Lys Asp Gly Lys 500 Arg Leu Ala Ala Asn Gly Asn Gly 515 520 Ala Pro Pro Ala Pro Lys pro Ala 530 535 Pro Gin Pro Pro Gin pro pro Gin 545 550 pro Glu Ala Pro Ala Pro Gin Pro 565 Ala Ala Asn Ala Ala vai Asn Thr 580 B80
Asp Asn Ala 395 Thr Trp vai Met Thr 400 Arg Leu 410 Ala ser Asp Gly Ser 415 vai Gly 425 Arg Phe Lys cys Leu 430 Met Vai Phe Arg Met Asn vai 445 Ala phe Ala vai vai Met Arg 460 Asp Ala ser Gly ser Gly ser 475 Glu Pro Ala ser Gly 480 Pro Arg 490 Gly ser Ala Ala Thr 495 phe vai 505 ASP lie Gly Thr Tyr 510 Arg Tyr Gin Trp Ser Leu Vai 525 Gly Ala Lys Pro Gin pro Gly 540 Pro Gin pro Gly Pro Pro Gin 555 pro Pro Gl n Arg Gin 560 Pro Ala 570 Gly Arg Glu Leu ser 575 Ala Gly 585 Gly vai Gly Leu Ala 590 Ser Thr
Leu Trp Tyr Ala Glu ser Asn 595 120
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • WO 2004067031 A [0009] • WO 9217587 A [0050] • US 4567042 A [0065] • US 4567043 A [0065] • US 60443418 B [0284
Literatura não relacionada com patentes referida na descrição • Shahin et al. Characterization of the Protective Capacity and Immunogenicity of the 69-kD Outer Membrane Protein of Bordetella pertussis. J. Exp. Med., 1990, vol. 171, 63-73 [0002] • Novotny et al. Biologic and Protective Properties of the 69-kD Outer Membrane Protein of Bordetella pertussis: A Novel Formulation for a Acellular Pertussis vaccine. J. Infect. Dis., 1991, vol. 164, 114-22 [0002] • He et al. Protective Role of Immunoglobulin G Antibodies to Filamentous Hemagglutinin and Pertactin of Bordetella pertussis in Bordetella parapertussis Infection. Eur. J Clin Microbíol Infect Dis., 1996, vol. 10, 793-798 [0002] • Kobisch et al. Identification of a 68-Kilodalton Outer Membrane Protein as the Major Protective Antigen of Bordetella bronchiseptica by Using Specific-Pathogen-Free Piglets. Infect. Immun., 1990, vol. 58 (2), 352-357 [0002] 121 • Montaraz et al. Infection and Immunity, 1985, vol. 47, 744-751 [0052] • Aspects of Immunity to Leptospira borgpetersenii serovar hardjo. Yan, K-T. PhD Thesis. The Queen's University of Belfast, 1996 [0066] • Mackintosh et al. The use of a hardjo-pomona vaccine to prevent leptospiruria in cattle exposed to natural challenge with Leptospia interrogans serovar hardjo. New Zealand Vet. J., 1980, vol. 28, 174-177 [0066] • Bolin. Effect of vaccination with a pentavalent leptopsiral vaccine on Leptospira interrogans serovar hardjo type hardjo-boivs infection of pregnant cattle. Am. J. Vet. Res., 1989, vol. 50, 161-165 [0066]

Claims (19)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição de vacina para utilização na imunização de cães contra a infecção causada por Leptospira bratislava que compreende uma preparação de células de Leptospira de Leptospira bratislava e um adjuvante.
2. A composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, em que a dita preparação de células de Leptospira compreende ainda uma preparação de células de pelo menos um de Leptospira canicola, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, ou Leptospira pomona, em que a quantidade de cada estirpe de Leptospira na composição de vacina encontra-se compreendida entre aproximadamente 100-3500 unidades nefelométricas por dose de vacina.
3. Uma vacina de combinação para utilização na imunização de cães contra patogénios caninos que compreende a composição de acordo com a reivindicação 2, e que compreende ainda uma estirpe atenuada de vírus da esgana canina (CD), uma estirpe atenuada de adenovírus canino tipo 2 (CAV-2), uma estirpe atenuada de virus da parainfluenza canina (CPI), uma estirpe atenuada de parvovírus canino (CPV) , e um adjuvante, em que a quantidade de cada estirpe atenuada de vírus na dita vacina se encontra compreendida entre 102 a 109 TCID50 por dose.
4. A vacina de combinação de acordo com a reivindicação 3, que compreende ainda uma preparação de células inteiras ou parciais inactivadas de uma estirpe de coronavirus canino (CCV).
5. Uma vacina de combinação para utilização na imunização de cães contra patogénios caninos que compreende uma preparação de células de Leptospira de Leptospira canicola, 2 Leptospira canicola, Leptospira gríppotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae, e Leptospira pomona, e que compreende ainda uma estirpe atenuada de virus da esgana canina (CD), uma estirpe atenuada de adenovirus canino tipo 2 (CAV-2), uma estirpe atenuada de virus da parainfluenza canina (CPI), uma estirpe atenuada de parvovírus canino (CPV), e um adjuvante.
6. A vacina de combinação de acordo com a reivindicação 5, que compreende ainda uma preparação de células inteiras ou parciais inactivadas de uma estirpe de coronavirus canino (CCV).
7. A composição de vacina de qualquer das reivindicações 1, 5 e 6, em que a quantidade de cada estirpe de Leptospira se encontra compreendida entre aproximadamente 100-3500 unidades nefelométricas por dose.
8. A composição de vacina de qualquer das reivindicações 1 a 6, em que a quantidade de cada estirpe de Leptospira se encontra compreendida entre aproximadamente 200-2000 unidades nefelométricas por dose.
9. A vacina de combinação de acordo com a reivindicação 5 ou reivindicação 6, em que a quantidade da dita estirpe atenuada de virus de CD na dita vacina se encontra compreendida entre 102 e 109 TCID50 por dose.
10. A vacina de combinação de acordo com a reivindicação 5 ou reivindicação 6, em que a quantidade da dita estirpe atenuada de CAV-2 na dita vacina se encontra compreendida entre 102 e 109 TCID50 por dose.
11. A vacina de combinação de acordo com a reivindicação 5 ou reivindicação 6, em que a quantidade da dita estirpe 3 atenuada de vírus de CPI na dita vacina se encontra compreendida entre 102 e 109 TCID50 por dose.
12. A vacina de combinação de acordo com a reivindicação 5 ou reivindicação 6, em que a quantidade da dita estirpe atenuada de CPV na dita vacina se encontra compreendida entre 102 e 109 TCID50 por dose.
13. A vacina de combinação de qualquer das reivindicações 4 e 6, em que a quantidade da preparação de células da dita estirpe de CCV na dita vacina é pelo menos aproximadamente 100 unidades relativas por dose.
14. A composição de vacina de qualquer das reivindicações 1 a 6, em que o adjuvante compreende saponina e um tensioactivo.
15. A composição de vacina de acordo com a reivindicação 14, em que a saponina é Quil A e o tensioactivo é colesterol.
16. A composição de vacina de acordo com a reivindicação 15, em que a quantidade de Quil A se encontra compreendida entre 1 e 1000 pg por dose, e a quantidade de colesterol se encontra compreendida entre 1 e 1000 pg por dose.
17. A composição de vacina de qualquer das reivindicações 1 a 6, em que o adjuvante compreende hidróxido de alumínio.
18. A composição de vacina de qualquer das reivindicações 1 a 6, em que a dita composição é administrada por uma via intravenosa, intranasal, oral, intramuscular ou subcutânea.
19. A composição de vacina de qualquer das reivindicações 1 a 6, em que o dito cão recebe a dita composição duas ou 4 três vezes com um intervalo de aproximadamente 2-4 semanas entre as administrações.
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