KR20050103215A - 보르데텔라 브론키셉티카에 대한 개 백신 - Google Patents

보르데텔라 브론키셉티카에 대한 개 백신 Download PDF

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조셉 클라우드 프렌츠
쉘리 린 쉴즈
리차드 리 크렙스
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Abstract

본 발명은 보르데텔라 브론키셉티카에 의해 초래된 질환에 대해 개를 보호하기 위한 백신 및 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개 병원체에 의해 초래된 질환 또는 장애, 예컨대 보르데텔라 브론키셉티카에 의해 초래된 전염성 기관기관지염, 개 디스템퍼(CD) 바이러스에 의해 초래된 개 디스템퍼, 제 1 형 개 아데노바이러스(CAV-1)에 의해 초래된 전염성 개 간염(ICH), 제 2 형 개 아데노바이러스(CAV-2)에 의해 초래된 호흡기 질환, 개 파라인플루엔자(CPI) 바이러스에 의해 초래된 개 파라인플루엔자, 개 코로나바이러스(CCV) 및 개 파르보바이러스(CPV)에 의해 초래된 장염, 및 렙토스피라 브라티스라바, 렙토스피라 카니콜라, 렙토스피라 그립포티포사, 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에 또는 렙토스피라 포모나에 의해 초래된 렙토스피라병에 대해 개를 보호하기 위한 조합 백신 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 백신은 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원을 포함한다.

Description

보르데텔라 브론키셉티카에 대한 개 백신{CANINE VACCINES AGAINST BORDETELLA BRONCHISEPTICA}
본 발명은 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica) p68 항원을 함유하는 백신, 및 보르데텔라 브론키셉티카에 의해 초래된 전염성 기관기관지염(tracheobronchitis)("켄넬코프(kennel cough)")에 대해 개를 보호하기 위한 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원 및 다른 개 병원체, 예컨대 개 디스템퍼(canine distemper, CD) 바이러스, 제 2 형 개 아데노바이러스(canine adenovirus type 2, CAV-2), 개 파라인플루엔자(canine parainfluenza, CPI) 바이러스, 개 코로나바이러스(canine coronavirus, CCV), 개 파르보바이러스(canine parvovirus, CPV), 렙토스피라 브라티스라바(Leptospira Bratislava), 렙토스피라 카니콜라(Leptospira canicola), 렙토스피라 그립포티포사(Leptospira grippotyphosa), 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에(Leptospira icterohaemorrhagiae) 또는 렙토스피라 포모나(Leptospira pomona)에 의해 초래된 렙토스피라병(leptospirosis)에 대한 하나 이상의 항원을 함유하는 조합 백신에 관한 것이다. 개 병원체에 의해 초래된 질환에 대해 조합 백신을 사용하여 개를 보호하기 위한 방법이 또한 제공된다.
시판 중인 개 보르데텔라 브론키셉티카 백신 제품은 불활성의 비애주번트화된(nonadjuvanted) 보르데텔라 브론키셉티카 전세포(whole cell) 세균백신(bacterin)으로 구성된다. 이러한 전세포 세균백신은 세포 단백질-관련 백신접종 후 반응(post-vaccination reaction)을 유발시킬 수 있다. 보르데텔라 브론키셉티카의 p68 단백질은 항원적으로(antigenically) 비 페르투스시스(B. pertussis)의 외막 단백질(Outer Membrane Protein, OMP) 및 비 파라페르투스시스(B. parapertussis)의 OMP와 유사하다[샤힌(Shahin) 등의 문헌 "Characterization of the Protective Capacity and Immunogenicity of the 69-kD Outer Membrane Protein of Bordetella pertussis", J. Exp. Med., 171: 63-73,1990]. 이 OMP의 보호 역할은 마우스[샤힌 등의 상기 문헌; 노보트니(Novotny) 등의 문헌 "Biologic and Protective Properties of the 69-kD Outer Membrane Protein of Bordetella pertussis: A Novel Formulation for a Acellular Pertussis Vaccine", J. Infect. Dis. 164: 114-22, 1991], 인간[헤(He) 등의 문헌 "Protective Role of Immunoglobulin G Antibodies to Filamentous Hemagglutinin and Pertactin of Bordetella pertussis in Bordetella parapertussis Infection", Eur. J Clin Microbiol Infect Dis. 10: 793-798, 1996], 및 돼지[코비쉬(Kobisch) 등의 문헌 "Identification of a 68-Kilodalton Outer Membrane Protein as the Major Protective Antigen of Bordetella bronchiseptica by Using Specific-Pathogen-Free Piglets", Infect. Immun. 58(2): 352-357,1990]에 대해서는 입증되어 있다.
본 발명 이전에, 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원이 개에게 안정하고 효과적인 백신일 수 있다는 것을 보여주지 못했었다. 따라서, 개에게 사용하는데 적합한 p68 항원을 함유하는 보르데텔라 브론키셉티카 백신을 개발할 필요가 있다. 이는 이러한 보르데텔라 브론키셉티카 p68 백신이 강아지에게 투여하는 경우에도 안정하며 장시간 보호를 제공한다면 더욱 유리할 것이다.
CD는 가변성 징후를 갖는 보편적인 높은 치사성 바이러스 질환이다. CD 바이러스에 감염된 백신접종되지 않은 비면역(nonimmune) 개의 약 50%에게서 임상적 증세가 전개되며, 이들 개의 약 90%가 죽는다.
제 1 형 개 아데노바이러스(CAV-1)에 의해 초래된 전염성 개 간염(infectious canine hepatitis, ICH)은 보편적이며 때로는 치명적인 개의 바이러스 질환이며, 이는 간 및 전신의 내피 상해를 그 특징으로 한다. CAV-2는 호흡기 질환을 유발시키며, 일부 경우에는 폐렴 및 기관지폐렴(bronchopneumonia)을 포함할 수 있다.
CPI는 통상적인 바이러스 상호흡기(upper respiratory) 질환이다. 단순(Uncomplicated) CPI는 경미하거나 무증상일 수 있으나(subclinical), 다른 호흡기 병원체와 함께 감염되는 경우 더욱 심각하게 징후들이 발전하게 된다.
CPV 감염은 장 질환을 유발하며, 이는 구토 및 설사, 종종 출혈성 질환의 돌연 발병을 특징으로 한다. 백혈구감소증(leukopenia)은 통상적으로 임상적 징후를 수반한다. 임의의 연령의 민감성 개가 감염될 수 있지만, 강아지에서 가장 큰 치사율을 나타낸다. 생후 4 내지 12주 강아지에서, CPV는 가끔 심근염(myocarditis)을 유발시킬 수 있으며, 이는 잠시 눈에 띄지 않는 병환 후에 급성 심장 부전을 초래할 수 있다. 감염 후, 다수의 개는 1년 또는 그 이상 동안 상기 질환에 대해 불응한다. 유사하게, 양성혈청반응성(seropositive) 암캐들은 그들의 강아지 CPV 항체에 전달할 수 있으며, 이는 생후 16주까지의 강아지의 활성 면역화를 간섭할 수 있다.
CCV는 또한 전세계의 모든 연령의 민감성 개에게서 장 질환을 유발시킨다. 매우 전염성이기에, 상기 바이러스는 주로 전염성 변과의 직접적인 접촉을 통해 이송되며, 노출 1 내지 4일 이내에 임상적 장염을 유발시킬 수 있다. 질환의 위중성은 다른 제제과 동시 감염에 의해 악화될 수 있다. CCV 감염의 주요 징후로는 식용감퇴, 구토, 및 설사가 포함된다. 구토의 빈도는 통상적으로 설사 개시 1 또는 2일 이내에 감소하지만, 설사는 감염 경로를 통해 쉽게 사라지지 않을 수 있으며(linger), 대변에는 가끔 약간의 혈액을 함유할 수 있다. CCV 감염에서, 대부분의 개에는 열이 있으며, 단순한 경우에는 백혈구감소증이 관찰되지 않는다.
렙토스피라병이 모든 연령의 개에게서 발병하지만, 급성 감염 후에 일반적으로 광범위한 임상적 징후 및 만성 신염이 뒷따른다. 렙토스피라 카니콜라 및 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에로의 감염은 임상적으로 분화될 수 없다.
본 발명 이전에는, 보르데텔라 브론키셉티카 및 하나 이상의 다른 개 병원체, 예컨대 CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스, CPV, CCV, 및 렙토스피라 종류, 예컨대 렙토스피라 브라티스라바, 렙토스피라 카니콜라, 렙토스피라 그립포티포사, 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에 및 렙토스피라 포모나에 대해 개를 보호하는 효과적인 조합 백신이 존재하지 않았다. 조합 백신을 개발하는데 있어서의 문제점 중 하나는 효능 간섭, 즉 조합 조성물 중의 하나 이상의 항원이 상기 조성물 중의 다른 항원의 존재로 인해 효능을 유지 또는 달성하지 못하게 되는 것이다. 이는 숙주(예: 개)에 투여된 조성물 중의 항원과의 간섭의 결과로서 상기 조성물 중에 존재하는 다른 항원 때문에 숙주 내에 유도되는 이러한 항원에 대한 면역학적 항원성 항체 또는 보호 반응으로 존재하는 것으로 생각된다. 그러나, 다른 숙주(예: 고양이)를 위한 조합 백신은 공지되어 있아. 이는 개에서의 효능 간섭이 개의 생물학적 시스템의 일부 특성에 기인하거나, 또는 개의 생물학적 시스템과 항원의 반응에 기인하는 것으로 생각된다.
따라서, 보르데텔라 브론키셉티카 및 하나 이상의 다른 개 병원체에 대해 개에 투여하는데 적합하며 개에서 효능 간섭을 나타내지 않는 조합 백신을 개발할 것이 요구된다. 이는 더욱이 이러한 조합 백신이 강아지에 투여하는데 안정하고 장시간 보호를 제공한다면 더욱 유리할 것이다.
발명의 요약
본 발명은 개 병원체에 의해 초래된 질환에 대해 개를 보호하기 위한 백신 및 방법을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 개에 투여하는데 적합하며 보르데텔라 브론키셉티카에 의해 초래된 질환에 대해 개를 보호할 수 있는 p68 백신을 제공한다. 본 발명의 이러한 백신은 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원 및 수의학적으로 허용 가능한 담체(예: 애주번트)를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은, 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원 및 수의학적으로 허용 가능한 담체(예: 애주번트)를 포함하는 백신을 개에 투여함으로써, 보르데텔라 브론키셉티카에 의해 초래된 질환에 대해 개를 보호하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 개에 투여하기에 적합한 조합 백신을 제공한다. 본 발명의 조합 백신은, 이러한 다른 병원체(들)에 의해 초래된 질환에 대해 개에서 보호 면역 반응을 유도할 수 있는, 다른 개 병원체로부터의 하나 이상의 다른 항원과 함께 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원을 포함한다. 이러한 다른 병원체는 개 디스템퍼(CD) 바이러스, 제 2 형 개 아데노바이러스(CAV-2), 개 파라인플루엔자(CPI) 바이러스, 개 파르보바이러스(CPV), 개 코로나바이러스(CCV), 개 헤르페스바이러스(canine herpesvirus), 광견병 바이러스(rabies virus), 렙토스피라 브라티스라바, 렙토스피라 카니콜라, 렙토스피라 그립포티포사, 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에, 렙토스피라 포모나, 렙토스피라 하르드조보비스(Leptospira hardjobovis), 포르피로모나스 종(Porphyromonas spp.), 박테리오데스 종(Bacteriodes spp.), 레이스흐마니아 종(Leishmania spp.), 보렐리아 종(Borrelia spp.), 에르리키아 종(Ehrlichia spp.), 미코플라즈마 종(Mycoplasma spp.) 및 마이크로스포룸 카니스(Microsporum canis)로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 조합 백신은 개 디스템퍼(CD) 바이러스, 제 2 형 개 아데노바이러스(CAV-2), 개 파라인플루엔자(CPI) 바이러스 및 개 파르보바이러스(CPV)의 약독화(attenuated) 균주; 개 코로나바이러스(CCV) 균주의 비활성화 제조물; 및 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 조합 백신은 개 디스템퍼(CD) 바이러스, 제 2 형 개 아데노바이러스(CAV-2), 개 파라인플루엔자(CPI) 바이러스 및 개 파르보바이러스(CPV)의 약독화 균주; 개 코로나바이러스(CCV) 균주의 비활성화 제조물; 보르데텔라 브론키셉티카 p68 단백질, 및 5개의 렙토스피라 세로바스(serovars)(렙토스피라 브라티스라바, 렙토스피라 카니콜라, 렙토스피라 그립포티포사, 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에 및 렙토스피라 포모나)의 비활성화 세포 제조물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 조합 백신은 CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스약독화 균주, CPV 균주; 및 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 조합 백신은 CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스약독화 균주, CPV 균주; 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원; 및 렙토스피라 카니콜라 및 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에의 비활성화 세포 제조물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 조합 백신은 CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스약독화 균주, CPV 균주, 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원, 및 5개의 렙토스피라 세로바스(렙토스피라 브라티스라바, 렙토스피라 카니콜라, 렙토스피라 그립포티포사, 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에 및 렙토스피라 포모나)의 비활성화 세포 제조물을 포함한다.
또 다른 바람직한 조합 백신은 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원 및 약독화 CPI 바이러스를 포함한다.
또 다른 바람직한 조합 백신은 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원, 약독화 CPI 바이러스, 및 렙토스피라 카니콜라 및 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에의 비활성화 세포 제조물을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 조합 백신을 개에 투여함으로써 개 병원체에 의해 초래된 질환에 대해 개를 보호하는 방법을 제공한다.
도 1은 보르데텔라 브론키셉티카 에어로졸 유발접종(challenge)된 백신접종되지 않은 개 및 보르데텔라 p68 (15㎍/투여량) 백신접종된 개에서의 p68 ELISA 종말점 적정량의 기하학적 평균의 요약을 도시한다.
도 2는 보르데텔라 브론키셉티카 에어로졸 유발접종한 후 개 내의 혈청 아밀로이드(Amyloid) A 적정량의 요약을 도시한다.
도 3은 보르데텔라 브론키셉티카 백신접종 및 에어로졸 유발접종 후 백신접종되지 않은 개 및 보르데텔라 p68 백신접종된 개에서의 p68 ELISA 종말점 적정량에서 기하학적 평균의 요약을 도시한다.
도 4는 보르데텔라 브론키셉티카 에어로졸 유발접종 후 개에서의 혈청 아밀로이드 A 적정량의 요약을 도시한다.
도 5는 p68 전세포 용해질(lysate)에 대한 p68 단클론 항체 Bord 2-7의 반응성을 나타내는 웨스턴 블로팅(Western blot)을 도시한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 보르데텔라 브론키셉티카에 의해 초래된 질환에 대해 개를 보호할 수 있는 개에게 투여하기 적합한 1가 백신을 제공한다. 본 발명의 1가 백신은 재조합 제조된 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원 및 수의학적으로 허용 가능한 담체(예: 애주번트)를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은, 재조합 제조된 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원 및 수의학적으로 허용 가능한 담체(예: 애주번트)를 포함하는 1가 백신을 개에 투여함으로써, 보르데텔라 브론키셉티카에 의해 초래된 질환에 대해 개를 보호하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 개에 투여하는데 적합한 조합 백신을 제공한다. 본 발명의 조합 백신은 이러한 다른 항원에 의해 초래된 질환에 대해 개에서 보호 면역 반응을 유도할 수 있는 하나 이상의 다른 항원과 함께 재조합 제조된 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원을 포함한다.
본 발명의 바람직한 조합 백신은 개 디스템퍼(CD) 바이러스, 제 2 형 개 아데노바이러스(CAV-2), 개 파라인플루엔자(CPI) 바이러스 및 개 파르보바이러스(CPV)의 약독화 균주; 개 코로나바이러스(CCV) 균주의 비활성화 제조물; 및 보르데텔라 브론키셉티카 p68 단백질을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 조합 백신은 개 디스템퍼(CD) 바이러스, 제 2 형 개 아데노바이러스(CAV-2), 개 파라인플루엔자(CPI) 바이러스 및 개 파르보바이러스(CPV)의 약독화 균주; 개 코로나바이러스(CCV) 균주의 비활성화 제조물; 보르데텔라 브론키셉티카 p68 단백질, 및 5개의 렙토스피라 세로바스(렙토스피라 브라티스라바, 렙토스피라 카니콜라, 렙토스피라 그립포티포사, 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에 및 렙토스피라 포모나)의 제조물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 조합 백신은 CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스약독화 균주, CPV 균주; 및 보르데텔라 브론키셉티카 p68 단백질을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 조합 백신은 CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스약독화 균주, CPV 균주; 보르데텔라 브론키셉티카 p68 단백질; 및 렙토스피라 카니콜라 및 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에의 제조물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 조합 백신은 CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스약독화 균주, CPV 균주 및 5개의 렙토스피라 세로바스(렙토스피라 브라티스라바, 렙토스피라 카니콜라, 렙토스피라 그립포티포사, 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에 및 렙토스피라 포모나)의 제조물을 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조합 백신을 개에 투여함으로써 개 병원체에 의해 초래된 질환에 대해 개를 보호하는 방법을 제공한다.
본원의 내용을 제한하지 않으면서 분명하게 하기 위해, 발명의 상세한 설명은 본 발명의 특정 특징, 실시양태 또는 적용을 기술 또는 설명하는 하기 하위 섹션으로 나뉜다.
정의 및 약어
본원에서 사용되는 용어 "개 병원체에 의해 초래된 질환에 대해 개를 보호하는"은 병원체에 의한 감염의 위험을 감소 또는 제거하거나, 감염의 징후를 경감 또는 완화시키거나, 또는 감염으로부터의 회복을 가속화시키는 것을 의미한다.
예를 들면, 바이러스 또는 박테리아 적재에서의 감소, 바이러스 또는 박테리아 셰딩(shedding)에서의 감소, 발병률 또는 감염 기간에서의 증가, 감소된 급성 상 혈청 단백질 수준, 감소된 직장 온도, 및/또는 음식물 섭취 및/또는 성장에서의 증가가 존재한다면 보호가 달성된다.
용어 "p68 항원"은 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 측정되는 분자량 68kDa의 단백질을 지칭하는 것으로서, p68-특이적 단클론 항체 Bord 2-7(ATCC#)에 의해 인지되고, 서열번호 1에서 개시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
"실질적으로 동일한"이라는 것은 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 더욱 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성 정도를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "1가 백신"은 하나의 주요 항원 성분을 갖는 백신을 지칭한다. 예를 들면, p68 1가 백신은 백신의 주요 항원 성분으로서 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원을 포함하고, 보르데텔라 브론키셉티카에 의해 초래된 질환에 대해 백신이 투여되는 동물을 보호할 수 있다.
용어 "조합 백신"은 개에서 보호 면역 반응을 유도할 수 있는 항원들의 2가 또는 다가 조합을 의미한다. 병원체(들)에 대한 조합 백신의 보호 효과는 보통 동물 대상에게서 면역 반응, 세포-매개된 또는 체액 면역 반응, 또는 이들 모두의 조합을 유도함으로써 달성된다.
"면역원성"이라는 것은 특정 병원체에 대해 개에게서 면역 반응을 유발시키는 조성물의 능력을 의미한다. 면역 반응은 세포독성 T-세포 및 시토카인-생성 T-세포에 의해 주로 매개되는 세포 면역 반응, 또는 조력(helper) T-세포에 의해 주로 매개된 후 B-세포를 활성화시켜 항체를 생성시키는 체액 면역 반응일 수 있다.
용어 "치료 효과량" 또는 "효과량"은 투여될 개에게서 보호 면역 반응을 유도하는데 충분한 1가 또는 조합 백신의 양을 지칭한다. 면역 반응은 세포 및/또는 체액 면역의 유도를 제한 없이 포함할 수 있다. 치료적으로 효과적인 백신의 양은 백신에 사용되는 특정 항원, 개의 연령 및 상태, 및/또는 감염 정도에 따라 달라질 수 있으며, 수의사에 의해 결정될 수 있다.
p68 백신
우선 본 발명은, 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원을 함유하는 백신 조성물이 보르데텔라 브론키셉티카에 의해 초래된 질환에 대해 개를 효과적으로 보호하는 것을 입증하였다. 본 발명의 백신 조성물은 의미있는 백신접종 후 반응을 초래하지 않고, 강아지에게 투여하는데 안전하며, 연장 기간 동안 지속하는 개에게서의 보호 면역을 유도한다.
따라서, 본 발명의 하나의 실시양태는 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원을 함유하는 백신 조성물(또는 "p68 백신")에 관한 것으로서, 개에 투여하는데 적합며, 보르데텔라 브론키셉티카에 의해 초래된 질환, 예컨대 전염성 기관기관지염("켄넬코프")에 대해 개를 보호할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "p68 항원"은 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 측정되는 분자량 68kDa의 단백질을 지칭하는 것으로서, p68-특이적 단클론 항체 Bord 2-7(ATCC#)에 의해 인지되고, 및 서열번호 1에서 개시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는다. "실질적으로 동일한"이라는 것은 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 더욱 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성 정도를 의미한다. 서열번호 1과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 p68 항원의 예로는 WO 92/17587 호에 기술된 p68 항원이며, 서열번호 3에 개시되어 있다. 본 발명의 p68 특이적 단클론 항체는 예컨대 박테리아의 표면에서 선천(native) p68 단백질, 재조합 p68 단백질 및 p68 단백질을 인식한다.
본 발명에 따라, 본 발명에 사용하는데 적합한 p68 항원은 선천 p68 단백질(즉, 보르데텔라 브론키셉티카로부터 정제된 천연 p68 단백질) 및 재조합 제조된 p68 단백질 모두를 포함한다.
보르데텔라 브론키셉티카로부터 선천 p68의 정제는 예컨대 몬타라즈(Montaraz) 등의 문헌 [Infection and immunity 47: 744-751 (1985)]에 기술되어 있으며, 또한 이후 본원에 제시되는 실시예에서 설명된다. p68의 재조합 제조는 당해 분야의 숙련자에게 잘 공지된 분자 클로닝 및 재조합 발현 기술 중 임의의 하나를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들면, p68을 코딩하는 핵산 분자는 적절한 숙주 세포, 예컨대 박테리아, 효모 세포(예컨대, Pichia 세포), 곤충 세포 또는 포유동물 세포(예컨대, CHO 세포) 내로 도입될 수 있다. p68-코딩 핵산 분자는 숙주 세포에서 p68 항원을 발현시킬 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 위치할 수 있다. 숙주 세포에 의해 발현되는 p68은 통상의 단백질 정제 기술을 사용하여 쉽게 정제될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 p68 항원을 코딩하는 서열번호 2에 개시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은, 발현 벡터에서 클로닝되며, 온도 민감성 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 위치한다. 발현 벡터는 이 콜라이 내에 도입되고, p68 항원은 열 유도에 따라 발현된다. 세포는 용해되고(lyse), p68 항원이 축적되는 봉입체(inclusion body)들은 원심분리에 의해 분리된다. 봉입체 내의 재조합 p68은 당해 분야에 공지되어 있는 SDS 또는 가용화제, 예컨대 유레아, 구아니딘 하이드로클로라이드, 소듐 콜레이트, 타루로클레이트 및 소듐 데옥시콜레이트를 사용하여 용해된다. 본 발명에 따라, 정제된 선천 또는 재조합 p68 단백질은 수의학적으로 허용 가능한 담체와 조합되어 p68 백신 조성물을 형성한다.
용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"는 용매, 분산 매질, 코팅, 애주번트, 안정화제, 희석제, 방부제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제(isotonic agent), 흡착 지연제(adsorption delaying agent) 등. 희석제는 물, 염수, 덱스트로스, 에탄올, 글라이세롤 등을 포함할 수 있다. 등장화제는 다른 것들 중 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 안정화제는 다른 것들 중 알부민을 포함한다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 애주번트로는, 몇몇 애주번트 부류, 예컨대 미네랄 염, 예컨대 Alum, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트 및 칼슘 포스페이트; 계면활성제 및 미립자, 예컨대, 비이온성 블록 중합체 계면활성제(예컨대, 콜레스테롤), 비로솜(virosome), 사포닌(saponin)(예컨대, Quil A, QS-21 및 GPI-0100), 프로테오솜, 면역 자극 착체, 코클레에이트, 4차 아민(다이메틸 다이옥카타데실 암모늄 브로마이드(DDA)), 아브리딘, 바이타민 A, 바이타민 E; 박테리아 생성물, 예컨대 RIBI 애주번트 시스템(리비 인코포레이티드(Ribi Inc.)), 미코박테리룸 플레이(Mycobacterum phlei)의 세포벽 골격(Detox(등록상표)), 무라밀 다이펩타이드(MDP) 및 트라이펩타이드(MTP), 모노포스포릴 지질 A, 바실루스 칼메테-구에린(Bacillus Calmete-Guerin), 열-불안정한 이 콜라이 엔테로톡신(enterotoxin), 콜레라 독소, 트레할로스 다이미콜레이트, CpG 올리고데옥스뉴클레오타이드; 시토카인 및 호르몬, 예컨대, 인터류킨(IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18), 그래뉼로사이트-마크로파지 콜로니 자극 인자, 데하이드로에피안드로스테론, 1,25-다이하이드록시 바이타민 D3; 폴리아니온, 예컨대 덱스트란; 폴리아크릴릭(예컨대, 폴리메틸메트아크릴레이트, Carbopol 934P); 담체, 예컨대 테타누스 톡시드, 딥테리아 톡시드, 콜레라 독소 B 서브유닛(subnuit), 엔테로톡시제닉 이 콜라이의 돌연변이체 열-불안정한 엔테로톡신(rmLT), 열 쇼크 단백질; 수중유적형 유화액, 예컨대 AMPHIGEN(등록상표)(하이드로닉스(Hydronics), 미국); 및 유중수적형 유화액, 예컨대 프로인트(Freund)의 완전 및 불완전 애주번트가 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
본 발명의 백신에 사용하기에 바람직한 애주번트는 Quil A 및 콜레스테롤를 포함한다.
p68 항원 및 수의학적으로 허용 가능한 담체는 임의의 편리하고 실제적인 방식으로, 예컨대 혼합, 용해, 현탁, 유화, 캡슐화, 흡수 등에 의해 조합되어 백신 조성물을 형성할 수 있으며, 배합물, 예컨대 주사, 이식, 흡입, 섭취 등에 적합한, 정제, 캡슐, 분말, 시럽, 현탁액으로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 백신은 이것이 개에게 약 0.1 내지 5㎖, 바람직하게는 약 0.5 내지 2.5㎖, 더욱 바람직하게는 약 1㎖의 투여량으로 주입함으로써 투여되도록 배합된다. 적절하다면, 본 발명의 약학 조성물은 잘 공지된 절차들에 의해 멸균으로 만들어야 한다.
백신 내의 p68의 양은 면역화에 효과적이어야 하며, 일반적으로 0.5 내지 1000㎍/투여량이다. 바람직하게는, p68의 양은 1 내지 260㎍/투여량이다. 더욱 바람직하게는, p68의 양은 10 내지 100㎍/투여량이다. 더욱더 바람직하게는, p68의 양은 약 15 내지 25㎍/투여량이다.
백신에 사용하는데 적합한 애주번트의 양은 사용되는 애주번트의 속성에 따라 달라진다. 예를 들면, Quil A 및 콜레스테롤이 애주번트로서 사용되는 경우, Quil A는 일반적으로 약 1 내지 1000㎍/투여량, 바람직하게는 30 내지 100㎍/투여량, 더욱 바람직하게는 약 50 내지 75㎍/투여량으로 존재하고; 콜레스테롤은 일반적으로 약 1 내지 1000㎍/투여량, 바람직하게는 약 30 내지 100㎍/투여량, 더욱 바람직하게는 약 50 내지 75㎍/투여량으로 존재한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 이전 본원에서 기술된 바와 같이 보르데텔라 브론키셉티카에 의해 초래된 질환에 대해 p68 백신 조성물을 개에 투여함으로써 개를 보호하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라, p68 백신 조성물은 약 4개월, 바람직하게는 약 6개월 이상, 더욱더 바람직하게는 약 1년 이상의 장기간의 면역을 갖는 개를 제공한다.
본 발명에 따라, p68 백신은 임의의 공지된 경로, 예컨대 경구, 비강내, 점막, 국부, 경피 및 비경구(예컨대, 정맥 내, 복강 내, 피부 내, 피하 또는 근육 사이)를 통해 개에 투여될 수 있다. 니들-부재 전달 장치를 사용하여 투여가 달성될 수 있다. 조합 경로, 예컨대 비경구 경로를 사용하는 제 1 투여 및 점막 경로를 사용하는 후속 투여를 사용하여 투여가 달성될 수 있다.
투여의 바람직한 경로는 피하 및 근육 사이 투여를 포함한다.
본 발명의 p68 백신 조성물은 생후 6주 이상, 바람직하게는 생후 7주 이상, 더욱 바람직하게는 생후 8 또는 9주의 개에게 투여될 수 있다. 개는 p68 백신을 단일 투여 또는 하나 이상의 투여를 통해 백신접종될 수 있다. 바람직하게는, p68 백신은 개에게 투여 간격을 약 2 내지 4주, 바람직하게는 약 3주로 2회 투여된다. 개가 생후 4개월 전에 백신접종된 경우, 이들은 생후 4개월에 다다름에 따라 단일 투여로 재백신접종할 것이 권유되는데, 이는 모체(maternal) 항체가 생후 4개월 미만의 강아지에게서 충분한 면역 반응의 전개를 간섭할 수 있기 때문이다. 또한, 개는 매년 단일 투여로 재백신접종될 수 있다. 보르데텔라 브론키셉티카가 예컨대 번식, 탑승 및 연출 상황과 같이 노출되는 경우, 이들 상황이 발생한 지 1년 이내, 바람직하게는 6개월 이내에 추가 부스터(booster)가 제공될 수 있다.
p68 조합 백신
다른 실시양태에서, 본 발명은 보르데텔라 브론키셉티카 및 하나 이상의 다른 개 병원체에 대해 이러한 좋바 백신을 투여함으로써 개를 보호하기 위한 조합 백신 및 방법을 제공한다. 본 발명의 조합 백신 조성물은 유효 간섭 나타내지 못하며, 강아지에게 투여하는데 안전하다.
본 발명의 조합 백신은, 이전 본원에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있는 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원, 및 이러한 다른 병원체에 의해 초래된 질환에 대해 개에게 보호 면역 반응을 유도할 수 있는 다른 개 병원체로부터의 하나 이상의 항원을 포함한다.
이러한 다른 병원체는 개 디스템퍼(CD) 바이러스, 제 2 형 개 아데노바이러스(CAV-2), 개 파라인플루엔자(CPI) 바이러스, 개 파르보바이러스(CPV), 개 코로나바이러스(CCV), 개 헤르페스바이러스 및 광견병 바이러스를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 본 발명의 백신 조성물에 사용하기 위한 이들 병원체로부터의 항원은, 변형된 살아있는 바이러스 제조물 또는 비활성화 바이러스 제조물로서 존재할 수 있다. 예를 들면, 이들 바이러스의 병독성 균주를 약독화하는 방법, 및 비활성화 바이러스 제조물을 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예컨대 미국 특허 제 4,567,042 호 및 미국 특허 제 4,567,043 호에 기술되어 있다.
또한, 다른 병원체로는 렙토스피라 브라티스라바, 렙토스피라 카니콜라, 렙토스피라 그립포티포사, 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에, 렙토스피라 포모나, 렙토스피라 하르드조보비스, 포르피로모나스 종, 박테리오데스 종, 레이스흐마니아 종, 보렐리아 종, 에르리키아 종, 미코플라즈마 종 및 마이크로스포룸 카니스가 포함된다. 본 발명의 백신 조성물에 사용하기 위한 이들 병원체로부터의 항원은, 당해 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 비활성화 전체 또는 부분 세포 제조물 형태로 존재할 수 있다. 예를 들면, 비활성화 전체 또는 부분 렙토스피라 세포 제조물을 제조하는 방법이 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 예컨대 얀(Yan, K-T)의 문헌 ["Aspects of Immunity to Leptospira borgpetersenii serovar hardjo", PhD Thesis, Appendix I, 1996. Faculty of Agriculture and Food Science, The Queen's University of Belfast]; 마킨토쉬(Mackintosh) 등의 문헌 ["The use of a hardjo-pomona vaccine to prevent leptospiruria in cattle exposed to natural challenge with Leptospia interrogans serovar hardjo", New Zealand Vet. J. 28: 174-177, 1980]; 볼린(Bolin) 등의 문헌 ["Effect of vaccination with a pentavalent leptopsiral vaccine on Leptospira interrogans serovar hardjo type hardjo-boivs infection of pregnant cattle", Am. J. Vet. Res. 50: 161-165, 1989]에 기술되어 있다.
본 발명에 따라, 조합 백신은 일반적으로 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 이전 본원에서 기술된 바와 같이, 수의학적으로 허용 가능한 담체는 용매, 분산 매질, 코팅, 애주번트, 안정화제, 희석제, 방부제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제, 흡착 지연제 등 중 임의의 또는 이들 모두를 포함한다. 희석제는 물, 염수, 덱스트로스, 에탄올, 글라이세롤 등을 포함할 수 있다. 등장화제는 다른 것들 중 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨, 및 락토스를 포함할 수 있다. 안정화제는 다른 것들 중 알부민을 포함한다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 애주번트로는, 몇몇 애주번트 부류, 예컨대 미네랄 염, 예컨대 Alum, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트 및 칼슘 포스페이트; 계면활성제 및 미립자, 예컨대, 비이온성 블록 중합체 계면활성제(예컨대, 콜레스테롤), 비로솜, 사포닌(예컨대, Quil A, QS-21 및 GPI-0100), 프로테오솜, 면역 자극 착체, 코클레에이트, 4차 아민(다이메틸 다이옥카타데실 암모늄 브로마이드(DDA)), 아브리딘, 바이타민 A, 바이타민 E; 박테리아 생성물, 예컨대 RIBI 애주번트 시스템(리비 인코포레이티드), 미코박테리룸 플레이의 세포벽 골격(Detox(등록상표)), 무라밀 다이펩타이드(MDP) 및 트라이펩타이드(MTP), 모노포스포릴 지질 A, 바실루스 칼메테-구에린, 열-불안정한 이 콜라이 엔테로톡신, 콜레라 독소, 트레할로스 다이미콜레이트, CpG 올리고데옥스뉴클레오타이드; 시토카인 및 호르몬, 예컨대, 인터류킨(IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18), 그래뉼로사이트-마크로파지 콜로니 자극 인자, 데하이드로에피안드로스테론, 1,25-다이하이드록시 바이타민 D3; 폴리아니온, 예컨대 덱스트란; 폴리아크릴릭(예컨대, 폴리메틸메트아크릴레이트, Carbopol 934P); 담체, 예컨대 테타누스 톡시드, 딥테리아 톡시드, 콜레라 독소 B 서브유닛, 엔테로톡시제닉 이 콜라이의 돌연변이체 열-불안정한 엔테로톡신(rmLT), 열 쇼크 단백질; 수중유적형 유화액, 예컨대 AMPHIGEN(등록상표)(하이드로닉스, 미국); 및 유중수적형 유화액, 예컨대 프로인트의 완전 및 불완전 애주번트가 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
본 발명의 조합 백신에 사용하기에 바람직한 애주번트는 Quil A 및 콜레스테롤를 포함한다.
p68 항원, 다른 병원체로부터의 하나 이상의 항원 및 수의학적으로 허용 가능한 담체는 임의의 편리하고 실제적인 방식으로, 예컨대 혼합, 용해, 현탁, 유화, 캡슐화, 흡수 등에 의해 조합되어 백신 조성물을 형성할 수 있으며, 배합물, 예컨대 주사, 이식, 흡입, 섭취 등에 적합한, 정제, 캡슐, 분말, 시럽, 현탁액으로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 백신은 이것이 개에게 약 0.1 내지 5㎖, 바람직하게는 약 0.5 내지 2.5㎖, 더욱 바람직하게는 약 1㎖의 투여량으로 주입함으로써 투여되도록 배합된다.
본 발명에 따라, p68 조합 백신은 생후 6주 이상, 바람직하게는 생후 7주 이상, 더욱더 바람직하게는 생후 8 또는 9주의 개에게 투여될 수 있다. 임의의 공지된 경로, 예컨대 경구, 비강내, 점막 국부, 경피 및 비경구(예컨대, 정맥 내, 복강 내, 피부 내, 피하 또는 근육 사이)를 통해 개에 투여될 수 있다. 또한, 니들-부재 전달 장치를 사용하여 투여가 달성될 수 있다. 조합 경로, 예컨대 비경구 경로를 사용하는 제 1 투여 및 점막 경로를 사용하는 후속 투여를 사용하여 투여가 달성될 수 있다. 투여의 바람직한 경로는 피하 및 근육 사이 투여를 포함한다.
바람직한 p68 조합 백신 및 백신접종 방법
본 발명의 바람직한 조합 백신은 CD 바이러스의 약독화 균주, CAV-2의 약독화 균주, CPI 바이러스의 약독화 균주, CPV의 약독화 균주, CCV 균주의 비활성화 제조물, 및 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원을 포함한다.
특히 바람직한 조합 백신으로는, "Snyder Hill" 균주(국립수의국 실험실(National Veterinary Service Laboratory), 아이오아주 에임즈 소재)로 지칭되는 약독화 CD 바이러스 균주, "Manhattan" 균주(국립수의국 실험실, 아이오아주 에임즈 소재)로 지칭되는 약독화 CAV-2 균주, "NL-CPI-5"(국립수의국 실험실, 아이오아주 에임즈 소재)로 지칭되는 약독화 CPI 바이러스 균주, "NL-35-D"(국립수의국 실험실, 아이오아주 에임즈 소재)로 지칭되는 약독화 CPV 균주, "NL-18"(국립수의국 실험실, 아이오아주 에임즈 소재)로 지칭되는 CCV 균주의 비활성화 제조물, 및 서열번호 1의 서열을 갖는 재조합 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원이 포함된다. 본원에서 "p68/5CV 조합 백신"으로도 또한 언급되는 이러한 조합 백신은, 바람직하게는 약독화 바이러스 균주 및 바이러스 제조물의 동결-건조된 제조물을 액체 제조물과 함께 재수화(rehydrating)시킴으로써 제조되며, 상기 액체 제조물은 멸균 염수 용액 중에 용해되고 Quil A 및 콜레스테롤로 애주번트화된 p68 항원으로 구성된다.
또 다른 특히 바람직한 조합 백신으로는, p68/5CV 조합 백신의 항원 성분, 및 5개의 렙토스피라 종류, 즉 렙토스피라 브라티스라바(예컨대, 국립수의국 실험실로부터 입수 가능한 렙토스피라 브라티스라바 균주, 아이오아주 에임즈 소재), 렙토스피라 카니콜라(예컨대, 균주 C-5, 국립수의국 실험실, 아이오아주 에임즈 소재), 렙토스피라 그립포티포사(예컨대, 균주 MAL 1540, 국립수의국 실험실, 아이오아주 에임즈 소재.), 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에(예컨대, 균주 NADL 11403, 국립수의국 실험실, 아이오아주 에임즈 소재) 및 렙토스피라 포모나(예컨대, 균주 T262, 국립수의국 실험실, 아이오아주 에임즈 소재)의 비활성화 전세포 제조물이 포함된다. 본원에서 p68/5CV-렙토스피라 조합 백신"으로도 또한 언급되는 이러한 조합 백신은, 바람직하게는 약독화 바이러스 균주의 동결-건조된 제조물(또는, 다른 방법, 예컨대 분무 건조 또는 탈수에 의한 제조물) 및 바이러스 제조물을 액체 제조물과 함께 재수화시킴으로써 제조되며, 상기 액체 제조물은 멸균 염수 용액 중에 용해되고 Quil A 및 콜레스테롤로 애주번트화된 p68 항원 및 렙토스피라 항원으로 구성된다.
본 발명에 따라, p68/5CV 및 p68/5CV-렙토스피라 조합 백신은 건강한 생후 4주 이상, 바람직하게는 생후 6주 이상의 개에게 바람직하게는 각각이 약 3주 간격으로 투여되는 3회 투여로 투여될 수 있다. 개는 연간 단일 투여로 재백신접종될 수 있다. 보르데텔라 브론키셉티카 및 개 바이러스가 예컨대 번식, 탑승 및 연출 상황과 같이 노출되는 경우, 이들 상황이 발생한 지 1년 이내, 바람직하게는 6개월 이내에 추가 부스터가 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 조합 백신으로는 CD 바이러스의 약독화 균주, CAV-2의 약독화 균주, CPI 바이러스의 약독화 균주, CPV의 약독화 균주, 및 재조합 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원이 포함된다.
특히 바람직한 조합 백신으로는, "Snyder Hill" 균주(국립수의국 실험실, 아이오아주 에임즈 소재)로 지칭되는 약독화 CD 바이러스 균주, "Manhattan" 균주(국립수의국 실험실, 아이오아주 에임즈 소재)로 지칭되는 약독화 CAV-2 균주, "NL-CPI-5"(국립수의국 실험실, 아이오아주 에임즈 소재)로 지칭되는 약독화 CPI 바이러스 균주, "NL-35-D"(국립수의국 실험실, 아이오아주 에임즈 소재)로 지칭되는 약독화 CPV 균주, 및 서열번호 1의 서열을 갖는 재조합 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원이 포함된다. 본원에서 "p68/DA2PP 조합 백신"으로도 또한 언급되는 이러한 조합 백신은, 바람직하게는 약독화 바이러스 균주의 동결-건조된 제조물(또는, 다른 방법, 예컨대 분무 건조 또는 탈수에 의한 제조물)을 액체 제조물과 함께 재수화시킴으로써 제조되며, 상기 액체 제조물은 멸균 염수 용액 중에 용해되고 Quil A 및 콜레스테롤로 애주번트화된 p68 항원으로 구성된다.
또 다른 특히 바람직한 조합 백신로는, p68/DA2PP 조합 백신의 항원 성분, 및 2개의 렙토스피라 종류, 즉 렙토스피라 카니콜라(예컨대, 균주 C-51, 국립수의국 실험실, 아이오아주 에임즈 소재) 및 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에(예컨대, 균주 NADL 11403, 국립수의국 실험실, 아이오아주 에임즈 소재)의 비활성화 전세포 제조물이 포함된다. 다르게는, 바람직한 조합 백신으로는, p68/DA2PP 조합 백신의 항원 성분, 및 5개의 렙토스피라 종류, 즉 렙토스피라 브라티스라바, 렙토스피라 카니콜라, 렙토스피라 그립포티포사, 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에 및 렙토스피라 포모나의 비활성화 전세포 제조물이 포함된다. "p68/DA2PP-렙토스피라 조합 백신"으로도 또한 언급되는 이들 조합 백신은, 바람직하게는 약독화 바이러스 균주의 동결-건조된 제조물(또는, 다른 방법, 예컨대 분무 건조 또는 탈수에 의한 제조물) 및 바이러스 제조물을 액체 제조물과 함께 재수화시킴으로써 제조되며, 상기 액체 제조물은 멸균 염수 용액 중에 용해되고 Quil A 및 콜레스테롤로 애주번트화된 p68 항원 및 렙토스피라 항원으로 구성된다.
본 발명에 따라, p68/DA2PP 및 p68/DA2PP-렙토스피라 조합 백신은, 건강한 생후 6주 이상, 바람직하게는 생후 8주 이상의 개에게 바람직하게는 각각이 약 3주 간격으로 투여되는 2회 투여로 투여될 수 있다. 단일 투여는 생후 12주 이상의 개에게 적합할 것이다. 개는 연간 단일 투여로 재백신접종될 수 있다. 보르데텔라 브론키셉티카 및 개 바이러스가 예컨대 번식, 탑승 및 연출 상황과 같이 노출되는 경우, 이들 상황이 발생한 지 1년 이내, 바람직하게는 6개월 이내에 추가 부스터가 제공될 수 있다. 또 다른 바람직한 조합 백신으로는, p68 항원, 바람직하게는 서열번호 1을 갖는 재조합 p68 항원, 및 CPI의 약독화 균주가 포함된다.
또 다른 바람직한 조합 백신으로는, p68 항원, 바람직하게는 서열번호 1을 갖는 재조합 p68 항원, CPI의 약독화 균주, 및 2개의 2개 이상의 렙토스피라 종류, 예컨대 렙토스피라 카니콜라(예컨대, 균주 C-51, 국립수의국 실험실, 아이오아주 에임즈 소재) 및 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에(예컨대, 균주 NADL 11403, 국립수의국 실험실, 아이오아주 에임즈 소재)가 포함된다.
본 발명의 조합 백신에서 하나 이상의 다른 병원체로부터의 p68 항원(들)의 양은 면역학적으로 효과적이어야 한다. 일반적으로, 조합 백신 중의 p68 항원은 약 0.5㎍/투여량 이상의 양으로 존재해야 한다. 약독화 CD 바이러스는 적어도 투여량당 약 102 내지 약 109 TCID50(조직 배양 전염성 투여량 50% 세포병변 효과(cytopathic effect)), 및 바람직하게는 약 104 내지 약 106 TCID50/투여량의 양으로 존재해야 한다. 약독화 CAV-2는 적어도 약 102 내지 약 109, 바람직하게는 104.0 내지 약 106.0 TCID50/투여량의 양으로 존재해야 한다. 약독화 CPI 바이러스는 적어도 약 102 내지 약 109, 바람직하게는 106 내지 약 108 TCID50/투여량의 양으로 존재해야 한다. 약독화 CPV는 적어도 약 102 내지 약 109, 바람직하게는 107 내지 약 109 TCID50/투여량의 양으로 존재해야 한다. 비활성화 바이러스 제조물 중의 CCV의 양은 투여량당 약 100 이상, 바람직하게는 1000 내지 4500 상대 단위로 존재해야 한다. 백신 중의 각각의 렙토스피라 종류는 백신 투여량당 약 100 내지 3500NU(혼탁 단위(nephelometric units)), 바람직하게는 200 내지 2000NU로 존재해야 한다.
조합 백신은 상기 백신이 개에게 0.1 내지 5㎖, 바람직하게는 0.5 내지 2.5㎖, 더욱 바람직하게는 약 1㎖의 투여량으로 주입함으로써 투여되도록 배합된다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예를 통해 추가로 설명한다.
실시예 1
개 보르데텔라 p68 재조합 항원 투여량 적정 연구
백신:
실험 백신 항원은 이 콜라이 균주 LW68에 의해 제조된 보르데텔라 브론키셉티카의 재조합 p68 외막 단백질(서열번호 1)이었다. 백신은 변하는 수준의 SDS(소듐 도데실 설페이트)를 함유하고, p68을 용해시키고, 1㎖ 투여량 중의 QAC(Quil A/50㎍ 콜레스테롤) 50㎍으로 애주번트화하였다.
유발접종 물질:
보르데텔라 브론키셉티카, 개 격리물(isolate) #85B, 패시지(passage) #3, lot #051597의 에어로졸을 유발접종 물질로서 사용하였다. 평균 플레이트 카운트는 1.59 X 108 CFU/㎖이었다.
동물:
60마리의 수컷 및 암컷 강아지를 6개의 처리 그룹 중 하나에 랜덤하게 배치하였다(그룹당 10마리의 강아지). 강아지를 사육하고, 제 1 백신접종 41일 전에 기관 면봉(trachea swab)들을 취하고, 다시 제 1 백신접종 28일 전에 기관 면봉들을 취하였으며, 임의의 양성혈청반응성 또는 배양 양성 동물을 연구로부터 제거하였다.
동물을 랜덤화 완전 블록 디자인에 따라 처리 및 방에 랜덤하게 할당하였다. 백신 할당 그룹에 대해 알지 못한 상태로 백신접종 후 관찰을 실시하였다.
디자인:
절차:
IVP 투여:
동물을 플라세보 또는 실험 백신으로 0일자에 백신접종시켰다. 제 2 백신접종을 21일자에 투여하였다. 제 1 백신접종을 우편 목에 피하 투여하고, 제 2 백신접종을 좌편 목에 피하 투여하였다.
유발접종 투여:
모든 동물을 보르데텔라 브론키셉티카의 에어로졸로 제 2 백신접종한지 28일 후에 유발접종하였다. 동물을 유발접종한지(51 내지 63일) 2 내지 14일 후에 매일 2회(오전 1회 및 오후 1회) 30분 동안 기침에 대해 모니터링하였다.
관찰 및 샘플 수거:
모든 주입 부위를 각 백신접종한지(0 내지 7일 및 21 내지 28일) 7일 동안 및 각 백신접종한지(14일 및 35일) 14일 후에 3차원적으로 만져보고 측정하였다.
직장 온도를 백신접종 일자에 및 각 백신접종한(0 내지 3일 및 21 내지 24일) 후 3일 동안 기록하였다.
백신접종한 일(0일 및 21일)자에 및 42, 50 및 63일자에 수거하고, 보르데텔라 브론키셉티카로부터 정제된 p68 단백질에 대한 특이적 항체에 대해 ELISA에 의해 검정하였다. 혈액을 또한 42, 49, 50, 52, 54, 56 및 58일자에 수거하고, 혈청 아밀로이드 A(SAA)에 대해 분석하였다.
모든 동물을 보르데텔라 브론키셉티카 격리를 위해 기관 면봉처리하고, 혈액을 백신접종하기(판매업자에게서, 41일 및 28일자에) 전에 및 49일자에 보르데텔라 브론키셉티카 응집(agglutination) 적정량을 위해 수거하였다.
보르데텔라 P68 개 및 마우스 항체 적정 DAB ELISA
정제된 선천 p68을 0.01M 보레이트 완충액 중의 600ng/㎖로 희석시키고, 각각의 웰에 100㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새도록 항온처리하였다. 그 다음, 플레이트를 과량의 PBS-Tween 20으로 1회 세척하였다. PBS 중의 1% 탈지 분유를 플레이트에 200㎕/웰로 첨가하였다. 그 다음, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 플레이트를 과량의 PBS-Tween 20으로 1회 세척하였다.
개 또는 마우스 혈청을 ELISA 플레이트의 상부 열에 1:50 희석으로 첨가하고, 2배의 연속 희석된 혈청을 플레이트 아래로 모두 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 후속적으로, 플레이트를 과량의 PBS-Tween 20으로 3회 세척하였다.
상기 개 혈청으로 항온처리된 플레이트에, 1:2000 희석으로 희석된 퍼옥시다제-표지된 염소 안티-개 IgG(H+L)를 100㎕/웰로 첨가하였다. 그 다음, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 상기 마우스 혈청으로 항온처리된 플레이트에, 1:4000 희석으로 희석된 퍼옥시다제-표지된 염소 안티-마우스 IgG(H+L)를 100㎕/웰로 첨가하였다. 그 다음, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 플레이트를 과량의 PBS-Tween 20로 3회 세척하였다.
ABTS 기질을 100㎕/웰로 첨가하였다. 약 20분 후, 몰레큘라 디바이스즈(Molecular Devices) 또는 동등의 플레이트 판독기(reader)를 사용하여 405 내지 490㎚에서 플레이트를 판독하였다.
DATA 분석:
피셔즈 이그젝트 테스트(Fisher's Exact Test)를 사용하여 개의 기침 수에서의 처리 차이들을 시험하였다. 5% 유의 수준을 사용하였다.
종합적 선형 복합 모델(general linear mixed model)을 사용하여 분석하기 전에 ELISA 적정량을 로그 변환시켰다. 처리 차이들을 변환시키기 위해 95% 신뢰 수준을 사용하였다. 유발접종 관찰을 각기 30분 동안 매일 2회 모니터링하였다.
결과:
기관 면봉 배양 및 응집 적정량
연구에 등록된 동물의 보르데텔라 브론키셉티카 상태(status)를 모니터링하기 위해 기관 면봉 배양 및 응집 적정량을 평가하였다. 다수의 개에서는, 여러 시점에서 적정량이 증가하지만 유발접종 전에는 128 초과로 적정량이 증가하지 않음이 입증되었다.
주입 부위 관찰
제 1 백신접종 후 주입 부위 반응은 하기 표 1에 제시한다. 가장 큰 주입 부위 반응이 T05(64㎍) 백신접종된 동물에서 관찰되며, 가장 큰 평균 주입 부위 반응은 단지 14.69㎤이다(백신접종 후 2일). T03(4㎍), T04(16㎍) 및 T06(256㎍) 백신접종된 동물에서는, 백신접종 후 7일까지 여러 주입 부위 반응이 입증되었다. T02 1㎍) 백신접종된 동물에서만, 백신접종 후 1일자의 반응이 입증되었다. 백신접종 후 7일까지는 처리 그룹 중 주입 부위 반응에서의 통계학적으로 유의한 차이가 없었다. 14일까지는 모든 주입 부위 반응이 없어졌다.
제 2 백신접종 후 주입 부위 반응은 하기 표 2에 제시한다. 제 2 백신접종 후, 가장 큰 평균 주입 부위 반응이 T06(256㎍)에서 관찰되며, 가장 큰 평균 주입 부위 반응은 50.03㎤이었다(백신접종 후 1일). 주입 부위 반응은 제 2 백신접종 후 7일까지 T05(64㎍) 및 T04(16㎍) 동물에서 입증되었다. 최소 주입 부위 반응은 백신접종 후 7일까지 T03(4㎍) 및 T02(1㎍) 동물에서 입증되었다. 플라세보 그룹과 통계학적으로 상이하지 않은 주입 부위 반응은, 백신접종 후의 T02(1㎍) 및 T03(4㎍)에서 입증되었다. 제 2 백신접종 후 14일 동안, 주입 부위 반응이 관찰되지 않았다.
제 1 백신접종 후 주입 부위 반응의 빈도는 하기 표 3에 제시한다. 제 1 백신접종 후 임의의 시간에서 나타나는 주입 부위의 가장 높은 전체 LSM 빈도(76%)는 T06(256㎍)을 사용하는 백신접종으로부터 초래되었다. 다음으로 가장 큰 빈도는 T05(64㎍)를 사용하는 제 1 백신접종 후 주입 부위의 72%가 반응을 나타내며, T04(16㎍)를 사용하는 제 1 백신접종 후 69%, 및 T03(4㎍)를 사용하는 제 1 백신접종 후 63%이었다. T02(1㎍)를 사용하는 제 1 백신접종에 따라 가장 낮은 빈도는 38%이었다.
제 2 백신접종 후 주입 부위 반응의 빈도는 하기 표 4에 제시한다. 각각의 백신에 대한 전체 LSM 빈도는 제 1 백신접종 후에 관찰되는 것과 일치하였다.
백신접종 후 주입 부위 반응의 발병 및 기간은 하기 표 5에 요약한다. 측정 가능한 주입 부위 반응의 발병(또는 임의의 시간에서의 반응을 나타내는 개의 수)는 제 1 및 제 2 백신접종 후 T03, T04, T05 및 T06(각각 4㎍, 16㎍, 64㎍ 및 256㎍)에 대해 100%이었다. T02(1㎍)가 제공된 동물에서는 적어도 백신접종 후 주입 부위 반응의 발병이 입증되었다(57.1%).
반응 기간(표 5에서 제시된 반응과 함께 날짜들의 최소 제곱 평균으로서 표기됨)은, 제 1 및 제 2 백신접종 후 T04, T05 및 T06(각각 16㎍, 64㎍ 및 256㎍) 백신접종된 동물에 비해 더욱 길었다(제 1 백신접종 후 2.7 내지 5.1일, 및 제 2 백신접종 후 6.0 내지 6.7일). T02 및 T03(각각 1㎍ 및 4㎍) 백신접종된 동물에서는 제 1 및 제 2 백신접종 후 주입 부위 반응을 갖는 가장 적은 수의 날짜가 입증되었다(제 1 백신접종 후 0.3 및 1.3일, 및 제 2 백신접종 후 1.9 및 4.5일).
직장 온도
평균 직장 온도 측정치는 하기 표 6에 요약한다. 1 및 24일에서의 T02(1㎍), 1, 21 및 24일에서의 T03(4㎍), 2 및 24일에서의 T04(16㎍), 23일에서의 T05(64㎍), 및 0, 1 및 24일에서의 T06(256㎍)에 대한 LSM 직장 온도는 플라세보와 유의적으로 상이하였다. 23일에서, 모든 비교사항들은 플라세보와 통계학적으로 유의하지 않았다(P > 0.05).
p68 ELISA 혈청학
p68 ELISA 데이터의 요약은 하기 표 7에 제시한다. 모든 그룹에서 p68 ELISA 특이적 항체의 백신접종 전 기하학적 평균 바이러스 적정량은 낮았으며(24.9 내지 28.9 범위), 플라세보에 대한 적정량은 연구 기간 전반에 걸쳐 낮게 남아있었다. 제 1 백신접종 후 21일 동안, p68 ELISA 기하학적 평균 적정량은 백신접종된 처리에서 증가하였지만(55.2 내지 4,411.7 범위), T02(1㎍) 적정량은 플라세보(T01)와 통계학적으로 상이하지 않았다. 제 2 백신접종 후 42일 동안, 기하학적 평균 적정량은 모든 백신접종된 그룹에서 증가하였으며(674.6 내지 48,382.0 범위), 이는 우수한 백신접종에 대한 혈청학적 반응을 입증하는 것이다.
혈청 아밀로이드 A(SAA) 혈청학
SAA 적정량은 하기 표 8에 요약한다. 유발접종 전, 기하학적 평균 SAA 적정량은 모든 처리 그룹에서 낮았다(0.1 내지 0.5 범위). 유발접종 후, T01 GMT 적정량은 1.5 내지 146.0이었으며, 여기서 p68 처리 그룹은 0.3 내지 23.1이었다. 모든 처리 그룹은 50, 52, 54 및 56일자에서 플라세보와 통계학적으로 상이하였다. p68 백신들 중에서는 통계학적 차이들이 입증되지 않았지만, 단 다른 모든 p68 처리 그룹과 통계학적으로 상이한 기하학적 평균이 입증되는 경우 52일자 T02(1㎍)는 제외되었다.
유발접종 반응
유발접종 반응 데이터는 하기 표 9에 제시한다. 유발접종 후 기침을 모니터링함으로써 반응을 측정하고, 2개의 방법, 즉 기침하는 날짜의 최소 제곱 평균 수 및 기침하는 2일 연속 날짜(질환의 발병)를 사용하여 관찰을 분석하였다.
기침하는 날짜들의 평균 수의 분석에서는 p68 처리 그룹들 사이에서 통계학적으로 유의적인 차이가 없는 것으로 입증되었지만; 플라세보로 백신접종된 개에서는 평균 8.6일 기침한 반면, p68 백신이 투여된 개에서는 기침이 크게 감소되었으며, 평균 2.2 내지 4.7일이었다.
질환의 발병을 사용하여 개를 평가하는 경우, 모든 T01(플라세보)은 연속 2일 동안 기침하는 것으로 관찰되었다(질환의 100% 발병). T04(16㎍) 및 T05(64㎍) 백신접종된 개에서는 각각 55.6% 및 66.7%의 질환 발명이 입증되었다. 단지, T02(1㎍) 백신접종된 개의 28.6%, T03(4㎍) 백신접종된 개의 50% 및 T06(256㎍) 백신접종된 개의 33.3%에서 연속 2일 동안 기침하는 것으로 관찰되었다.
논의:
이 연구에서, 개에서 항원 투여량, 면역 반응 및 보호 사이의 관계를 구축하는 것이 목적이다. 검사된 p68 항원 투여량은 1, 4, 16, 64 및 256㎍이었다.
주입 부위 반응 측정의 분석에서는 p68 처리 그룹에서 무시해도 좋은 반응이 입증되었지만, 단 제 2 백신접종 후 1일자 T06(256㎍)은 제외되었다. 관찰된 반응은 작은 경향을 가졌으며, 일반적으로 관찰 기간 도안 크기의 감소를 나타낸다. 이들 반응의 크기는 임상적으로 무의미하며, 면도하지 않은 개에 대해서는 가장 크게 간과되었다.
백신접종 후 직장 온도는 현저하지 않으며, 모든 그룹 내의 모든 개에 대한 보통의 한계 범위 내에 속하였다.
백신접종에 대한 혈청학적 반응은 T03 내지 T06 그룹에서 탁월하였다. 이들 처리 그룹에서, 모두에서는 21 내지 63일에서 플라세보와 비교하는 경우 유의적으로 더욱 높은 p68 ELISA 적정량이 입증되었다. T02(1㎍)에서는 42 내지 63일에서 T01(플라세보)과 비해 유의적인 p68 ELISA 적정량이 입증되었다. 가장 높은 적정량이 T05(64㎍) 및 T06(256㎍)에서 관찰되었다.
유발접종 후 모든 p68 백신접종된 개에서 SAA 반응의 검사에서는 대조 개에 비교하는 경우 SAA 유발접종 후에 더욱 적은 상승이 나타났다. 유발접종 후 p68 백신 투여량 수준 사이에서 차이가 없는 것으로 입증되었지만, 단 52일자 T02(1㎍)는 다른 모든 p68 처리 그룹과 통계학적으로 상이한 기하학적 평균이 입증되었다.
유발접종 후, 기침한 날짜의 수 또는 연속 2일 기침한 날짜(질환의 발병)의 수의 최소 제곱 평균(LSM)을 사용하여 기침 관찰을 분석하였다. 기침하는 날짜의 LSM를 사용함으로써, 플라세보와 모든 p68 백신접종된 그룹 사이의 유의적인 차이를 입증하였지만, 여러 p68 백신 투여량 수준들 사이에서는 차이점이 없는 것으로 입증되었다. 질환의 발병을 사용하면, T02(1㎍), T03(4㎍) 및 T06(256㎍) 백신접종된 개는 플라세보보다 유의적으로 적게 기침하였다.
결론:
연구를 실시함으로써 개에서 항원 투여량, 면역 반응 및 보호 사이의 관계를 구축하였다. 검사된 p68 항원 투여량은 1, 4, 16, 64 및 256㎍이었다.
모든 백신은 최소 주입 부위 반응, 보통 직장 온도 및 백신접종에 대한 역반응의 부재로 입증되는 바와 같이 안정하였다. 주입 부위 반응의 크기 및 이들 반응의 기간은 더욱 낮은 항원 처리 그룹들에서 낮았다. 백신접종에 대한 혈청학적 반응은 ELISA 적정량에 의해 측정할 경우 더욱 높은 항원 투여량 그룹에서 탁월하였으며, 이는 더욱 높은 혈청학적 반응을 입증하는 것이다. 비교 방법으로서 기침하는 LSM 날짜를 사용하는 경우, 모든 처리 그룹에서는 플라세보에 비교할 때 기침이 유의적으로 감소되는 것으로 입증되었다. 처리 그룹들 사이에 차이점이 주목되지 않았다. 연소 2일 기침하는 날짜(또는 질환의 발병)가 비교를 위해 사용되는 경우, T02(1㎍), T03(4㎍) 및 T06(256㎍) 백신접종된 개는 플라세보보다 유의적으로 적게 기침하였다.
실시예 2
개 보르데텔라 p68 면역원성 연구
동물
45마리 수컷 및 암컷 잡종 개를 구입하였다. 강아지가 연구 장소에 도착한 일자에, MLV 파르보바이러스 백신을 모든 강아지에 투여하였다. 연구 기간 동안 실험 생성물 이외의 다른 백신을 강아지에 투여하지 않았다. 개들은 0일에 생후 약 9주(±1주)이었다(제 1 백신접종일).
유발접종 전 보르데텔라 및 다른 개 병원체에 노출되는 것을 방지하는데 필요로 하는 격리 설비 내에 개들을 보관하였다. 보르데텔라로 에어로졸 유발접종한 후, 다른 개 병원체에 노출되는 것을 방지하도록 격리 절차를 계속 유지하였다.
백신
플라세보 백신으로서 멸균 염수를 처리 그룹 T01 및 T02 중에 사용하였다. 개 재조합 p68 보르데텔라 브론키셉티카 백신을 처리 그룹 T03 및 T04 중에 사용하였다. p68 항원의 구조 유전자를 이 콜라이 내에서 클로닝하고, 유전자 발현을 온도 민감성 프로모터에 의해 규제하였다. 세포를 용해시키고, 봉입체를 원심분리에 의해 분리시켰다. 봉입체 내의 재조합 p68을 SDS 처리에 의해 용해시켰다. 희석제로서 멸균 염수(㎖) 중에서, 재조합 p68(15㎍/㎖)을 Quil A 50㎍/㎖ 및 콜레스테롤 50㎍/㎖과 합쳤다. 각각의 1㎖ 투여량에는 0.28%의 에탄올 및 0.01%의 치메로살(thimerosal)를 함유하였다.
유발접종 접종물(Challenge Inoculum)
바이올로직스 콘트롤 래보래토리즈-마이크로바이올로지(Biologics Control Laboratories-Microbiology)에 의해 현재 사용되고 있는 방법을 사용하여 유발접종 접종물로서 보르데텔라 브론키셉티카 Bihr Cat 균주를 제조하였다. Bordet-Genou 아가 플레이트를 평판시켰으며(plate), 보르데텔라 브론키셉티카-Bihr Cat 균주의 전면성장(confluent growth)이 나타나고, 48시간 동안 37.5 +/- 2.5℃에서 항온처Z리하였다. I기 병독성 콜로니를 선택하고, Bordet-Genou 아가 상에서 스트리킹하고(streak), 24시간 동안 37.5 +/- 2.5℃에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 보르데텔라 염수를 사용하여 아가로부터 콜로니를 세척하고, 항원을 600㎚에서 0.80의 광학 밀도로 희석시켰다. 혼탁측정기(nephelometer) 판독의 확인을 위해 유발접종 전후에 세포의 수를 세었다. 유발접종 표적 농도는 약 1 × 109 CFU이었다. 유발접종 전 농도는 2.37 × 109 CFU(100% I기)이고, 유발접종 후 농도는 1.35 × 109 CFU(100% I기)이었다.
연구 디자인
요약 표
백신접종부터 유발접종 일자까지의 기간 동안, 동물을 총체 블록 디자인에 따른 처리에 할당하였다. 처리는 방에 랜덤하게 할당하였다. 유발접종하는 날에는, 동물을 블록으로 유발접종 방에 랜덤하게 할당하였다.
할당된 처리 그룹에 대해 모르는 적임의 개인들이 주입 부위의 미생물학적 및 혈청학적 분석 및 평가, 직장 온도의 측정 및 기침의 관찰을 실시하였다.
데이터 분석
백신접종 후 반응 변수는 주입 부위 데이터, 직장 온도 및 p68 ELISA 적정량으로 이루어졌다. 주입 부위 데이터를 다음의 방법으로 요약하였다: 1) 처리 및 연구 날짜에 의해 측정 가능한 반응을 갖는 동물의 수, 2) 처리에 의해 측정 가능한 반응을 갖는 동물 시점의 수, 3) 처리에 의해 임의의 시점에 측정 가능한 반응을 갖는 동물의 수.
별도로 제 1 및 제 2 백신접종에서, 종합적 선형 복합 모델을 사용하여 주입 부위 부피(㎤), 직장 온도 및 자연 로그-변환된 p68 ELISA 적정량 데이터를 분석하였다.
각각의 관찰 시점에서 처리 그룹 차이를 시험하고 각각의 처리에서의 시점들을 비교하기 위해, 관찰 시점 최소 제곱 평균에 의한 처리의 선험적(priori) 선형 콘트라스트를 구성하였다. 모든 비교에서 5%의 유의 수준을 사용하였다.
유발접종 후 반응 변수는 일일 기침 관찰, p68 ELISA 적정량 및 혈청 아밀로이드 A 적정량으로 이루어졌다. 종합적 선형 복합 모델을 사용함으로써 유발접종 후 기간 동안의 기침 날짜 수를 분석하였다.
처리 그룹 차이를 시험하기 위해 처리 최소 제곱 평균의 선험적 콘트라스트를 구성하였다. 모든 비교에서 5%의 유의 수준을 사용하였다.
별도로 제 1 및 제 2 백신접종에서, 2일 연속 기침의 발병에 대해 피셔즈 이그젝트 테스트를 사용하여 처리 그룹들을 비교하였다. 모든 비교에서 5% 유의 수준을 사용하였다.
혈청 아밀로이드 A(SAA) 적정량 데이터 유발접종 후, 종합적 선형 복합 모델을 사용하여 분석하기 전에 자연 로그로 변환시켰다.
각각의 관찰 시점에서 처리 그룹 차이를 시험하고 각각의 처리에서 시점들을 비교함으로써, 관찰 시점 최소 제곱 평균에 의한 처리의 선험적 선형 콘트라스트를 구성하였다. 모든 비교에서 5%의 유의 수준을 사용하였다.
연구 절차
상세하게 설명된 동물 절차
45마리 음성혈청반응성(seronegative) 및 배양 네거티브 강아지를 4마리 처리 그룹 중 하나에 랜덤하게 할당하였다. 87마리 개를 각각 총 15마리 대조 개를 위해 근육 내(IM) 또는 피하(SC) 대조 그룹에 할당하였다. 15마리 개를 p68 SC 처리 그룹에 할당하고, 15마리 개를 p68 IM 처리 그룹에 할당하였다. 처리 그룹은 하기 연구 디자인 섹션에서 상세하게 설명된다.
0일은 제 1 백신접종의 날짜로 지정하였다. 0일에 백신접종하고, 21일 후에 반복적으로 수행하였다. 제 1 백신접종에서, 우측 목을 사용하고, 제 2 백신접종에서, 좌측 목을 사용하였다. 제 1 및 제 2 백신접종을 위해 각각 오른쪽 및 왼쪽 반막모양근(semimembranosus muscle)에 근육 내 주입을 실시하였다. 모든 주입 부위를 각각의 백신접종 후 7일 동안 3차원으로 측정하고, 백신접종 후 14일 동안 추적 측정을 실시하였다. 직장 온도를 백신접종일(백신접종 전) 및 각각의 백신접종 후 3일 동안 모니터링하였다.
35일에, 모든 동물을 보르데텔라 브론키셉티카 배양을 위해 기관 면봉을 실시하고, 혈액을 응집 적정량을 위해 수거하였다. 모든 동물은 기관 면봉에 의해 네거티브이고, 보르데텔라에 대해 혈청학적으로 네거티브이며, 유발접종에 적격인 것으로 생각되었다.
45일, 제 2 백신접종 후 24일에, 보르데텔라 브론키셉티카의 에어로졸 유발접종을 모든 개에게 투여하였다. 진정된 개의 주둥이 위에 편안하게 장착된 일회용 노즈 콘(nose cone)을 사용하여 상기 개를 유발접종하였다. 5.5 내지 6.0psi로 설정된 진공 압력 펌프에 부착된 분무기에 상기 노즈 콘을 부착시켰다. 유발접종 물질 1㎖를 분무기 내에 위치시키고, 에어로졸화된 유발접종 물질을 4분 동안 각각의 개에 투여하였다. 관찰자들은 처리 그룹 할당에 대해 인지하지 못하였다.
유발접종 후 14일 동안 기침에 대해 동물을 모니터링하였다(46 내지 59일). 각각의 날짜의 거의 동일한 시간에 약 30분 동안 관찰을 2개로 나누었으며, 하나는 AM에 실시하고, 하나는 PM에 실시하였으며, 결과를 기록하였다.
혈액 수거
응집 적정량을 위한 혈액을 제 1 백신접종 전 및 유발접종 전에 수거하였다. 안티-p68 ELISA 재평가를 위한 혈액을 백신접종 전 0 및 21일, 및 35, 45 및 59일에 수거하였다. 혈청 아밀로이드 A(SAA) 분석을 위한 혈액을 유발접종 날짜(45일), 및 46, 48, 50, 52 및 54일에 수거하였다.
샘플 상에서 실시된 시험
배양에 의한 보르데텔라 브론키셉티카의 존재에 대해 기관 면봉을 평가하였다. 각각의 기관 면봉을 보르데텔라 선택적 아가 플레이트 상으로 스트리킹시켰다. 포지티브 및 네거티브 대조군을 포함시켰다. 플레이트를 37.5 ± 2.5℃에서 48 ± 4시간 동안 항온처리하였다. 각각의 플레이트 상의 생성된 콜로니를 포지티브 대조군과 비교하고, 포지티브 대조군과 동일한 것으로 보여지는 임의의 콜로니를 보르데텔라 브론키셉티카의 존재를 확인하기 위해 추가로 시험하였다. 확인 시험에는 TSI, 시트레이트 및 유레아 아가, 및 나이트레이트 레드 매질(Nitrate Red media)의 사용이 포함되었다.
하기 방법들을 사용하여 혈청을 응집 적정량, p68 ELISA 분석 또는 SAA 분석을 위해 평가하였다.
보르데텔라 염수를 사용하여 응집 적정량-혈청을 연속적으로 미세적정량 플레이트 내에서 희석시켰다. 포지티브 및 네거티브 대조군을 각각의 플레이트 상에 포함시켰다. 보르데텔라 브론키셉티카 균주 87(Bordet Genou 아가 상에서 성장하고, 수확하고, 비활성화시키고, 630㎚에서 20% T로 희석시킴)을 응집성 항원으로서 사용하고, 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 진탕시키고, 2시간 동안 35 ± 2℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 22시간 동안 실온에서 제 2 항온처리 후 플레이트를 판독하였다. 50% 응집을 나타내는 최종 웰을 사용하여 종말점 적정량을 결정하였다.
p68 ELISA 적정량 - 재조합 p68 항원을 보르데텔라 p68 항원에 특이적인 다클론 항혈청으로 코팅된 96개 웰 미세적정량 플레이트 상에 포획하였다. 개 혈청의 연속적인 2배 희석액을 플레이트에 첨가하고, 항온처리하였다. 포지티브 및 네거티브 대조군을 1:1000 희석으로 각각의 플레이트 상에 포함시켰다. p68 항원에 특이적인 항체를 검출하기 위해, 퍼옥시다제-표지된 친화도 정제된 염소 안티-개 IgG 지시자 콘쥬게이트(indicator conjugate)를 사용하였다. 그 다음, 발색성 기질 ABTS를 첨가하고, 플레이트에서 포지티브 대조 웰이 1.2 + 0.2의 O.D.를 가질 경우를 판독하였다. 네거티브 대조 혈청 희석 + 5 표준 편차의 평균보다 큰 광학 밀도를 갖는 최종 희석의 역수로서 소정 샘플의 적정량을 계산하였다.
SAA 적정량- 미국 네브래스카주 68198 오마하 소재의 네브래스카 의료 센터 대학의 아큐플렉스 캄파니(Accuplex Co. University of Nebraska Medical Center)로부터 구입한 키트를 사용하여 개 혈청 아밀로이드 A 적정량을 평가하였다. 요약한다면, 단클론 안티-개 SAA 항체로 코팅된 미세적정량 플레이트 상에서 개 SAA를 포획하였다. 개 혈청의 희석된 샘플을 플레이트에 첨가한 후, 바이오틴-표지된 안티-개 항체 콘쥬게이트에 첨가하였다. 항온처리 후, 퍼옥시다제 콘쥬게이트된 스트렙트애비딘 발색성 기질을 첨가하였다. 플레이트를 30분 후에 판독하였다.
결과
직장 온도
직장 온도 측정의 요약을 하기 표 10 및 11에 제시한다.
제 1 백신접종 후의 임의의 날짜에서 임의의 그룹들 사이의 유의적인 차이가 주목되지 않았다. 21일자에 염수 백신접종된 개와 모든 p68 백신접종된 개 사이의 유의적인 차이(T01T02 v T03T04에 대해 p=0.0053)가 주목되었다. 24일자 p68 SC와 IM 백신접종 사이의 유의적인 차이 (p=0.0124)가 입증되었다.
주입 부위 반응
주입 부위 반응을 하기 표 12 및 13에 요약한다. 기술적 과실로 인해, 14일 관찰 및 이후 제 2 백신접종(35일)에서 주입 부위 관찰이 실시되지 못했다.
측정 가능한 부위 반응이 T03(p68 SC)에서 관찰되고, 크기는 최소이었다. 작은 주입 부위 반응이 3일자에 T04(p68 IM) 내의 1마리 개에서 주목되지만, 측정의 최소 충격은 그룹에 대한 전체 평균에 반영되지 않는다.
주입 부위 측정에서의 유의적인 차이를 하기 표 14에 요약한다. 제 1 백신접종 후 6일 동안, T02(염수 SC)와 T03(p68 15㎍ SC) 사이의 주입 부위 측정에서의 유의적인 차이가 주목되었다. 7일 및 다시 14일(2주 재평가 관찰)까지, 임의의 처리 그룹들 사이에서 유의적인 차이가 주목되지 않았다.
제 2 백신접종 후 7일 동안, T02(염수 SC)와 T03(p68 15㎍ SC) 사이의 주입 부위 측정에서의 유의적인 차이가 주목되었다.
p68 ELISA 적정량
p68 ELISA 데이터를 하기 표 15 및 도 1에 요약한다. 백신접종된 개에서 p68에 대한 상당한 적정량 반응으로 인해, 연구시 여러 시점에서 다양한 적정 최소량을 사용하였다. 0 및 21일에 대한 적정량을 50에서 시작하였다. 35, 45 및 59일에서, 적정량은 200에서 시작하였다. "미만"으로 기록된 임의의 값은 분석 전에 2로 나누었다. 연구 도중에 대조 그룹(T01 및 T02)에 대한 p68 ELISA 값에서 발견되는 증분 상승은, 이들 최소 적정 값 때문이다. 응집 적정량은 ＜4으로 잔존한다.
모든 p68 백신접종된 동물은 플라세보 백신접종된 동물과 비교할 때 적어도 백신접종의 제 1일로부터 유발접종일(0일 대 45일)까지의 적정량에서 4배 증가를 입증하였다.
백신접종 후 및 유발접종 후 ELISA 적정량의 최소 제곱 평균에 대한 유의적 차이를 하기 표 16에 나열한다. 백신접종이 완료된 후, p68 SC 및 p68 IM 백신접종된 동물들 사이의 유의적 차이가 주목되지 않았다.
혈청 아밀로이드 A 적정량
유발접종 후 0, 1, 3, 5, 7 및 9일자에 SAA 값을 측정하였다. 혈청 아밀로이드 A 값을 하기 표 17에 제시하고 도 2에 나타냈다.
SAA 적정량에서의 유의적 차이를 하기 표 18에 요약한다. 염수 대조군에서는 유발접종 후 1, 3 및 5일자에 백신접종된 개보다 높은 SAA 적정량이 입증되었다. 염수 SC 대조군에서는 유발접종 후 7 및 9일자에 백신접종된 SC 개와 비교할 경우 크게 높은 SAA 적정량이 계속적으로 입증되었다.
기침 관찰
모든 처리 그룹에 대한 에어로졸 유발접종은 제 2 백신접종 후 24일에 실시하였다(45일). 기침 관찰은 2개의 방법 - 연속 2일 기침(표 19에 제시됨) 및 기침하는 날짜(%)(표 20 및 21에 제시됨)에 기초한 질환 상태를 사용하여 검사하였다. 연속 2일 기침의 기준을 사용하여 개를 평가하는 경우, p68 백신접종된 개(SC 및 IM)의 80%가 적어도 연속 2일 동안 기침하는 반면, 염수 SC 및 염수 IM 백신접종된 개는 각각 100% 및 87.5% 기침하였다. 기침이 관찰된 날짜(%)를 사용하여 개를 평가하는 경우, p68 SC 및 IM 백신접종된 개는 각각 관찰된 날짜의 38.72% 및 41.05% 동안 기침하였다. 염수 SC 및 염수 IM 백신접종된 개는 각각 69.04% 및 62.66% 기침하였다.
질환 상태를 연속 2일 기침에 기초하는 경우, 염수 백신접종된 및 p68 백신접종된 개들 사이에 유의적 차이가 없는 것으로 입증되었다.
T02(염수 SC)와 T03(p68 15㎍ SC) 사이의 유의적 차이(p=0.0112)가 입증되었다. T01(염수 IM)과 T04(p68 15㎍ IM) 사이의 유의적 차이가 없음이 입증되었다.
염수 대조군과 p68-백신접종된 개 사이의 유의적 차이(p=0.0022)가 입증되었다.
논의
개에서 p68 보르데텔라 15㎍/투여량 백신의 안정성 및 효능이 입증되도록 연구를 디자인하였다.
주입 부위 및 직장 온도 관찰을 사용하여 안정성을 검사하였다. 주입 부위 반응 측정의 분석에서는, IM 백신접종된 그룹에서 무시해도 좋은 반응 및 SC 백신접종된 그룹에서 최소 반응이 입증되었다. 관찰된 반응은 작은 경향을 가지며, 이는 일반적으로 관찰 기간 동안 크기가 감소된다. 이들 반응의 크기는 면도하지 않은 개에 대해 가장 간과되었다. 유의적 차이가 21일자에 염수와 백신접종된 개에서 관찰되고, 24일자에 IM과 SC 백신접종 사이에서 관찰되며, 직장 온도는 임상적으로 현저하지 않고, 모든 그룹 내의 모든 개에 대한 보통의 한계 내에 속하는 것이었다.
p68 ELISA 종말점 적정량 및 기침의 측정에 대해 관찰함으로써 효능을 검사하였다. 투여 경로와 관계없이, 35일까지 p68-백신접종된 그룹에서 우수한 p68 항체 반응이 입증되었다. 우수한 기억촉진 반응이 백신접종 유발접종 후에 관찰되었다. 비록 더욱 높은 항체 반응이 SC 경로와 비교하여 더욱 혈관이 많고(more vascular) 덜 지방이 있는 IM 경로에서 통상적으로 얻어졌지만, p68 SC와 IM 백신접종 사이의 차이는 연구 과정을 통해 유의적이지 않았다.
유발접종 후 백신접종된 및 백신접종되지 않은 p68 보르데텔라 개에서의 SAA 반응에 대한 검사에서는, 백신접종된 동물 그룹에서 특히 유발접종 후 1, 3 및 5일자에 SAA 값에서 매우 적은 상승이 나타났다.
결론
이 연구에서, 백신접종 24일 후의 개 유발접종 모델을 사용하여 15㎍/투여량 p68 개 보르데텔라 백신의 효능을 검사하였다. 백신은 보통의 직장 온도 및 최소 주입 부위 반응에 의해 입증되는 바와 같이 안정하고, 효능은 합쳐진 IM와 SC 그룹에서 입증되었다. SAA 값들의 비교에서는 에어로졸 유발접종 후 1, 3 및 5일자에 염수 및 p68 백신접종된 개 사이의 유의적 차이가 입증되었다.
실시예 3
개 보르데텔라 p68 백신에 대한 6개월 면역 연구
동물
90마리 수컷 및 암컷 잡종 개를 구입하고, 대부분의 강아지는 제 1 백신접종 일자에 생후 9주(±1주)이었다.
연구 장소에 도착한 일자에, MLV 파르보바이러스 백신을 개에 투여하였다. 연구에 적합하도록, 기관 면봉 및 응집 적정량에 의해 동물을 측정하였으며, 보르데텔라 브론키셉티카에 대해 네거티브이었다. 연구 기간 동안 실험 생성물 이외의 다른 백신을 투여하지 않았다.
유발접종 전 보르데텔라 브론키셉티카 및 개 병원체에 노출되는 것을 방지하는데 필요로 하는 격리 설비 내에 개들을 보관하였다. 보르데텔라 브론키셉티카로 에어로졸 유발접종한 후, 다른 개 병원체에 노출되는 것을 방지하도록 격리 절차를 계속 유지하였다.
백신
플라세보 백신으로서 멸균 염수를 처리 그룹 T01 및 T02 중에 사용하였다. 개 재조합 p68 보르데텔라 브론키셉티카 백신을 처리 그룹 T03 및 T04 중에 사용하였다. p68 항원의 구조 유전자를 이 콜라이 내에서 클로닝하고, 유전자 발현을 온도 민감성 프로모터에 의해 규제하였다. 세포를 용해시키고, 봉입체를 원심분리에 의해 분리시켰다. 봉입체 내의 재조합 p68을 SDS 처리에 의해 용해시켰다. 별도로, 희석제로서 멸균 렙토(Lepto) 염수(㎖) 중에서, p68 15㎍ 및 p68 60㎍을 Quil A 50㎍/㎖ 및 콜레스테롤 50㎍/㎖과 합쳤다. 합쳐진 성분들을 24시간 동안 4℃에서 혼합시키고, 마이크로유동화제(microfluidizer)를 통해 3회 통과시켰다. 각각의 1㎖ 투여량에는 에탄올 2.7㎕ 및 0.0001%의 치메로살을 함유하였다. 실험 백신 중의 p68 농도를 p68 ELISA에 의해 측정하였다. 모든 분석을 5회 반복하여 실시하였다. 모든 백신을 조립체 6개월 이내에 사용하였다.
유발접종 접종물
Bordet-Genou 아가 플레이트를 보르데텔라 브론키셉티카-Bihr Cat 균주로 평판시키고, 48시간 동안 37.5 +/- 2.5℃에서 항온처리하였다. I기 병독성 콜로니를 선택하고, Bordet-Genou 아가 상에서 스트리킹하고, 24시간 동안 37.5 +/- 2.5℃에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 보르데텔라 염수를 사용하여 아가로부터 콜로니를 세척하고, 항원을 600㎚에서 0.80의 광학 밀도로 희석시켰다. 혼탁측정기 판독의 확인을 위해 유발접종 전후에 세포의 수를 세었다. 유발접종 표적 농도는 약 1 × 109 CFU이었다. 제 I 그룹에서, 유발접종 전 농도는 1.94 × 109이고, 유발접종 후 농도는 1.43 × 109이었다. 제 II 그룹에서, 유발접종 전 농도는 2.55 × 109이고, 유발접종 후 농도는 2.13 × 109이었다.
연구 디자인
요약 표
제 I 그룹에 48마리의 개 및 제 II 그룹에 42마리의 개로 이루어진 그룹 또는 2개의 기에서 연구를 수행하였다. 각 그룹에서 제 1 백신접종이 0일자에 이루어졌다. 이후, 제 2 백신접종이 20일자에 이루어졌다. 제 I 그룹 내의 실행은 제 II 그룹과 약 15일 차이가 났다. 최종 백신접종 181일 후에 보르데텔라 브론키셉티카로 개들을 에어로졸 유발접종하였다.
랜덤화/블라인딩
동물들을 완전 랜덤화 디자인에 따라 랜덤하게 처리하고 방에 랜덤하게 할당하였다.
각각의 연구 그룹 내에서 제 1 백신접종으로부터 유발접종 일자까지의 기간 동안, 랜덤화 계획을 사용하여 동물들을 랜덤하게 처리하고 방에 랜덤하게 할당하였다(방마다 3 내지 5마리 개).
유발접종 일자에, 예비 처리된 동물을 총체 블록 디자인을 사용하여 연구 그룹 내의 방을 유발접종하도록 랜덤화하였다.
할당된 처리 그룹에 대해 모르는 적임의 개인들이 미생물학적 및 혈청학적 분석, 및 기침 및 주입 부위에 대한 평가를 실시하였다.
데이터 분석
백신접종 후 반응 변수는 주입 부위 데이터, 직장 온도 및 p68 ELISA 적정량으로 이루어졌다. 주입 부위 데이터를 다음의 방법으로 요약하였다: 1) 처리 및 연구 날짜에 의해 측정 가능한 반응을 갖는 동물의 수, 2) 처리에 의해 측정 가능한 반응을 갖는 동물 시점의 수, 3) 처리에 의해 임의의 시점에 측정 가능한 반응을 갖는 동물의 수, 4) 각각의 동물에 대한 측정 가능한 반응의 기간.
별도로 제 1 및 제 2 백신접종에서, 종합적 선형 복합 모델을 사용하여 주입 부위 부피(㎤), 직장 온도 및 자연 로그-변환된 p68 ELISA 적정량 데이터를 분석하였다.
각각의 관찰 시점에서 처리 그룹 차이를 시험하고 각각의 처리에서의 시점들을 비교하기 위해, 관찰 시점 최소 제곱 평균에 의한 처리의 선험적 선형 콘트라스트를 구성하였다. 해당 특정 비교는 T01 vs. T03, T01 vs. T05, T03 vs. T05, T02 vs. T04, T02 vs. T06, 및 T04 vs. T06이었다. 시점-처리-연구 그룹 상호작용 기간은 P＜0.05에서 유의적이면, 각 시점에서 처리 그룹들 중 및 처리 그룹 내의 시점들 중의 콘트라스트는 각 연구 그룹 내에 존재하는 반면, 이들 콘트라스트는 시점-처리 상호작용 효과 최소 제곱 평균에 기초하였다. 모든 비교에서 5%의 유의 수준을 사용하였다.
유발접종 후 반응 변수는 일일 기침 관찰, p68 ELISA 적정량, 혈청 아밀로이드 A 적정량 및 일일 기침 관찰로 이루어졌다. 유발접종 후 p68 ELISA 적정량은 전술된 바와 같이 분석하였다. 유발접종 후 혈청 아밀로이드 A(SAA) 적정량 데이터에서, 종합적 선형 복합 모델을 사용함으로써 분석 전에 적정량 값에 대해 자연 로그-변환시켰다.
기침에 대한 분석을 USDA 요건을 반영하도록 정정하였다. 각각의 개에서, 기침이 관찰되는 관찰 기간(%)을 계산하였다. 분석 전에, 아크사인(arcsin) 제곱근 변환을 사용하여 %를 변화시켰다. 기침에 대해 분석하기 위해 종합적 선형 복합 모델을 사용하였다.
이 분석으로부터 최소 제곱 평균을 역으로 %로 변환시키고, 기침에서의 감소(%)를 다음과 같이 계산하였다.
감소(%) = 100 ×[(대조군 평균 - 처리 그룹 평균) / (대조군 평균)]
시험 처리 그룹 차이를 시험하기 위해 처리 최소 제곱 평균의 선험적 선형 콘트라스트를 구성하였다. 해당 특정 비교는 T01 vs. T03, T01 vs. T05, T03 vs. T05, T02 vs. T04, T02 vs. T06, 및 T04 vs. T06이었다. 처리-연구 그룹 상호작용 기간이 P＜0.05에서 유의적이면, 처리 그룹들 중 콘트라스트는 각 연구 그룹 내에 존재하는 반면, 처리 그룹 중 콘트라스트는 처리 주요 효과 최소 제곱 평균에 기초하였다. 모든 비교에서 5%의 유의 수준을 사용하였다.
연구 절차
상세하게 설명된 동물 절차
연구 전제에 대해 도달하기 전 및 제 1 백신접종 전에, 강아지를 보르데텔라 브론키셉티카 배양 동안 기관 면봉처리하고, 응집 적정량을 위해 혈액을 수거하였다. 모든 동물은 기관 면봉에 의해 네거티브하고, 보르데텔라에 대해 혈청학적으로 네거티브하며, 연구에 대해 적격인 것으로 간주된다. 48마리 강아지를 제 I 그룹에 대해 6개의 처리 그룹 중 하나에 랜덤하게 할당하였다. 제 II 그룹에 대해 42마리 개를 사용하여 절차를 반복 수행하였다.
그룹 및 처리는 섹션 7.4A에서 상세하게 설명한다. 설비 규제 및 유발접종 후 기침 관찰의 정확도를 강화시키기 때문에, 백신접종 및 각각의 유발접종 기간은 15일 주기로 엇갈리게 하여 2개의 개 그룹을 생성시켰다. 제 2 백신접종을 20일 후에 실시하였다. 처리 T01, T03 및 T05를 피하 경로를 통해 투여하였다. 처리 T02, T04 및 T06을 근육 내 경로를 통해 투여하였다. 목의 뒤가쪽(dorsolateral) 양태로 피하 주입을 투여하였다. 제 1 백신접종에서, 목의 우측을 사용하였고, 제 2 백신접종에서, 목의 좌측을 사용하였다. 제 1 백신접종 및 제 2 백신접종을 위해 각각 우편 및 좌편 반막 근육에서 근육 내 주입을 투여하였다. 각각의 백신접종 후 7일 동안 모든 주입 부위를 3차원적으로 측정하였으며, 백신접종 후 14일 후처리 측정을 하였다. 직장 온도를 백신접종 일자(백신접종 전) 및 각각의 백신접종 후 3일 동안 모니터링하였다. 각각의 백신접종 전(-1일 및 10일) 및 50일자에, p68 ELISA 적정량 측정을 위해 혈액을 수거하였다.
매월, 모든 개를 보르데텔라 브론키셉티카 네거티브 상태를 확인하기 위해 진정 상태 하에 보르데텔라 브론키셉티카 배양을 위해 모든 개에 대해 기관 면봉을 실시하였다. 응집 및 ELISA 적정량을 위해 혈액을 또한 수거하였다. 각각의 그룹에 대한 유발접종 전에 7일 동안 절차를 반복 수행하였다. 포지티브 기관 면봉 배양 또는 증가하는 응집 적정량에 대한 증거로 인해 동물이 연구에서 배제되었다.
제 2 백신접종 후 181일 동안 개에 유발접종을 투여하였다. 진정된 개의 주둥이 위에 편안하게 고정된 일회용 노오즈 콘을 사용하여 진정된 개를 유발접종하였다. 5.5 내지 6.0psi로 설정된 진공 압력 펌프에 부착된 분무기에 상기 노즈 콘을 부착시켰다. 유발접종 물질 1㎖를 분무기 내에 위치시키고, 에어로졸화된 유발접종 물질을 4분 동안 각각의 개에 투여하였다.
유발접종 후, USDA 권고에 부합되도록 유발접종하기 전에 기침 관찰을 정정하였다. 유발접종 후, 총 8일 동안 유발접종 후 3일과 10일 사이에 각각의 개 그룹을 관찰하였다. 각 관찰 기간 동안 매일 2회 약 45분 동안 개의 기침에 대해 관찰하였다. 관찰 기간 사이의 간격은 약 12시간이었다. 할당된 치료 그룹에 대해 알지 못하는 개인이 기침 관찰을 기록하였다.
혈액 수거
응집 적정량을 위한 혈액을, 각 그룹에 대해 제 1 백신접종 전, 매월 및 유발접종 전에 수거하였다. 안티-p68 ELISA 평가를 위한 혈액을 제 1 및 제 2 백신접종 전, 50일자에 수거하며, 이후 각 그룹에 대해 약 30일 간격으로 수거하였다. 또한, 유발접종 일자 및 유발접종 후 관찰하는 최종 일자에 수거하였다.
혈청 아밀로이드 A(SAA) 분석을 위한 혈액을 각 그룹에 대해 유발접종 날짜(유발접종 전), 및 유발접종 후 1, 3, 5, 7 및 9일 동안 수거하였다.
샘플 상에서 실시된 시험
배양에 의한 보르데텔라 브론키셉티카의 존재에 대해 기관 면봉을 평가하였다. 각각의 기관 면봉을 보르데텔라 선택적 아가 플레이트 상으로 스트리킹시켰다. 포지티브 및 네거티브 대조군을 포함시켰다. 플레이트를 37.5 ± 2.5℃에서 48 ± 4시간 동안 항온처리하였다. 각각의 플레이트 상의 생성된 콜로니를 포지티브 대조군과 비교하고, 포지티브 대조군과 동일한 것으로 보여지는 임의의 콜로니를 보르데텔라 브론키셉티카의 존재를 확인하기 위해 추가로 시험하였다. 확인 시험에는 TSI, 시트레이트 및 유레아 아가, 및 나이트레이트 레드 매질의 사용이 포함되었다.
하기 방법들을 사용하여 혈청을 응집 적정량, p68 ELISA 분석 또는 SAA 분석을 위해 평가하였다.
보르데텔라 염수를 사용하여 응집 적정량-혈청을 연속적으로 미세적정량 플레이트 내에서 희석시켰다. 포지티브 및 네거티브 대조군을 각각의 플레이트 상에 포함시켰다. 보르데텔라 브론키셉티카 균주 87(Bordet Genou 아가 상에서 성장하고, 수확하고, 비활성화시키고, 630㎚에서 20% T로 희석시킴)을 응집성 항원으로서 사용하고, 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 진탕시키고, 2시간 동안 35 ± 2℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 22시간 동안 실온에서 제 2 항온처리 후 플레이트를 판독하였다. 50% 응집을 나타내는 최종 웰을 사용하여 종말점 적정량을 결정하였다.
p68 ELISA 적정량 - 재조합 p68 항원을 보르데텔라 p68 항원에 특이적인 다클론 항혈청으로 코팅된 96개 웰 미세적정량 플레이트 상에 포획하였다. 개 혈청의 연속적인 2배 희석액을 플레이트에 첨가하고, 항온처리하였다. 포지티브 및 네거티브 대조군을 1:1000 희석으로 각각의 플레이트 상에 포함시켰다. p68 항원에 특이적인 항체를 검출하기 위해, 퍼옥시다제-표지된 친화도 정제된 염소 안티-개 IgG 지시자 콘쥬게이트를 사용하였다. 그 다음, 발색성 기질 ABTS를 첨가하고, 플레이트에서 포지티브 대조 웰이 1.2 + 0.2의 O.D.를 가질 경우를 판독하였다. 네거티브 대조 혈청 희석 + 5 표준 편차의 평균보다 큰 광학 밀도를 갖는 최종 희석의 역수로서 소정 샘플의 적정량을 계산하였다.
SAA 적정량- 단클론 안티-개 SAA 항체로 코팅된 96웰 미세적정량 플레이트 상에서 개 혈청 아밀로이드 A를 포획하였다. 개 혈청의 희석된 샘플을 플레이트에 첨가하여 0.31 내지 20ng/㎖의 표준 곡선을 얻었다. 바이오틴-표지된 안티-개 항체 콘쥬게이트에 첨가하였다. 바이오틴-표지된 안티-개 항체의 항온처리 후, 퍼옥시다제 콘쥬게이트된 스트렙트애비딘을 첨가하였다. 발색성 기질 TMB를 첨가하고, 플레이트를 30분 후에 판독하였다. 샘플을 표준 곡선과 비교하고 적절한 희석 인자로 곱함으로써, 혈청 아밀로이드 A의 농도를 측정하였다.
결과
달리 지적되지 않는 한, 결과는 제 I 그룹과 제 II 그룹의 합쳐진 데이터이다.
기관 면봉 배양 및 응집 적정량
포지티브 기관 면봉 배양 및/또는 증가하는 응집 적정량을 연구 과정 동안 11마리 개에서 입증하였다. 이들 개 및 포지티브 개와 함께 사육된 임의의 개를 연구에서 제거하였으며, 20마리 개를 잃었다. 각 그룹으로부터 제거된 개의 수는 T01-4 개, T02-2 개, T03-3 개, T04-1 개, T05-5 개, T06-5개이었다.
주입 부위 관찰
주입 부위 반응을 하기 표 22 내지 25에 요약한다. 기술적 과실로 인해, 제 I 그룹에 대해 21일자에 Dog 81595를 위한 주입 부위 정보를 수거하지 못했다. 프로토콜은 22일자에 제 II 그룹에서 개에 대한 주입 부위 반응 데이터가 수거되지 않도록 정정되었으며, 따라서, 22일로부터 데이터 요약에는 제 I 그룹에서의 처리 그룹당 8마리 개로부터의 정보만을 함유하였다. 주입 부위 반응은 IM 처리한 임의의 개에서는 관찰되지 않았다. 주입 부위 측정은 SC 백신접종된 처리 그룹(T03 및 T05) 모두에서 최소이었다.
주입 부위 측정에서의 유의적인 차이를 하기 표 26에 요약한다. 제 1 백신접종 후 7일 동안, T01(염수 SC)와 T03(60㎍ SC) 사이의 주입 부위 측정에서의 유의적인 차이가 주목되었다. 제 1 백신접종 후 최초 4일 동안에만, T01(염수 SC)와 T05(15㎍ SC) 사이의 주입 부위 측정에서의 유의적인 차이가 주목되었다. 3 내지 7일자에, T03(60㎍ SC)와 T05(15㎍ SC) 사이에서의 유의적인 차이가 나타났다. 14일(2주 재평가 관찰)까지, 임의의 그룹들 사이에서 유의적인 차이가 주목되지 않았다.
제 2 백신접종 후 7일 동안, T03(60㎍ SC)와 T05(15㎍ SC)에 대한 T01(염수 SC) 사이의 주입 부위 측정에서의 유의적인 차이(P=0.0138)가 주목되었다. 23 내지 27일자에, T03(60㎍ SC)와 T05(15㎍ SC) 사이에서의 유의적인 차이가 나타났다. 34일(2주 재평가 관찰)까지, 임의의 그룹들 사이에서 유의적인 차이가 주목되지 않았다.
직장 온도
직장 온도 측정을 하기 표 27 및 28에 요약한다. 프로토콜은 22일자에 제 II 그룹에서 개에 대한 주입 부위 반응 데이터가 수거되지 않도록 정정되었으며, 따라서, 22일로부터 데이터 요약에는 제 I 그룹에서의 처리 그룹당 개로부터의 정보만을 함유하였다.
제 1 백신접종 후 1일자에 T02(염수 M)와 T04(60㎍ IM) 사이의 직장 온도에서의 유의적인 차이가 주목되었다. 제 2 백신접종 후의 임의의 날짜에서 임의의 그룹들 사이의 직장 온도에서 유의적인 차이가 주목되지 않았다.
p68 ELISA 적정량
유발접종 전 p68 ELISA 데이터를 하기 표 29에 요약한다. 19일자에 T06에서 제 I 그룹의 개의 반응으로 인해, p68 ELISA 적정량의 데이터 분석에서 효과가 나타났다. 효과가 작았으며, 다른 분석된 시점에 영향을 미치지 않았다. 따라서, 제 I 및 제 II 그룹으로부터 데이터를 기록 목적으로 합쳤다.
백신접종된 개에서 p68에 대한 상당한 적정량 반응으로 인해, 연구시 여러 시점에서 다양한 적정 최소량을 사용하였다. -1 및 19일에 대한 적정량을 50에서 시작하였다. 50 내지 195일에서, 적정량은 200에서 시작하였다. 201 및 211일자에 수거된 샘플에 대한 적정량을 1000에서 시작하였다. "미만"으로 기록된 임의의 값은 분석 전에 2로 나누었다. 연구 도중에 대조 그룹(T01 및 T02)에 대한 p68 ELISA 값에서 발견되는 증분 상승은, 이들 최소 적정 값 때문이다. 응집 적정량은 앞서 지적한 바를 제외하고 ＜4으로 잔존한다.
플라세보 백신접종된 동물은 50일자에 p68 적정량 ＜200을 가졌다. 모든 p68 백신접종된 동물은 플라세보 백신접종된 동물과 비교할 때 적어도 제 2 백신접종 후(0일 대 45일) 적정량에서 4배 증가를 입증하였다.
백신접종 후 ELISA 적정량의 최소 제곱 평균에 대한 유의적 차이를 하기 표 30에 나열한다. 백신접종 전(-1일), SC 대조군과 SC 백신접종된 동물 또는 IM 대조군관 IM 백신접종된 동물들 사이의 p68 ELISA 적정량에서의 유의적 차이가 주목되지 않았다.
연구 과정에서 측정된 p68 ELISA 적정량을 하기 표 31에 요약하며 도 3에 도시하였다.
연구 과정에서, 제 I 그룹과 제 II 그룹 사이의 활성을 매번 조정하고자 시도하였다. 추축 데이터 수거 시점(즉, 백신접종 및 유발접종 주위의 사건)에서, 이를 달성하였다. 연구 중의 3개의 예에서, 혈액 및 기관 면봉 수거는 그룹들 사이에서 1 또는 2일까지 변하였다. 이 사이 기간 동안 p68 ELISA 적정량을 요약 및 기록하기 위해, 이들 일자들로부터의 데이터를 조합하였다. 따라서, 79일은 79일(제 I 그룹) 및 81일(제 II 그룹)자로부터 조합된 데이터를 조합하고, 111일은 110일(제 II 그룹) 및 111일(제 I 그룹)에 상응하고, 169일은 169일(제 II 그룹) 및 170일(제 I 그룹)에 상응한다. 프로토콜마다, 50일을 제외하고는 p68 ELISA 적정량에 대한 데이터 분석을 실행하지 않았다.
기침 관찰
모든 그룹에 대한 에어로졸 유발접종은 제 2 백신접종 후 181일에 실시하였다(45일). USDA 권고에 부합하기 위해, 유발접종 후 3일 내지 8일에 약 12시간 간격으로 약 45분 동안 관찰하도록 기침 관찰을 정정하였다. 기침 관찰을 하기 표 32 및 33에 요약한다.
15㎍/투여량 그룹에 대한 기침 감소(%)는 염수 대조군과 비교할 때 51.55%이고, 60㎍/투여량 그룹에서는 11.09%이었다. 통계학적 유의적 차이를 하기 표 34에 요약한다.
혈청 아밀로이드 A
유발접종 후 0, 1, 3, 5, 7 및 9일자에 SAA 값을 측정하였다. 혈청 아밀로이드 A 값을 하기 표 35에 제시하고 도 4에 나타냈다.
SAA 적정량에서의 유의적 차이를 하기 표 36에 요약하였다.
논의
개에서 재조합 p68 보르데텔라 백신의 안정성 및 6개월 효능이 입증되도록 연구를 디자인하였다. 15㎍/투여량 및 60㎍/투여량 백신의 안정성이 입증되었다. 15㎍/투여량의 면역 6개월 기간 및 효능은 연구에 의해 잘 지지되었다.
주입 부위 및 직장 온도 관찰을 사용하여 안정성을 검사하였다. 주입 부위 반응 측정의 분석에서는, IM 백신접종된 그룹에서 무반응이 입증되고, 15㎍/투여량 및 60㎍/투여량 SC 백신접종된 그룹 모두에서 최소 반응이 입증되었다. 관찰된 반응은 15㎍/투여량 SC 백신접종된 개에서 작은 경향을 가졌다. 관찰되는 이러한 반응들은 14일 이내에 일반적으로 분해되는 일시적인 것이었다. 이들 반응의 크기는 주입 부위가 면도되지 않은 개에 대해 가장 간과되었다. 백신접종 후 직장 온도는 현저하지 않고, 모든 그룹 내의 모든 개에 대한 보통의 한계 내에 속하는 것이었다.
p68 ELISA 종말점 적정량 및 기침의 측정에 대해 관찰함으로써, 백신접종으로부터 181일 동안의 면역 기간 및 효능을 검사하였다. 염수 대조군에서 기침하는 비율(%)(78.26%)은 연구 동물에 투여된 유발접종이 허용 가능함을 나타냈다. 15㎍/투여량 그룹에 대한 기침하는 시점(%)(37.92%)은 대조군과 비교할 때 기침 감소(51.55%)를 입증하였으며, 이는 USDA에 의해 규정된 효능 요건을 충족하는 것이다. 대조군과 비교할 경우, 기침에서의 최소 감소가 입증되는 개에게서는, 60㎍/투여량 그룹(69.58%)에서 보호되지 않는 것으로 입증되었다.
통계학적으로 비교되지 않을지라도, 표 29 및 31에서 SC 백신접종이 IM 백신접종과 비교할 경우 더욱 높은 항체 반응을 갖는 경향이 있는 것으로 알 수 있다. 논 목적을 위해, 여러 투여량 그룹에 대한 추가의 해설은 투여의 IM 및 SC 경로의 결과들을 결합시킨다.
투여 경로와 관계없이, 50일까지 백신접종된 그룹에서 우수한 p68 항체 반응이 입증되었으며, 연구 과정을 통해 백신접종에 의해 유지되었다. 우수한 기억촉진 반응이 백신접종 유발접종 후에 관찰되었다.
15㎍/투여량 및 60㎍/투여량의 p68 ELISA 적정량의 비교에서는 60㎍/투여량 그룹이 약간 높은 적정량 반응을 보이는 것으로 나타냈다(도 3). 이 반응은 비록 우수함에도 불구하고 하기 에어로졸 유발접종 후 보호와 관련되지 않았다. p68 ELISA 적정량 반응은 연구로부터 제거된 개에게서 포지티브 기관 면봉 또는 상승 응집 적정량과 함께 변할 수 있다. 포지티브 기관 면봉 또는 상승 응집 적정량과 함께 연구로부터 제거된 6개의 대조군들 중 3개는 ＜200의 p68 ELISA 적정량을 유지하였다. 연구로부터 제거된 개의 기관 면봉 또는 응집 적정량 상태에 대한 p68 ELISA 적정량의 관련성이 없는 것으로 나타난다.
유발접종 후 백신접종된 및 백신접종되지 않은 p68 보르데텔라 개에서의 SAA 반응에 대한 검사에서는, 백신접종된 동물 그룹에서 특히 유발접종 후 5 및 7일자에 15㎍/투여량 그룹에서의 SAA 값에서 매우 적은 상승이 나타났다.
결론
이 연구에서, 백신접종 후 6개월 동안 개 유발접종 모델을 사용하여 15㎍/투여량 및 60㎍/투여량 p68 개 보르데텔라 백신의 효능을 검사하였다. 백신 모두는 보통의 직장 온도 및 최소 주입 부위 반응에 의해 입증되는 바와 같이 안정하였다. 비록 15㎍/투여량 및 60㎍/투여량 백신접종된 개 모두가 p68 ELISA 적정량에 의해 측정되는 경우 백신접종에 대한 우수한 혈청학적 반응을 나타낼지라도, 상기 반응은 60㎍/투여량 백신접종된 개에서의 임상학적 보호와 관련되지 않았다. 60㎍/투여량 백신접종된 개는 백신접종되지 않은 대조군과 비교할 경우 기침에서 유의적 차이를 나타내지 않는 것으로 입증되었다. 15㎍/투여량 백신의 우수한 효능은 대조군과 비교할 경우 기침의 50% 미만 감소로 입증되었다. 60㎍/투여량 백신에서 SDS의 증가된 수준이 보호에서의 입증된 차이를 초래할 수 있는 것으로 가정된다. SAA 값들의 비교에서는 백신접종과 대조군 사이의 차이를 입증하였다.
실시예 4
VANGUARD(등록상표) Plus 5/CV-L의 안정성 및 효능
VANGUARD(등록상표) Plus 5/CV-L은, CD 바이러스의 약독화 균주, CAV-2의 약독화 균주, CPI 바이러스의 약독화 균주, CPV의 약독화 균주, 및 렙토스피라 카니콜라과 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에의 비활성화 전체 배양액 + 비활성화 CCV와 애주번트의 액체 제조물의 동결-건조된 제조물이다. 모든 바이러스를 구축된 세포주 상에서 증식시켰다. 개 세포주 상의 낮은 통과에 의해 CPV 분획을 약독화시켰으며, 이로 인해 하기 표 38에 제시된 수준에서 모체 항체 간섭을 무시할 수 있는 면역원성이 부여된다. 진공의 불활성 기체로 제자리에 포장되어 있는 동결-건조된 성분을 재수화시키는데 액체 성분을 사용하였다.
실험실 재평가에서는, VANGUARD(등록상표) Plus 5/CV-L이 CD, ICH, CAV-2 및 CPI 호흡기 질환, CCV 및 CPV에 의해 초래된 장염, 및 렙토스피라 카니콜라 및 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에에 의해 초래된 렙토스피라병에 대해 개를 면역화시키며, 이에는 백신 분획 중에 면역학적 간섭이 존재하지 않음이 입증되었다. 확대된 분야의 안정성 시도에서는, 보통의 사용 조건 하에 생후 6주 정도 어린 개에서 안정하며 본질적으로는 반응-부재인 것으로 나타났다.
또한, CAV-2 백신이 CAV-1에 의해 초래된 ICH에 대해 교차-보호하는 것으로 입증되었다. 연구에서는, CAV-2가 ICH에 대해서 뿐만 아니라 CAV-2 호흡기 질환을 보호하는 것으로 입증되었다. 제 2 형 개 아데노바이러스 유발접종 바이러스는 수행된 시험에서 CAV-2-백신접종된 개로부터 회수되지 않았다.
VANGUARD(등록상표) Plus 5/CV-L에서의 CPV 분획을 포괄적 안정성 및 효능에 대해 시험하였다. 이는 당 분야의 조건 하에서 실험실 시험 및 임상적 시도에서 안정적이며 본질적으로는 반응-부재인 것으로 나타났다. 제품 안정성에 대해서는, 모두가 정상을 잔존하는 감수성 개에게 다수 투여의 백신 균주의 경구 투여가 포함되는 백패시지(backpassage) 연구에 의해 추가로 입증되었다.
연구에서는 CPV 바이러스 적정량이 증가된 백신의 3회 투여가 모체 항체와 조합된 혈청 중화(SN) 적정량을 해결할 수 있다. 1:4 정도로 낮은 혈청 중화 적정량은 통상의 개질된 살아있는 백신을 사용하여 다른 것에 의한 활성 면역화를 간섭하는 것으로 제시되었다. 임상적 시도는 생후 56주의 강아지[25마리 백신접종(SN 적정량 범위-256) 및 25마리 백신-비유발접종된 대조군(SN 적정량 범위 4-1024)]를 사용하여 수행하였다(표 37). 백신접종 그룹은 6주에서 시작하여 3주 간격으로 백신접종을 3회 투여하였다. 1 백신접종 후, 13/25 강아지는 CPV SN 적정량(혈청전환(seroconversion))에서 4배 이상의 증가를 나타냈다(표 38). 이들 13마리 강아지 중 12마리는 제 1 백신접종할 때에 ≤1:16의 모체 SN 적정량을 가지되, 나머지 강아지는 1:64의 SN 적정량을 갖는다. 1:16 내지 1:256의 초기 SN 적정량을 갖는 또 다른 9 강아지는 제 2 백신접종 후에 혈청전환되었다. 그들의 모체 항체 SN 적정량은 제 2 백신접종할 때 ≤1:64로 저하되었다. 유사하게, 1:128의 초기 SN 적정량을 갖는 최종 3 백신접종은 제 3 백신접종 후에 혈청전환되었으며, 그들의 모체 항체 CPV 적정량은 ≤1:64로 저하되었다. 따라서, 이 연구에서, 3회 투여의 백신이 생후 6주에서 시작하는 경우, 모든 25 백신접종은 이것이 가장 높은 모체 항체 수준을 갖는 경우에도 점점 활성적으로 면역화된(GM = 1:1176; SN 적정량 128-4096). 모든 50마리 개에게는 이종 CPV 유발접종 바이러스와 함께 제 3 백신접종 한 후 3주 동안 유발접종시켰다. 25마리 백신-비유발접종된 대조 개 중 14마리가 죽거나, 또는 안락사를 실시할 만큼 위중한 병환을 나타낸 반면, 모든 25마리 백신접종된 개는 본질적으로 건강하게 살아 있었다. 따라서, VANGUARD(등록상표) Plus 5/CV-L 중의 높은 적정량의 낮은 패시지(passage) 백신 바이러스는 높은 면역원성이며, 모체 항체의 존재 하에 활성 면역을 자극할 수 있었다.
VANGUARD(등록상표) Plus 5/CV-L의 CCV 분획의 효능은 확대된 백신접종 유발접종 연구에서 입증되었다. 16마리의 생후 7 내지 8주 강아지를 VANGUARD(등록상표) Plus 5/CV-L로 백신접종하고(백신접종), 17마리는 Vanguard(등록상표) Plus 5/L로 백신접종하였다(대조군). 모든 강아지는 3주 간격으로 1㎖ 투여량으로 3회 투여하였다. 제 3 백신접종 후 3주 동안, 강아지를 CCV의 병독성 균주(CV-6)로 유발접종시켰다. 임상적 관찰, 온도, 체중 및 혈액 파라미터를 감염 후 21일 동안 모니터링하였다. CCV 백신접종에서는 설사의 발생이 감소되는 것으로 입증되고, 대조군에 비해 병독성 CCV의 양이 떨어졌다(shed). 유발접종 후 21일 동안, 소장 섹션의 병독성 CCV에 대한 형광 항체 염색에서는, CCV 백신접종과 대조군 사이의 검출 가능한 CCV 항원에서 유의적인 감소(P)가 입증되었다(표 39).
결론
이 연구에서, CD 바이러스, CAV-2, CPI 바이러스, CPV, 및 렙토스피라 카니콜라 및 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에 및 CCV의 비활성화된 전체 배양액을 함유하는 애주번트화 조합 백신은 강아지에 사용되는 경우 백신으로서 안정하고 효과적인 것으로 나타났다. 또한, 조합 백신은 모체 항체와 조합된 혈청 중화(SN) 적정량을 해결하는 것으로 나타났다.
실시예 5
개 보르데텔라 선천 p68 면역원성 연구
동물
연구에는 2ℓ SPF 비글(beagle) 및 2ℓ랜덤 소오스(random source) 개가 포함되었다. 개를 백신접종된 또는 백신접종되지 않은 그룹으로 랜덤하게 할당하였다. 연구에는 총 10마리 백신접종된 개 및 11마리 백신접종되지 않은 개가 포함되었다.
실험 백신의 제조물
열 추출 완충액 5 내지 10㎖로 플레이트 표면을 세척함으로써, 48시간 Bordet-Gengou 혈액 아가 스프레드(spread) 플레이트로부터 보르데텔라 브론키셉티카(균주 110H)를 수확하였다. 다르게는, 배양액(Charlotte Parker Defined Medium) 중에서 성장된 세포를 원심분리에 의해 수확하며, 상청액을 폐기시켰다. 수확된 세포를 25mM Tris-HCl 중에 현탁시켜 pH 8.8로 만들고, 1시간 동안 60℃에서 항온처리하였다. 세포 부스러기를 30분 동안 4℃에서 20,000의 열 추출 원심분리에 의해 분리시켰다. 소듐 아자이드(0.01%)를 열 추출된 상청액 분획물에 첨가한 후, 이를 미세 여과에 의해 추가로 정제하였다.
표준 절차를 사용하여 단클론 항체(Bord 2-7로 명명됨)를 CNBr-활성화된 Sepharose 4B에 콘주게이트시킴으로써 단클론 항체 친화성 수지를 제조하였다. 단클론 항체 약 30.35mg을 친화성 수지 1g에 콘주게이트시켰다. (앞서) 정제된 열 추출 상청액 및 Bord 2-7 친화성 수지를 1ℓ 추출물 대 20㎖ 수지의 근접 비율로 조합하였다.
선천 p68과 수지의 결합은 주위 온도에서 혼합물을 알맞게 진탕시키면서 밤새도록 항온처리한 후, 수지 침전 및 상청액 분획물의 흡출(aspiration)에 의해 촉진시켰다. 그 다음, 수지를 2.6cm 직경의 칼럼 내에 패킹시키고, 후속적으로 상기 칼럼을 PBS로 세척하여 pH 7.5로 만들고, 5㎖/분의 유량으로 10mM 포스페이트 완충액으로 세척하여 pH 8.0으로 만들었다. 280㎚에서의 흡광도(absorbance)가 기준선 수준에 도달하는 경우, 결합된 물질을 100mM 트라이에틸아민을 사용하여 용출시키고, 280㎚ 흡광도의 단일의 큰 피크 하의 분획물을수거하고, ELISA에 의해 p68의 존재에 대해 시험하였다. p68을 함유하는 분획물을 모으고, PBS에 대해 투석시켜 트라이에틸아민을 제거하였다.
연속 배합된 실험 백신을 정제 p68 및 1% 알루미늄 하이드록사이드 겔 약 100㎍을 함유하도록 배합하였다. 포르말린(0.01%)을 1㎖ 최종 백신 투여량 부피 중에 방부제로서 사용하였다.
유발접종 접종물
앞서 실시예에서 기술된 바와 본질적으로 동일하게 유발접종 물질을 제조하였다.
연구 절차
21마리 음성혈청반응성 및 배양 네거티브 강아지를 2개의 처리 그룹 중 하나에 랜덤하게 할당하였다. 11마리 개를 비백신접종된 대조 그룹에 할당하고, 10마리 개를 백신접종된 그룹에 할당하였다. 0일은 제 1 백신접종일로서 지정하였다. 백신 1㎖를 0일자에 피하 투여하고, 이후 21일 동안 반복 실행하였다. 제 1 및 제 2 백신접종 전에 혈청학적 p68 ELISA를 위해 혈액을 수거하였다.
35일에, 제 2 백신접종 후 14일 동안, 보르데텔라 브론키셉티카의 에어로졸 유발접종을 전술된 바와 같이 모든 개에 투여하였다. 이전 실시예에서 기술된 바오 같이 유발접종 후 14일 동안 기침에 대해 동물을 모니터링하였다.
결과
p68에 대한 임상적 관찰 및 혈청학적 반응의 요약을 하기 표 40에 제시한다.
논의
이 연구에서, 10마리 대조 개 중 10마리가 적어도 연속 2일 동안 기침하였다. 개는 연속 2일 동안 기침하는 경우 임상적으로 질병을 앓고 있는 것으로 간주된다. 이 기준에 의해, 백신접종되지 않은 대조 개의 100%가 질병을 앓았다. 백신접종된 그룹에서, 1마리 개는 유발접종 후 4일자에 기침하고, 1마리 개는 유발접종 후 4 및 6일자에 기침하였다. 2마리 개는 14일자에 기침하였다. 어떠한 백신접종된 개도 연속 2일 동안 기침하지 않았다. 따라서, 선천 p68 백신접종된 그룹 내의 개 100%는 유발접종 후 정상을 유지하는 것으로 판명되었다.
결론
이 시도는 보르데텔라 브론키셉티카 질환에 대해 보호하기 위한 선천 p68 백신의 능력을 입증하고 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Dominowski, Paul J. Frantz, Joseph C. Krebs, Richard L. Shields, Shelly L. Sorensen, Robert G. <120> CANINE VACCINES AGAINST BORDETELLA BRONCHISEPTICA <130> 16112 (PC25496A) <140> 60/443,418 <141> 2003-01-29 <160> 3 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 602 <212> PRT <213> Bordetella bronchiseptica <400> 1 Asp Pro Asn Thr Val Ser Ile Ile Lys Ala Gly Glu Arg Gln His Gly 1 5 10 15 Ile His Ile Lys Gln Ser Asp Gly Ala Gly Val Arg Thr Ala Thr Gly 20 25 30 Thr Thr Ile Lys Val Ser Gly Arg Gln Ala Gln Gly Val Leu Leu Glu 35 40 45 Asn Pro Ala Ala Glu Leu Arg Phe Gln Asn Gly Ser Val Thr Ser Ser 50 55 60 Gly Gln Leu Phe Asp Glu Gly Val Arg Arg Phe Leu Gly Thr Val Thr 65 70 75 80 Val Lys Ala Gly Lys Leu Val Ala Asp His Ala Thr Leu Ala Asn Val 85 90 95 Ser Asp Thr Arg Asp Asp Asp Gly Ile Ala Leu Tyr Val Ala Gly Glu 100 105 110 Gln Ala Gln Ala Ser Ile Ala Asp Ser Thr Leu Gln Gly Ala Gly Gly 115 120 125 Val Arg Val Glu Arg Gly Ala Asn Val Thr Val Gln Arg Ser Thr Ile 130 135 140 Val Asp Gly Gly Leu His Ile Gly Thr Leu Gln Pro Leu Gln Pro Glu 145 150 155 160 Asp Leu Pro 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Ala Leu Ala Ser Gln Ala Arg Trp Thr Gly Ala Thr 370 375 380 Arg Ala Val Asp Ser Leu Ser Ile Asp Asn Ala Thr Trp Val Met Thr 385 390 395 400 Asp Asn Ser Asn Val Gly Ala Leu Arg Leu Ala Ser Asp Gly Ser Val 405 410 415 Asp Phe Gln Gln Pro Ala Glu Ala Gly Arg Phe Lys Val Leu Met Val 420 425 430 Asp Thr Leu Ala Gly Ser Gly Leu Phe Arg Met Asn Val Phe Ala Asp 435 440 445 Leu Gly Leu Ser Asp Lys Leu Val Val Met Arg Asp Ala Ser Gly Gln 450 455 460 His Arg Leu Trp Val Arg Asn Ser Gly Ser Glu Pro Ala Ser Ala Asn 465 470 475 480 Thr Met Leu Leu Val Gln Thr Pro Arg Gly Ser Ala Ala Thr Phe Thr 485 490 495 Leu Ala Asn Lys Asp Gly Lys Val Asp Ile Gly Thr Tyr Arg Tyr Arg 500 505 510 Leu Ala Ala Asn Gly Asn Gly Gln Trp Ser Leu Val Gly Ala Lys Ala 515 520 525 Pro Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro 530 535 540 Gln Pro Gly Pro Gln Pro Pro Gln Pro Pro Gln Pro Pro Gln Pro Pro 545 550 555 560 Gln Arg Gln Pro Glu Ala Pro Ala Pro Gln Pro Pro Ala Gly Arg Glu 565 570 575 Leu Ser Ala Ala Ala Asn Ala Ala Val Asn Thr Gly Gly Val Gly Leu 580 585 590 Ala Ser Thr Leu Trp Tyr Ala Glu Ser Asn 595 600 <210> 2 <211> 1806 <212> DNA <213> Bordetella bronchiseptica <400> 2 gatccaaaca ctgtgtcaat catcaaggcc ggcgagcgcc agcacggcat ccacatcaag 60 caaagcgatg gcgccggcgt acggaccgcc accggaacga ccatcaaggt aagcggtcgt 120 caggcccagg gcgtcctgct ggaaaatccc gcggccgagc tgcggttcca gaacggcagc 180 gtcacgtctt cgggacagct gttcgacgaa ggcgtccggc gctttctggg caccgtcacc 240 gtcaaggccg gcaagctggt cgccgatcac gccacgctgg ccaacgtcag cgacacccgg 300 gacgacgacg gcatcgcgct ctatgtggcc ggcgagcagg cccaggccag catcgccgac 360 agcaccctgc agggcgcggg cggcgtgcgg gtcgagcgcg gcgccaatgt cacggtccaa 420 cgcagcacca tcgttgacgg gggcttgcat atcggcaccc tgcagccgct gcagccggaa 480 gaccttccgc ccagccgggt ggtgctgggc gacaccagcg tgaccgccgt gcccgccagc 540 ggcgcgcccg cggcggtgtc tgtattcggg gccaatgagc ttacggttga tggcgggcac 600 atcaccgggg ggcgggcagc gggggtggcg gccatggacg gggcgatcgt gcatctgcag 660 cgcgcgacga tacggcgggg ggacgcgcct gccggcggtg cggttccagg 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Gly Gly Ala Gln Gly Gln Gly 340 345 350 Asp Ile Val Ala Thr Glu Leu Pro Pro Ile Pro Gly Ala Ser Ser Gly 355 360 365 Pro Leu Asp Val Ala Leu Ala Ser Gln Ala Arg Trp Thr Gly Ala Thr 370 375 380 Arg Ala Val Asp Ser Leu Ser Ile Asp Asn Ala Thr Trp Val Met Thr 385 390 395 400 Asp Asn Ser Asn Val Gly Ala Leu Arg Leu Ala Ser Asp Gly Ser Val 405 410 415 Asp Phe Gln Gln Pro Ala Glu Ala Gly Arg Phe Lys Cys Leu Met Val 420 425 430 Asp Thr Leu Ala Gly Ser Gly Leu Phe Arg Met Asn Val Ala Phe Ala 435 440 445 Asp Leu Gly Leu Ser Asp Lys Leu Val Val Met Arg Asp Ala Ser Gly 450 455 460 Gln His Arg Leu Leu Val Arg Asn Ser Gly Ser Glu Pro Ala Ser Gly 465 470 475 480 Asn Thr Met Leu Leu Val Gln Thr Pro Arg Gly Ser Ala Ala Thr Phe 485 490 495 Thr Leu Ala Asn Lys Asp Gly Lys Val Asp Ile Gly Thr Tyr Arg Tyr 500 505 510 Arg Leu Ala Ala Asn Gly Asn Gly Gln Trp Ser Leu Val Gly Ala Lys 515 520 525 Ala Pro Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly 530 535 540 Pro Gln Pro Pro Gln Pro Pro Gln Pro Pro Gln Pro Pro Gln Arg Gln 545 550 555 560 Pro Glu Ala Pro Ala Pro Gln Pro Pro Ala Gly Arg Glu Leu Ser Ala 565 570 575 Ala Ala Asn Ala Ala Val Asn Thr Gly Gly Val Gly Leu Ala Ser Thr 580 585 590 Leu Trp Tyr Ala Glu Ser Asn 595

Claims (15)

  1. 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)에 대해 개를 보호하는데 효과적인 양의 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원 및 보조제를 포함하는 백신 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원이 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함하며 재조합하여 제조되는 백신 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 보조제가 Quil A 및 콜레스테롤을 포함하는 백신 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 백신 조성물을 개에 투여함을 포함하는, 보르데텔라 브론키셉티카에 대해 개를 보호하는 방법.
  5. 개 디스템퍼(canine distemper, CD) 바이러스의 약독화(attenuated) 균주, 제 2 형 개 아데노바이러스(canine adenovirus type 2, CAV-2)의 약독화 균주, 개 파라인플루엔자(canine parainfluenza, CPI) 바이러스의 약독화 균주 및 개 파르보바이러스(canine parvovirus, CPV)의 약독화 균주의 제조물; 개 코로나바이러스(canine coronavirus, CCV) 균주의 전체 또는 일부 비활성화된 제조물; 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원; 및 보조제를 포함하는, 개 병원체에 대해 개를 면역화하기 위한 조합 백신.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원이 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함하며 재조합하여 제조되는 조합 백신.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 보조제가 Quil A 및 콜레스테롤을 포함하는 조합 백신.
  8. 개 디스템퍼(CD) 바이러스의 약독화 균주, 제 2 형 개 아데노바이러스(CAV-2)의 약독화 균주, 개 파라인플루엔자(CPI) 바이러스의 약독화 균주 및 개 파르보바이러스(CPV)의 약독화 균주의 제조물; 개 코로나바이러스(CCV) 균주의 전체 또는 일부 비활성화된 제조물; 보르데텔라 브론키셉티카 p68 단백질; 렙토스피라 입포티포사(Leptospira ippotyphosa), 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에(Leptospira icterohaemorrhagiae) 또는 렙토스피라 포모나(Leptospira pomona)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 렙토스피라 종의 렙토스피라 세포 제조물; 및 보조제를 포함하는, 개 병원체에 대해 개를 면역화하기 위한 조합 백신.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 렙토스피라 세포 제조물이 렙토스피라 브라티스라바, 렙토스피라 카니콜라, 렙토스피라 그립포티포사(Leptospira grippotyphosa), 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에 및 렙토스피라 포모나의 세포 제조물을 포함하는 조합 백신.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원이 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함하며 재조합하여 제조되는 조합 백신.
  11. 제 8 항에 있어서,
    상기 보조제가 Quil A 및 콜레스테롤을 포함하는 조합 백신.
  12. 개 디스템퍼(CD) 바이러스의 약독화 균주, 제 2 형 개 아데노바이러스(CAV-2)의 약독화 균주, 개 파라인플루엔자(CPI) 바이러스의 약독화 균주 및 개 파르보바이러스(CPV)의 약독화 균주의 제조물; 보르데텔라 브론키셉티카 p68 단백질; 렙토스피라 브라티스라바, 렙토스피라 카니콜라, 렙토스피라 그립포티포사, 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에 및 렙토스피라 포모나로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 렙토스피라 종의 렙토스피라 세포 제조물을 포함하는 렙토스피라 세균백신(bacterin); 및 보조제를 포함하는, 개 병원체에 대해 개를 면역화하기 위한 조합 백신.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 렙토스피라 세포 제조물이 렙토스피라 브라티스라바, 렙토스피라 카니콜라, 렙토스피라 그립포티포사, 렙토스피라 이크테로하에모르라기아에 및 렙토스피라 포모나의 세포 제조물을 포함하는 조합 백신.
  14. 제 12 항에 있어서,
    상기 보르데텔라 브론키셉티카 p68 항원이 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함하며 재조합하여 제조되는 조합 백신.
  15. 제 12 항에 있어서,
    상기 보조제가 Quil A 및 콜레스테롤을 포함하는 조합 백신.
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