JP2006515024A

JP2006515024A - Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａに対するイヌワクチン

Info

Publication number: JP2006515024A
Application number: JP2005518725A
Authority: JP
Inventors: ジョセフドミノフスキー，ポール; クラウドフランツ，ジョセフ; リークレブス，リチャード; リンシールズ，シェリー; グレッグソーレンセン，ロバート
Original assignee: ファイザー・プロダクツ・インク
Priority date: 2003-01-29
Filing date: 2004-01-15
Publication date: 2006-05-18
Also published as: US20080226670A1; ZA200506073B; CA2513352C; AU2004208556B2; MXPA05008051A; PL378001A1; EP1592444B1; NO20053734D0; WO2004067031A1; BRPI0407032A; TW200505476A; CN1835767A; US20040185062A1; HRP20050660A2; RU2005124130A; KR20050103215A; ATE395077T1; UY28171A1; JP2011137017A; JP2007161718A

Abstract

本発明はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａにより引き起こされる疾患に対してイヌを保護するためのワクチン及び方法に関する。本発明はまたイヌ病原体により引き起こされる疾患又は障害、例えば、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａにより引き起こされる感染性気管気管支炎、イヌヂステンパー（ＣＤ）ウイルスにより引き起こされるイヌヂステンパー、イヌアデノウイルス１型（ＣＡＶ−１）により引き起こされる感染性イヌ肝炎（ＩＣＨ）、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）により引き起こされる呼吸疾患、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルスにより引き起こされるイヌパラインフルエンザ、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）及びイヌパルヴォウイルス（ＣＰＶ）により引き起こされる腸炎、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ又はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｐｏｍｏｎａにより引き起こされるレプトスピラ症に対してイヌを保護するための組み合わせワクチン及び方法にも関する。本発明に係るワクチンはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原を含む。

Description

発明の分野
本発明はボルデテラ・ブロンキセプティカｐ６８（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８）抗原を含むワクチン及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａにより引き起こされる感染性気管気管支炎（「犬舎咳」）に対してイヌを保護するためのその使用に関する。本発明はまたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原及びイヌヂステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、イヌパルヴォウイルス（ＣＰＶ）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ又はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｐｏｍｏｎａの如き、他のイヌ病原体の１以上の抗原を含む組み合わせワクチンにも関する。組み合わせワクチンを用いてイヌ病原体により引き起こされる疾患に対してイヌを保護する方法もまた提供される。

発明の背景
現在商業的に入手可能なイヌＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａワクチン製品は不活性化された、アヂュヴァントを伴わないＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ全細胞細菌ワクチンから成る。上記全細胞細菌ワクチンは細胞タンパク質関連予防接種後反応を引き起こしうる。Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａのｐ６８タンパク質はＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのＯｕｔｅｒＭｅｍｂｒａｎｅＰｒｏｔｅｉｎ（ＯＭＰ）及びＢ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓのＯＭＰと抗原として同様である（Ｓｈａｈｉｎｅｔａｌ．， “ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＣａｐａｃｉｔｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅ６９−ｋＤＯｕｔｅｒＭｅｍｂｒａｎｅＰｒｏｔｅｉｎｏｆＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ”，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７１：６３−７３，１９９０）。このＯＭＰの保護の役割はマウス（Ｓｈａｈｉｎｅｔａｌ．，上記；Ｎｏｖｏｔｎｙｅｔａｌ．， “ＢｉｏｌｏｇｉｃａｎｄＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｈｅ６９−ｋＤＯｕｔｅｒＭｅｍｂｒａｎｅＰｒｏｔｅｉｎｏｆＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ：ＡＮｏｖｅｌＦｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｆｏｒａＡｃｅｌｌｕｌａｒＰｅｒｔｕｓｓｉｓＶａｃｃｉｎｅ”，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６４：１１４−２２，１９９１）、ヒト（Ｈｅｅｔａｌ．， “ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＲｏｌｅｏｆＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏＦｉｌａｍｅｎｔｏｕｓＨｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎａｎｄＰｅｒｔａｃｔｉｎｏｆＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓｉｎＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ”，Ｅｕｒ．ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｎｆｅｃｔＤｉｓ．１０：７９３−７９８，１９９６）及びブタ（Ｋｏｂｉｓｃｈｅｔａｌ．， “Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａ６８−ＫｉｌｏｄａｌｔｏｎＯｕｔｅｒＭｅｍｂｒａｎｅＰｒｏｔｅｉｎａｓｔｈｅＭａｊｏｒＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＡｎｔｉｇｅｎｏｆＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｂｙＵｓｉｎｇＳｐｅｃｉｆｉｃ−Ｐａｔｈｏｇｅｎ−ＦｒｅｅＰｉｇｌｅｔｓ”，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８（２）：３５２−３５７，１９９０）について示されている。

本発明に先行して、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原がイヌにおいて安全な及び有効なワクチンでありうることを示したものはなかった。それゆえ、イヌの使用のために好適なｐ６８抗原を含むＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａワクチンを開発する要求がある。上記Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８ワクチンが子イヌへの投与に安全であり及び長期保護を提供する場合、それはさらにより有益であろう。

ＣＤは変化しやすい症状発現を伴う遍在する高い死亡率のウイルス疾患である。ＣＤウイルスに感染した予防接種をしていない免疫のないイヌの約５０％は臨床徴候を発展し、及びそれらのイヌの約９０％が死亡する。

イヌアデノウイルス１型（ＣＡＶ−１）により引き起こされる感染性イヌ肝炎又はＩＣＨは肝の及び全身性の内皮病変により特徴付けられるイヌの遍在する、ときには致死的なウイルス疾患である。ＣＡＶ−２は、重篤な場合には肺炎及び気管支肺炎を含みうる呼吸疾患を引き起こす。

ＣＰＩは通常のウイルス性の呼吸器系最上部の疾患である。合併症を伴わないＣＰＩは軽症又は無症状でありうるが、他の呼吸性病原体での同時感染が存在する場合、徴候はより重篤になる。

ＣＰＶ感染は、しばしば出血性の、嘔吐及び下痢の突然の開始により特徴付けられる腸疾患をもたらす。白血球減少が通常臨床徴候に付随する。どんな年齢でもかかりやすいイヌは影響されうるが、死亡率は子イヌにおいて最も大きい。４〜１２週齢の子イヌにおいて、ＣＰＶは短期の及び目立たない病気後の急性心不全をもたらしうる心筋炎をときに引き起こしうる。感染後、多くのイヌは１年以上上記疾患に抵抗力がある。同様に、血清反応陽性の雌イヌはそれらの子イヌに１６週齢をとおして子イヌの活性免疫化を妨害しうるＣＰＶ抗体をうつしうる。

ＣＣＶもまた世界中で全ての年齢の、かかりやすいイヌにおいて腸疾患を引き起こす。高く感染性なので、上記ウイルスは主に感染性の糞との直接的な接触をとおしてうつされ、及び暴露後１〜４日以内に臨床腸炎を引き起こしうる。疾患の重篤さは他の因子での同時感染により悪化されうる。ＣＣＶ感染の主な徴候は食欲不振、嘔吐、及び下痢を含む。嘔吐の頻度は通常下痢の開始後１日又は２日以内に減少するが、下痢は感染の過程をとおして長く続きうる、及び糞はときにはすじ状の血液を含みうる。ＣＣＶ感染でほとんどのイヌは無熱のままであり、及び白血球減少は合併症を伴わない場合には観察されない。

レプトスピラ症は全ての年齢のイヌにおいて起こり、及び広い範囲の臨床徴候及び慢性腎炎が一般的に急性感染に続く。Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ及びＬ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅでの感染は臨床的に区別できない。

本発明に先行して、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ及びＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶ、ＣＣＶ、及びＬ．ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌ．ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ及びＬ．ｐｏｍｏｎａの如きＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ種の如き１以上の他のイヌ病原体に対してイヌを保護する、有効な組み合わせワクチンはなかった。組み合わせワクチンの開発における問題は有効性妨害、すなわち、組成物中の他の抗原の存在のための、組み合わせ組成物中の１以上の抗原の有効性を維持する又は達成することの失敗を含む。これは上記組成物中に存在する他の抗原のための、ある抗原が宿主において誘導した免疫学的な、抗原性の抗体又は保護応答における、宿主、例えば、イヌに投与される組成物中の上記抗原の妨害の結果であると考えられる。しかしながら、ネコの如き他の宿主については、組み合わせワクチンは知られる。イヌにおける有効性妨害はイヌの生物学的システムのいくつかの特性のため又はイヌの生物学的システムとの抗原の反応のためであると考えられる。

それゆえ、イヌにおいて有効性妨害を示さない、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ及び１以上の他のイヌ病原体に対するイヌへの投与のために好適な組み合わせワクチンを開発する要求がある。上記組み合わせワクチンが子イヌへの投与に安全であり及び長期保護を提供する場合、それはさらにより有益であろう。

発明の要約
本発明はイヌ病原体により引き起こされる疾患に対してイヌを保護するためのワクチン及び方法を提供する。

１の態様において、本発明はイヌへの投与に好適な及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａにより引き起こされる疾患に対してイヌを保護することができるｐ６８ワクチンを提供する。本発明に係る上記ワクチンはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原及びアヂュヴァントの如き獣医学的に許容される担体を含む。

他の態様において、本発明はイヌにＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原及びアヂュヴァントの如き獣医学的に許容される担体を含むワクチンを投与することによりＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａにより引き起こされる疾患に対してイヌを保護する方法を提供する。

さらに他の態様において、本発明はイヌへの投与に好適な組み合わせワクチンを提供する。本発明に係る組み合わせワクチンは、他の病原体（単数又は複数）により引き起こされる疾患に対してイヌにおいて保護性の免疫応答を誘導することができる、少なくとも１の上記他のイヌ病原体からの他の抗原との組み合わせのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原を含む。上記他の病原体はイヌヂステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス、イヌパルヴォウイルス（ＣＰＶ）、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、イヌヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｐｏｍｏｎａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｈａｒｄｊｏｂｏｖｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｓｐｐ．、Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓｓｐｐ．、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｐｐ．、Ｂｏｒｒｅｌｉａｓｐｐ．、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓｐｐ．及びＭｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍｃａｎｉｓから選ばれうる。

本発明に係る好ましい組み合わせワクチンはイヌヂステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス及びイヌパルヴォウイルス（ＣＰＶ）の減衰された株；イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）の株の不活性化調製物；及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原を含む。

本発明に係る他の好ましい組み合わせワクチンはイヌヂステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス及びイヌパルヴォウイルス（ＣＰＶ）の減衰された株；イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）の株の不活性化調製物；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８タンパク質、及び５のレプトスピラ血液型亜型（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｐｏｍｏｎａ）の不活性化細胞調製物を含む。

本発明に係るさらに他の好ましい組み合わせワクチンはＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶ株の減衰された株；及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原を含む。

本発明に係る他の好ましい組み合わせワクチンはＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶ株の減衰された株；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原；及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｃａｎｉｃｏｌａ及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの不活性化細胞調製物を含む。

本発明に係るさらに他の好ましい組み合わせワクチンはＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶ株の減衰された株、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原及び５のレプトスピラ血液型亜型（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｐｏｍｏｎａ）の不活性化細胞調製物を含む。

他の好ましい組み合わせワクチンはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原及び減衰されたＣＰＩウイルスを含む。

さらに他の好ましい組み合わせワクチンはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原、減衰されたＣＰＩウイルス及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｃａｎｉｃｏｌａ及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの不活性化細胞調製物を含む。

本発明はまたイヌに本発明に係る組み合わせワクチンを投与することによるイヌ病原体により引き起こされる疾患に対してイヌを保護する方法をも提供する。

発明の詳細な説明
１の態様において、本発明はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａにより引き起こされる疾患に対してイヌを保護することができるイヌへの投与に好適な一価のワクチンを提供する。本発明に係る一価のワクチンは組換えで作出されたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原及びアヂュヴァントの如き獣医学的に許容される担体を含む。

他の態様において、本発明はイヌに組換えで作出されたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原及びアヂュヴァントの如き獣医学的に許容される担体を含む一価のワクチンを投与することによるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａにより引き起こされる疾患に対してイヌを保護する方法を提供する。

さらに他の態様において、本発明はイヌへの投与に好適な組み合わせワクチンを提供する。本発明に係る組み合わせワクチンは他の抗原により引き起こされる疾患に対してイヌにおいて保護性の免疫応答を誘導することができる少なくとも１の上記他の抗原との組み合わせの、組換えで作出されたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原を含む。

本発明に係る好ましい組み合わせワクチンはイヌヂステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス及びイヌパルヴォウイルス（ＣＰＶ）の減衰された株；イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）の株の不活性化調製物；及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８タンパク質を含む。

本発明に係る他の好ましい組み合わせワクチンはイヌヂステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス及びイヌパルヴォウイルス（ＣＰＶ）の減衰された株；イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）の株の不活性化調製物；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８タンパク質、及び５のレプトスピラ血液型亜型（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｐｏｍｏｎａ）の調製物を含む。

本発明に係るさらに他の好ましい組み合わせワクチンはＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶ株の減衰された株；及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８タンパク質を含む。

本発明に係る他の好ましい組み合わせワクチンはＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶ株の減衰された株；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８タンパク質；及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｃａｎｉｃｏｌａ及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの調製物を含む。

本発明に係るさらに他の好ましい組み合わせワクチンはＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶ株の減衰された株、及び５のレプトスピラ血液型亜型（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｐｏｍｏｎａ）の調製物を含む。

開示の明瞭のために、及び限定のためでなく、本発明の詳細な説明は、本発明のいくつかの特徴、態様又は適用を示す又は例示する以下の小区分に分けられる。

定義及び略語
上記用語「イヌ病原体により引き起こされる疾患に対してイヌを保護する」は、本明細書中で使用されるとき、病原体による感染の危険性を減少させる若しくは消去すること、感染の症状を改善する若しくは緩和すること又は感染からの回復を加速させることを意味する。例えば、ウイルス又は細菌ロードにおける減少、ウイルス又は細菌発散における減少、感染の発生又は期間における減少、減少した急性相血清タンパク質値、減少した直腸温度、及び／又は食物摂取及び／又は成長における増大がある場合、保護は達成される。

上記用語「ｐ６８抗原」はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される６８ｋＤａの分子量のタンパク質をいい、ｐ６８特異的モノクローナル抗体Ｂｏｒｄ２−７（ＡＴＣＣ＃）により認識され、及び配列ＩＤ番号：１中に示されるアミノ酸配列又は配列ＩＤ番号：１に実質的に同一のアミノ酸配列を有する。

「実質的に同一」により、少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％又はより好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性の程度が意味される。

上記用語「一価のワクチン」は、本明細書中で使用されるとき、１の主要な抗原成分を有するワクチンをいう。例えば、ｐ６８一価ワクチンは上記ワクチンの主要な抗原成分としてＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原を含み、及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａにより引き起こされる疾患に対して上記ワクチンが投与された動物を保護することができる。

上記用語「組み合わせワクチン」はイヌにおいて保護性の免疫応答を誘導することができる二価の又は多価の抗原の組み合わせを意味する。病原体（単数）又は病原体（複数）に対する組み合わせワクチンの保護効果は動物被検体において免疫応答、細胞仲介若しくは体液性免疫応答又は両方の組み合わせのいずれかを誘導することにより通常達成される。

「免疫原性」により、特定の病原体に対してイヌにおいて免疫応答を引き起こす組成物の能力が意味される。上記免疫応答は細胞毒性Ｔ−細胞及びサイトカイン生成Ｔ−細胞により主に仲介される細胞性免疫応答又はヘルパーＴ−細胞により主に仲介される体液性免疫応答でありうる、及びそれは抗体生成を引き起こすＢ−細胞を活性化する。

上記用語「治療的に有効な量」又は「有効な量」は、それが投与されたイヌにおいて保護性の免疫応答を誘発するのに十分な一価の又は組み合わせワクチンの量をいう。上記免疫応答は、非限定的に、細胞性及び／又は体液性免疫の誘導を含みうる。治療的に有効なワクチンの量はワクチン中に使用される特定の抗原、イヌの年齢及び状態、及び／又は感染の程度に因り変化しうる、及び獣医師により決定されうる。

ｐ６８ワクチン
本発明は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原を含むワクチン組成物がＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａにより引き起こされる疾患に対してイヌを有効に保護したことをはじめて示した。本発明に係るワクチン組成物は顕著な予防接種後反応を引き起こさず、子イヌへの投与に安全であり、及び長期間続くイヌにおける保護性の免疫を誘導する。

したがって、本発明の１の態様はイヌへの投与に好適な及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａにより引き起こされる疾患、例えば、感染性気管気管支炎（「犬舎咳」）に対してイヌを保護することができる、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原（又は「ｐ６８ワクチン」）を含むワクチン組成物に方向付けられる。

本発明の目的のために、上記用語「ｐ６８抗原」はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される６８ｋＤａの分子量のタンパク質をいい、ｐ６８特異的モノクローナル抗体Ｂｏｒｄ２−７（ＡＴＣＣ＃）により認識され、及び配列ＩＤ番号：１中に示されるアミノ酸配列又は配列ＩＤ番号：１に実質的に同一のアミノ酸配列を有する。「実質的に同一」により、少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％又はより好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性の程度が意味される。配列ＩＤ番号：１に実質的に同一のアミノ酸配列を有するｐ６８抗原の例は配列ＩＤ番号：３中に示される、ＷＯ９２／１７５８７中に示されるｐ６８抗原である。本発明に係るｐ６８特異的モノクローナル抗体は例えば、ネイティブｐ６８タンパク質、組換えｐ６８タンパク質及び細菌の表面上のｐ６８タンパク質を認識する。

本発明にしたがって、本発明における使用のために好適なｐ６８抗原はネイティブｐ６８タンパク質（すなわち、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａから精製された天然ｐ６８タンパク質）及び組換えで作出されたｐ６８タンパク質の両方を含む。

Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａからのネイティブｐ６８の精製は例えば、Ｍｏｎｔａｒａｚｅｔａｌ．，ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ４７：７４４−７５１（１９８５）中に示され、及びまた本明細書中以下に提供される実施例中に例示される。ｐ６８の組換え生成は当業者に知られる分子クローニング及び組換え発現技術の１を用いて達成されうる。例えば、ｐ６８をコードする核酸分子は細菌、酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ細胞）、昆虫細胞又は哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）の如き、適切な宿主細胞に導入されうる。上記ｐ６８をコードする核酸分子は上記宿主細胞においてｐ６８抗原の発現を実行することができるプロモーターへの機能可能な結合で入れられうる。上記宿主細胞により発現されるｐ６８はルーティンのタンパク質精製技術を用いて容易に精製されうる。

本発明の好ましい態様においては、配列ＩＤ番号：１のアミノ酸配列を有するｐ６８抗原をコードする配列ＩＤ番号：２中に示されるヌクレオチド配列は発現ベクター中にクローニングされ、及び温度感受性プロモーターへの機能可能な結合で入れられる。上記発現ベクターはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉへ導入され、及びｐ６８抗原は熱誘導に際して発現される。上記細胞は溶解され、及びｐ６８抗原が蓄積する封入体は遠心分離により分離される。上記封入体中の組換えｐ６８はＳＤＳ又は尿素、塩酸グアニヂン、コール酸ナトリウム、タウロコール酸、及びデオキシコール酸ナトリウムの如き本分野において知られる他の可溶化剤を用いて可溶化される。本発明にしたがって、精製されたネイティブ又は組換えｐ６８タンパク質は獣医学的に許容される担体と混合され、ｐ６８ワクチン組成物を形成する。

上記用語「獣医学的に許容される担体」はいかなる及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、アヂュヴァント（補助剤）、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗菌及び抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤等をも含む。希釈剤は水、塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等を含みうる。等張剤は数ある中で、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースを含みうる。安定化剤は数ある中で、アルブミンを含む。

本発明にしたがう使用に好適なアヂュヴァントは、非限定的に、鉱物塩、例えば、アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及びリン酸カルシウム；界面活性剤及び微粒子、例えば、非イオン性ブロック重合体界面活性剤（例えば、コレステロール）、人工ウイルス粒子（ｖｉｒｏｓｏｍｅｓ）、サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ−２１及びＧＰＩ−０１００）、プロテオソーム、免疫刺激複合体、ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ、第四アミン（ヂメチルヂオカタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ））、アヴリヂン、ヴィタミンＡ、ヴィタミンＥ；ＲＩＢＩアヂュヴァントシステム（ＲｉｂｉＩｎｃ．）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｕｍｐｈｌｅｉの細胞壁骨格（Ｄｅｔｏｘ（商標））、ムラミルヂペプチド（ＭＤＰ）及びトリペプチド（ＭＴＰ）、モノフォスフォリル脂質Ａ、ＢａｃｉｌｌｕｓＣａｌｍｅｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ、熱不安定性Ｅ．ｃｏｌｉエンテロトキシン、コレラ毒素、トレハロースヂマイコレート、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの如き細菌製品；サイトカイン及びホルモン、例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、デヒドロエピアンドロステロン、１，２５−ヂヒドロキシヴィタミンＤ₃；ポリアニオン、例えば、デキストラン；ポリアクリル酸（例えば、ポリメチルメタクリル酸、Ｃａｒｂｏｐｏｌ９３４Ｐ）；担体、例えば、破傷風類毒素、ヂフテリア類毒素、コレラ毒素Ｂサブユニット、腸毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉの突然変異体熱不安定性エンテロトキシン（ｒｍＬＴ）、熱ショックタンパク質；水中油エマルジョン、例えば、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標）（Ｈｙｄｒｏｎｉｃｓ，ＵＳＡ）；及び例えば、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ完全及び不完全アヂュヴァントの如き油中水エマルジョンの如き、いくつかのアヂュヴァントクラスを含む。

本発明に係るワクチンにおける使用のために好ましいアヂュヴァントはＱｕｉｌＡ及びコレステロールを含む。

ｐ６８抗原及び獣医学的に許容される担体は、例えば、混合、溶解、懸濁、乳化、カプセル化、吸収等による、いかなる便利な及び実用的な様式でも混合され、ワクチン組成物を形成することができ、及び注入、埋入、吸入、摂取等に好適な錠剤、カプセル、粉末、シロップ、懸濁物の如き調剤中に作出されうる。好ましくは、上記ワクチンは、それが約０．１〜５ｍｌ又は好ましくは約０．５〜２．５ｍｌの用量で又はさらにより好ましくは約１ｍｌの用量で注入によりイヌに投与されうるように調合される。適切な場合、本発明に係る医薬組成物は周知の手順により滅菌されるべきである。

上記ワクチン中のｐ６８の量は免疫化に有効であるべきであり、及び一般的に１用量当たり０．５〜１０００μｇの範囲内である。好ましくは、ｐ６８の量は１用量当たり１〜２６０μｇの範囲内である。より好ましくは、ｐ６８の量は１用量当たり１０〜１００μｇの範囲内である。さらにより好ましくは、ｐ６８の量は１用量当たり約１５〜２５μｇである。

上記ワクチンにおける使用のために好適なアヂュヴァントの量は使用されるアヂュヴァントの性質に因る。例えば、ＱｕｉｌＡ及びコレステロールがアヂュヴァントとして使用されるとき、ＱｕｉｌＡは一般的に１用量当たり約１〜１０００μｇ、好ましくは１用量当たり３０〜１００μｇ、及びより好ましくは１用量当たり約５０〜７５μｇの量であり；及びコレステロールは一般的に１用量当たり約１〜１０００μｇ、好ましくは１用量当たり約３０〜１００μｇ、及びより好ましくは１用量当たり約５０〜７５μｇの量である。

他の態様において、本発明はイヌに本明細書中上記に示されるｐ６８ワクチン組成物を投与することによりＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａにより引き起こされる疾患に対してイヌを保護する方法を提供する。本発明にしたがって、ｐ６８ワクチン組成物は少なくとも約４ヶ月間、好ましくは少なくとも約６ヶ月間又はさらにより好ましくは約１年間長期免疫をイヌに提供する。

本発明にしたがって、ｐ６８ワクチンは経口、鼻内、粘膜、局所、経皮、及び非経口（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下又は筋内）を含むいかなる既知の経路によってもイヌに投与されうる。投与はまた針なしデリバリー装置を用いても達成されうる。投与は経路の組み合わせを用いて、例えば、第一の投与は非経口経路を用い、及び続く投与は粘膜経路を用いて達成されうる。

好ましい投与経路は皮下及び筋内投与を含む。
本発明に係るｐ６８ワクチン組成物は少なくとも６週齢、好ましくは少なくとも７週齢、及びより好ましくは少なくとも８又は９週齢のイヌに投与されうる。イヌは１用量で又は１超の用量のｐ６８ワクチンで予防接種されうる。好ましくは、２用量のｐ６８ワクチンが２の投与の間に約２〜４週間、好ましくは約３週間の間隔を有してイヌに投与される。イヌが４月齢より前に予防接種される場合、母親の抗体が４月齢未満の子イヌにおいて十分な免疫応答の発展を妨害しうるので、それらは４月齢に達した際に単一の用量で再び予防接種されることが推奨される。イヌはまた単一の用量で毎年再び予防接種されうる。交配、搭乗（乗船、乗車）、及び展示状況のように、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ暴露が起こりそうな場合、追加のブースターがこれらの事件の発生の１年又は好ましくは６ヶ月以内に与えられうる。

ｐ６８組み合わせワクチン
他の態様において、本発明は組み合わせワクチンを投与することによりＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ及び１以上の他のイヌ病原体に対してイヌを保護するための組み合わせワクチン及び方法を提供する。本発明に係る組み合わせワクチン組成物は有効性妨害を示さず、及び子イヌへの投与に安全である。

本発明に係る組み合わせワクチンは、他の病原体により引き起こされる疾患に対してイヌにおいて保護性の免疫応答を誘導することができる上記他のイヌ病原体からの少なくとも１の抗原との組み合わせの、本明細書中上記に示されるように作出されうるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原を含む。

上記他の病原体は、非限定的に、イヌヂステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス、イヌパルヴォウイルス（ＣＰＶ）、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、イヌヘルペスウイルス、及び狂犬病ウイルスを含む。本発明に係るワクチン組成物における使用のためのこれらの病原体からの抗原は改変された生きたウイルス調製物又は不活性化されたウイルス調製物の形態でありうる。これらのウイルスの悪性株を減衰させる方法及び不活性化ウイルス調製物を作出する方法は本分野において知られ、及び例えば、米国特許第４，５６７，０４２号及び第４，５６７，０４３号中に示される。

他の病原体はまたＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｐｏｍｏｎａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｈａｒｄｊｏｂｏｖｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｓｐｐ．、Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓｓｐｐ．、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｐｐ．、Ｂｏｒｒｅｌｉａｓｐｐ．、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓｐｐ．及びＭｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍｃａｎｉｓを含む。本発明に係るワクチン組成物における使用のためのこれらの病原体からの抗原は本分野において周知の方法を用いた、不活性化された全体の又は部分の細胞調製物の形態でありうる。例えば、不活性化された全体の又は部分のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞調製物の作出方法は本分野において知られ、及び例えば、Ｙａｎ，Ｋ−Ｔ，“ＡｓｐｅｃｔｓｏｆＩｍｍｕｎｉｔｙｔｏＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉｓｅｒｏｖａｒｈａｒｄｊｏ”，ＰｈＤＴｈｅｓｉｓ，ＡｐｐｅｎｄｉｘＩ，１９９６．ＦａｃｕｌｔｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＴｈｅＱｕｅｅｎ’ｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＢｅｌｆａｓｔ；Ｍａｃｋｉｎｔｏｓｈｅｔａｌ．， “Ｔｈｅｕｓｅｏｆａｈａｒｄｊｏ−ｐｏｍｏｎａｖａｃｃｉｎｅｔｏｐｒｅｖｅｎｔｌｅｐｔｏｓｐｉｒｕｒｉａｉｎｃａｔｔｌｅｅｘｐｏｓｅｄｔｏｎａｔｕｒａｌｃｈａｌｌｅｎｇｅｗｉｔｈＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓｓｅｒｏｖａｒｈａｒｄｊｏ”，ＮｅｗＺｅａｌａｎｄＶｅｔ．Ｊ．２８：１７４−１７７，１９８０；Ｂｏｌｉｎｅｔａｌ．， “ＥｆｆｅｃｔｏｆｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈａｐｅｎｔａｖａｌｅｎｔｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｌｖａｃｃｉｎｅｏｎＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓｓｅｒｏｖａｒｈａｒｄｊｏｔｙｐｅｈａｒｄｊｏ−ｂｏｉｖｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆｐｒｅｇｎａｎｔｃａｔｔｌｅ”，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．５０：１６１−１６５，１９８９中に示される。

本発明にしたがって、上記組み合わせワクチンは一般的に獣医学的に許容される担体を含む。本明細書中上記に示されるように、獣医学的に許容される担体はいかなる及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、アヂュヴァント（補助剤）、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗菌及び抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤等を含む。希釈剤は水、塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等を含みうる。等張剤は数ある中で、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースを含みうる。安定化剤は数ある中で、アルブミンを含む。

本発明にしたがう使用のために好適なアヂュヴァントは、非限定的に、鉱物塩、例えば、アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及びリン酸カルシウム；界面活性剤及び微粒子、例えば、非イオン性ブロック重合体界面活性剤（例えば、コレステロール）、人工ウイルス粒子（ｖｉｒｏｓｏｍｅｓ）、サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ−２１及びＧＰＩ−０１００）、プロテオソーム、免疫刺激複合体、ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ、第四アミン（ヂメチルヂオカタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ））、アヴリヂン、ヴィタミンＡ、ヴィタミンＥ；ＲＩＢＩアヂュヴァントシステム（ＲｉｂｉＩｎｃ．）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｕｍｐｈｌｅｉの細胞壁骨格（Ｄｅｔｏｘ（商標））、ムラミルヂペプチド（ＭＤＰ）及びトリペプチド（ＭＴＰ）、モノフォスフォリル脂質Ａ、ＢａｃｉｌｌｕｓＣａｌｍｅｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ、熱不安定性Ｅ．ｃｏｌｉエンテロトキシン、コレラ毒素、トレハロースヂマイコレート、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの如き細菌製品；サイトカイン及びホルモン、例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、デヒドロエピアンドロステロン、１，２５−ヂヒドロキシヴィタミンＤ₃；ポリアニオン、例えば、デキストラン；ポリアクリル酸（例えば、ポリメチルメタクリル酸、Ｃａｒｂｏｐｏｌ９３４Ｐ）；担体、例えば、破傷風類毒素、ヂフテリア類毒素、コレラ毒素Ｂサブユニット、腸毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉの突然変異体熱不安定性エンテロトキシン（ｒｍＬＴ）、熱ショックタンパク質；水中油エマルジョン、例えば、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標）（Ｈｙｄｒｏｎｉｃｓ，ＵＳＡ）；及びＦｒｅｕｎｄ’ｓ完全及び不完全アヂュヴァントの如き油中水エマルジョンの如き、いくつかのアヂュヴァントクラスを含む。

本発明にしたがう組み合わせワクチンにおける使用のための好ましいアヂュヴァントはＱｕｉｌＡ及びコレステロールを含む。

上記ｐ６８抗原、１以上の他の病原体からの抗原、及び獣医学的に許容される担体は、例えば、混合、溶解、懸濁、乳化、カプセル化、吸収等による、いかなる便利な及び実用的な様式でも混合され、組み合わせワクチン組成物を形成しうる、及び注入、埋入、吸入、摂取等に好適な錠剤、カプセル、粉末、シロップ、懸濁物の如き調剤中に作出されうる。好ましくは、上記ワクチンは、それが約０．１〜５ｍｌ又は好ましくは約０．５〜２．５ｍｌの用量で又はさらにより好ましくは約１ｍｌの用量で注入によりイヌに投与されうるように調合される。

本発明にしたがって、ｐ６８組み合わせワクチンは少なくとも６週齢、好ましくは少なくとも７週齢、及びより好ましくは少なくとも８又は９週齢のイヌに投与されうる。上記投与は経口、鼻内、粘膜、局所、経皮、及び非経口（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下又は筋内）を含む、いかなる既知の経路によってもなされうる。投与はまた針なしデリバリー装置を用いても達成されうる。投与はまた経路の組み合わせを用いて、例えば、第一の投与は非経口経路を用い、及び続く投与は粘膜経路を用いて達成されうる。好ましい投与経路は皮下及び筋内投与を含む。

好ましいｐ６８組み合わせワクチン及び予防接種方法
本発明に係る好ましい組み合わせワクチンはＣＤウイルスの減衰された株、ＣＡＶ−２の減衰された株、ＣＰＩウイルスの減衰された株、ＣＰＶの減衰された株、ＣＣＶの株の不活性化調製物、及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原を含む。

特に好ましい組み合わせワクチンは「ＳｎｙｄｅｒＨｉｌｌ」株（ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｅｒｖｉｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）と呼ばれる減衰されたＣＤウイルス株、「Ｍａｎｈａｔｔａｎ」株（ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｅｒｖｉｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）と呼ばれる減衰されたＣＡＶ−２株、「ＮＬ−ＣＰＩ−５」（ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｅｒｖｉｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）の名称を有する減衰されたＣＰＩウイルス株、「ＮＬ−３５−Ｄ」（ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｅｒｖｉｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）の名称を有する減衰されたＣＰＶ株、「ＮＬ−１８」（ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｅｒｖｉｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）の名称を有するＣＣＶ株の不活性化調製物、及び配列ＩＤ番号：１の配列を有する組換えＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原を含む。「ｐ６８／５ＣＶ組み合わせワクチン」とも本明細書中で呼ばれる、上記組み合わせワクチンは減衰されたウイルス株のフリーズドライ調製物及びウイルス調製物を液体調製物で再水和化することにより好ましく調製され、その液体調製物は滅菌塩水溶液中に溶解され及びＱｕｉｌＡ及びコレステロールで補助されるｐ６８抗原から成る。

他の特に好ましい組み合わせワクチンはｐ６８／５ＣＶ組み合わせワクチンの抗原成分、及び５のレプトスピラ種：Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｂｒａｔｉｓｌａｖａ（例えば、ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｅｒｖｉｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡから得られうるＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｂｒａｔｉｓｌａｖａ株）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃａｎｉｃｏｌａ（例えば、株Ｃ−５、ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｅｒｖｉｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ（例えば、株ＭＡＬ１５４０、ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｅｒｖｉｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ（例えば、株ＮＡＤＬ１１４０３、ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｅｒｖｉｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｐｏｍｏｎａ（例えば、株Ｔ２６２、ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｅｒｖｉｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）の不活性化全細胞調製物を含む。「ｐ６８／５ＣＶ−Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ組み合わせワクチン」とも本明細書中で呼ばれる、上記組み合わせワクチンは減衰されたウイルス株のフリーズドライ調製物（又はスプレイ乾燥又は脱水の如き他の方法により作出される調製物）及びウイルス調製物を液体調製物で再水和化することにより好ましく調製され、その液体調製物は滅菌塩水溶液中に溶解され、及びＱｕｉｌＡ及びコレステロールで補助されたｐ６８抗原及びレプトスピラの抗原から成る。

本発明にしたがって、ｐ６８／５ＣＶ及びｐ６８／５ＣＶ−Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ組み合わせワクチンは４週齢以上、好ましくは６週齢以上の健康なイヌに、及び好ましくはそれぞれ約３週間離れて投与される３用量で投与されうる。イヌは単一の用量で毎年再予防接種されうる。交配、搭乗（乗船、乗車）、及び展示状況のように、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ及びイヌウイルス暴露が起こりそうな場合、追加のブースターはこれらの事件の発生の１年又は好ましくは６ヶ月以内に与えられうる。

本発明に係るさらに他の好ましい組み合わせワクチンはＣＤウイルスの減衰された株、ＣＡＶ−２の減衰された株、ＣＰＩウイルスの減衰された株、ＣＰＶの減衰された株、及び組換えＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原を含む。

特に好ましい組み合わせワクチンは「ＳｙｎｄｅｒＨｉｌｌ」株（ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｅｒｖｉｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）と呼ばれる減衰されたＣＤウイルス株、「Ｍａｎｈａｔｔａｎ」株（ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｅｒｖｉｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）と呼ばれる減衰されたＣＡＶ−２株、「ＮＬ−ＣＰＩ−５」（ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｅｒｖｉｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）の名称を有する減衰されたＣＰＩウイルス株、「ＮＬ−３５−Ｄ」（ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｅｒｖｉｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）と呼ばれる減衰されたＣＰＶ株、及び配列ＩＤ番号：１の配列を有する組換えＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原を含む。「ｐ６８／ＤＡ₂ＰＰ組み合わせワクチン」とも本明細書中で呼ばれる、上記組み合わせワクチンは減衰されたウイルス株のフリーズドライ調製物（又はスプレイ乾燥又は脱水の如き他の方法により作出される調製物）を液体調製物で再水和化することにより好ましく調製され、その液体調製物は滅菌塩水溶液中に溶解され、及びＱｕｉｌＡ及びコレステロールで補助されるｐ６８抗原から成る。

他の特に好ましい組み合わせワクチンはｐ６８／ＤＡ₂ＰＰ組み合わせワクチンの抗原成分及び２のレプトスピラ種：Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃａｎｉｃｏｌａ（例えば、株Ｃ−５１、ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｅｒｖｉｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ（例えば、株ＮＡＤＬ１１４０３、ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｅｒｖｉｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）の不活性化全細胞調製物を含む。あるいは、好ましい組み合わせワクチンはｐ６８／ＤＡ₂ＰＰ組み合わせワクチンの抗原成分及び５のレプトスピラ種：Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｐｏｍｏｎａの不活性化全細胞調製物を含みうる。「ｐ６８／ＤＡ₂ＰＰ−Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ組み合わせワクチン」とも本明細書中で呼ばれる、これらの組み合わせワクチンは減衰されたウイルス株のフリーズドライ調製物（又はスプレイ乾燥又は脱水の如き他の方法により作出される調製物）及びウイルス調製物を液体調製物で再水和化することにより好ましく調製され、その液体調製物は滅菌塩水溶液中に溶解され、及びＱｕｉｌＡ及びコレステロールで補助されたｐ６８抗原及びレプトスピラの抗原から成る。

本発明にしたがって、ｐ６８／ＤＡ₂ＰＰ及びｐ６８／ＤＡ₂ＰＰ−Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ組み合わせワクチンは６週齢以上又は好ましくは８週齢以上の健康なイヌに、及び好ましくはそれぞれ約３週間離れて投与される２用量で投与されうる。少なくとも１２週齢のイヌに与えられる場合、単一用量は十分でありうる。イヌは単一の用量で毎年再予防接種されうる。交配、搭乗（乗船、乗車）、及び展示状況のように、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ及びイヌウイルス暴露が起こりそうな場合、追加のブースターはこれらの事件の発生の１年又は好ましくは６ヶ月以内に与えられうる。他の好ましい組み合わせワクチンはＣＰＩの減衰された株との組み合わせの、ｐ６８抗原、好ましくは配列ＩＤ番号：１を有する組換えｐ６８抗原を含む。

さらに他の好ましい組み合わせワクチンはｐ６８抗原、好ましくは配列ＩＤ番号：１を有する組換えｐ６８抗原、ＣＰＩの減衰された株、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｃａｎｉｃｏｌａ（例えば、株Ｃ−５１、ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｅｒｖｉｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ（例えば、株ＮＡＤＬ１１４０３、ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｅｒｖｉｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）の如き２の少なくとも２のレプトスピラ種を含む。

本発明に係る組み合わせワクチンにおけるｐ６８抗原及び1以上の他の病原体からの抗原（単数又は複数）の量は免疫化に有効であるべきである。一般的に、組み合わせワクチンにおけるｐ６８抗原は１用量当たり少なくとも約０．５μｇの量であるべきである。上記減衰されたＣＤウイルスは１用量当たり少なくとも約１０²〜約１０⁹ＴＣＩＤ₅₀（組織培養感染性用量５０％細胞障害効果）の量で、及び好ましくは１用量当たり約１０⁴〜約１０⁶ＴＣＩＤ₅₀の範囲内であるべきである。上記減衰されたＣＡＶ−２は１用量当たり少なくとも約１０²ＴＣＩＤ₅₀〜約１０⁹ＴＣＩＤ₅₀の量で、好ましくは１用量当たり１０^4.0〜約１０^6.0ＴＣＩＤ₅₀の範囲内であるべきである。上記減衰されたＣＰＩウイルスは１用量当たり少なくとも約１０²ＴＣＩＤ₅₀〜約１０⁹ＴＣＩＤ₅₀の量で、及び好ましくは１用量当たり１０⁶〜約１０⁸ＴＣＩＤ₅₀の範囲内であるべきである。上記減衰されたＣＰＶは１用量当たり少なくとも約１０²ＴＣＩＤ₅₀〜約１０⁹ＴＣＩＤ₅₀の量で、好ましくは１用量当たり１０⁷〜約１０⁹ＴＣＩＤ₅₀の範囲内の量であるべきである。不活性化ウイルス調製物中のＣＣＶの量は１用量当たり少なくとも約１００相対ユニット、及び好ましくは１用量当たり１０００〜４５００相対ユニットの範囲内であるべきである。上記ワクチン中のそれぞれのレプトスピラ種は１ワクチン用量当たり約１００〜３５００ＮＵ（比濁単位）の範囲内で、及び好ましくは１用量当たり２００〜２０００ＮＵの範囲内であるべきである。

上記組み合わせワクチンは、上記ワクチンが０．１ｍｌ〜５ｍｌ、好ましくは０．５ｍｌ〜２．５ｍｌ、及びより好ましくは、約１ｍｌの用量で注入によりイヌに投与されうるよう調合される。
本発明は以下の非限定的な実施例によりさらに例示される。

実施例１
イヌＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｐ６８組換え抗原用量滴定研究
ワクチン：
実験のワクチン抗原はＥ．ｃｏｌｉ株ＬＷ６８により生成されるＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの組換えｐ６８外膜タンパク質（配列ＩＤ番号：１）であった。上記ワクチンは１ｍＬ用量中に５０μｇのＱＡＣ（ＱｕｉｌＡ／５０μｇコレステロール）で補助されたさまざまな値のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）可溶化ｐ６８を含んだ。

チャレンジ物質：
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａのエーロゾル、イヌ単離物＃８５Ｂ、パッセージ＃３、ロット＃０５１５９７をチャレンジ物質として使用した。平均プレートカウントは１．５９×１０⁸ＣＦＵ／ｍｌであった。

動物：
６０の雄及び雌の子イヌを６処置群の１にランダムに割り当てた（１群当たり１０頭の子イヌ）。子イヌを出血させ、及び気管綿棒を第一の予防接種の４１日前に及び再び第一の予防接種の２８日前に取り、及び血清反応陽性の又は培養陽性の動物を研究から除去した。
動物をランダム化完全ブロック設計にしたがって処置及び部屋にランダムに割り当てた。予防接種後観察をワクチン割当て群の知識なしに行った。

手順：
ＩＶＰ投与：
動物をプラシーボ又は実験ワクチンのいずれかで０日目に予防接種した。第二の予防接種を２１日目に投与した。第一の予防接種は右の首に皮下投与し、及び第二の予防接種は左の首に皮下投与した。

チャレンジ投与：
全ての動物を第二の予防接種２８日後にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａのエーロゾルでチャレンジした。動物をチャレンジ後２〜１４日目の間（５１〜６３日目）毎日２回（午前中に１回及び午後に１回）３０分間咳についてモニターした。

観察及びサンプル回収：
全ての注入部位をそれぞれの予防接種後７日間（０〜７及び２１〜２８日目）及びそれぞれの予防接種後１４日目（１４及び３５日目）に触診し、及び３次元的に計測した。
直腸温度を予防接種の日及びそれぞれの予防接種後３日間（０〜３及び２１〜２４日目）記録した。

血液を予防接種の日（０及び２１日目）及び４２、５０、及び６３日目に回収し、及びＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａから精製したｐ６８タンパク質に対する特異的抗体についてＥＬＩＳＡにより分析した。血液をまた４２、４９、５０、５２、５４、５６及び５８日目に回収し、及びＳｅｒｕｍＡｍｙｌｏｉｄＡ(血清アミロイドＡ）（ＳＡＡ）について分析した。

全ての動物についてＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ単離のために気管綿棒を行い、及び血液を予防接種前（業者で、−４１日目及び−２８日目）に及び４９日目にＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ凝集タイターのために回収した。

Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐ６８イヌ及びマウス抗体滴定ＤＡＢＥＬＩＳＡ
精製したネイティブｐ６８を０．０１ＭＢｏｒａｔｅＢｕｆｆｅｒ中に６００ｎｇ／ｍＬに希釈し、及び１００μＬ／ウェルでそれぞれのウェルに添加した。上記プレートを４℃で一晩インキュベートした。上記プレートをその後過剰のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で１回洗浄した。ＰＢＳ中の１％無脂肪乾燥乳を２００μＬ／ウェルで上記プレートに添加した。上記プレートをその後３７℃で１時間インキュベートした。上記プレートをその後過剰のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で１回洗浄した。

イヌ又はマウス血清を上記ＥＬＩＳＡプレートの上の横行に１：５０希釈で添加し、及び２倍連続希釈血清を上記プレートの全てにわたり添加した。上記プレートを３７℃で１時間インキュベートした。続いて、上記プレートを過剰のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。

上記のイヌ血清でインキュベートしたプレートに、１：２０００希釈に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を１００μＬ／ウェルで添加した。上記プレートをその後３７℃で１時間インキュベートした。上記のマウス血清でインキュベートしたプレートに、１：４０００希釈に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を１００μＬ／ウェルで添加した。上記プレートをその後３７℃で１時間インキュベートした。上記プレートをその後過剰のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。
ＡＢＴＳ基質を１００μＬ／ウェルで添加した。約２０分後、上記プレートを４０５〜４９０ｎｍでＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ又は同等のプレートリーダーで読んだ。

データ分析：
咳をするイヌの数における処置差をＦｉｓｈｅｒ’ｓＥｘａｃｔＴｅｓｔを用いて試験した。５％値の有意性を使用した。
ＥＬＩＳＡタイターを一般的な直線混合モデルを用いて分析前にログ変換した。９５％値の信頼性を処置差を評価するために使用した。チャレンジ観察を毎日２回それぞれ３０分間モニターした。

結果：
気管綿棒培養及び凝集タイター
気管綿棒培養及び凝集タイターを研究に含まれる動物のＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ状態をモニターするために評価した。何頭かのイヌはさまざまな時点で増大したタイターを示したが、タイターがチャレンジ前に１２８超に増大したことはなかった。

注入部位観察
第一の予防接種後の注入部位反応は表１中に示される。最も大きな注入部位反応はＴ０５（６４μｇ）予防接種動物において観察され、最も大きな平均注入部位反応はわずかに１４．６９ｃｍ³を計測した（予防接種２日後）。Ｔ０３（４μｇ）、Ｔ０４（１６μｇ）及びＴ０６（２５６μｇ）予防接種動物は予防接種７日後までさまざまな注入部位反応を示した。Ｔ０２（１μｇ）予防接種動物は予防接種後１日目にのみ反応を示した。予防接種後７日目には、処置群間で注入部位反応における統計的な有意差はなかった。１４日目には、全ての注入部位反応は消散していた。

第二の予防接種後の注入部位反応は表２中に示される。第二の予防接種後、最も大きな平均注入部位反応はＴ０６（２５６μｇ）において観察され、最も大きな平均注入部位反応は５０．０３ｃｍ³を計測した（予防接種１日後）。注入部位反応は第二の予防接種７日後までＴ０５（６４μｇ）及びＴ０４（１６μｇ）動物において示された。極小の注入部位反応が予防接種７日後までＴ０３（４μｇ）及びＴ０２（１μｇ）動物において示された。プラシーボ群と統計的に異ならなかった注入部位反応が予防接種後Ｔ０２（１μｇ）及びＴ０３（４μｇ）において示された。第二の予防接種１４日後、注入部位反応は観察されなかった。

第一の予防接種後の注入部位反応の頻度は表３中に示される。第一の予防接種後のいつ時でも反応を示した注入部位の最も高い全体ＬＳＭ頻度、７６％はＴ０６（２５６μｇ）での予防接種に由来した。次に最も頻繁なものはＴ０５（６４μｇ）で第一の予防接種後に反応を示した注入部位の７２％、Ｔ０４（１６μｇ）で第一の予防接種後の６９％、及びＴ０３（４μｇ）で第一の予防接種後の６３％であった。最も低い頻度、３８％はＴ０２（１μｇ）の第一の予防接種に続いた。

第二の予防接種後の注入部位反応の頻度は表４中に示される。それぞれのワクチンについての全体ＬＳＭ頻度は第一の予防接種後に見られたものと一致した。
予防接種後の注入部位反応の発生及び期間は表５中に要約される。計測可能な注入部位反応の発生（又はいつ時でも反応を示すイヌの数）は第一の及び第二の予防接種後Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５及びＴ０６（それぞれ、４μｇ、１６μｇ、６４μｇ、及び２５６μｇ）について１００％であった。Ｔ０２（１μｇ）を受けた動物は予防接種後注入部位反応の最も少ない発生を示した（５７．１％）。

反応の期間（表５中に示される反応を有する日の最小二乗法平均として表される）は第一の及び第二の予防接種後（第一の予防接種２．７〜５．１日後及び第二の予防接種６．０〜６．７日後）のＴ０４、Ｔ０５及びＴ０６（それぞれ、１６μｇ、６４μｇ、及び２５６μｇ）予防接種動物について、より長かった。Ｔ０２及びＴ０３（それぞれ、１μｇ及び４μｇ）予防接種動物は第一の及び第二の予防接種後（第一の予防接種０．３及び１．３日後及び第二の予防接種１．９及び４．５日後）の注入部位反応について最も少ない日数を示した。

直腸温度
平均直腸温度計測は表６中に要約される。１及び２４日目のＴ０２（１μｇ）についての、１、２１、及び２４日目のＴ０３（４μｇ）についての、２及び２４日目のＴ０４（１６μｇ）についての、２３日目のＴ０５（６４μｇ）についての、及び０、１、及び２４日目のＴ０６（２５６μｇ）についてのＬＳＭ直腸温度はプラシーボとは有意に異なった。２３日目には、全ての比較はプラシーボと統計的に有意（Ｐ＞０．０５）でなかった。

ｐ６８ＥＬＩＳＡ血清学
ｐ６８ＥＬＩＳＡデータの要約は表７中に示される。全ての群におけるｐ６８ＥＬＩＳＡ特異的抗体の予防接種前幾何平均ウイルスタイターは低く（２４．９〜２８．９に及ぶ）、及びプラシーボについてのタイターは研究の期間をとおして低いままであった。第一の予防接種２１日後、ｐ６８ＥＬＩＳＡ幾何平均タイターは予防接種処置において増大した（５５．２〜４，４１１．７に及ぶ）、しかしながら、Ｔ０２（１μｇ）タイターはプラシーボ（Ｔ０１）と統計的に異ならなかった。第二の予防接種４２日後、幾何平均タイターは全ての予防接種群においてさらに増大され（６７４．６〜４８，３８２．０に及ぶ）、予防接種に対する優れた血清反応を示した。

血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）血清学
ＳＡＡタイターは表８中に要約される。チャレンジ前に、幾何平均ＳＡＡタイターは全ての処置群において低かった（０．１〜０．５に及ぶ）。チャレンジ後、Ｔ０１ＧＭＴタイターは１．５〜１４６．０に及び、ここでｐ６８処置群は０．３〜２３．１に及んだ。全ての処置群は５０、５２、５４、及び５６日目にプラシーボと統計的に異なった。統計的な差は、それが全ての他のｐ６８処置群と統計的に異なる幾何平均を示した５２日目のＴ０２（１μｇ）を除いては、ｐ６８ワクチン群間では示されなかった。

チャレンジ応答
チャレンジ応答データは表９中に示される。上記応答はチャレンジ後の咳をモニターすることにより決定され、及び上記観察は２の方法：咳をした日数の最小二乗法平均及び咳をした２の連続した日（疾患の発生）を用いて分析された。

咳をした日数の平均の分析はｐ６８処置群間で統計的に有意な差を示さなかった；しかし、プラシーボで予防接種されたイヌは平均８．６日間咳をし、一方、ｐ６８ワクチンを投与されたイヌは有意に咳が少なく、平均は２．２〜４．７日間に及んだ。

イヌが疾患の発生を用いて評価されたとき、全てのＴ０１（プラシーボ）は２の連続した日に咳をしたことが観察された（１００％疾患の発生）。Ｔ０４（１６μｇ）及びＴ０５（６４μｇ）予防接種イヌはそれぞれ５５．６％及び６６．７％の疾患の発生を示した。Ｔ０２（１μｇ）予防接種イヌのわずかに２８．６％、Ｔ０３（４μｇ）の５０％、及びＴ０６（２５６μｇ）の３３．３％は２の連続した日に咳をしたことが観察された。

議論：
この研究において、目的はイヌにおける抗原用量、免疫応答、及び保護の間の関係を確立することであった。調べられたｐ６８抗原用量は１μｇ、４μｇ、１６μｇ、６４μｇ、及び２５６μｇであった。

注入部位反応計測の分析は、第二の予防接種後1日目のＴ０６（２５６μｇ）を除いては、ｐ６８処置群においてごくわずかな反応しか示さなかった。観察された反応は小さい傾向があり、一般的に観察期間中に大きさが減少した。これらの反応の大きさは臨床的にほんのわずかであり、及び毛を剃られていないイヌにおいてはほとんど気付かれなかったであろう。
予防接種後直腸温度は普通であり、及び全ての群における全てのイヌについて正常の限界内であった。

予防接種に対する血清応答はＴ０３〜Ｔ０６群において優れていた。これらの処置群において、全てが２１日目〜６３日目でプラシーボに比較されたとき有意に高いｐ６８ＥＬＩＳＡタイターを示した。Ｔ０２（１μｇ）は４２日目〜６３日目でＴ０１（プラシーボ）に比較して有意なｐ６８ＥＬＩＳＡタイターを示した。最も高いタイターはＴ０５（６４μｇ）及びＴ０６（２５６μｇ）において観察された。

チャレンジ後の全てのｐ６８予防接種イヌにおけるＳＡＡ応答の調査はコントロールイヌに比較されたときチャレンジ後のＳＡＡにおける非常により小さな上昇を示した。全ての他のｐ６８処置群と統計的に異なる幾何平均を示した５２日目のＴ０２（１μｇ）を除いては、チャレンジ後のｐ６８ワクチン用量値の間に差は示されなかった。

チャレンジ後の咳観察は咳をした日数の最小二乗法平均（ＬＳＭ）又は咳をした２の連続した日（疾患の発生）を用いて分析された。咳をした日数のＬＳＭを用いて、有意差がプラシーボ及び全てのｐ６８予防接種群の間で示されたが、異なるｐ６８ワクチン用量値の間で差は示されなかった。疾患の発生を用いて、Ｔ０２（１μｇ）、Ｔ０３（４μｇ）及びＴ０６（２５６μｇ）予防接種イヌはプラシーボより有意に咳が少なかった。

結論：
上記研究はイヌにおける抗原用量、免疫応答、及び保護の間の関係を確立するために行われた。調べられたｐ６８抗原用量は１μｇ、４μｇ、１６μｇ、６４μｇ、及び２５６μｇであった。

全てのワクチンは極小の注入部位反応、正常な直腸温度及び予防接種への悪い応答の不在により示されるように安全であった。注入部位反応の大きさ及びこれらの反応の期間はより低い抗原処置群において小さかった（短かった）。ＥＬＩＳＡタイターにより計測される予防接種への血清応答は、より高い血清応答を示すより高い抗原用量群で優れていた。比較の方法として咳をした日数のＬＳＭを用いたとき、全ての処置群はプラシーボと比較されたとき咳をすることにおける有意な減少を示した。処置群間では差は見られなかった。咳をした２の連続した日（又は疾患の発生）が比較のために使用されたとき、Ｔ０２（１μｇ）、Ｔ０３（４μｇ）及びＴ０６（２５６μｇ）予防接種イヌはプラシーボより有意に咳が少なかった。

実施例２
イヌＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｐ６８免疫原性研究
動物
４５頭の雄及び雌混合飼育イヌを購入した。ＭＬＶパルヴォウイルスワクチンを子イヌが研究場所に到着した日に全ての子イヌに投与した。実験製品以外の他のワクチンは研究中上記子イヌに投与されなかった。イヌは０日目（第一の予防接種の日）に約９週齢（±１週）であった。

イヌをチャレンジ前にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ及び他のイヌ病原体への暴露を避けるために必要な隔離施設内に保った。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａでのエーロゾルチャレンジ後、隔離手順を他のイヌ病原体への暴露を避けるために続けた。

ワクチン
滅菌塩水を処置群Ｔ０１及びＴ０２においてプラシーボワクチンとして使用した。イヌ組換えｐ６８Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａワクチンを処置群Ｔ０３及びＴ０４において使用した。ｐ６８抗原の構造遺伝子をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中にクローニングし、及び遺伝子発現を温度感受性プロモーターにより制御させた。上記細胞を溶解し、及び封入体を遠心分離により分離した。上記封入体中の組換えｐ６８をＳＤＳ処理により可溶化した。上記組換えｐ６８（ｍＬ当たり１５μｇ）を希釈剤としての滅菌塩水中でｍＬ当たり５０μｇのＱｕｉｌＡ及び５０μｇのコレステロールと混合した。それぞれの１ｍＬ用量は０．２８％エタノール及び０．０１％チメロサールを含んだ。

チャレンジ接種物
ＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａＢｉｈｒＣａｔ株をＢｉｏｌｏｇｉｃｓＣｏｎｔｒｏｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ−Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙにより最近使用される方法を用いてチャレンジ接種物として調製した。Ｂｏｒｄｅｔ−ＧｅｎｏｕアガープレートにＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ−ＢｉｈｒＣａｔ株のコンフルエント成長をまき、及び３７．５＋／−２．５℃で４８時間インキュベートした。悪性相Ｉコロニーを選択し、及びＢｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎｏｕアガー上にすじを書き、及び３７．５＋／−２．５℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ塩水を上記アガーからコロニーを洗浄するために使用し、及び抗原を６００ｎｍで０．８０の光学濃度まで希釈した。細胞カウントを比濁計の計測の確認のためにチャレンジ前及び後に行った。チャレンジ標的濃度は約１×１０⁹ＣＦＵであった。チャレンジ前濃度は２．３７×１０⁹ＣＦＵ（１００％相Ｉ）であり、及びチャレンジ後濃度は１．３５×１０⁹ＣＦＵ（１００％相Ｉ）であった。

研究設計
要約表

ランダム化／盲検
予防接種からチャレンジの日までの期間中、動物を一般化ブロック設計にしたがって処置に割り当てた。処置を部屋にランダムに割り当てた。チャレンジの日に、動物をブロックによりチャレンジ部屋にランダムに割り当てた。
割り当てられた処置群を知らない、適任な個人が微生物学及び血清学分析及び注入部位の評価、直腸温度の計測、及び咳の観察を行った。

データ分析
予防接種後応答変数は注入部位データ、直腸温度及びｐ６８ＥＬＩＳＡタイターから成った。注入部位データを以下の方法で要約した：１）処置により計測可能な反応を有する動物数及び研究の日、２）処置により計測可能な反応を有する動物時点の数、３）処置によりどの時点でも計測可能な反応を有する動物数。
第一の及び第二の予防接種について別々に、注入部位体積（立方ｃｍ）、直腸温度及び自然対数変換ｐ６８ＥＬＩＳＡタイターデータを一般直線混合モデルを用いて分析した。

観察時点最小二乗法平均による処置のｐｒｉｏｒｉ直線対照をそれぞれの観察時点での処置群差を試験するために、及びそれぞれの処置内の時点を比較するために構築した。５％値の有意性を全ての比較について使用した。
チャレンジ後応答変数は毎日の咳観察、ｐ６８ＥＬＩＳＡタイター及び血清アミロイドＡタイターから成った。チャレンジ後の期間中の咳をした日数を一般直線混合モデルを用いて分析した。

処置最小二乗法平均のｐｒｉｏｒｉ対照を処置群差を試験するために構築した。５％の有意性を全ての比較について使用した。
第一の及び第二の予防接種について別々に、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓＥｘａｃｔ試験を、咳をした２の連続した日の発生について処置群を比較するために使用した。５％値の有意性を全ての比較について使用した。
チャレンジ後の血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タイターデータについて、自然対数変換を一般直線混合モデルを用いる分析前にタイター値に適用した。
観察時点最小二乗法平均による処置のｐｒｉｏｒｉ直線対照をそれぞれの観察時点での処置群差を試験するために及びそれぞれの処置内の時点を比較するために構築した。５％値の有意性を全ての比較について使用した。

研究手順
詳細な動物手順
４５頭の血清反応陰性及び培養陰性子イヌを４の処置群の１にランダムに割り当てた。８及び７頭のイヌをそれぞれ筋内（ＩＭ）又は皮下（ＳＣ）コントロール群に割り当て、全部で１５頭のコントロールイヌとした。１５頭のイヌをｐ６８ＳＣ処置群に割り当て、及び１５頭のイヌをｐ６８ＩＭ処置群に割り当てた。処置群は上記の研究設計の節において詳述される。

０日目を第一の予防接種の日とした。予防接種を０日目に投与し、及び２１日後に繰り返した。第一の予防接種のために、首の右側を使用し、及び第二の予防接種のために、首の左側を使用した。筋内注入をそれぞれ、第一の及び第二の予防接種について右及び左の半膜様の筋肉内に投与した。全ての注入部位をそれぞれの予防接種後７日間三次元的に計測し、及びフォローアップ計測を予防接種１４日後に行った。直腸温度を予防接種の日に（予防接種前に）及びそれぞれの予防接種後３日間モニターした。

３５日目に、全ての動物についてＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ培養のために気管綿棒を行い、及び血液を凝集タイターのために回収した。全ての動物は気管綿棒により陰性であり、及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａについて血清反応陰性であり、及びチャレンジに適格であると考えられた。

第二の予防接種２４日後である４５日目に、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａのエーロゾルチャレンジを全てのイヌに投与した。鎮静されたイヌを、上記鎮静されたイヌの鼻口部にわたり沿うようフィットされた使い捨て鼻コーンを用いてチャレンジした。上記鼻コーンを５．５〜６．０ｐｓｉに設定された真空圧ポンプに取り付けられた噴霧器に取り付けた。１ｍＬのチャレンジ物質を上記噴霧器中に入れ、及びエーロゾル化されたチャレンジ物質をそれぞれのイヌに４分間投与した。観察を行う人員は処置群割当てを知らなかった。

動物をチャレンジ後１４日間（４６〜５９日目）咳についてモニターした。観察をそれぞれの日のおよそ同じ時間に、２回、約３０分間行い、１回はＡＭに、及び１回はＰＭに行い、及び結果を記録した。

血液回収
凝集タイターのための血液を第一の予防接種前及びチャレンジ前に回収した。抗−ｐ６８ＥＬＩＳＡ評価のための血液を０及び２１日目の予防接種前に及び３５、４５、及び５９日目に回収した。血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）分析のための血液をチャレンジの日（４５日目）に及び４６、４８、５０、５２及び５４日目に回収した。

サンプルについて行われた試験
気管綿棒を培養によりＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの存在について評価した。それぞれの気管綿棒でＢｏｒｄｅｔｅｌｌａＳｅｌｅｃｔｉｖｅＡｇａｒプレート上にすじを書いた。陽性及び陰性コントロールを含めた。上記プレートを３７．５±２．５℃で４８±４時間インキュベートした。それぞれのプレート上の生ずるコロニーを上記陽性コントロールと比較し、及び上記陽性コントロールと同一に見えるコロニーをＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの存在を確認するためにさらに試験した。確認試験はＴＳＩ、ＣｉｔｒａｔｅａｎｄＵｒｅａＡｇａｒ及びＮｉｔｒａｔｅＲｅｄ培地の使用を含んだ。

血清を以下の方法を用いて凝集タイター、ｐ６８ＥＬＩＳＡ分析又はＳＡＡ分析について評価した：
凝集タイター−血清をＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ塩水を用いてマイクロタイタープレート中に連続希釈した。陽性及び陰性コントロールをそれぞれのプレート上に含めた。Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ株８７（ＢｏｒｄｅｔＧｅｎｏｕアガー上で生育した、回収された、不活性化された及び６３０ｎｍで２０％Ｔまで希釈された）を凝集抗原として使用し、及びそれぞれのウェルに添加した。プレートを３５±２℃で２時間振り及びインキュベートした。プレートを室温で２２時間の第二のインキュベーション後に読んだ。終点タイターを、５０％凝集を示すよう最終ウェルを用いて決定した。

ｐ６８ＥＬＩＳＡタイター−組換えｐ６８抗原をＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｐ６８抗原に特異的なポリクローナル抗血清でコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレート上に捕えた。イヌ血清の連続２倍希釈物を上記プレートに添加し、及びインキュベートした。１：１０００希釈の陽性及び陰性コントロールをそれぞれのプレート上に含めた。ペルオキシダーゼ標識アフィニティ精製ヤギ抗−イヌＩｇＧインディケーター結合物をｐ６８抗原に特異的な抗体を検出するために使用した。発色性基質ＡＢＴＳをその後添加し、及び上記プレートを上記陽性コントロールウェルが１．２±０．２のＯ．Ｄ．を有したとき読んだ。あるサンプルのタイターを陰性コントロール血清希釈の平均＋５標準偏差より大きな光学濃度を有する最終希釈の逆数として計算した。

ＳＡＡタイター−イヌ血清アミロイドＡタイターをＡｃｃｕｐｌｅｘＣｏ．，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＮｅｂｒａｓｋａＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ，Ｏｍａｈａ，ＮＥ６８１９８から購入したキットを用いて評価した。簡単に述べると、イヌＳＡＡをモノクローナル抗−イヌＳＡＡ抗体でコーティングしたマイクロタイタープレート上に捕えた。イヌ血清の希釈サンプル、続いてビオチン標識抗−イヌ抗体結合物を上記プレートに添加した。インキュベーション後、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアヴィヂン発色性基質を添加した。上記プレートを３０分後に読んだ。

結果
直腸温度
直腸温度計測の要約は表１０及び１１中に示される。

第一の予防接種後のいずれの日にもいずれの群間にも有意差は見られなかった。２１日目に塩水予防接種イヌ及び全てのｐ６８予防接種イヌの間に有意差が見られた（Ｔ０１Ｔ０２対Ｔ０３Ｔ０４についてｐ＝０．００５３）。ｐ６８ＳＣ及びＩＭ予防接種群間の有意差（ｐ＝０．０１２４）が２４日目に示された。

注入部位反応
注入部位反応は表１２及び１３中に要約される。技術的な見落としのために、注入部位観察は第二の予防接種後の１４日目観察で行われなかった（３５日目）。
計測可能な部位反応はＴ０３（ｐ６８ＳＣ）において観察され、及び大きさは極小であった。小さな注入部位反応が３日目にＴ０４（ｐ６８ＩＭ）における１のイヌにおいて見られたが、上記計測の極小の影響は上記群についての全体の平均においては反映されない。

注入部位計測における有意差は表１４中に要約される。Ｔ０２（塩水ＳＣ）対Ｔ０３（ｐ６８１５μｇＳＣ）間の注入部位計測における有意差は第一の予防接種後６日間見られた。７日目までに及び再び１４日目に（２週再評価観察）、どの処置群間でも有意差は見られなかった。

Ｔ０２（塩水ＳＣ）対Ｔ０３（ｐ６８１５μｇＳＣ）間の注入部位計測における有意差は第二の予防接種後７日間見られた。

ｐ６８ＥＬＩＳＡタイター
ｐ６８ＥＬＩＳＡデータは表１５及び図１中に要約される。予防接種されたイヌにおけるｐ６８に対するかなりのタイター応答のために、さまざまな滴定最小値が研究中の異なる時点で使用された。０及び２１日目についての滴定は５０で開始された。３５、４５及び５９日目について、滴定は２００で開始された。「未満」として報告される値は分析前に２で割られた。研究の過程中コントロール群（Ｔ０１及びＴ０２）についてのｐ６８ＥＬＩＳＡ値において観察された増大する上昇はこれらの最小滴定値のためである。凝集タイターは＜４のままであった。
全てのｐ６８予防接種動物はプラシーボ予防接種動物に比較されたとき予防接種のはじめの日からチャレンジの日まで（０日目対４５日目）のタイターにおいて少なくとも４倍の増大を示した。

予防接種後及びチャレンジ後ＥＬＩＳＡタイターの最小二乗法平均についての有意差は表１６中に列挙される。予防接種が完了した後、ｐ６８ＳＣ及びｐ６８ＩＭ予防接種動物の間に有意差は見られなかった。

血清アミロイドＡタイター
ＳＡＡ値をチャレンジ後０、１、３、５、７及び９日目に決定した。血清アミロイドＡ値は表１７中に示され及び図２中に表示される。

ＳＡＡタイターにおける有意差は表１８中に要約される。塩水コントロールはチャレンジ後１、３及び５日目に、予防接種されたイヌより高いＳＡＡタイターを示した。塩水ＳＣコントロールはチャレンジ後７及び９日目に、予防接種されたＳＣイヌに比較されたとき、有意に高いＳＡＡタイターを示し続けた。

咳観察
全ての処置群についてのエーロゾルチャレンジは第二の予防接種２４日後に起こった（４５日目）。咳観察を２の方法−咳をした２の連続した日に基づいた疾患状態（表１９中に示される）及び咳をした日の割合（表２０及び２１中に示される）−を用いて調べた。イヌが、咳をした２の連続した日の基準を用いて評価されたとき、塩水ＳＣ及び塩水ＩＭ予防接種イヌがそれぞれ１００％及び８７．５％咳をした一方で、８０％のｐ６８予防接種イヌ（ＳＣ及びＩＭ）が少なくとも２の連続した日に咳をした。イヌが、咳を観察された日の割合を用いて評価されたとき、ｐ６８ＳＣ及びＩＭ予防接種イヌはそれぞれ観察された日の３８．７２％及び４１．０５％咳をした。塩水ＳＣ及び塩水ＩＭ予防接種イヌはそれぞれ６９．０４％及び６２．６６％咳をした。

疾患状態が咳をした２の連続した日に基づいたとき、塩水予防接種及びｐ６８予防接種イヌの間に有意差は示されなかった。

Ｔ０２（塩水ＳＣ）及びＴ０３（ｐ６８１５μｇＳＣ）間で有意差（ｐ＝０．０１１２）が示された。Ｔ０１（塩水ＩＭ）及びＴ０４（ｐ６８１５μｇＩＭ）間では有意差は示されなかった。

塩水コントロール及びｐ６８−予防接種イヌの間で有意差（ｐ＝０．００２２）が示された。

議論
上記研究はイヌにおけるｐ６８Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ１５μｇ／用量ワクチンの安全性及び有効性を示すために設計された。

安全性は注入部位及び直腸温度観察を用いて調べられた。注入部位反応計測の分析はＩＭ予防接種群におけるわずかな反応及びＳＣ予防接種群における極小の反応を示した。観察された反応は小さい傾向があり、一般的に観察期間中に大きさが減少した。これらの反応の大きさは毛を剃られていないイヌにおいてはほとんど気付かれなかったであろう。２１日目に塩水及び予防接種群の間で及び２４日目にＩＭ及びＳＣ予防接種群の間で有意差が観察されたが、直腸温度は臨床的に普通であり、及び全ての群における全てのイヌについて正常限界内であった。

有効性はｐ６８ＥＬＩＳＡ終点タイターの計測及び咳の観察を用いて調べられた。投与経路に関わらず、優れたｐ６８抗体応答が３５日目までｐ６８−予防接種群において示された。優れた既往応答がチャレンジ後に予防接種群において観察された。より高い抗体応答がＳＣ経路に比較してより血管性の及びより脂肪が少ないＩＭ経路で伝統的に得られているが、ｐ６８ＳＣ及びＩＭ予防接種群間の差は研究の過程をとおして有意でなかった。

チャレンジ後の予防接種及び非予防接種ｐ６８ＢｏｒｄｅｔｅｌｌａイヌにおけるＳＡＡ応答の調査は特にチャレンジ後１、３及び５日目の予防接種動物群においてＳＡＡ値における非常により小さな上昇を示した。

結論
この研究において、１５μｇ／用量ｐ６８イヌＢｏｒｄｅｔｅｌｌａワクチンの有効性が予防接種２４日後のイヌチャレンジモデルを用いて調べられた。上記ワクチンは正常な直腸温度、極小の注入部位反応により示されるように安全であり、及び有効性は混合したＩＭ及びＳＣ群において示された。ＳＡＡ値の比較はエーロゾルチャレンジ後１、３及び５日目の塩水及びｐ６８予防接種イヌの間で有意差を示した。

実施例３
イヌＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｐ６８ワクチンの６ヶ月間免疫研究
動物
９０頭の雄及び雌混合飼育イヌを購入し、及び大部分の子イヌは第一の予防接種の日に９週齢（±１週）であった。

ＭＬＶパルヴォウイルスワクチンを研究場所への到着の際にイヌに投与した。研究に適格であるために、動物は気管綿棒及び凝集タイターによりＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａに陰性であることを決定された。実験製品以外のワクチンは研究の間投与されなかった。
イヌをチャレンジ前にＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ及びイヌ病原体への暴露を避けるために必要な隔離施設内で保った。Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａでのエーロゾルチャレンジ後、隔離手順を他のイヌ病原体への暴露を避けるために続けた。

ワクチン
滅菌塩水を処置群Ｔ０１及びＴ０２においてプラシーボワクチンとして使用した。イヌ組換えｐ６８Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａワクチンを処置群Ｔ０３及びＴ０４において使用した。ｐ６８抗原の構造遺伝子をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中にクローニングし、及び遺伝子発現を温度感受性プロモーターにより制御させた。上記細胞を溶解し、及び封入体を遠心分離により分離した。上記封入体中の組換えｐ６８をＳＤＳ処理により可溶化した。別々に、１５μｇｐ６８及び６０μｇｐ６８を希釈剤としての滅菌Ｌｅｐｔｏ塩水中でｍＬ当たり５０μｇのＱｕｉｌＡ及び５０μｇのコレステロールと混合した。上記混合された成分を４℃で２４時間混合し、及びマイクロフルイダイザーを３回とおした。それぞれの１ｍＬ用量は２．７μｌのエタノール及び０．０００１％のチメロサールを含んだ。実験ワクチン中のｐ６８濃度をｐ６８ＥＬＩＳＡにより計測した。全ての分析は５重で行った。全てのワクチンを６ヶ月のアセンブリー内に使用した。

チャレンジ接種物
Ｂｏｒｄｅｔ−ＧｅｎｏｕアガープレートにＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ−ＢｉｈｒＣａｔ株をまき、及び３７．５＋／−２．５℃で４８時間インキュベートした。悪性相Ｉコロニーを選択し、及びＢｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎｏｕアガー上にすじを書き及び３７．５＋／−２．５℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ塩水をアガーからコロニーを洗浄するために使用し、及び上記細胞を６００ｎｍで０．８０の光学濃度まで希釈した。細胞カウントを比濁計の計測の確認のためにチャレンジ前及び後に行った。チャレンジ標的濃度は約１×１０⁹ＣＦＵであった。群Ｉについて、チャレンジ前濃度カウントは１．９４×１０⁹であり、及びチャレンジ後濃度カウントは１．４３×１０⁹であった。群ＩＩについて、チャレンジ前濃度カウントは２．５５×１０⁹であり、及びチャレンジ後濃度カウントは２．１３×１０⁹であった。

研究設計
要約表

上記研究を群Ｉ中の４８頭のイヌ及び群ＩＩ中の４２頭のイヌから成る２の相又は群で行った。予防接種＃１はそれぞれの群について０日目に起こった。予防接種＃２は２０日後に起こった。群Ｉにおける事件は約１５日、群ＩＩにおける事件から相殺された。イヌを最後の予防接種１８１日後Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａでエーロゾルチャレンジした。

ランダム化／盲検
動物を完全ランダム化設計にしたがって処置及び部屋にランダムに割り当てた。
それぞれの研究群内の予防接種＃１からチャレンジの日までの期間について、動物をランダム化プランを用いて処置及び部屋（１部屋当たり３〜５頭のイヌ）にランダムに割り当てた。
チャレンジの日に、以前に処置した動物を一般化ブロック設計を用いて研究群内のチャレンジ部屋にランダム化した。
割り当てられた処置群を知らない、適任の個人が微生物学及び血清学分析及び咳及び注入部位の評価を行った。

データ分析
予防接種後応答変数は注入部位データ、直腸温度及びｐ６８ＥＬＩＳＡタイターから成った。注入部位データは以下のように要約される：１）処置により計測可能な反応を有する動物数及び研究の日、２）処置により計測可能な反応を有する動物時点の数、３）処置によりどの時点でも計測可能な反応を有する動物数、４）それぞれの動物についての計測可能な反応の期間。

第一の及び第二の予防接種について別々に、注入部位体積（立方ｃｍ）、直腸温度及び自然対数変換ｐ６８ＥＬＩＳＡタイターデータを一般直線混合モデルを用いて分析した。

観察時点最小二乗法平均による処置のｐｒｉｏｒｉ直線対照をそれぞれの観察時点での処置群差を試験するために及びそれぞれの処置内の時点を比較するために構築した。特に興味深い比較はＴ０１対Ｔ０３、Ｔ０１対Ｔ０５、Ｔ０３対Ｔ０５、Ｔ０２対Ｔ０４、Ｔ０２対Ｔ０６、及びＴ０４対Ｔ０６であった。時点−処置−研究群関係項がＰ＜０．０５で有意であった場合、それぞれの時点での処置群間の及び処置群内の時点間の対照はそれぞれの研究群内であり、そうでなければ、これらの対照は時点−処置関係効果最小二乗法平均に基づいた。５％値の有意性を全ての比較について使用した。

チャレンジ後応答変数はｐ６８ＥＬＩＳＡタイター、血清アミロイドＡタイター及び毎日の咳観察から成った。チャレンジ後ｐ６８ＥＬＩＳＡタイターを以前に示されるように分析した。チャレンジ後の血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タイターデータについて、自然対数変換を一般直線混合モデルを用いる分析前にタイター値に適用した。
咳の分析をＵＳＤＡ要求を反映するよう修正した。それぞれのイヌについて、咳が観察された観察期間の割合を計算した。分析前に、割合をアークサイン平方根変換を用いて変換した。一般直線混合モデルを咳の分析に使用した。

この分析からの最小二乗法平均を割合に変換し戻し、及び咳におけるパーセント減少を：

のように計算した。

処置最小二乗法平均のｐｒｉｏｒｉ直線対照を処置群差を試験するために構築した。特に興味深い比較はＴ０１対Ｔ０３、Ｔ０１対Ｔ０５、Ｔ０３対Ｔ０５、Ｔ０２対Ｔ０４、Ｔ０２対Ｔ０６、及びＴ０４対Ｔ０６であった。処置−研究群関係項がＰ＜０．０５で有意であった場合、処置群間の対照はそれぞれの研究群内であり、そうでなければ、処置群間の対照は処置主要効果最小二乗法平均に基づいた。５％値の有意性を全ての比較について使用した。

研究手順
詳細な動物手順
研究場所への到着前に及び第一の予防接種前に、子イヌについてＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ培養のために気管綿棒を行い、及び血液を凝集タイターのために回収した。全ての動物は気管綿棒により陰性であり、及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａに血清反応陰性であり、及び研究に適格であると考えられた。４８頭の子イヌを群Ｉについての６処置群の１にランダムに割り当てた。上記手順を群ＩＩについて４２頭のイヌを用いて繰り返した。動物を少なくとも５日間研究場所に順応させた。

群及び処置は節７．４．Ａ中に詳述される。施設の制約のために及びチャレンジ後の咳観察の正確さを高めるために、予防接種及びそれぞれのチャレンジ期間を２のイヌ群を作出するよう１５日で交替させた。０日目は群Ｉ及びＩＩの両方について予防接種＃１の日をいう。予防接種＃２は２０日後に起こった。処置Ｔ０１、Ｔ０３、及びＴ０５を皮下経路を介して投与した。処置Ｔ０２、Ｔ０４、及びＴ０６を筋内経路を介して投与した。皮下注入を首の側背面中に投与した。予防接種＃１について、首の右側を使用し、及び予防接種＃２について、首の左側を使用した。筋内注入をそれぞれ予防接種＃１及び予防接種＃２について右及び左の半膜様筋肉中に投与した。全ての注入部位をそれぞれの予防接種後７日間三次元的に計測し、及びフォローアップ計測を予防接種１４日後に行った。直腸温度を予防接種の日に（予防接種前に）及びそれぞれの予防接種後３日間モニターした。血液をｐ６８ＥＬＩＳＡタイター決定のためにそれぞれの予防接種前（−１日目及び１９日目）に及び５０日目に回収した。

それぞれの月に、全てのイヌについてＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ陰性状態を確認するために鎮静作用下でＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ培養のために気管綿棒を行った。血液をまた凝集及びＥＬＩＳＡタイターのために回収した。上記手順をそれぞれの群についてチャレンジ７日前に繰り返した。陽性気管綿棒培養物又は上昇する凝集タイターの証拠は上記研究から動物を除外した。

チャレンジを予防接種＃２の１８１日後にイヌに投与した。鎮静されたイヌを、上記鎮静されたイヌの鼻口部にわたり沿ってフィットされた使い捨て鼻コーンを用いてチャレンジした。上記鼻コーンは、５．５〜６．０ｐｓｉに設定された真空圧ポンプに取り付けられた噴霧器に取り付けられた。１ｍＬのチャレンジ物質を上記噴霧器内に入れ、及びエーロゾル化チャレンジ物質をそれぞれのイヌに４分間投与した。
チャレンジ後咳観察をＵＳＤＡ推奨に従うようチャレンジ前に修正した。チャレンジ後、それぞれのイヌの群をチャレンジ後３日目〜１０日目の間、全部で８日間観察した。動物を毎日２回それぞれの観察期間に約４５分間咳について観察した。観察期間の間隔は約１２時間であった。割り当てられた処置群を知らない人員が咳観察を記録した。

血液回収
凝集タイターのための血液をそれぞれの群について第一の予防接種前に、毎月、及びチャレンジ前に回収した。
抗−ｐ６８ＥＬＩＳＡ評価のための血液をそれぞれの群について予防接種＃１及び＃２の前日に、５０日目に及びその後約３０日間隔で回収した。血液をまたチャレンジの日及びチャレンジ後観察の最終日に回収した。
血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）分析のための血液をそれぞれの群についてチャレンジの日に（チャレンジの前に）及びチャレンジ１、３、５、７、及び９日後に回収した。

サンプルについて行った試験
気管綿棒を培養によりＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの存在について評価した。それぞれの気管綿棒でＢｏｒｄｅｔｅｌｌａＳｅｌｅｃｔｉｖｅＡｇａｒプレート上にすじを書いた。陽性及び陰性コントロールを含めた。上記プレートを３７．５±２．５℃で４８±４時間インキュベートした。それぞれのプレート上に生ずるコロニーを陽性コントロールと比較し、及び陽性コントロールと同一であるように見えるコロニーをＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの存在を確認するためにさらに試験した。確認試験はＴＳＩ、ＣｉｔｒａｔｅａｎｄＵｒｅａＡｇａｒ及びＮｉｔｒａｔｅＲｅｄ培地の使用を含んだ。

血清を以下の方法を用いて凝集タイター、ｐ６８ＥＬＩＳＡ分析又はＳＡＡ分析について評価した：
凝集タイター−血清をＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ塩水を用いてマイクロタイタープレート中に連続希釈した。陽性及び陰性コントロールをそれぞれのプレート上に含めた。Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ株８７（ＢｏｒｄｅｔＧｅｎｏｕアガー上で生育され、回収され、不活性化され及び６３０ｎｍで２０％Ｔまで希釈された）を凝集抗原として使用し、及びそれぞれのウェルに添加した。プレートを３５±２℃で２時間振り及びインキュベートした。プレートを室温で２２時間の第二のインキュベーション後に読んだ。終点タイターを５０％凝集を示すよう最終ウェルを用いて決定した。

ｐ６８ＥＬＩＳＡタイター−組換えｐ６８抗原をＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｐ６８抗原に特異的なポリクローナル抗血清でコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレート上に捕えた。イヌ血清の連続２倍希釈物を上記プレートに添加し、及びインキュベートした。１：１０００希釈の陽性及び陰性コントロールをそれぞれのプレート上に含めた。ペルオキシダーゼ標識アフィニティ精製ヤギ抗−イヌＩｇＧインディケーター結合物をｒｐ６８抗原に特異的な抗体を検出するために使用した。発色性基質ＡＢＴＳをその後添加し、及び陽性コントロールウェルが１．２±０．２のＯ．Ｄ．を有したとき上記プレートを読んだ。あるサンプルのタイターを陰性コントロール血清希釈の平均＋５標準偏差より大きな光学濃度を有する最終希釈の逆数として計算した。

ＳＡＡタイター−イヌ血清アミロイドＡをモノクローナル抗−イヌＳＡＡ抗体でコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレート上に捕えた。イヌ血清の希釈サンプルを上記プレートに添加し、及びインキュベートした。リファレンス標準を０．３１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの標準曲線を得るために添加した。ビオチン標識抗−イヌ抗体結合物を添加した。上記ビオチン標識抗−イヌ抗体のインキュベーション後、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアヴィヂンを添加した。発色性基質ＴＭＢを添加し、及び上記プレートを３０分後に読んだ。血清アミロイドＡの濃度を標準曲線に対するサンプルの比較及び適切な希釈因子の乗法により決定した。

結果
別段の定めなき限り、結果は群Ｉ及びＩＩからの混合されたデータである。
気管綿棒培養物及び凝集タイター
陽性気管綿棒培養物及び／又は上昇する凝集タイターは研究の過程中１１頭のイヌにおいて示された。これらのイヌ及び陽性イヌと共に飼われたイヌは研究から除去され、２０頭のイヌの喪失をもたらした。それぞれの群から除去されたイヌの数は：Ｔ０１−４頭、Ｔ０２−２頭、Ｔ０３−３頭、Ｔ０４−１頭、Ｔ０５−５頭、Ｔ０６−５頭であった。

注入部位観察
注入部位反応は表２２〜２５中に要約される。注入部位情報は技術的な見落としのために群Ｉについて２１日目にイヌ８１５９５について回収されなかった。上記プロトコルは、注入部位反応データが２２日目の群ＩＩにおけるイヌについて回収されなかったように修正され、それゆえ、２２日目からのデータの要約は群Ｉにおける処置群当たり８頭のイヌからの情報のみを含む。注入部位反応はＩＭ処置を受けたどのイヌについても観察されなかった。注入部位計測はＳＣ予防接種処置群（Ｔ０３及びＴ０５）の両方について極小であった。

注入部位計測における有意差は表２６中に要約される。Ｔ０１（塩水ＳＣ）対Ｔ０３（６０μｇＳＣ）間の注入部位計測における有意差は第一の予防接種後７日間見られた。Ｔ０１（塩水ＳＣ）及びＴ０５（１５μｇＳＣ）間の有意差は第一の予防接種後はじめの４日間のみ見られた。３〜７日目にＴ０３（６０μｇＳＣ）及びＴ０５（１５μｇＳＣ）間で有意差が見られた。１４日目には（２週再評価観察）、いずれの群の間にも差は見られなかった。

Ｔ０１（塩水ＳＣ）対Ｔ０３（６０μｇＳＣ）及びＴ０５（１５μｇＳＣ）の間の注入部位計測における有意差（Ｐ＝０．０１３８）は第二の予防接種後７日間見られた。２３〜２７日目にＴ０３（６０μｇＳＣ）及びＴ０５（１５μｇＳＣ）間に有意差が見られた。３４日目には（２週再評価観察）、いずれの群の間にも差は見られなかった。

直腸温度
直腸温度計測は表２７及び２８中に要約される。上記プロトコルは、直腸温度データが２２日目の群ＩＩイヌについて回収されなかったように修正され、それゆえ、２２日目からのデータの要約は群Ｉにおける処置群当たりのイヌからの情報のみを含む。

第一の予防接種後１日目のＴ０２（塩水ＩＭ）及びＴ０４（６０μｇＩＭ）間の直腸温度において有意差が見られた。第二の予防接種後どの日のどの群間でも直腸温度において有意差は見られなかった。

ｐ６８ＥＬＩＳＡタイター
チャレンジ前ｐ６８ＥＬＩＳＡデータは表２９中に要約される。１９日目のＴ０６における群Ｉイヌの応答のために、群に帰すべき影響がｐ６８ＥＬＩＳＡタイターのデータ分析において観察された。上記影響は小さく、及び他の分析された時点に影響しなかった。それゆえ、群Ｉ及びＩＩからのデータは報告目的のために混合される。

予防接種イヌにおけるｐ６８に対するかなりのタイター応答のために、さまざまな滴定最小値が研究における異なる時点で使用された。−１及び１９日目についての滴定は５０で開始された。５０〜１９５日目について、滴定は２００で開始された。２０１及び２１１日目に回収されたサンプルについての滴定は１０００で開始された。「未満」として報告された値は分析前に２で割られた。研究の過程中コントロール群（Ｔ０１及びＴ０２）についてのｐ６８ＥＬＩＳＡ値において観察された増大する上昇はこれらの最小滴定値のためである。凝集タイターは、以前に示されたものを除いては、＜４のままであった。

全てのプラシーボ予防接種イヌは５０日目に＜２００のｐ６８タイターを有した。全てのｐ６８予防接種動物はプラシーボ予防接種動物と比較されたとき、第二の予防接種後（０日目対５０日目）のタイターにおいて少なくとも４倍増大を示した。

予防接種後のＥＬＩＳＡタイターの最小二乗法平均についての有意差は表３０中に列挙される。予防接種前（−１日目）にＳＣコントロール群及びＳＣ予防接種群又はＩＭコントロール群及びＩＭ予防接種群の間にｐ６８ＥＬＩＳＡタイターにおける有意差は観察されなかった。

研究の過程中に計測されたｐ６８ＥＬＩＳＡタイターは表３１中に要約され、及び図３中に例示される。
研究の過程中、群Ｉ及びＩＩ間で活動を協調させるよう毎回の試みがなされた。中枢のデータ回収時点（すなわち、予防接種及びチャレンジを取り巻く事件）について、これは達成された。研究の合間中の３の場合において、血液及び気管綿棒回収は群間で１又は２日変化した。この合間期間についてｐ６８ＥＬＩＳＡデータを要約し及び報告するために、これらの日からのデータを混合した。それゆえ、７９日目は７９日目（群Ｉ）及び８１日目（群ＩＩ）からの混合したデータを含み、１１１日目は１１０日目（群ＩＩ）及び１１１日目（群Ｉ）に対応し、及び１６９日目は１６９日目（群ＩＩ）及び１７０日目（群Ｉ）に対応する。プロトコルごとに、データ分析は５０日目を過ぎてｐ６８ＥＬＩＳＡデータについて行われなかった。

咳観察
両方の群についてのエーロゾルチャレンジは第二の予防接種１８１日後に起こった。ＵＳＤＡ推奨にしたがうために、咳基準はチャレンジ後３日目〜８日目の約１２時間離れた約４５分間の観察に修正された。咳観察は表３２及び３３中に要約される。

塩水コントロールに比較されたとき咳におけるパーセント減少は１５μｇ／用量群について５１．５５％及び６０μｇ／用量群について１１．０９％であった。統計的な有意差は表３４中に要約される。

血清アミロイドＡ
ＳＡＡ値はチャレンジ後０、１、３、５、７及び９日目に決定された。血清アミロイドＡ値は表３５中に示され及び図４中に表示される。

ＳＡＡタイターにおける有意差は表３６中に要約される。

議論
上記研究はイヌにおける組換えｐ６８Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａワクチンの安全性及び６ヶ月有効性を示すために設計された。１５μｇ／用量及び６０μｇ／用量ワクチンの安全性が示された。１５μｇ／用量の有効性及び免疫の６ヶ月の期間は上記研究において十分に支持された。

安全性は注入部位及び直腸温度観察を用いて調べられた。注入部位反応計測の分析はＩＭ予防接種群における無反応及び１５μｇ／用量及び６０μｇ／用量ＳＣ予防接種群における極小反応を示した。観察された反応は１５μｇ／用量ＳＣ予防接種イヌにおいてより小さい傾向があった。見られた上記反応は一過性であり、一般的に１４日以内に消散した。これらの反応の大きさは注入部位が剃られていないイヌにおいてはほとんど気付かれなかったであろう。予防接種後の直腸温度は普通であり、及び全ての群における全てのイヌについて正常限界内であった。

免疫の有効性及び期間は咳の観察及びｐ６８ＥＬＩＳＡ終点タイターの計測を用いて予防接種から１８１日間調べられた。塩水コントロール群における咳の割合（７８．２６％）は、研究動物に投与されたチャレンジは許容可能であったことを示した。１５μｇ／用量群についての咳をした時点の割合（３７．９２％）はコントロール群と比較されたとき咳における５１．５５％減少を示し、ＵＳＤＡにより要求される有効性要求を満たす。コントロール群に比較されたとき咳における極小減少を示すイヌを有する６０μｇ／用量群においては保護は示されなかった（６９．５８％）。

統計的に比較されないが、ＳＣ予防接種群はＩＭ予防接種群に比較されたときより高い抗体応答を有する傾向があったことが表２９及び３１から見られうる。議論の目的のために、異なる用量群に関するさらなるコメントはＩＭ及びＳＣ投与経路の結果を結合する。
投与経路に関わらず、優れたｐ６８抗体応答が５０日目までに両方の予防接種群において示され、及び研究の過程をとおして予防接種群により維持された。優れた既往応答がチャレンジ後の予防接種群において観察された。

研究の過程中の１５μｇ／用量及び６０μｇ／用量のｐ６８ＥＬＩＳＡタイターの比較は、６０μｇ／用量群がわずかに高いタイター応答を示したことを示した（図３）。この応答は、優れているが、エーロゾルチャレンジ後の保護とは相関しなかった。ｐ６８ＥＬＩＳＡタイター応答は陽性気管綿棒又は上昇する凝集タイターで研究から除去されたイヌにおいては変動した。陽性気管綿棒培養物及び／又は上昇する凝集タイターで研究から除去された６のコントロールのうちの３は＜２００のｐ６８ＥＬＩＳＡタイターを維持した。研究から除去されたイヌの気管綿棒又は凝集タイター状態に対するｐ６８ＥＬＩＳＡタイターの相関はないように見える。
チャレンジ後の予防接種及び非予防接種ｐ６８ＢｏｒｄｅｔｅｌｌａイヌにおけるＳＡＡ応答の調査は、特にチャレンジ後５及び７日目に１５μｇ／用量群においてＳＡＡ値における非常により小さな上昇を示した。

結論
この研究において、ｐ６８イヌＢｏｒｄｅｔｅｌｌａワクチンの１５μｇ／用量及び６０μｇ／用量の有効性が予防接種６ヶ月後イヌチャレンジモデルを用いて調べられた。両方のワクチンは正常な直腸温度及び極小の注入部位反応により示されるように安全であった。１５μｇ／用量及び６０μｇ／用量予防接種イヌはｐ６８ＥＬＩＳＡタイターにより計測されるように予防接種に対する優れた血清応答を示したが、上記応答は６０μｇ／用量予防接種イヌにおいて臨床保護と相関しなかった。６０μｇ／用量予防接種イヌは非予防接種コントロールに比較されたとき咳における有意差を示さなかった。１５μｇ／用量ワクチンの優れた有効性はコントロール群と比較されたとき咳における５０％超の減少により示された。６０μｇ／用量ワクチン中のＳＤＳの増大した値は保護における示された差をもたらしうることが仮定される。ＳＡＡ値の比較は予防接種群及びコントロール群間の差を示した。

実施例４
ＶＡＮＧＵＡＲＤ（商標）Ｐｌｕｓ５／ＣＶ−Ｌの安全性及び有効性
ＶＡＮＧＵＡＲＤ（商標）Ｐｌｕｓ５／ＣＶ−Ｌはアヂュヴァントを伴うＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶの減衰された株のフリーズドライ調製物、及びＬ．ｃａｎｉｃｏｌａ及びＬ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの不活性化全体培養物、及び不活性化ＣＣＶの液体調製物である。全てのウイルスは確立された細胞系上で増殖された。ＣＰＶ画分は、表３８中に示される値で母親の抗体妨害をくつがえすことができる免疫原性特性をそれに与えるイヌ細胞系上で少ない継代により減衰された。液体成分は、真空の代わりに不活性気体と共に包装された上記フリーズドライ成分を再水和化するために使用された。

研究室評価は、ＶＡＮＧＵＡＲＤ（商標）Ｐｌｕｓ５／ＣＶ−ＬはＣＤ、ＩＣＨ、ＣＡＶ−２及びＣＰＩ呼吸疾患、ＣＣＶ及びＣＰＶにより引き起こされる腸炎、及びＬ．ｃａｎｉｃｏｌａ及びＬ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅにより引き起こされるレプトスピラ症に対してイヌに免疫性を与えたこと、及び上記ワクチン画分中には免疫妨害は存在しなかったことを示した。広い分野の安全性試験は、それが通常の使用条件下では６週齢の若いイヌにおいて安全であり、及び本質的に反応を伴わないことを示した。

また、ＣＡＶ−２ワクチンはＣＡＶ−１により引き起こされるＩＣＨに対してクロス保護をすることも示された。研究は、ＣＡＶ−２はＩＣＨに対してのみでなく、ＣＡＶ−２呼吸疾患に対しても保護することを示した。イヌアデノウイルス２型チャレンジウイルスは行われた試験におけるＣＡＶ−２予防接種イヌから回復されなかった。

ＶＡＮＧＵＡＲＤ（商標）Ｐｌｕｓ５／ＣＶ−Ｌ中のＣＰＶ画分を包括的な安全性及び有効性試験にかけた。それは研究室試験において及び実地条件下の臨床試験において安全であり及び本質的に反応を伴わないことが示された。製品安全性は、それらの全てが正常なままであった、かかりやすいイヌへの多用量の上記ワクチン株の経口投与を含んだ直腸研究によりさらに示された。

研究は、増大したＣＰＶウイルスタイターを有する３用量の上記ワクチンは母親の抗体に関連する血清中和（ＳＮ）タイターを克服しうることを示した。１：４の低い血清中和タイターは慣用の改変された生存ワクチンを用いた活性免疫化を妨害することが他の者により示された。臨床試験を５０頭の６週齢の子イヌ［２５頭の予防接種群（ＳＮタイター範囲−２５６）及び２５頭の非予防接種コントロール群（ＳＮタイター範囲４−１０２４）］で行った（表３７）。予防接種の群は３用量を受け、及び予防接種は６週齢で開始して３週間離して投与された。１の予防接種後、１３／２５の子イヌはＣＰＶＳＮタイター（セロコンヴァージョン）における４倍以上の増大を示した（表３８）。これらの１３頭の子イヌのうちの１２頭は第一の予防接種の時点で母親のＳＮタイター≦１：１６を有し、及び残りの子イヌは１：６４のＳＮタイターを有した。１：１６〜１：２５６の開始ＳＮタイターを有する他の９頭の子イヌは第二の予防接種後にセロコンヴァートされた。それらの母親の抗体ＳＮタイターは第二の予防接種の時点で≦１：６４まで減少した。同様に、１：１２８の開始ＳＮタイターを有する、最後の３頭の予防接種イヌは、それらの母親の抗体ＣＰＶタイターが≦１：６４に落ちた後に、第三の予防接種後にセロコンヴァートされた。それゆえ、この研究において、３用量のワクチンが６週齢で開始されて与えられたとき、全ての２５頭の予防接種イヌは、最も高い母親抗体値を有するものでさえも、活性免疫化された（ＧＭ＝１：１１７６；ＳＮタイターの範囲１２８〜４０９６）。全ての５０頭のイヌを異種のＣＰＶチャレンジウイルスで第三の予防接種３週間後にチャレンジした。２５頭の非予防接種コントロールイヌのうちの１４頭は死亡し又は安楽死を正当化するのに十分重篤な疾患を示し、一方で、全ての２５頭の予防接種イヌは本質的に健康なままであった。ＶＡＮＧＵＡＲＤ（商標）Ｐｌｕｓ５／ＣＶ−Ｌにおける高いタイターの、少ない継代のワクチンウイルスはそれゆえ、高く免疫原性であり、及び母親抗体の存在下で活性免疫を刺激することができた。

ＶＡＮＧＵＡＲＤ（商標）Ｐｌｕｓ５／ＣＶ−ＬのＣＣＶ画分の有効性は広い範囲の予防接種チャレンジ研究において示された。１６頭の７〜８週齢の子イヌをＶＡＮＧＵＡＲＤ（商標）Ｐｌｕｓ５／ＣＶ−Ｌで（予防接種群）及び１７頭をＶａｎｇｕａｒｄ（商標）Ｐｌｕｓ５／Ｌで（コントロール群）予防接種した。全ての子イヌは３の１ｍＬ用量を３週間隔で受けた。第三の予防接種３週間後、子イヌをＣＣＶの悪性株（ＣＶ−６）でチャレンジした。臨床観察、温度、体重、及び血液パラメーターを感染後２１日間モニターした。ＣＣＶ予防接種群はコントロール群と比較されたとき下痢の発生及び悪性ＣＣＶの抜け殻の量における減少を示した。チャレンジ後２１日で、小腸切片の悪性ＣＣＶについての蛍光抗体染色はＣＣＶ予防接種群及びコントロール群の間で検出可能なＣＣＶ抗原における有意な減少（Ｐ）を示した（表３９）。

結論
この研究において、ＣＤウイルス、ＣＡＶ−２、ＣＰＩウイルス、ＣＰＶ及びＬ．ｃａｎｉｃｏｌａ及びＬ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの不活性化全体培養物及びＣＣＶを含む補助された組み合わせワクチンは子イヌにおいて使用されたときワクチンとして安全で及び有効であることが示された。上記組み合わせワクチンはまた母親抗体に関連する血清中和（ＳＮ）タイターを克服することも示された。

実施例５
イヌＢｏｒｄｅｔｅｌｌａネイティブｐ６８免疫原性研究
動物
上記研究は２の同腹のＳＰＦビーグル及び２の同腹のランダムな源のイヌを含んだ。イヌを予防接種又は非予防接種群にランダムに割り当てた。上記研究は全部で１０頭の予防接種及び１１頭の非予防接種イヌを含んだ。

実験ワクチンの調製
Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ（株１１０Ｈ）をプレート表面を５〜１０ｍｌの熱抽出緩衝液で洗浄することにより４８時間Ｂｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎｏｕ血液アガースプレッドプレートから回収した。あるいは、両方の培養（ＣｈａｒｌｏｔｔｅＰａｒｋｅｒＤｅｆｉｎｅｄＭｅｄｉｕｍ）において生育した細胞を遠心分離及び上清画分を捨てることにより回収した。回収された細胞を２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８中に懸濁し、及び６０℃で１時間インキュベートした。細胞くずを４℃で３０分間の２０，０００×ｇでの遠心分離により熱抽出物から分離した。ナトリウムアジド（０．０１％）を上記熱抽出上清画分に添加し、それをその後微孔ろ過によりさらに不純物除去した。

モノクローナル抗体アフィニティ樹脂を標準の手順を用いたＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂへのモノクローナル抗体（Ｂｏｒｄ２−７といわれる）の結合により調製した。約３０．３５ｍｇのモノクローナル抗体を１グラムのアフィニティ樹脂に結合した。不純物除去した熱抽出上清画分（上記）及びＢｏｒｄ２−７アフィニティ樹脂を１リットル抽出物対２０ｍｌ樹脂のおよその割合で混合した。

上記樹脂へのネイティブｐ６８の結合を、上記混合物を環境温度でおだやかに攪拌しながら一晩インキュベートすることにより促進し、続いて樹脂を沈殿させ及び上清画分を吸引した。上記樹脂をその後２．６ｃｍ直径カラムに詰め、及び上記カラムをＰＢＳ、ｐＨ７．５及び１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０で連続して５ｍｌ／分の流速で洗浄した。２８０ｎｍでの吸収が基礎値に達したとき、結合物質を１００ｍＭトリエチルアミンを用いて溶離し、及び２８０ｎｍ吸収の単一の大きなピーク下の画分を回収し、及びＥＬＩＳＡによりｐ６８の存在について試験した。ｐ６８を含む画分を集め、及びトリエチルアミンを除去するためにＰＢＳに対して透析した。
調合された実験ワクチンシリアルは約１００μｇの精製ｐ６８及び１％水酸化アルミニウムゲルを含むよう調合された。フォルマリン（０．０１％）を１ｍＬの最終ワクチン用量体積中に保存剤として使用した。

チャレンジ接種物
チャレンジ物質を本質的に上記の実施例中に示されるように調製した。

研究手順
２１頭の血清反応陰性及び培養陰性子イヌを２の処置群の１にランダムに割り当てた。１１頭のイヌを非予防接種、コントロール群に、及び１０頭のイヌを予防接種群に割り当てた。０日目を第一の予防接種の日とした。１ｍＬのワクチンを０日目に皮下投与し、及び２１日後に繰り返した。血液を第一の及び第二の予防接種前に血清学ｐ６８ＥＬＩＳＡのために回収した。

第二の予防接種１４日後である３５日目に、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａのエーロゾルチャレンジを上記に示されるように全てのイヌに投与した。動物を以前に実施例中に示されるようにチャレンジ後１４日間咳についてモニターした。

結果
臨床観察及びｐ６８への血清応答の要約は表４０中に示される。

議論
この研究において、１０頭のコントロールイヌのうちの１０頭は少なくとも２の連続した日に咳をした。イヌが２の連続した日に咳をする場合は、そのイヌを臨床的に病気にかかっていると考える。この基準により、１００％の非予防接種コントロールイヌは病気にかかった。予防接種群においては、１頭のイヌはチャレンジ後４日目に咳をし、及び１頭のイヌはチャレンジ後４及び６日目に咳をした。２頭のイヌは１４日目に咳をした。２の連続した日に咳をした予防接種イヌはなかった。それゆえ、ネイティブｐ６８予防接種群中の１００％のイヌはチャレンジ後正常のままであると判断された。

結論
この試験はネイティブｐ６８ワクチンのＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ疾患に対して保護する能力を示す。

図１。非予防接種及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｐ６８（１５μｇ／用量）予防接種イヌ−Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａでのエーロゾルチャレンジにおけるｐ６８ＥＬＩＳＡ終点タイターの幾何平均の要約。図２。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａでのエーロゾルチャレンジ後のイヌにおける血清アミロイドＡタイターの要約。図３。予防接種及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａでのエーロゾルチャレンジ後の非予防接種及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｐ６８予防接種イヌにおけるｐ６８ＥＬＩＳＡ終点タイターの幾何平均の要約。図４。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａでのエーロゾルチャレンジ後のイヌにおける血清アミロイドＡタイターの要約。図５。ｐ６８全細胞溶解物に対するｐ６８モノクローナル抗体Ｂｏｒｄ２−７の反応性を示すウェスタンブロット。

Claims

Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａに対してイヌを保護するために有効な量のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原及びアヂュヴァントを含むワクチン製剤。
前記Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み及び組換えで作出される、請求項１に記載のワクチン製剤。
前記アヂュヴァントはＱｕｉｌＡ及びコレステロールを含む、請求項１に記載のワクチン製剤。
イヌに請求項１〜３のいずれか１に記載のワクチン製剤を投与することを含むＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａに対してイヌを保護する方法。
イヌヂステンパー（ＣＤ）ウイルスの弱化された株、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）の弱化された株、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルスの弱化された株及びイヌパルヴォウイルス（ＣＰＶ）の弱化された株の調製物；イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）の株の不活性化した全体の又は部分の細胞調製物、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８タンパク質、及びアヂュヴァントを含む、イヌ病原体に対してイヌを免疫化するための併合ワクチン。
前記Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み及び組換えで作出される、請求項５に記載の併合ワクチン。
前記アヂュヴァントはＱｕｉｌＡ及びコレステロールを含む、請求項５に記載の併合ワクチン。
イヌヂステンパー（ＣＤ）ウイルスの弱化された株、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）の弱化された株、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルスの弱化された株及びイヌパルヴォウイルス（ＣＰＶ）の弱化された株の調製物；イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）の株の不活性化した全体の又は部分の細胞調製物、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８タンパク質、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｃｔｅｒｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｐｏｍｏｎａから成る群から選ばれる少なくとも１のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ種のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞調製物、及びアヂュヴァントを含む、イヌ病原体に対してイヌを免疫化するための併合ワクチン。
前記Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細胞調製物はＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｃｔｅｒｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｐｏｍｏｎａの細胞調製物を含む、請求項８に記載の併合ワクチン。
前記Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み及び組換えで作出される、請求項８に記載の併合ワクチン。
前記アヂュヴァントはＱｕｉｌＡ及びコレステロールを含む、請求項８に記載の併合ワクチン。
イヌヂステンパー（ＣＤ）ウイルスの弱化された株、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）の弱化された株、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルスの弱化された株及びイヌパルヴォウイルス（ＣＰＶ）の弱化された株の調製物；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８タンパク質、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｃｔｅｒｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｐｏｍｏｎａから成る群から選ばれる少なくとも１のＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ種の細胞調製物を含むＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ細菌ワクチン；及びアヂュヴァントを含む、イヌ病原体に対してイヌを免疫化するための併合ワクチン。
前記Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ細菌ワクチンはＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｃｔｅｒｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａｐｏｍｏｎａの細胞調製物を含む、請求項１２に記載の併合ワクチン。
前記Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａｐ６８抗原は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み及び組換えで作出される、請求項１２に記載の併合ワクチン。
前記アヂュヴァントはＱｕｉｌＡ及びコレステロールを含む、請求項１２に記載の併合ワクチン。