ES2303046T3 - Vacunas caninas contra bordetella bronchiseptica. - Google Patents

Vacunas caninas contra bordetella bronchiseptica. Download PDF

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Abstract

Uso de un antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica y de un adyuvante para la producción de una composición de vacuna para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o de un trastorno en perros, que se ha causado por infección con Bordetella bronchiseptica.

Description

Vacunas caninas contra Bordetella bronchiseptica.
Campo del invento
Este invento se refiere a vacunas que contienen un antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica y al uso de las mismas para proteger a perros frente a la traqueobronquitis infecciosa ("tos de perrera") causada por Bordetella bronchiseptica. Este invento se refiere también a vacunas en combinación que contienen un antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica y uno o más antígenos de otro patógeno canino tal como los virus del moquillo canino (CD, de Canine Distemper), los adenovirus caninos del tipo 2 (CAV-2, de Canine AdenoVirus type 2), los virus de la parainfluenza canina (CPI, de Canine ParaInfluenza), los coronavirus caninos (CCV, de Canine CoronaVirus), los parvovirus caninos (CPV, de Canine ParvoVirus), Leptospira Bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae o Leptospira pomona.
Antecedentes del invento
El actual producto de vacuna contra Bordetella bronchiseptica canina, que está comercialmente disponible, se compone de una bacterina de células enteras de Bordetella bronchiseptica inactivadas, a la que no se han añadido adyuvantes. Dicha bacterina de células enteras puede conducir a reacciones posteriores a la vacunación relacionadas con la proteína celular. La proteína p68 procedente de B. bronchiseptica es similar desde el punto de vista antigénico a la Proteína Membranal Exterior (OMP, de Outer Membrane Protein) de B. pertussis y a la OMP de B. parapertussis (Shahin y colaboradores, "Characterization of the Protective Capacity and Immunogenicity of the 69-kd Outer Membrane Protein of Bordetella pertussis" [Caracterización de la capacidad protectora y la inmunogenicidad de la Proteína Membranal Exterior de 69 kd procedente de Bordetella pertussis], J. Exp. Med., 171: 63-73, 1990). Se ha demostrado un cometido protector de esta OMP para ratones (Shahin y colaboradores, supra; Novotny y colaboradores, "Biologic and Protective Properties of the 69-kD Outer Membrane Protein of Bordetella pertussis: A novel Formulation for a Acellular Pertusis Vaccine" [Propiedades biológicas y protectoras de la Proteína Membranal Exterior de 69 kd procedente de Bordetella pertussis. Una nueva formulación para una vacuna Pertussis acelular], J. Infec. Dis. 164:114-22, 1991), para seres humanos (He y colaboradores, "Protective Role of Immunoglobulin G Antibodies to Filamentous Hemagglutinin and Pertactin of Bordetella pertussis in Bordetella parapertussis infection" [Cometido protector de los anticuerpos de inmunoglobulina G para hemaglutinina filamentosa y pertactina de Bordetella pertussis en una infección causada por Bordetella parapertussis], Eur. J. Clin Microbiol Infect Dis. 10:793-798, 1996) y para cerdos (Kobisch y colaboradores, "Identification of a 68-Kilodalton Outer Membrane Protein as the Major Protective Antigen of Bordetella bronchiseptica by Using Specific-Pathogen-Free Piglets" [Identificación de una Proteína Membranal Exterior de 68 Kilodalton como el antígeno protector principal de Bordetella bronchiseptica por uso de cerditos exentos de patógenos específicos], Infect. Immun. 58(2):352-357, 1990.
Antes del presente invento, no ha habido ninguna demostración de que el antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica pueda ser una vacuna segura y eficaz en perros. Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar una vacuna contra Bordetella bronchiseptica con un contenido de un antígeno de p68 que sea apropiado para un uso canino. Sería incluso más ventajoso que dicha vacuna con p68 procedente de Bordetella bronchiseptica fuese segura para su administración a cachorros y proporcionase una protección a largo plazo.
El CD es una enfermedad vírica universal, con alta tasa de mortalidad, que presenta manifestaciones variables. Aproximadamente un 50% de los perros no inmunes y no vacunados, que están infectados con el virus del CD, desarrollan signos clínicos, y aproximadamente un 90% de estos perros mueren.
La hepatitis canina infecciosa o ICH (de Infectious Canine Hepatitis), causada por los adenovirus caninos del tipo 1 (CAV-1) es una enfermedad vírica universal, algunas veces fatal, de perros, que está caracterizada por lesiones hepáticas y endoteliales generalizadas. Los CAV-2 causan una enfermedad respiratoria, que, en casos graves, puede incluir neumonía y bronconeumonía.
La CPI es una enfermedad respiratoria superior vírica corriente. Una CPI sin complicaciones puede ser suave o subclínica, volviéndose los signos más graves si existe una infección concurrente con otros patógenos respiratorios.
Una infección causada por los CPV da como resultado una enfermedad entérica caracterizada por un comienzo repentino de vómitos y diarreas, con frecuencia de carácter hemorrágico. Una leucopenia acompaña corrientemente a los signos clínicos. Pueden ser afectados perros susceptibles de cualquier edad, pero la mortalidad es máxima en cachorros. En cachorros con una edad de 4-12 semanas los CPV pueden causar ocasionalmente una miocarditis, que puede dar como resultado un fallo cardíaco agudo después de una enfermedad breve y no evidente. A continuación de una infección, muchos perros son refractarios a la enfermedad durante un año o más. Similarmente, las perras seropositivas pueden transferir a sus cachorros anticuerpos de CPV, que pueden interferir con una inmunización activa de los cachorros a lo largo de 16 semanas de edad.
Los CCV causan en todo el mundo también una enfermedad entérica en perros susceptibles de todas las edades. Al ser altamente contagiosos, los virus se transmiten principalmente por medio de un contacto directo con heces infecciosas, y pueden causar una enteritis clínica en el transcurso de 1-4 días después de la exposición. La gravedad de una enfermedad puede ser exacerbada por una infección concurrente con otros agentes. Los signos primarios de una infección causada por los CCV incluyen anorexia, vómitos y diarreas. La frecuencia de los vómitos disminuye usualmente en el transcurso de un día o 2, después del comienzo de una diarrea, pero esta diarrea puede persistir a lo largo del curso de una infección, y las deposiciones pueden contener ocasionalmente vetas de sangre. Con una infección causada por los CCV, la mayor parte de los perros permanecen afebriles (sin fiebre) y una leucopenia no se observa en casos sin complicaciones.
La leptospirosis se presenta en perros de todas las edades, con una amplia gama de signos clínicos y nefritis crónicas generalmente a continuación de una infección aguda. Las infecciones con L. canicola y L. icterohaemorrhagiae no pueden ser diferenciadas clínicamente.
Antes del presente invento, no ha habido ninguna vacuna en combinación eficaz que proteja a los perros frente a Bordetella bronchiseptica y uno o más de otros patógenos caninos tales como los virus de CD, CAV-2, virus de CPI, CPV, CCV, y una especie de Leptospira tal como L. Bratislava, L. canicola, L. grippotyphosa, L. icterohaemorrhagiae y L. pomona. Un problema que se plantea al desarrollar vacunas en combinación implica una interferencia entre las eficacias, a saber un fracaso de uno o más antígenos en una composición en combinación para mantener o conseguir una eficacia a causa de la presencia de los otros antígenos en la composición. Se cree que esto es un resultado de una interferencia con un antígeno en la composición administrada a un hospedante, p.ej. a un perro, en la respuesta inmunológica, antigénica, de anticuerpos o protectora, que dicho antígeno había inducido en el hospedante a causa de los otros antígenos presentes en la composición. Sin embargo, para otros hospedantes, tales como gatos, se conocen vacunas en combinación. Se cree que la interferencia entre eficacias en perros es debida a una cierta peculiaridad del sistema biológico canino, o es debida a la reacción de los antígenos con el sistema biológico canino.
Existe por lo tanto, una necesidad de desarrollar una vacuna en combinación que sea apropiada para su administración a perros contra Bordetella bronchiseptica y uno o más patógenos caninos de otros tipos, que no exhiba ninguna interferencia entre eficacias en animales caninos. Sería incluso más ventajoso que dicha vacuna en combinación fuese segura para su administración a cachorros y proporcionase una protección a largo plazo.
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Sumario del invento
El presente invento proporciona vacunas y métodos destinados a proteger a perros frente a enfermedades causadas por patógenos caninos.
En una realización, el presente invento proporciona el uso de p68 para la producción de vacunas que son apropiadas para su administración a perros y son capaces de proteger a los perros frente a una enfermedad causada por Bordetella bronchiseptica. Dichas vacunas incluyen un antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica y un vehículo aceptable en veterinaria, tal como un adyuvante.
En otra realización, el presente invento proporciona vacunas en combinación, que son apropiadas para su administración a perros. Las vacunas en combinación del presente invento incluyen un antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica en combinación con por lo menos otro antígeno procedente de otros patógenos caninos, que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria protectora en perros frente a una enfermedad causada por dicho(s) otro(s)
patógeno(s). Dichos otros patógenos se pueden seleccionar entre los virus del moquillo canino (CD), los adenovirus caninos del tipo 2 (CAV-2), los virus de la parainfluenza canina (CPI), los coronavirus caninos (CCV), los parvovirus caninos (CPV), los herpesvirus caninos, los virus de la rabia, Leptospira Bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira hardjobovis, Porphyromonas ssp, Bacteriodes spp., Leishmania spp., Borrelia spp, Ehrlichia spp., Mycoplasma spp. y Microsporum canis.
Una preferida vacuna en combinación del presente invento incluye cepas atenuadas de los virus del moquillo canino (CD), adenovirus caninos del tipo 2 (CAV-2), virus de la parainfluenza canina (CPI), coronavirus caninos (CCV) y parvovirus caninos (CPV); una preparación inactivada de una cepa de coronavirus canino (CCV); y un antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica.
Otra preferida vacuna en combinación del presente invento incluye cepas atenuadas de los virus del moquillo canino (CD), adenovirus caninos del tipo 2 (CAV-2), virus de la parainfluenza canina (CPI), coronavirus caninos (CCV) y parvovirus caninos (CPV); una preparación inactivada de una cepa de coronavirus canino (CCV); y una proteína p68 procedente de Bordetella bronchiseptica, y una preparación de células inactivadas de cinco serovariedades de Leptospira (Leptospira Bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona).
Todavía otra preferida vacuna en combinación del presente invento incluye cepas atenuadas de los virus de CD, CAV-2, virus de CPI, una cepa de CPV; y un antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica.
Otra preferida vacuna en combinación del presente invento incluye cepas atenuadas de los virus de CD, CAV-2, virus de CPI, una cepa de CPV; y un antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica; y una preparación de células inactivadas de Leptospira canicola y Leptospira icterohaemorrhagiae.
Todavía otra preferida vacuna en combinación del presente invento incluye cepas atenuadas de los virus de CD, CAV-2, virus de CPI, una cepa de CPV; y un antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica, y una preparación de células inactivadas de cinco serovariedades de Leptospira (Leptospira Bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona).
Otra preferida vacuna en combinación incluye un antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica y un virus de CPI atenuado.
Todavía otra preferida vacuna en combinación incluye un antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica, un virus de CPI atenuado y una preparación de células inactivadas de Leptospira canicola y Leptospira icterohae- morrhagiae.
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Breve descripcion de los dibujos
Figura 1. Sumario de la media geométrica de los títulos de punto final de un ELISA con p68 en una estimulación mediante un aerosol con Bordetella bronchiseptica de perros sin vacunar y de perros vacunados con Bordetella de p68 (15 \mug/dosis).
Figura 2. Sumario de los títulos de Amiloide A de Suero en perros después de la estimulación con Bordetella bronchiseptica mediante un aerosol.
Figura 3. Sumario de la media geométrica de los títulos de punto final de un ELISA con p68 en perros sin vacunar y en perros vacunados contra Bordetella con p68 después de la vacunación y de una estimulación con Bordetella bronchiseptica mediante un aerosol.
Figura 4. Sumario de los títulos de Amiloide A de Suero en perros después de la estimulación con Bordetella bronchiseptica mediante un aerosol.
Figura 5. Una transferencia de borrón Western que muestra la reactividad del anticuerpo monoclonal p68 procedente de Bord 2-7 a un material lisado de células enteras de p68.
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Descripción detallada del invento
En una realización, el presente invento proporciona la producción de vacunas monovalentes apropiadas para su administración a perros, que son capaces de proteger a los perros frente a una enfermedad causada por Bordetella bronchiseptica. Las vacunas monovalentes incluyen un antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica producido por vía recombinante y un vehículo aceptable en veterinaria, tal como un adyuvante.
En otra realización, el presente invento proporciona vacunas en combinación apropiadas para su administración a perros. Las vacunas en combinación del presente invento incluyen un antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica, producido por vía recombinante, en combinación con por lo menos otro antígeno capaz de inducir una respuesta inmunitaria protectora en perros frente a una enfermedad causada por dicho otro antígeno.
Una preferida vacuna en combinación del presente invento incluye cepas atenuadas de los virus del moquillo canino (CD), adenovirus caninos del tipo 2 (CAV-2), virus de la parainfluenza canina (CPI) y parvorvirus caninos (CPV); una preparación inactivada de una cepa de coronavirus caninos (CCV); y una proteína p68 procedente de Bordetella bronchiseptica.
Otra preferida vacuna en combinación del presente invento incluye cepas atenuadas de los virus del moquillo canino (CD), adenovirus caninos del tipo 2 (CAV-2), virus de la parainfluenza canina (CPI) y parvorvirus caninos (CPV); una preparación inactivada de una cepa de coronavirus caninos (CCV); una proteína p68 procedente de Bordetella bronchiseptica, y una preparación de cinco serovariedades de Leptospira (Leptospira Bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona).
Todavía otra preferida vacuna en combinación del presente invento incluye cepas atenuadas de los virus de CD, CAV-2, virus de CPI, una cepa de CPV; y una proteína p68 procedente de Bordetella bronchiseptica.
Otra preferida vacuna en combinación del presente invento incluye cepas atenuadas de los virus de CD, CAV-2, virus de CPI, una cepa de CPV; una proteína p68 procedente de Bordetella bronchiseptica; y una preparación de Leptospira canicola y Leptospira icterohaemorrhagiae
Todavía otra preferida vacuna en combinación del presente invento incluye cepas atenuadas de los virus de CD, CAV-2, virus de CPI, una cepa de CPV; y una preparación de cinco serovariedades de Leptospira (Leptospira Bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona).
Definiciones y Abreviaturas
El término "proteger a un perro frente a una enfermedad causada por un patógeno canino", tal como se usa en el presente contexto, significa reducir o eliminar el riesgo de una infección causada por el patógeno, mejorar o aliviar los síntomas de una infección, o acelerar la recuperación desde una infección. La protección se consigue si hay una reducción en la carga por virus o bacterias, una reducción en el derramamiento de virus o bacterias, una disminución en la incidencia o la duración de infecciones, niveles reducidos de proteínas en suero en fase aguda, temperaturas rectales reducidas y/o un aumento en la asimilación de alimentos y/o en el crecimiento, por ejemplo.
El término "antígeno de p68" se refiere a una proteína que tiene un peso molecular de 68 kDa tal como se determina en una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, es reconocida por el anticuerpo monoclonal Bord 2-7 (ATCCnº )
específico para p68, y tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a SEQ ID NO 1.
Por "sustancialmente idéntica" se entiende un grado de identidad entre secuencias de por lo menos aproximadamente 90%, de modo preferible de por lo menos aproximadamente 95% o, de modo más preferible, de por lo menos aproximadamente 98%.
El término "vacuna monovalente" como se usa en el presente contexto, se refiere a una vacuna que tiene un componente antigénico principal. Por ejemplo, una vacuna monovalente de p68 incluye un antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica como el componente antígeno principal de la vacuna, y es capaz de proteger al animal al que se administra la vacuna frente a enfermedades causadas por Bordetella bronchiseptica.
Por el término "vacuna en combinación" se entiende una combinación bivalente o multivalente de antígenos que son capaces de inducir una respuesta inmunitaria protectora en perros. Los efectos protectores de una vacuna en combinación frente a un patógeno o varios patógenos se consiguen normalmente induciendo en el animal sujeto una respuesta inmunitaria, ya sea una respuesta mediada por células o una respuesta inmunitaria humoral o bien una combinación de ambas.
Por "inmunogénica" se entiende la capacidad de una composición para provocar una respuesta inmunitaria en perros frente a un patógeno particular. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria celular mediada principalmente por células T citóxicas y células T productoras de citocinas, o una respuesta inmunitaria humoral mediada principalmente por células T cooperantes, que a su vez activan a las células B, conduciendo a una producción de anticuerpos.
El término "cantidad efectiva terapéuticamente" o "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de una vacuna monovalente o en combinación, que es suficiente para provocar una respuesta inmunitaria protectora en el perro al que ésta se administra. La respuesta inmunitaria puede comprender, sin ninguna limitación, la inducción de una inmunidad celular y/o humoral. La cantidad de una vacuna que es efectiva terapéuticamente puede variar dependiendo del antígeno particular que se use en la vacuna, de la edad y de la condición del perro y/o del grado de infección, y puede ser determinada por un médico veterinario.
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Vacunas de p68
El presente invento ha demostrado por primera vez que una composición de vacuna que contiene un antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica protege de una manera eficaz a perros frente a una enfermedad causada por Bordetella bronchiseptica. La composición de vacuna del presente invento no causa significativas reacciones posteriores a la vacunación, es segura para su administración a cachorros, e induce en perros una inmunidad protectora, que persiste durante un prolongado período de tiempo.
Correspondientemente, una realización del presente invento se dirige a una composición de vacuna que contiene un antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica (o "una vacuna de p68"), que se adecua para su administración a perros y es capaz de proteger a los perros frente a una enfermedad causada por Bordetella bronchiseptica, p.ej. la traqueobronquitis infecciosa ("tos de perrera").
Para la finalidad del presente invento, el término "antígeno de p68" se refiere a una proteína que tiene un peso molecular de 68 kDa tal como se determina mediante una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, es reconocida por el anticuerpo monoclonal Bord2-7 (ATCCnº ) específico para p68, y tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a SEQ ID NO: 1. Por "sustancialmente idéntica" se entiende un grado de identidad entre secuencias de por lo menos aproximadamente 90%, preferiblemente de por lo menos aproximadamente 95%, o más preferiblemente de por lo menos aproximadamente 98%. Un ejemplo de un antígeno de p68, que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a SEQ ID NO: 1, es el antígeno de p68 descrito en el documento de solicitud de patente internacional WO 92/17587, que se expone en SEQ ID NO: 3. El anticuerpo monoclonal específico para p68 reconoce a proteínas p68 nativas, a proteínas p68 recombinantes y a proteínas p68 situadas en la superficie de bacterias, por ejemplo.
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De acuerdo con el presente invento, los antígenos p68 apropiados para su uso en el presente invento incluyen tanto proteínas p68 nativas (es decir proteínas p68 que se presentan en la naturaleza, que han sido purificadas a partir de Bordetella bronchiseptica) como proteínas p68 que se han producido por vía recombinante.
La purificación de una p68 nativa procedente de Bordetella bronchiseptica se describe, p.ej. en la cita de Montaraz y colaboradores, Infection and Immunity 47: 744-751 (1985), y se ilustra también en los ejemplos que se proporcionan a continuación en esta memoria. La producción de p68 por vía recombinante se puede conseguir usando cualquiera de las técnicas de clonación molecular y expresión recombinante que son conocidas por los expertos en la especialidad. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica p68 se puede introducir en una apropiada célula hospedante, tal como una bacteria, una célula de levadura (p.ej. una célula de Pichia), una célula de insecto o una célula de mamífero (p.ej. célula de CHO, de Chinese Hamster Ovary = ovario de hámster chino). La molécula de ácido nucleico que codifica p68 se puede disponer en una vinculación operativa con un promotor capaz de efectuar la expresión del antígeno de p68 en la célula hospedante. La p68, que es expresada por la célula hospedante, se puede purificar con facilidad usando técnicas rutinarias de purificación de proteínas.
En una realización preferida del presente invento, la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 2 que codifica el antígeno de p68, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, es clonada en un vector de expresión y dispuesta en una vinculación operativa con un promotor sensible a la temperatura. El vector de expresión es introducido en Escherichia coli y el antígeno de p68 es expresado después de una inducción por calor. Las células son lisadas y los cuerpos de inclusión, en donde se acumula el antígeno de p68, son separados por centrifugación. La p68 recombinante existente en los cuerpos de inclusión se solubiliza usando SDS (de Sodium Dodecyl Sulfate = dodecil sulfato de sodio) u otros agentes solubilizantes que son conocidos en la especialidad, tales como urea, hidrocloruro de guanidina, colato de sodio, taurocolato y desoxicolato de sodio. De acuerdo con el presente invento, una proteína p68 purificada, nativa o recombinante, es combinada con un vehículo aceptable en veterinaria para formar una composición de vacuna de p68.
El término "un vehículo aceptable en veterinaria" incluye uno cualquiera o la totalidad de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, adyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardadores de la adsorción, y similares. Los diluyentes pueden incluir agua, una solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen una albúmina, entre otros.
Los adyuvantes apropiados para su uso de acuerdo con el presente invento incluyen, pero no están limitados a, varias clases de adyuvantes, tales como: sales minerales, p.ej. alumbre (sulfato de aluminio), hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y fosfato de calcio; agentes tensioactivos y micropartículas, p.ej. agentes tensioactivos del tipo de polímeros de bloques no iónicos (p.ej. colesterol), virosomas, saponinas (p.ej., Quil A, QS-21 y GPI-0100), proteosomas, complejos estimulantes de la inmunidad, cocleados, aminas cuaternarias (bromuro de dimetil dioctadecil amonio (DDA)), avridina, vitamina A, vitamina E, productos bacterianos tales como el sistema de adyuvante de RIBI (de Ribi Inc.), el esqueleto de paredes celulares de Mycobacterium phlei (Detox®), muramil dipéptidos (MDP) y tripéptidos (MTP), el monofosforil lípido A, Bacillus de Calmette-Guerin, enterotoxinas de E. coli inestables frente al calor, la toxina del cólera, dimicolato de trehalosa, oligodesoxinucleótidos de CpG; citocinas y hormonas, p.ej. interleucinas (IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18), el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, deshidroepiandrosterona, 1,25-dihidroxi vitamina D_{3}; polianiones, p.ej. dextrano; polímeros acrílicos (p.ej. poli-(metacrilato de metilo), Carbopol 934P); vehículos p.ej., el toxoide de tétanos, el toxoide de la difteria, la subunidad de la toxina B del cólera, la enterotoxina mutante, inestable frente al calor, de E. coli enterotoxigénico (rmLT), proteínas de choque térmico (termosensibles); emulsiones del tipo de aceite en agua, p.ej. AMPHIGEN® (de Hydronics, EE.UU) y emulsiones del tipo de agua en aceite, tales como p.ej. adyuvantes completos e incompletos de Freund.
Los adyuvantes preferidos para su uso en las vacunas del presente invento incluyen Quil A y colesterol.
El antígeno de p68 y el vehículo aceptable en veterinaria se pueden combinar de cualquier manera que sea conveniente y práctica para formar una composición de vacuna, p.ej. por adición a la mezcla, disolución, suspensión, emulsificación, encapsulación, absorción y similares, y se pueden confeccionar en formulaciones tales como tabletas, cápsulas, polvos, jarabes, suspensiones que son apropiadas para inyecciones, implantaciones, inhalaciones, ingestiones o similares. Preferiblemente, la vacuna se formula de tal manera que se pueda administrar a perros por inyección en una dosis de aproximadamente 0,1 a 5 ml, o de manera preferible de aproximadamente 0,5 a 2,5 ml, o de manera incluso más preferible en una dosis de aproximadamente 1 ml. Cuando sea apropiado, las composiciones farmacéuticas del presente invento deberán ser hechas estériles por procedimientos bien conocidos.
La cantidad de p78 en las vacunas deberá ser efectiva para inmunización, y esta situada generalmente en el intervalo de 0,5 - 1.000 \mug por dosis. Preferiblemente, la cantidad de p68 está situada en el intervalo de 1 - 260 \mug por dosis. Más preferiblemente, la cantidad de p68 está situada en el intervalo de 10-100 \mug por dosis. De manera incluso más preferible, la cantidad de p68 es de aproximadamente 15 a 25 \mug por dosis.
La cantidad de adyuvantes apropiados para su uso en las vacunas depende de la naturaleza del adyuvante que se use. Por ejemplo, cuando se usan Quil A y colesterol como adyuvantes, el Quil A está presente generalmente en una cantidad de aproximadamente 1-1.000 \mug por dosis, de manera preferible de 30-100 \mug y de manera más preferible de aproximadamente 50-75 \mug por dosis; y el colesterol está presente generalmente en una cantidad de aproximadamente 1-1.000 \mug por dosis, de manera preferible de aproximadamente 30-100 \mug por dosis, y de manera más preferible de aproximadamente 50-75 \mug por dosis.
La presente divulgación proporciona métodos de proteger a perros frente a una enfermedad causada por Bordetella bronchiseptica por medio de una administración a un perro de una composición de vacuna de p68, como se ha descrito anteriormente en esta memoria. De acuerdo con el presente divulgación, la composición de vacuna de p68 proporciona a los perros una inmunidad a largo plazo durante por lo menos aproximadamente 4 meses, de manera preferible durante por lo menos aproximadamente 6 meses, o de manera incluso más preferible, durante aproximadamente un año.
De acuerdo con la presente divulgación, una vacuna de p68 se puede administrar a un perro por cualesquiera vías conocidas, inclusive las vías oral, intranasal, mucosal, tópica, transdérmica y parenteral (p.ej. las vías intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea o intramuscular). La administración se puede conseguir también usando dispositivos para el suministro, sin agujas. La administración se puede conseguir usando una combinación, p.ej. una primera administración usando una vía parenteral y una subsiguiente administración usando una vía mucosal.
Las vías preferidas de administración incluyen las administraciones subcutáneas e intramusculares.
La composición de vacuna de p68 del presente invento se puede administrar a perros con una edad de por lo menos 6 semanas, preferiblemente con una edad de por lo menos 7 semanas, y, más preferiblemente, con una edad de por lo menos 8 ó 9 semanas. Los perros se pueden vacunar con una dosis, o con más de una dosis, de una vacuna de p68. De manera preferible, dos dosis de una vacuna de p68 se administran a los perros con un intervalo de aproximadamente 2-4 semanas, de manera preferible de aproximadamente 3 semanas, entre las dos administraciones. Si los perros son vacunados antes de la edad de 4 meses, se recomienda que éstos sean revacunados con una única dosis al alcanzar los 4 meses de edad, puesto que los anticuerpos maternales pueden interferir con el desarrollo de una respuesta inmunitaria adecuada en cachorros con una edad de menos de 4 meses. Los perros se pueden revacunar también anualmente con una única dosis. Cuando es probable una exposición a B. bronchiseptica tal como en situaciones de crianza, hospedaje y exposición, se puede administrar una carga adicional de refuerzo (revacunación) en el transcurso de 1 año, o preferiblemente de 6 meses, desde la aparición de estos sucesos.
Vacunas en combinación de p68
En otra forma de realización, el presente invento proporciona vacunas en combinación y métodos para proteger a perros frente a Bordetella bronchiseptica y frente a uno o más de otros patógenos caninos, por administración de dichas vacunas en combinación. Las composiciones de vacunas en combinación del presente invento no exhiben interferencia entre eficacias y son seguras para su administración a cachorros.
Las vacunas en combinación del presente invento incluyen un antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica, que se puede producir como se ha descrito anteriormente en esta memoria, en combinación con por lo menos un antígeno procedente de otros patógenos caninos, capaces de inducir un respuesta inmunitaria protectora en perros frente a una enfermedad causada por dichos otros patógenos.
Dichos otros patógenos incluyen, pero no se limitan a, los virus del moquillo canino (CD), adenovirus caninos del tipo 2 (CAV-2), virus de parainfluenza canina (CPI), parvovirus caninos (CPV), coronavirus caninos (CCV), herpesvirus caninos y virus de la rabia. Los antígenos procedentes de estos patógenos para su uso en las composiciones de vacunas del presente invento pueden estar en la forma de una preparación de virus vivos modificados o una preparación de virus inactivados. Los métodos de atenuar cepas virulentas de estos virus y los métodos de producir una preparación de virus inactivados son conocidos en la especialidad y se describen, p.ej. en las patentes de los EE.UU. 4.567.042 y 4.567.043.
Otros patógenos incluyen también Leptospira Bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira hardjobovis, Porphyromonas spp., Bacteriodes spp, Leishmania spp., Borrelia spp., Ehrlichia spp., Mycoplasme ssp. y Microsporum canis. Los antígenos procedentes de estos patógenos destinados a su uso en las composiciones de vacunas del presente invento, pueden estar en la forma de una preparación de células enteras o parciales, inactivadas, usando métodos bien conocidos en la especialidad. Por ejemplo, métodos de producir una preparación de células de Leptospira enteras o parciales, inactivadas, son conocidos en la especialidad y se describen p.ej. en las citas de Yan, K-T, "Aspects of Immunity to Leptospira borgpetersenii serovar hardjo", [Aspectos de inmunidad frente a Leptospira borgpetersenii serovariedad hardjo] Tesis Doctoral, Apéndice I, 1996, Facultad de Ciencias Agrícolas y Alimentarias, The Queen's University of Belfast (La Universidad Real de Belfast); Mackintosh y colaboradores, "The use of a hardjo-pomona vaccine to prevent leptospiruria in cattle exposed to natural challenge with Leptospira interrogans serovar hardjo" [El uso de una vacuna de hardjo-pomona para prevenir la leptospiruria en ganado expuesto a estimulación natural con Leptospira interrogans serovar hardjo], New Zealand Vet. J. 28:174-177, 1980; Bolin y colaboradores, "Effect of vaccination with a pentavalent leptospiral vacine on Leptospira interrogans serovariedad hardjo type hardjo-bovis infection of pregnant cattle" [Efecto de una vacunación con una vacuna leptospiral pentavalente al producirse una infección con Leptospira interrogans serovariedad hardjo tipo hardjo-bovis de reses preñadas], Am. J. Vet. Res. 50:161-165, 1989.
De acuerdo con el presente invento, las vacunas en combinación incluyen generalmente un vehículo aceptable en veterinaria. Tal como se ha descrito con anterioridad en esta memoria, un vehículo aceptable en veterinaria incluye uno cualquiera y la totalidad de dichos disolventes, medios de dispersión, revestimientos, adyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardadores de la adsorción, y similares. Los diluyentes pueden incluir agua, una solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen una albúmina, entre otros.
Los adyuvantes apropiados para su uso de acuerdo con el presente invento incluyen, pero no se limitan a, diversas clases de adyuvantes tales como: sales minerales, p.ej. alumbre (sulfato de aluminio), hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y fosfato de calcio; agentes tensioactivos y micropartículas, p.ej. agentes tensioactivos del tipo de polímeros de bloques no iónicos (p.ej. colesterol), virosomas, saponinas (p.ej., Quil A, QS-21 y GPI-0100), proteosomas, complejos estimulantes de la inmunidad, cocleados, aminas cuaternarias (bromuro de dimetil dioctadecil amonio (DDA)), avidina, vitamina A, vitamina E, productos bacterianos tales como el sistema de adyuvante de RIBI (de Ribi Inc.), el esqueleto de paredes celulares de Mycobacterium phlei (Detox®), muramil dipéptidos (MDP) y tripéptidos (MTP), el monofosforil lípido A, Bacillus de Calmette-Guerin, enterotoxinas de E. coli inestables frente al calor, la toxina del cólera, dimicolato de trehalosa, oligodesoxinucleótidos de CpG; citocinas y hormonas, p.ej. interleucinas (IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18), el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, deshidroepiandrosterona, 1,25-dihidroxi vitamina D_{3}; polianiones, p.ej. dextrano; polímeros acrílicos (p.ej. poli-(metacrilato de metilo), Carbopol 934P); vehículos p.ej., el toxoide de tétanos, el toxoide de la difteria, la subunidad de la toxina B del cólera, la enterotoxina mutante, inestable frente al calor de E. coli enterotoxigénico (rmLT), proteínas de choque térmico (termosensibles); emulsiones del tipo de aceite en agua, p.ej. AMPHIGEN® (de Hydronics, EE.UU) y emulsiones del tipo de agua en aceite, tales como p.ej. adyuvantes completos e incompletos de Freund.
Los adyuvantes preferidos para su uso en las vacunas del presente invento incluyen Quil A y colesterol.
El antígeno de p68, uno o más antígenos procedentes de otros patógenos, y el vehículo aceptable en veterinaria, se pueden combinar de cualquier manera conveniente y práctica para formar una composición de vacuna en combinación, p.ej. por adición a una mezcla, disolución, suspensión, emulsificación, encapsulación, adsorción y similares, y se pueden confeccionar en formulaciones, tales como tabletas, cápsulas, polvos, jarabes, suspensiones que son apropiadas para inyecciones, implantaciones, inhalaciones, ingestiones o similares. De manera preferible, la vacuna se formula de manera tal que se puede administrar a perros por inyección en una dosis de aproximadamente 0,1 a 5 ml, o de manera preferible de aproximadamente 0,5 a 2,5 ml, o incluso de manera más preferible, en una dosis de aproximadamente 1 ml.
De acuerdo con la presente divulgación, las vacunas en combinación de p68 se pueden administrar a un perro con una edad de por lo menos 6 semanas, preferiblemente con una edad de por lo menos 7 semanas, y, más preferiblemente, con una edad de por lo menos 8 ó 9 semanas. La administración se puede efectuar por cualesquiera vías conocidas, inclusive las vías oral, intranasal, mucosal tópica, transdérmica y parenteral (p.ej. las vías intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea o intramuscular). La administración se puede conseguir también usando dispositivos para el suministro sin agujas. La administración se puede conseguir usando una combinación, p.ej. una primera administración usando una vía parenteral y una subsiguiente administración usando una vía mucosal. Las vías preferidas de administración incluyen las administraciones subcutáneas e intramusculares.
Vacunas en combinación de p-68 preferidas y métodos de vacunación
Una vacuna en combinación preferida del presente invento incluye una cepa atenuada de virus de CD, una cepa atenuada de CAV-2, una cepa atenuada de virus de CPI, una cepa atenuada de CPV, una preparación inactivada de una cepa de CCV, y un antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica.
Una vacuna en combinación especialmente preferida incluye la cepa atenuada de virus de CD que se designa como la cepa de "Snyder Hill" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), la cepa atenuada de CAV-2 designada como la cepa de "Manhattan" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), la cepa atenuada de virus de CPI que tiene la designación de "NL-CPI-5" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), la cepa atenuada de CPV que tiene la designación de "NL-35-D" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), una preparación inactivada de la cepa de CCV que tiene la designación de "NL-18" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA) y el antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1. Dicha vacuna en combinación, también citada en esta memoria como "la vacuna en combinación de p68 / 5 CV", se prepara preferiblemente rehidratando una preparación liofilizada de las cepas víricas atenuadas y una preparación de virus con una preparación líquida, cuya preparación líquida se compone del antígeno de p68 disuelto en una solución salina estéril y a la que se han añadido como adyuvantes Quil A y colesterol.
Otra vacuna en combinación especialmente preferida incluye los componentes antigénicos de la vacuna en combinación de p68 / 5 CV, así como preparaciones de células enteras inactivadas de cinco especies de Leptospira: Leptospira Bratislava (p.ej., una cepa de Leptospira Bratislava que se puede obtener del National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), Leptospira canicola (p.ej., la cepa C-5, del National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), Leptospira grippotyphosa (p.ej., la cepa MAL 1540, del National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), Leptospira icterohaemorrhagiae (p.ej., la cepa NADL 11403, del National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA) y Leptospira pomona (p.ej., la cepa T262, del National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA). Dicha vacuna en combinación, citada también en este texto como "la vacuna en combinación de p68 / 5CV - Leptospira", se prepara preferiblemente rehidratando una preparación liofilizada de las cepas atenuadas de virus (o una preparación producida por otros métodos tales como secado o desecación por atomización) y una preparación de virus con una preparación líquida, cuya preparación líquida se compone del antígeno de p68 y de antígenos de Leptospira, disueltos en una solución salina estéril y a la que se han añadido los adyuvantes Quil y A y colesterol.
De acuerdo con la presente divulgación, las vacunas en combinación de p68 / 5CV así como de p68 / 5CV - Leptospira se pueden administrar a perros sanos con una edad de 4 semanas o más viejos, preferiblemente de 6 semanas o más viejos, y preferiblemente en 3 dosis, administrada cada una con una separación de 3 semanas entre ellas. Los perros pueden ser revacunados anualmente con una única dosis. Cuando es probable una exposición a B. bronchiseptica y a virus caninos, tal como en situaciones de crianza, hospedaje y exposición, se puede administrar una vacuna de refuerzo adicional en el transcurso de un año o preferiblemente de 6 meses, desde la aparición de estos sucesos.
Todavía otra preferida vacuna en combinación del presente invento incluye una cepa atenuada de virus de CD, una cepa atenuada de CAV-2, una cepa atenuada de virus de CPI, una cepa atenuada de CPV y un antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica recombinante.
Una vacuna en combinación especialmente preferida incluye la cepa de virus CD atenuada designada como la cepa de "Snyder Hill" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), la cepa atenuada de CAV-2 designada como la cepa de "Manhattan" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), la cepa atenuada de virus de CPI que tiene la designación de "NL-CPI-5" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), la cepa atenuada de CPV que tiene la designación de "NL-35-D" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), una preparación inactivada de la cepa de CCV que tiene la designación de "NL-18" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA) y el antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1. Dicha vacuna en combinación, también citada en esta memoria como "la vacuna en combinación de p68 / 5 CV", se prepara preferiblemente rehidratando una preparación liofilizada de las cepas víricas atenuadas y una preparación de virus con una preparación líquida, cuya preparación líquida se compone del antígeno de p68 disuelto en una solución salina estéril, y a la que se han añadido como adyuvantes Quil A y colesterol.
Otra vacuna en combinación especialmente preferida incluye los componentes antigénicos de la vacuna en combinación de p68 / DA_{2}PP, así como preparaciones de células enteras inactivadas de dos especies de Leptospira: Leptospira canicola (p.ej., la cepa C-51, del National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), Leptospira icterohaemorrhagiae (p.ej., la cepa NADL 11403, del National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA). Alternativamente, una vacuna en combinación preferida puede incluir los componentes antigénicos de la vacuna en combinación de p68 /
DA_{2}PP, así como preparaciones de células enteras inactivadas de cinco cepas de Leptospira: Leptospira Bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona. Estas vacunas en combinación, también citadas en esta memoria como "las vacunas en combinación de p68 / DA_{2}PP - Leptospira", se preparan preferiblemente rehidratando una preparación liofilizada de las cepas atenuadas de virus (o una preparación producida por otros métodos, tales como secado por atomización o desecación) y una preparación de virus con una preparación líquida, cuya preparación líquida se compone del antígeno de p68 y de antígenos de Leptospira, disueltos en una solución salina estéril, y a la que se han añadido los adyuvantes Quil y A y colesterol.
De acuerdo con la presente divulgación, las vacunas en combinación de p68 / DA_{2}PP y de p68 / DA_{2}PP - Leptospira se pueden administrar a perros sanos con una edad de 6 semanas o más viejos, o preferiblemente con una edad de 8 semanas o más viejos, y de manera preferible en 2 dosis, administrada cada una con una separación de aproximadamente 3 semanas entre sí. Una única dosis puede ser suficiente si se administra a un perro con una edad de por lo menos 12 semanas. Los perros se pueden revacunar anualmente con única dosis. Cuando es probable la exposición a B. bronchiseptica y a virus caninos, tal como en situaciones de crianza, hospedaje y exposición, se puede administrar una vacuna de refuerzo adicional en el transcurso de 1 año, o preferiblemente de 6 meses, desde la aparición de estos sucesos. Otra vacuna en combinación preferida incluye un antígeno de p68, preferiblemente el antígeno de p68 recombinante que tiene la SEQ ID NO: 1, en combinación con una cepa atenuada de CPI.
Todavía otra preferida vacuna en combinación incluye un antígeno de p68, preferiblemente el antígeno de p68 recombionante que tiene la SEQ ID NO:1, una cepa atenuada de CPI y por lo menos dos especies de Leptospira tales como Leptospira canicola (p.ej. la cepa C-51, del National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), y Leptospira icterohaemorrhagiae (p.ej. la cepa NADL 11403, del National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA).
La cantidad del antígeno de p68 y la(s) del (de los) antígeno(s) procedente(s) de uno o más de otros patógenos en las vacunas en combinación del presente invento deberán ser eficaces para inmunizar. En general, el antígeno de p68 en una vacuna en combinación deberá estar en una cantidad de por lo menos aproximadamente 0,5 \mug por dosis. El virus de CD atenuado deberá estar en una cantidad de por lo menos aproximadamente 10^{2} a aproximadamente 10^{9} TCID_{50} por dosis de TCID_{50} (de Tissue Culture Infectious Dose 50% = dosis infecciosa de cultivo de tejidos con efecto citopático de 50%) por dosis, y de manera preferible en el intervalo de aproximadamente 10^{4} a aproximadamente 10^{6} TCID_{50} por dosis. Los CAV-2 atenuados deberán estar en una cantidad de por lo menos aproximadamente 10^{2} TCID_{50} a aproximadamente 10^{9} TCID_{50} por dosis, preferiblemente en el intervalo de 10^{4,0} a aproximadamente 10^{6,0} de TCID_{50} por dosis. Los virus de CPI atenuados deberán estar en una cantidad de por lo menos aproximadamente 10^{2} TCID_{50} a aproximadamente 10^{9} TCID_{50} por dosis, y preferiblemente en el intervalo de 10^{6} a aproximadamente 10^{8} TCID_{50} por dosis. Los CPV atenuados deberán estar en una cantidad de por lo menos aproximadamente 10^{2} TCID_{50} a aproximadamente 10^{9} TCID_{50} por dosis, preferiblemente en una cantidad en el intervalo de 10^{7} a aproximadamente 10^{9} TCID por dosis. La cantidad de CCV en una preparación vírica inactivada deberá ser de por lo menos aproximadamente 100 unidades relativas por dosis, y preferiblemente en el intervalo de 1.000-4.500 unidades relativas por dosis. Cada especie de Leptospira en la vacuna deberá estar en el intervalo de aproximadamente 100-3.500 NU (de Nephelometric Units = unidades nefelométricas) por dosis de vacuna, y preferiblemente en el intervalo de 200-2.000 NU por dosis.
Las vacunas en combinación se formulan de manera tal que estas vacunas se pueden administrar a perros por inyección en una dosis de 0,1 ml a 5 ml, de manera preferible de 0,5 ml a 2,5 ml y de manera más preferible de aproximadamente 2 ml.
El presente invento se ilustra adicionalmente por los siguientes Ejemplos no limitativos
Ejemplo 1 Estudio de titulación de las dosis del antígeno recombinante p68 procedente de Bordetella canina Vacuna
El antígeno de vacuna experimental era una proteína de membrana externa p68 recombinante (SEQ ID NO: 1) procedente de B. bronchiseptica, producida por la cepa LW68 de E. coli. La vacuna contenía niveles variables de p68 solubilizado en SDS (de Sodium Dodecyl Sulfate = dodecil sulfato de sodio), al que se habían añadido como adyuvante 50 \mug de QAC (Quil A / 50 \mug de colesterol) en una dosis de 1 ml.
Material de estimulación
Se usó como material de estimulación un aerosol de un material aislado de Bordetella bronchiseptica de perro, nº 85B, pasada nº 3, lote nº 05197. El recuento medio en placas fue de 1,59 x 10^{8} CFU/ml. (CFU, de Colony Forming Units = unidades formadoras de colonias)
Animales
Sesenta cachorros caninos machos y hembras se asignaron aleatoriamente a uno de seis grupos de tratamiento (10 cachorros por grupo). Se extrajo sangre de los cachorros y se tomaron frotes traqueales 41 días antes de la primera vacunación y de nuevo 28 días antes de la primera vacunación, y se apartaron del estudio cualesquiera animales seropositivos o positivos en cultivo.
Los animales se asignaron aleatoriamente a tratamientos y habitaciones de acuerdo con un diseño de bloques completos distribuidos aleatoriamente. Las observaciones después de las vacunaciones se hicieron sin conocer los grupos de asignación a vacunas.
Diseño
1
Proceso Administración IVP
Los animales se vacunaron en el Día 0 o bien con el placebo o con la vacuna experimental. Una segunda vacunación se administró en el Día 21. La primera vacunación se administró por vía subcutánea en la parte derecha del cuello y la segunda vacunación se administró por vía subcutánea en la parte izquierda del cuello.
Administración de Estimulación
Todos los animales fueron estimulados 28 días después de la segunda vacunación por un aerosol de Bordetella bronchiseptica. Se vigilaron los animales en cuanto a si tosían durante un período de tiempo de 30 minutos, dos veces por
día (una vez por la mañana y una vez por la tarde) en los días dos a catorce después de la estimulación (Días 51 a 63).
Observaciones y Recogida de Muestras
Todos los sitios de inyección se palparon y midieron tridimensionalmente durante siete días después de cada vacunación (en los Días 0 a 7 y 21 a 28) y en el Día 14º después de cada vacunación (Días 14 y 35).
Las temperaturas rectales se registraron en el día de la vacunación y durante tres días después de cada vacunación (Días 0 a 3 y 21 a 24).
Se recogió sangre en los días de vacunación (Días 0 y 21) y en los días 42, 50 y 63 y se ensayó mediante un ELISA en cuanto a anticuerpos específicos contra la proteína p68 purificada procedente de B. bronchiseptica. Se recogió también sangre en los Días 42, 49, 50, 52, 54, 56 y 58 y se analizó en cuanto a Amiloide A de Suero (SAA de Serum Amyloid A).
De todos los animales se obtuvieron frotes traqueales para el aislamiento de B. bronchiseptica y se recogió sangre para determinar los títulos de aglutinación de B. bronchiseptica antes de la vacunación (en los locales del vendedor, en el Día -41 y en el Día -28) y en el Día 49.
ELISA DAB para Titulación de Anticuerpos de p68 procedente de Bordetella en Perros y Ratones
Un p68 nativo purificado se diluyó hasta 600 ng/ml, en un Tampón de Borato 0,01 M y se añadió a cada pocillo a razón de 100 \mul/pocillo. Las placas se incubaron durante una noche a 4ºC. Luego las placas se lavaron una vez con PBS - Tween 20 en exceso. Se añadió leche secada no grasa al 1% en PBS a las placas a razón de 200 \mul/pocillo. Luego las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Seguidamente, las placas se lavaron una vez con un exceso de PBS - Tween 20.
Se añadió suero de perro o de ratón en una dilución de 1:50 a la fila superior de las placas de ELISA y se añadió suero diluido en serie de razón doble durante todo el camino hacia abajo en la placa. Las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Subsiguientemente, las placas se lavaron tres veces con un exceso de PBS - Tween 20.
A las placas incubadas con el suero de perro anterior, se les añadió a razón de 100 \mul/pocillo una IgG de cabra anti -
perro marcada con peroxidasa (H + L), diluida en una dilución de 1:2.000. Luego las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC. A las placas incubadas con el suero de ratón anterior, se les añadió a razón de 100 \mul / pocillo la IgG de cabra anti - ratón marcada con peroxidasa, antes citada (H + L), diluida en una dilución de 1:1:4.000, a razón de 100 \mul / pocillo. Luego las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC. A continuación las placas se lavaron 3 veces con un exceso de PBS - Tween 20.
El substrato ABTS se añadió a razón de 100 \mul / pocillo. Aproximadamente 20 minutos más tarde, las placas se leyeron con un lector de placas de Molecular Devices o uno equivalente a 405-490 nm.
Análisis de los datos
Se ensayaron las diferencias entre tratamientos en el número de perros que estaban tosiendo usando el Ensayo Exacto de Fisher. Se usó el nivel de significancia de 5%.
Los títulos de ELISA se transformaron a logaritmos naturales antes del análisis usando un modelo mixto lineal general. El nivel de confianza de 95% se usó para determinar las diferencias entre tratamientos. Las observaciones de estimulación se vigilaron dos veces por día durante 30 minutos en cada caso.
Resultados Títulos de Cultivos de Frotes Traqueales y de Aglutinación
Los títulos de los cultivos de frotes traqueales y de aglutinación se evaluaron para vigilar el estado de B. bronchiseptica de animales enrolados en el estudio. Cierto número de perros demostraron títulos aumentados en diversos puntos de tiempo, pero ningún título había aumentado por encima de 128 antes de la estimulación.
Observaciones en los Sitios de Inyección
Las reacciones en los sitios de inyección a continuación de la primera vacunación se presentan en la Tabla 1. Las reacciones más grandes en sitios de inyección se observaron en animales vacunados con T05 (64 \mug), ocurriendo que la reacción media más grande en sitios de inyección medía solamente 14,69 cm^{3} (a los dos días después de la vacunación). Los animales vacunados con T03 (4 \mug), T04 (16 \mug) y T06 (256 \mug) demostraron reacciones variables en los sitios de inyección hasta 7 días después de la vacunación. Los animales vacunados con T02 (1 \mug) demostraron solamente reacciones en el Día 1 después de la vacunación. En el séptimo día después de la vacunación, no había ninguna diferencia estadísticamente significativa en las reacciones en los sitios de inyección entre los grupos de tratamiento. En el Día 14, todas las reacciones en los sitios de inyección se habían disipado.
Las reacciones en los sitios de inyección después de la segunda vacunación se presentan en la Tabla 2. A continuación de la segunda vacunación, las reacciones medias más grandes en los sitios de inyección se observaron en T06 (256 \mug), ocurriendo que la mayor reacción media en los sitios de inyección medía 50,03 cm^{3} (un día después de la vacunación). Se demostraron reacciones en los sitios de inyección en animales con T05 (64 \mug) y con T04 (10 \mug) hasta 7 días después de la segunda vacunación. Reacciones mínimas en los sitios de inyección se demostraron en animales en T03 (4 \mug) y con T02 (1 \mug) hasta 7 días después de la vacunación. Reacciones en los sitios de inyección, que no eran diferentes estadísticamente con respecto del grupo con placebo, se demostraron con T02 (1 \mug) y con T03 (4 \mug) después de la vacunación. A los catorce días después de la segunda vacunación no se observaron reacciones en los sitios de inyección.
La frecuencia de reacciones en los sitios de inyección después de la primera vacunación se presenta en la Tabla 3. La más alta frecuencia global LSM (de Least Mean Squares = media de mínimos cuadrados), de 76%, de sitios de inyección que exhiben una reacción en cualquier momento después de una primera vacunación, resultó de la vacunación con T06 (256 \mug). Las siguientes medias más frecuentes fueron de 72% de los sitios de inyección que mostraban una reacción a continuación de la primera vacunación con T05 (64 \mug), 69% después de la primera vacunación con T04 (16 \mug) y 63% a continuación de la primera vacunación con T03 (4 \mug). La frecuencia más baja, 38%, siguió a la primera vacunación con T02 (1 \mug).
La frecuencia de reacciones en los sitios de inyección a continuación de la segunda vacunación se presenta en la Tabla 4. La frecuencia LSM global para cada vacuna era compatible con la observada después de la primera vacunación.
La incidencia y la duración de las reacciones en los sitios de inyección a continuación de una vacunación se recopilan en la Tabla 5. La incidencia (o el número de perros que muestran una reacción en un momento cualquiera) de una reacción medible en los sitios de inyección era de 100% para T03, T04, T05 y T06 (4 \mug, 16 \mug, 64 \mug y 256 \mug, respectivamente) a continuación de las vacunaciones primera y segunda. Los animales que recibieron T02 (1 \mug) demostraron la menor incidencia de reacciones en los sitios de inyección después de la vacunación (57,1%).
La duración de la reacción (expresada como una media de mínimos cuadrados de días con una reacción, mostrada en la Tabla 5) era más larga para los animales vacunados con T04, T05 y T06 (16 \mug, 64 \mug y 256 \mug respectivamente) a continuación de las vacunaciones primera y segunda (de 2,7 a 5,1 días después de la primera vacunación y de 6,0 a 6,7 días después de la segunda vacunación). Los animales vacunados con T02 y T03 (1 \mug y 4 \mug, respectivamente) demostraron el más pequeño número de días con una reacción en los sitios de inyección a continuación de las vacunaciones primera y segunda (0,3 y 1,3 días después de la primera vacunación y 1,9 y 4,5 días después de la segunda vacunación).
Temperaturas Rectales
Las mediciones medias de temperaturas rectales se recopilan en la Tabla 6. La temperatura rectal LSM para T02 (1 \mug) en los Días 1 y 24, para T03 (4 \mug) en los Días 1, 21 y 24, para T04 (16 \mug) en los Días 2 y 24, para T05 (64 \mug) en el Día 23 y para T06 (256 \mug) en los Días 0, 1 y 24 fueron significativamente diferentes con respecto del placebo. En el Día 23 todas las comparaciones no eran estadísticamente significativas (p >0,05) con respecto del placebo.
Serología por ELISA de p68
El sumario de los datos de ELISA con respecto de p68 se presentan en la Tabla 7. Los títulos de virus medios geométricos antes de la vacunación de anticuerpos específicos para ELISA de p68 en todos los grupos fueron bajos (en el intervalo de 24,9 a 28,9) y los títulos para el placebo permanecieron bajos por toda la duración del estudio. A los veintiún días después de la primera vacunación, los títulos medios geométricos de los ELISA de p68 habían aumentando en el tratamiento vacunado (intervalo de 55,2 a 4.411,7) pero el título con T02 (1 \mug) no era estadísticamente diferente con respecto del placebo (T01). A los cuarenta y dos días después de la segunda vacunación, los títulos medios geométricos aumentaron adicionalmente en todos los grupos vacunados (intervalo de 674,6 a 48.382,0) demostrando una buena respuesta serológica a la vacunación.
Serología de Amiloide A de Suero (SAA)
Los títulos de SAA se recopilan en la Tabla 8. Antes de la estimulación, los títulos medios geométricos (GMT de Geometric Mean Titer) de SAA eran bajos en todos los grupos de tratamiento (intervalo de 0,1 a 0,5). Después de la estimulación, los títulos de GMT en T01 fluctuaban entre 1,5 y 146,0, mientras que los grupos de tratamiento con p68 fluctuaban entre 0,3 y 23,1. Todos los grupos de tratamiento eran estadísticamente diferentes con respecto del placebo en los Días 50, 52, 54 y 56. No se demostraron diferencias estadísticas entre las vacunas de p68, con la excepción de T02 (1 \mug) en el Día 52, en el que éste grupo demostró una media geométrica estadísticamente diferente con respecto de todos los otros grupos de tratamiento con p68.
Respuesta a la Estimulación
Los datos de respuesta a la estimulación se presentan en la Tabla 9. La respuesta fue determinada vigilando la tos después de la estimulación y las observaciones se analizaron usando dos métodos: el del número medio de mínimos cuadrados de días con tos y el de dos días consecutivos con tos (Incidencia de la Enfermedad).
El análisis del número medio de días con tos no demostró ninguna diferencia estadísticamente significativa entre los grupos de tratamiento con p68; sin embargo, los perros vacunados con un placebo tosían una media de 8,6 días, mientras que los perros a los que se administraron vacunas de p68 tosían significativamente menos, fluctuando las medias entre 2,2 y 4,7 días.
Cuando se evaluaron los perros usando la Incidencia de la Enfermedad, se observó que todos los perros vacunados con T01 (placebo) tosían durante dos días consecutivos (Incidencia de la Enfermedad de 100%). Los perros vacunados con T04 (16 \mug) y T05 (64 \mug) demostraron una Incidencia de la Enfermedad de 55,6% y 66,7% respectivamente. Se observó que solamente 28,6% de los perros vacunados con T02 (1 \mug), 50% de los vacunados con T03 (4 \mug) y 33,3% de los vacunados con T06 (256 \mug) tosían durante dos días consecutivos.
Discusión
En este estudio, el objetivo fue el de establecer una relación entre la dosis del antígeno, la respuesta inmunitaria y la protección en perros. Las dosis examinadas del antígeno de p68 fueron de 1 \mug, 4 \mug, 16 \mug, 64 \mug y 256 \mug.
El análisis de las mediciones de reacciones en los sitios de inyección demostró una reacción despreciable en los grupos de tratamiento con p68, con la excepción de T06 (256 \mug) en el primer día después de la segunda vacunación. Las reacciones que se observaron tendían a ser pequeñas, disminuyendo generalmente en magnitud durante los períodos de observación. La magnitud de estas reacciones era clínicamente insignificante y con la mayor probabilidad pasaría inadvertida en perros no afeitados.
Las temperaturas rectales después de la vacunación eran inobservables y se encontraban dentro de los límites normales para todos los perros en todos los grupos.
La respuesta serológica a la vacunación era excelente en los grupos con T03 hasta T06. En estos grupos de tratamiento, todos los animales demostraron unos títulos de ELISA de p68 significativamente más altos cuando se compararon con el placebo desde el Día 21 hasta el Día 63. Los anmimales tratados con T02 (1 \mug) demostraron unos títulos significativos de ELISA de p68 en comparación con el T01 (placebo) desde el Día 42 al Día 63. Los títulos más altos se observaron en T05 (64 \mug) y T06 (256 \mug).
El examen de la respuesta a SAA en todos los perros vacunados con p68 después de la estimulación, indicó un aumento mucho menor en el SAA después de la estimulación cuando se comparó con la de perros testigos. No se demostró ninguna diferencia entre los niveles de dosis de vacuna de p68 después de la estimulación con la excepción de T02 (1 \mug) en el día 52, que demostraron una media geométrica estadísticamente diferente con respecto de los otros grupos de tratamiento con p68.
Las observaciones de perros que tosían después de la estimulación se analizaron usando medias de mínimos cuadrados (LSM) del número de días con tos o de tos en dos días consecutivos (incidencia de la enfermedad). Usando la LSM de los días con tos, se demostró una diferencia significativa entre los grupos con placebo y todos los grupos vacunados con p68, aunque no se demostró ninguna diferencia entre los diferentes niveles de dosis de vacuna con p68. Usando la Incidencia de la Enfermedad, los perros vacunados con T02 (1 \mug), T03 (4 \mug) y T06 (256 \mug) tosieron significativamente menos que el placebo.
Conclusiones
El estudio se realizó para establecer una relación entre la dosis de antígeno, la respuesta inmunitaria y la protección en perros. Las dosis examinadas de antígeno de p68 fueron de 1 \mug, 4 \mug, 16 \mug, 64 \mug y 256 \mug.
Todas las vacunas fueron seguras, tal como se demuestra por unas mínimas reacciones en los sitios de inyección, unas temperaturas rectales normales y la ausencia de respuesta desfavorable a la vacunación. La magnitud de las reacciones en los sitios de inyección y la duración de estas reacciones fueron menores en los grupos de tratamiento con antígeno. La respuesta serológica a la vacunación, como se midió por los títulos de ELISA, era excelente con los grupos de más alta dosis de antígeno, demostrando respuestas serológicas más altas. Cuando se usaba la LSM de los días con tos como un método de comparación, todos los grupos de tratamiento demostraron una reducción significativa en la tos cuando se comparaban con el placebo. No se observaron diferencias entre los grupos de tratamiento. Cuando se usaron como comparación los días consecutivos con tos (o Incidencia de la Enfermedad) los perros vacunados con T02 (1 \mug), T03 (4 \mug) y T06 (256 \mug) tosían significativamente menos que los tratados con un placebo.
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TABLA 9 Incidencia y Duración de la Tos en Perros Después de la Estimulación de Perros Vacunados con un Antígeno de p68 o con un Placebo
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Ejemplo 2 Estudio de la inmunogenicidad de p68 procedente de Bordetella canina Animales
Se adquirieron cuarenta y cinco perros de razas mixtas, machos y hembras. Una vacuna de parvovirus MLV se administró a todos los cachorros en el día en que los cachorros llegaron al sitio del estudio. No se administraron a los cachorros durante el estudio otras vacunas, distintas de los productos experimentales. Los perros tenían una edad de aproximadamente 9 semanas (\pm 1 semana) en el Día 0 (día de la primera vacunación).
Los perros se mantuvieron en una instalación de aislamiento necesaria para evitar la exposición a Bordetella y a otros patógenos caninos antes de la estimulación. Después de la estimulación por un aerosol con Bordetella, se continuaron los procesos de aislamiento para evitar una exposición a otros patógenos caninos.
Vacunas
Se usó una solución salina estéril como vacuna de placebo en los grupos de tratamiento T01 y T02. Una vacuna contra Bordetella bronchiseptica con p68 recombinante canino se usó en los grupos de tratamiento T03 y T04. El gen estructural del antígeno de p68 se clonó en Escherichia coli y la expresión del gen se reguló por medio de un promotor sensible a las temperaturas. Las células fueron lisadas y los cuerpos de inclusión fueron separados por centrifugación. La p68 recombinante existente en los cuerpos de inclusión se solubilizó por tratamiento con SDS. La p68 recombinante (15 \mug por ml) se combinó con 50 \mug de Quil A y 50 \mug de colesterol por ml en una solución salina estéril como diluyente. Cada dosis de un ml contenía 0,28% de etanol y 0,0% de timerosal.
Inóculo de estimulación
La cepa Bihr Cat de Bordetella bronchiseptica se preparó como el inóculo de estimulación usando el método actualmente empleado por Biologics Control Laboratories-Microbiology. Placas de agar de Bordet-Genou se sembraron con un material en crecimiento confluyente de la cepa Bihr Cat de Bordetella bronchiseptica y se incubaron durante 48 horas a 37,5 \pm 2,5ºC. Las colonias virulentas en la fase I se seleccionaron y se aplicaron en franjas sobre el agar de Bordet-Genou y se incubaron durante 24 horas a 37,5 \pm 2,5ºC. Después de la incubación, se usó una solución salina con Bordetella para separar las colonias por lavado del agar y el antígeno se diluyó hasta una densidad óptica de 0,80 a 600 nm. Un recuento de las células se llevó a cabo antes y después de la estimulación, para la confirmación de la lectura en el nefelómetro. La concentración diana de estimulación fue de aproximadamente 1 x 10^{9} CFU. La concentración antes de la estimulación fue de 2,37 x 10^{9} CFU (100% de Fase I) y el recuento en la concentración después de la estimulación fue de 1,35 x 10^{9} CFU (100% de Fase I).
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Diseño del estudio 
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TABLA SUMARIO
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Distribución Aleatoria y Ensayo a Ciegas
Durante el período de tiempo que transcurrió desde la vacunación hasta el día de la estimulación, los animales se asignaron a los tratamientos de acuerdo con un diseño de bloques generalizados. Los tratamientos se asignaron aleatoriamente a las habitaciones. En el día de la estimulación, los animales se asignaron aleatoriamente a habitaciones de estimulación por bloques.
Individuos cualificados, desconocedores de los grupos de tratamiento asignados, realizaron ensayos microbiológicos y serológicos y comprobaciones de los sitios de inyección, mediciones de las temperaturas rectales, y observaciones de la tos.
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Análisis de los Datos
Las variables de respuestas después de la vacunación consistían en datos de los sitios de inyección, temperaturas rectales y títulos por ELISA de p68. Los datos de los sitios de inyección se recopilaron de las siguientes maneras: 1) número de animales que tenían una reacción medible por tratamiento y día del estudio, 2) número de puntos de tiempo en los animales que tienen una reacción medible por tratamiento, 3) número de animales que tienen una reacción medible en cualquier punto de tiempo por tratamiento.
Por separado para las vacunaciones primera y segunda, se analizaron los datos de los volúmenes (en centímetros cúbicos) en los sitios de inyección, las temperaturas rectales y los títulos por ELISA de p68 transformados a logaritmos naturales usando un modelo mixto lineal general.
Contrastes lineales a priori del tratamiento por la media de mínimos cuadrados en los puntos de tiempo de observación se establecieron para ensayar las diferencias entre los grupos de tratamiento en cada punto de tiempo de observación y para comparar los puntos de tiempo dentro de cada tratamiento. El nivel de significancia de 5% se usó para todas las comparaciones.
Las variables de respuestas después de la estimulación consistían en observaciones diarias de tos, títulos por ELISA de p68 y títulos de amiloide A de suero. El número de días con tos durante el período posterior a la estimulación se analizó usando un modelo mixto lineal general.
Los contrastes a priori de la media de mínimos cuadrados de los tratamientos se construyó para ensayar las diferencias entre los grupos de tratamiento de ensayo. El nivel de significancia de 5% se usó para todas las comparacio-
nes.
Por separado para las vacunaciones primera y segunda, se usó el Ensayo Exacto de Fisher para comparar los grupos de tratamiento en cuanto a la incidencia de tos durante dos días consecutivos. El nivel de significancia de 5% se usó para todas las comparaciones.
Para los datos de título de amiloide A de suero (SAA) después de la estimulación, se aplicó a los valores de los títulos la transformación a logaritmos naturales antes de un análisis usando un modelo mixto lineal general.
Contrastes lineales a priori del tratamiento por la media de mínimos cuadrados en los puntos de tiempo de observación se establecieron para ensayar las diferencias entre los grupos de tratamiento en cada punto de tiempo de observación y para comparar los puntos de tiempo dentro de cada tratamiento. El nivel de significancia de 5% se usó para todas las comparaciones.
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Proceso del Estudio Procesos Detallados con Animales
Cuarenta y cinco (45) cachorros seronegativos y negativos en cultivo se asingnaron aleatoriamente a uno de 4 grupos de tratamiento. Se asignaron ocho y siete perros a los grupos testigos por vía intramuscular (IM) o subcutánea (SC), respectivamente, para un total de 15 perros testigos. Quince perros se asignaron al grupo de tratamiento SC con p68 y 15 perros se asignaron al grupo de tratamiento IM con p68. Los Grupos de Tratamiento se detallan en la Sección de Diseño de Estudio anterior.
El Día 0 fue designado como el día de la primera vacunación. Las vacunaciones se administraron en el Día 0 y se repitieron 21 días más tarde. Para la primera vacunación, se uso el lado derecho del cuello, y para la segunda vacunación, se usó el lado izquierdo del cuello. Se administraron inyecciones intramusculares en los músculos semimembranosos derecho e izquierdo para las vacunaciones primera y segunda, respectivamente. Todos los sitios de inyección se midieron tridimensionalmente durante siete días a continuación de cada vacunación, realizándose una medición de seguimiento a los 14 días a continuación de la vacunación. Las temperaturas rectales se vigilaron en el día de la vacunación (antes de la vacunación) y durante tres días después de cada vacunación.
En el Día 35, se tomaron frotes de las traqueas de todos los animales para obtener un cultivo de B. bronchiseptica y se recogió sangre para los títulos de aglutinación. Todos los animales eran negativos según el frote traqueal y serológicamente negativos para Bordetella y se consideraron que eran elegibles para estimulación.
En el Día 45, veinticuatro días después de la segunda vacunación, se administró a todos los perros una estimulación por un aerosol de B. bronchiseptica. Los perros sedados se estimularon utilizando un cono nasal desechable, que se acopló apretadamente sobre el morro del perro sedado. El cono nasal se unió a un nebulizador que se había unido a una bomba a presión de vacío ajustada a 5,5 hasta 6,0 psi (0,385 hasta 0,42 kg/cm^{2}). Se dispuso un mililitro de material de estimulación en el nebulizador y el material de estimulación transformado en aerosol se administró a cada perro durante 4 minutos. El personal que hacía las observaciones era desconocedor de las asignaciones a los grupos de tratamiento.
Los animales se vigilaron en cuanto a si tosían durante 14 días después de la estimulación (Días 46-59). Las observaciones se hicieron en 2 (dos) períodos de tiempo de aproximadamente 30 minutos, aproximadamente en el mismo momento de cada día, una realizada por la mañana y otra por la tarde, y se registraron los resultados.
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Recogida de Sangre
La sangre para los títulos de aglutinación se recogió antes de la primera vacunación y antes de la estimulación. La sangre para la evaluación por ELISA de anti-p68 se recogió antes de la vacunación en los Días 0 y 21 y en los Días 35, 45 y 59. La sangre para el ensayo de Amiloide A de Suero (SAA) se recogió en el día de la estimulación (Día 45) y en los días 46, 48, 50, 52 y 54.
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Ensayos Realizados en las Muestras
Los frotes traqueales se evaluaron en cuanto a la presencia de B. bronchiseptica por medio de cultivo. Cada frote traqueal se extendió en franjas sobre una placa de Agar Selectivo para Bordetella. Se incluyeron testigos positivos y negativos. Las placas se incubaron a 37,5 \pm 2,5ºC durante 48 \pm 4 horas. Las colonias resultantes en cada placa se compararon con el testigo positivo y cualquier colonia que manifestó ser idéntica para el testigo positivo se ensayó adicionalmente para confirmar la presencia de B. bronchiseptica. Los ensayos confirmatorios incluían el uso de TSI, Agar con Citrato y Urea y medios con Rojo de Nitrato.
Los sueros se evaluaron en cuanto a los títulos de aglutinación, el análisis por ELISA de p68 o el análisis de SAA, usando los siguientes métodos:
Títulos de aglutinación - Los sueros se diluyeron en serie en placas de microtitulación usando una solución salina con Bordetella. Se incluyeron en cada placa testigos positivos y negativos. Se usó la Cepa 87 de B. bronchiseptica (crecida sobre un agar de Bordet Genou, cosechada, inactivada y diluida a 20% de T a 630 nm) como el antígeno aglutinante y se añadió a cada pocillo. Las placas se sacudieron e incubaron a 35 \pm 2ºC durante 2 horas. Se leyeron las placas después de una segunda incubación a la temperatura ambiente durante 22 horas. El título de punto final se determinó usando el último pocillo que mostraba una aglutinación de 50%.
Títulos por ELISA de p68 - El antígeno de p68 recombinante se capturó en una placa de microtitulación con 96 pocillos, revestida con un antisuero policlonal específico para el antígeno de p68 procedente de Bordetella. Diluciones en serie de razón doble del suero canino se añadieron a la placa y se incubaron. Los testigos positivos y negativos en una dilución de 1:1.000 se incluyeron en cada placa. Un conjugado de indicador y de IgG de cabra anti-perro, purificado por afinidad y marcado con peroxidasa se usó para detectar anticuerpos específicos para el antígeno de p68. Se añadió luego un substrato cromogénico ABTS y la placa se leyó cuando los pocillos con testigos positivos tenían una densidad óptica D.O. de 1,2 \pm 0,2. El título de una muestra dada se calculó como el valor recíproco de la última dilución con una densidad óptica mayor que la media de la dilución de un suero testigo negativo más cinco desviaciones típicas.
Títulos de SAA - Los títulos de Amiloide A de Suero canino se evaluaron usando un estuche adquirido de Accuplex Co., Centro Médico de la Universidad de Nebraska, Omaha, NE 68198. Expresado brevemente, el SAA canino se capturó en una placa de micotitulación revestida con un anticuerpo monoclonal anti-SAA canino. Muestras diluidas del suero canino se añadieron a la placa, seguidas por un conjugado de anticuerpo anti-canino marcado con biotina. Después de la incubación, se añadió un substrato cromogénico de estreptavidina conjugada con peroxidasa. La placa se leyó después de 30 minutos.
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Resultados Temperaturas Rectales
Unos sumarios de las mediciones de las temperaturas rectales se presentan en las Tablas 10 y 11.
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TABLA 10 Media de mínimos cuadrados de las temperaturas rectales (ºC) en perros a continuación de una vacunación contra Bordetella con una solución salina o con un p68 (después de la primera vacunación^{a})
9
TABLA 11 Media de mínimos cuadrados de las temperaturas rectales (ºC) en perros a continuación de una vacunación contra Bordetella con una solución salina o con un p68 (después de la segunda vacunación^{a})
10 
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No se observó ninguna diferencia significativa entre cualesquiera grupos en cualesquiera días después de la primera vacunación. Se observó una diferencia significativa entre los perros vacunados con solución salina y todos los perros vacunados con p68 (p = 0,0053 para T01T02 frente a T03T04) en el Día 21. Se demostró en el Día 24 una diferencia significativa (p = 0,0124) entre animales vacunados con p68 SC e IM.
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Reacciones en los Sitios de Inyección
Las reacciones en los sitios de inyección se recopilan en las Tablas 12 y 13. Debido a un descuido técnico, no se realizaron observaciones en los sitios de inyección en el caso de la observación del día 14 a continuación de la segunda vacunación (Día 35).
Se observaron reacciones medibles en los sitios en el tratamiento en T03 (p68 SC) y éstas eran de magnitud mínima. Una pequeña reacción en el sitio de inyección se observó en un perro en T04 (p68 IM) para el Día 3, pero el mínimo impacto de la medición no se refleja en la media global para el grupo.
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TABLA 12 Media de mínimos cuadrados (cm cúbicos) de reacciones en los sitios de inyección en perros a continuación de una vacunación contra Bordetella con una solución salina o con p68 (15 \mug/dosis) (después de la primera vacunación^{a})
11
TABLA 13 Media de mínimos cuadrados (cm cúbicos) de reacciones en los sitios de inyección en perros a continuación de una vacunación contra Bordetella con una solución salina o con p68 (15 \mug/dosis) (después de la segunda vacunación^{a})
12
Las diferencias significativas en las mediciones realizadas en los sitios de inyección se recopilan en la Tabla 14. Una diferencia significativa en las mediciones realizadas en los sitios de inyección entre T02 (con solución salina SC) frente a T03 (con p68 15 \mug SC) se observó para los seis días a continuación de la primera vacunación. En el Día 7 y nuevamente en el Día 14 (la observación para evaluación renovada en dos semanas), no se observaron diferencias significativas entre ningún grupo de tratamiento.
Una diferencia significativa en las mediciones realizadas en los sitios de inyección entre T02 (con solución salina SC) frente a T03 (p68, 15 \mug de SC) se observó para los siete días a continuación de la segunda vacunación.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 14 Valores de significancia para contrastes a priori entre las medias de mínimos cuadrados de las mediciones de las reacciones en los sitios de inyección
13
Solamente se presentan los contrastes significativos (p < 0,05).
Títulos por ELISA de p68
Los datos de los ELISA de p68 se recopilan en la Tabla 15 y en la Figura 1. Debido al considerable título de la respuesta a p68 en los perros vacunados, se usaron diversos mínimos de titulación en diferentes puntos de tiempo durante el estudio. Las titulaciones para los Días 0 y 21 se comenzaron en 50. Para los Días 35, 45 y 59, las titulaciones se comenzaron en 200. Cualquier valor informado como "menor que" fue dividido por 2 antes del análisis. La subida incremental observada en los valores de los ELISA de p68 para los grupos testigos (T01 y T02) durante el curso del estudio, es debida a estos valores de titulancones mínimas. Los títulos de aglutinación permanecieron < 4.
Todos los animales vacunados con p68 demostraron un aumento por lo menos cuatro veces mayor en los títulos desde el primer día de vacunación hasta el día de estimulación (Día 0 frente a Día 45) cuando se compararon con animales vacunados con un placebo.
TABLA 15 Medias geométricas y errores típicos de títulos de punto final^{a} por ELISA de p68 (15 \mug/dosis) en perros a continuación de una vacunación con una solución salina o con p68 (15 \mug/dosis) y después de la estimulación por un aerosol con B. bronchiseptica
14
Las diferencias significativas para las medias de mínimos cuadrados de los títulos de ELISA después de la vacunación y después de la estimulación se enumeran en la Tabla 16. No se observó ninguna diferencia significativa entre los animales vacunados con p68 SC y con p68 IM, después de que se hubo completado la vacunación.
TABLA 16 Valores de significancia para contrastes a priori entre las medias de mínimos cuadrados de los títulos de punto final por ELISA de p68 después de la vacunación y después de la estimulación
15
Solo se presentan los contrastes significativos (p<0,05)
Títulos de Amiloide A de Suero
Los valores de SAA se determinaron en los Días 0, 1, 3, 5, 7 y 9 después de la estimulación. Los valores de Amiloide A de Suero se presentan en la Tabla 17 y se representan en la Figura 2.
TABLA 17 Medias geométricas y errores típicos de los títulos de Amiloide A de Suero en perros vacunados contra Bordetella con solución salina y con p68 (15 \mug/dosis) después de la estimulación por un aerosol con Bordetella bronchiseptica
16
Las diferencias significativas en los títulos de SAA se recopilan en la Tabla 18. Los testigos con solución salina demostraron títulos más altos de SAA que los perros vacunados en los Días 1, 3 y 5 después de la estimulación. Los testigos con solución salina SC continuaron demostrando títulos de SAA significativamente mayores cuando se compararon con perros vacunados SC en los Días 7 y 9 después de la estimulación.
TABLA 18 Valores de significancia para contrastes a priori entre las medias de mínimos cuadrados de los títulos de Amiloide A de Suero después de la estimulación
17 
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Observaciones de Tos
La estimulación por un aerosol para todos los grupos de tratamiento se realizó a los 24 días a continuación de la segunda vacunación (día 45). Las observaciones de tos se examinaron usando dos métodos - el del estado de la enfermedad basado en la tos en dos días consecutivos con tos (presentado en la Tabla 19) y el del porcentaje de días con tos (presentado en las Tablas 20 y 21). Cuando los perros se evaluaron usando criterios de tos durante dos días consecutivos, un 80% de los perros vacunados (SC e IM) con p68 tosieron por lo menos durante dos días consecutivos mientras que los perros vacunados con Solución Salina SC y con Solución Salina IM tosieron un 100% y 87,5% respectivamente. Cuando los perros se evaluaron usando el porcentaje de días en que se observó la tos, los perros vacunados con p68 SC e IM tosieron un 38,72% y 41,05% de los días observados, respectivamente. Los perros vacunados con Solución Salina SC y con Solución Salina IM tosieron 69,04% y 62,66% respectivamente.
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TABLA 19 Sumario de los estados de enfermedad en perros vacunados contra Bordetella con solución salina y con p68 (15 \mug/dosis) basándose en la tos durante dos días consecutivos después de estimulación por un aerosol con Bordetella bronchiseptica
18
No se demostró ninguna diferencia significativa entre los perros vacunados con solución salina y los perros vacunados con p68 cuando el estado de enfermedad estaba basado en la tos durante dos días consecutivos.
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TABLA 20 Porcentaje medio de días con tos en perros vacunados contra Bordetella con solución salina y con p68 (15 \mug/dosis) después de la estimulación por un aerosol con Bordetella bronchiseptica
19
Se demostró una diferencia significativa (p = 0,0112) entre T02 (con salina SC) y T03 (con p68 15 \mug SC). No se demostró ninguna diferencia significativa entre T01 (con salina IM) y T04 (con p68 15 \mug IM).
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TABLA 21 Porcentaje medio de días con tos por tratamiento en perros vacunados contra Bordetella con solución salina y con p68 (14 \mug/dosis) después de la estimulación por un aerosol con Bordetella bronchiseptica
20
Se demostró una diferencia significativa (p = 0,0022) entre los testigos con solución salina y los perros vacunados con p68.
Discusión
El estudio se diseño para demostrar la seguridad y la eficacia de una vacuna contra Bordetella con 15 \mug de p68/dosis en perros.
La seguridad se examinó usando observaciones de la temperatura en los sitios de inyección y de la temperatura rectal. El análisis de las mediciones de las reacciones en los sitios de inyección demostró una reacción despreciable en el grupo vacunado por IM y reacciones mínimas en el grupo vacunado por SC. Las reacciones que se observaron tendían a ser pequeñas, disminuyendo generalmente en magnitud durante los períodos de observación. La magnitud de estas reacciones quedaría con la máxima probabilidad sin observar en perros no afeitados. Aunque se observó una diferencia significativa entre los animales tratados con solución salina y los vacunados en el Día 21 y entre los vacunadoss por IM y por SC en el Día 24, las temperaturas rectales eran inobservables clínicamente y estaban dentro de los límites normales para todos los perros en todos los grupos.
La eficacia se examinó usando observaciones de las mediciones de los títulos de punto final por ELISA de p68 y de la tos. Independientemente de la vía de administración, se demostró una buena respuesta a anticuerpos p68 en los grupos vacunados con p68 en el Día 35. Una buena respuesta anamnésica se observó en los animales vacunados después de la estimulación. Aunque se han obtenido tradicionalmente mayores respuestas a los anticuerpos con la vía IM, más vascular y menos grasa, en comparación con la vía SC, la diferencia entre animales vacunados con p68 por SC e IM no era significativa durante el curso del estudio.
El examen de la respuesta a SAA en perros vacunados y no vacunados contra Bordetella con p68 después de la estimulación, indicó un aumento mucho menor en los valores de SAA en los grupos de animales vacunados, especialmente en los Días 1, 3 y 5 días después de la estimulación.
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Conclusiones
En este estudio, la eficacia de una vacuna contra Bordetella canina con 15 \mug de p68/dosis se examinó usando un modelo de estimulación canina a los 24 días después de la vacunación. La vacuna era segura, tal como se demostró por las temperaturas rectales normales, por las reacciones mínimas en los sitios de inyección, y la eficacia se demostró la eficacia en grupos de IM y SC combinados. La comparación de los valores de SAA demostró una diferencia significativa entre los perros vacunados con solución salina y con p68 en los Días 1, 3 y 5 después de la estimulación por un aerosol.
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Ejemplo 3 Duracion de seis meses del estudio de inmunidad de una vacuna con p68 procedente de Bordetella canina Animales
Se adquirieron noventa perros de razas mixtas, machos y hembras, y la mayoría de los cachorros tenían una edad de 9 semanas (\pm 1 semana) en el día de la primera vacunación.
Una vacuna contra parvovirus MLV se administró a perros después de la llegada al sitio de estudio. Para que fuesen elegibles para el estudio, se determinó que los animales eran negativos frente a B. bronchiseptica por medio de frotes traqueales y títulos de aglutinación. No se administraron vacunas, distintas de los productos experimentales, durante el estudio.
Los perros fueron mantenidos en una disposición de aislamiento necesaria para evitar la exposición a B. bronchiseptica y patógenos caninos antes de la estimulación. Después de la estimulación por un aerosol con B. bronchiseptica, se continuaron los procesos de aislamiento para evitar la exposición a otros patógenos caninos.
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Vacunas
Se usó una solución salina estéril como una vacuna placebo en grupos de tratamiento con T01 y T02. Una vacuna contra Bordetella bronchiseptica con p68 recombinante canino se usó en los grupos de tratamiento con T03 y T04. El gen estructural del antígeno de p68 se clonó en Escherichia coli y la expresión del gen se reguló por medio de un promotor sensible a las temperaturas. Las células fueron lisadas y los cuerpos de inclusión fueron separados por centrifugación. La p68 recominante en los cuerpos de inclusión se solubilizó mediante un tratamiento con SDS. Por separado, los 15 \mug de p68 y 60 \mug de p68 se combinaron con 50 \mug de Quil A y 50 \mug de colesterol por ml en solución salina Lepto estéril como diluyente. Los componentes combinados se mezclaron a 4ºC durante 24 horas y pasaron tres veces a través de un microfluidizador. Cada dosis de un ml contenía 2,7 \mul de etanol y 0,0001% de timerosal. Las concentraciones de p68 en las vacunas experimentales se midieron por un ELISA de p68. Todos los ensayos se realizaron en replicas de a cinco (5). Todas las vacunas se usaron dentro de los 6 meses desde su confección.
Inóculo de estimulación
Placas de agar de Bordet-Genou se sembraron con la cepa Bihr Cat de Bordetella bronchiseptica y se incubaron durante 48 horas a 37,5 \pm 2,5ºC. Las colonias virulentas en la fase I se seleccionaron y se extendieron en franjas sobre un agar de Bordet-Genou y se incubaron durante 24 horas a 37,5 \pm 2,5ºC. Después de la incubación, se usó una solución salina con Bordetella para separar las colonias por lavado fuera del agar y las células se diluyeron hasta alcanzar una densidad óptica de 0,80 a 600 nm. Un recuento de células antes y después de la estimulación para efectuar la confirmación de la lectura en el nefelómetro. La concentración diana de estimulación fue de aproximadamente 1 x 10^{9} CFU. Para el Grupo I, el recuento de la concentración antes de la estimulación fue de 1,94 x 10^{9} y el recuento de la concentración después de la estimulación fue de 1,43 x 10^{9}. Para el Grupo II, el recuento de la concentración antes de la estimulación fue de 2,55 x 10^{9} y el recuento de la concentración después de la estimulación fue de 2,13 x 10^{9}.
Diseño del Estudio TABLA SUMARIO
21
El estudio se realizó en dos fases o grupos que constaban de 48 perros en el Grupo I y de 42 perros en el Grupo II. La vacunación nº 1 se realizó en el Día 0 para cada grupo. La vacunación nº 2 se realizó 20 días más tarde. Los sucesos en el Grupo I estaban desfasados con respecto de los sucesos en el Grupo II por aproximadamente 15 días. Los perros se estimularon por un aerosol con B. bronchiseptica a los 181 días después de la última vacunación.
Distribución Aleatoria / Tratamiento a Ciegas
Los animales se asignaron aleatoriamente a tratamientos y habitaciones de acuerdo con un diseño completamente aleatorio.
Por el período de tiempo desde la vacunación nº 1 hasta el día de estimulación dentro de cada grupo de estudio, los animales se asignaron aleatoriamente a tratamientos y habitaciones (de 3 a 5 perros por habitación) usando un plan de distribución aleatoria.
En el día de la estimulación, los animales previamente tratados se distribuyeron aleatoriamente a habitaciones para estimulación dentro de un grupo de estudio, usando un diseño de bloques generalizados.
Individuos cualificados, desconocedores de los grupos de tratamiento asignados, realizaron ensayos microbiológicos y serológicos y comprobaciónes de tos y sitios de inyección.
Análisis de los Datos
Las variables de respuestas después de la vacunación constaban de datos de sitios de inyección, temperaturas rectales y títulos por ELISA de p68. Los datos de sitios de inyección se resumieron de la siguiente manera: 1) número de animales que tienen una reacción medible por tratamiento y día de estudio, 2) número de puntos de tiempo con animales que tienen una reacción medible por tratamiento, 3) número de animales que tienen una reacción medible en cualquier momento por tratamiento, 4) duración de una reacción medible para cada animal.
Por separado para las vacunaciones primera y segunda, los datos de volumen en los sitios de inyección (en cm cúbicos), de temperaturas rectales y de títulos por ELISA de p68 transformados a logaritmos naturales se analizaron usando un modelo mixto lineal general.
Se establecieron contrastes lineales a priori del tratamiento mediante las medias de mínimos cuadrados de los puntos de tiempo de observación para ensayar las diferencias entre grupos de tratamiento en cada punto de tiempo de observación y para comparar los puntos de tiempo dentro de cada tratamiento. Las comparaciones específicas de interés fueron de T01 frente a T03, de T01 frente a T05, de T03 frente T05, de T02 frente T04, de T02 frente a T06 y de T04 frente T06. Si el término de interacción entre puntos de tiempo por tratamiento por grupo de estudio era significativo a P < 0,05, los contrastes entre grupos de tratamiento en cada punto de tiempo y entre puntos de tiempo dentro de grupos de tratamiento estaban dentro de cada grupo de estudio, en caso contrario estos contrastes se basaron entre la media de mínimos cuadrados del efecto de interacción entre puntos de tiempo por tratamiento. El nivel de significancia de 5% se usó para todas las comparaciones.
Las variables de respuesta después de la estimulación consistían en los títulos por ELISA de p68, los títulos de Amiloide A de Suero y las observaciones de tos diaria. Los títulos por ELISA de p68 después de la estimulación se analizaron como antes se ha descrito. Para los datos del título de Amiloide A de Suero (SAA) después de la estimulación se aplicó una transformación a logaritmos naturales a los valores del título antes del análisis usando un modelo mixto lineal general.
El análisis de la tos se corrigió para reflejar los requisitos de la USDA. Para cada perro se calculó el porcentaje de períodos de tiempo de observación durante los cuales se observaba tos. Antes del análisis, el porcentaje se transformó usando la transformación a raíz cuadrada de arcsin. Se usó un modelo mixto lineal general para el análisis de la tos.
Las medias de mínimos cuadrados procedentes de estos análisis se transformaron de retorno en porcentajes y se calculó la reducción porcentual en tos como:
Reducción porcentual = 100 x \frac{\text{(media de grupos testigo - media de grupos de tratamiento)}}{\text{(media de grupos testigo)}}
Los contrastes lineales a priori de la media de mínimos cuadrados de tratamientos se establecieron para ensayar las diferencias entre grupos de tratamiento. Las comparaciones específicas de interés fueron de T01 frente a T03, de T01 frente a T05, de T03 frente T05, de T02 frente a T04, de T02 frente a T06 y de T04 frente T06. Si el término de interacción entre puntos de tiempo por tratamiento por grupo de estudio era significativo a P < 0,05, los contrastes entre grupos de tratamiento estaban dentro de cada grupo de estudio, en caso contrario los contrastes entre grupos de tratamiento se basaron entre la media de mínimos cuadrados del efecto principal de tratamiento. El nivel de significancia de 5% se usó para todas las comparaciones.
Proceso de Estudio Procesos Detallados con Animales
Antes de la llegada a las instalaciones de estudio y antes de la primera vacunación, los cachorros se sometieron a frotes traqueales para el cultivo de B. bronchiseptica y se recogió la sangre para determinar los títulos de aglutinación. Todos los animales eran negativos según los frotes traqueales y serológicamente negativos para Bordetella y se estimaron elegibles para el estudio. Cuarenta y ocho cachorros se asignaron aleatoriamente a uno de seis grupos de tratamiento para el Grupo I. El proceso se repitió usando cuarenta y dos perros para el Grupo II. Los animales se aclimataron al sitio del estudio durante por lo menos cinco días.
Los grupos y tratamientos se detallan en la Sección 7.4.A. Debido a las restricciones en las instalaciones y para aumentar la exactitud de las observaciones de tos durante la estimulación, los períodos de tiempo de vacunación y los respectivos períodos de tiempo de estimulación fueron escalonados por 15 días para generar los dos grupos de perros. El Día 0 se refiere al día de vacunación nº 1 tanto para el Grupo I como para el Grupo II. La vacunación nº 2 se realizó 20 días más tarde. Los tratamientos con T01, T03 y T05 se administraron por la vía subcutánea. Los tratamientos con T02, T04 y T06 se administraron por la vía intramuscular. Las inyecciones subcutáneas se administraron en la faz dorsolateral del cuello. Para la vacunación nº 1 se usó el lado derecho del cuello y para la vacunación nº 2 se usó el lado izquierdo del cuello. Se administraron inyecciones intramusculares en los músculos semimembranosos derecho e izquierdo para la vacunación nº 1 y la vacunación nº 2, respectivamente. Todos los sitios de inyección se midieron tridimensionalmente durante siete días después de cada vacunación, realizándose una medición de seguimiento a los 14 días después de la vacunación. Las temperaturas rectales se vigilaron en el día de la vacunación (antes de la vacunación) y durante tres días después de cada vacunación. Se recogió sangre antes de cada vacunación (en el Día -1 y el Día 19) y en el Día 50 para la determinación del título por ELISA de p68.
Cada mes, todos los perros se sometieron a frotes traqueales para el cultivo de B. bronchiseptica mediando sedación con el fin de confirmar el estado negativo en cuanto a B. bronchiseptica. Se recogió también sangre para la aglutinación y para los títulos de ELISA. El proceso se repitió 7 días antes de la estimulación para cada grupo. La evidencia de un cultivo de frote traqueal positivo o un título de aglutinación en aumento excluía al animal con respecto del estudio.
Una estimulación se administró a perros 181 días después de la vacunación nº 2. Perros sedados se estimularon usando un cono nasal desechable, que estaba acoplado apretadamente sobre el morro del perro sedado. El cono nasal se unió a un nebulizador que estaba unido a una bomba de presión en vacío ajustada a 5,5 hasta 6,0 psi (0,385 hasta 0,42 kg/cm^{2}). Se dispuso un ml de material de estimulación dentro del nebulizador y el material de estimulación convertido en aerosol se administró a cada perro durante 4 minutos.
Las observaciones de tos después de la estimulación se corrigieron antes de la estimulación con el fin de cumplir las recomendaciones de la USDA. Después de la estimulación, cada grupo de perros fue observado entre los días tercero y décimo después de la estimulación, durante un total de 8 días. Los animales fueron observados dos veces por día para determinar si tosían durante aproximadamente 45 minutos en cada período de observación. El intervalo entre los períodos en observación era de aproximadamente 12 horas. Un personal desconocedor de los grupos de tratamiento asignados registró las observaciones de tos.
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Recogida de Sangre
La sangre para los títulos de aglutinación se recogió antes de la primera vacunación, una vez por mes y antes de la estimulación para cada grupo.
La sangre para la evaluación por ELISA de anti-p68 se recogió el día antes de las vacunaciones nº 1 y nº 2 en el Día 50 y aproximadamente a intervalos de 30 días después de ello para cada grupo. Se recogió también sangre en el día de la estimulación y en el día final de la observación después de la estimulación.
La sangre para el ensayo de Amiloide A de Suero (SAA) se recogió en el día de la estimualción (antes de la estimulación) y en los días 1, 3, 5, 7 y 9 después de la estimulación para cada grupo.
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Ensayos Realizados con Muestras
Se evaluaron frotes traqueales para determinar la presencia de B. bronchiseptica por cultivo. Cada frote traqueal se extendió en franjas sobre una placa de agar selectivo para Bordetella. Se incluyen testigos positivos y negativos. Las placas fueron incubadas a 37,5 \pm 2,5ºC durante 48 \pm 4 horas. Las colonias resultantes en cada placa se compararon con el testigo positivo y cualquier colonia que apareció como idéntica al testigo positivo se ensayó adicionalmente para confirmar la presencia de B. bronchiseptica. El ensayo confirmatorio incluía el uso de TSI, Agar con Citrato y Urea y medios con Rojo de Nitrato.
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Los sueros se evaluaron en cuanto a los títulos de aglutinación, análisis por ELISA de p68 o análisis de SAA usando los siguientes métodos:
Títulos de aglutinación - Los sueros se diluyeron en serie en placas de microtitulación usando una solución salina con Bordetella. Se incluyeron en cada placa testigos positivos y negativos. Se usó la Cepa 87 de B. bronchiseptica (crecida sobre un agar de Bordet Genou, cosechada, inactivada y diluida a 20% de T a 630 nm) como el antígeno aglutinante y se añadió a cada pocillo. Las placas se sacudieron e incubaron a 35 \pm 2ºC durante 2 horas. Se leyeron las placas después de una segunda incubación a la temperatura ambiente durante 22 horas. El título de punto final se determinó usando el último pocillo que mostraba una aglutinación de 50%.
Títulos por ELISA de p68 - El antígeno de p68 recombinante se capturó en una placa de microtitulación con 96 pocillos, revestida con un antisuero policlonal específico para el antígeno de p68 procedente de Bordetella. Diluciones en serie de razón doble del suero canino se añadieron a la placa y se incubaron. Los testigos positivos y negativos en una dilución de 1:1.000 se incluyeron en cada placa. Un conjugado de indicador y de IgG de cabra anti-perro, purificado por afinidad y marcado con peroxidasa se usó para detectar anticuerpos específicos para el antígeno de p68. Se añadió luego un substrato cromogénico ABTS y la placa se leyó cuando los pocillos con testigos positivos tenían una densidad óptica D.O. de 1,2 \pm 0,2. El título de una muestra dada se calculó como el valor recíproco de la última dilución con una densidad óptica mayor que la media de la dilución de un suero testigo negativo más cinco desviaciones típicas.
Títulos de SAA - El Amiloide A de Suero canino se capturó en una placa de micotitulación revestida con un anticuerpo monoclonal anti-SAA canino. Muestras diluidas del suero canino se añadieron a la placa y se incubaron. Se añadió un patrón de referencia para obtener una curva patrón desde 0,31 ng/ml hasta 20 ng/ml. Se añadió un conjugado de anticuerpo anti-canino marcado con biotina. Después de la incubación del anticuerpo anti-canino marcado con biotina, se añadió estreptavidina conjugada con peroxidasa. Se añadió un substrato cromogénico TMB y la placa se leyó después de 30 minutos. La concentración de Amiloide A de Suero se determinó por comparación de la muestra con la curva patrón y multiplicación por el apropiado factor de dilución.
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Resultados
A menos que se señalase de otro modo distinto, los resultados son los datos combinados de los Grupos I y II.
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Cultivo de Frote Traqueal y Títulos de Aglutinación
Los cultivos de frotes traqueales positivos y/o los títulos de aglutinación en aumento se demostraron en once perros durante el curso del estudio. Estos perros y cualquier perro alojado junto con los testigos positivos se sacaron del estudio, dando como resultado una pérdida de 20 perros. El número de perros sacados de cada grupo fue: 4 perros con T01, 2 perros con T02, 3 perros con T03, 1 perro con T04, 5 perros con T05 y 5 perros con T06.
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Observaciones en los Sitios de Inyección
Las reacciones en los sitios de inyección se recopilan en las Tablas 22-25. La información acerca de los sitios de inyección no se recogió para el perro 81595 en el Día 21 para el Grupo I debido a un descuido técnico. El protocolo se corrigió de manera tal que los datos acerca de reacciones en los sitios de inyección no se recogieron para los perros del Grupo II en el Día 22, y por lo tanto el sumario de datos acerca del Día 22 contiene solamente información acerca de los ocho perros por grupo de tratamiento en el Grupo I. No se observaron reacciones en los sitios de inyección para ningún perro que recibía un tratamiento IM. Las mediciones en los sitios de inyección eran mínimas para ambos grupos de tratamiento vacunados por SC (T03 y T05).
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TABLA 22 Media de mínimos cuadrados (en cm cúbicos) de reacciones en sitios de inyección en perros a continuación de una vacunación contra Bordetella con solución salina o con p68 (después de la primera vacunación^{a})
22
TABLA 23 Media de mínimos cuadrados (en cm cúbicos) de reacciones en sitios de inyección en perros a continuación de una vacunación contra Bordetella con solución salina o con p68 (después de la segunda vacunación^{a})
23 
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TABLA 24 Porcentaje de perros que tienen una reacción medible en los sitios de inyección después de vacunación contra Bordetella con solución salina o con p68 (después de la primera vacunación^{a})
24
TABLA 25 Porcentaje de perros que tienen una reacción medible en los sitios de inyección después de vacunación contra Bordetella con solución salina o con p68 (después de la segunda vacunación^{a})
25
Las diferencias significativas en las mediciones en los sitios de inyección se recopilan en la Tabla 26. Una diferencia significativa en las mediciones en los sitios de inyección entre T01 (con solución salina SC) frente a T03 (con 60 \mug SC) se observó durante siete días después de la primera vacunación. Una diferencia significativa entre T01 (con solución salina SC) y T05 (con 15 \mug SC) se observó solamente durante los primeros cuatro días después de la primera vacunación. Se encontró una diferencia significativa entre T03 (60 \mug de SC) y T05 (15 \mug SC) en los Días 3 hasta 7. En el Día 14 (la observación de evaluación renovada a las dos semanas) no se observó ninguna diferencia entre ninguno de los grupos.
Una diferencia significativa (P = 0,0138) en las mediciones en los sitios de inyección entre T01 (con solución salina SC) frente a T03 (con 60 \mug SC) y T05 (con 15 \mug SC) se observó durante siete días después de la segunda vacunación. Se encontró una diferencia significativa entre T03 (con 60 \mug SC) y T05 (con 15 \mug SC) en los días 23 a 27. En el Día 37 (la observación de evaluación renovada durante dos semanas) no se observó ninguna diferencia entre ninguno de los grupos.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 26 Valores de significancia para contrastes a priori entre las medias de mínimos cuadrados de mediciones de las reacciones en los sitios de inyección
26 
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Temperatura Rectal
Las mediciones de las temperaturas rectales se recopilan en las Tablas 27 y 28. El protocolo se corrigió de tal manera que no se recogieron datos de temperatura rectal para los perros del Grupo II en el día 22, por lo tanto el sumario de datos del Día 22 contiene solamente información procedente de los perros por grupo de tratamiento en el grupo I.
TABLA 27 Media de mínimos cuadrados de las temperaturas rectales (ºC) en perros a continuación de una vacunación contra Bordetella con solución salina o con p68 (después de la primera vacunación^{a})
27 
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TABLA 28 Media de mínimos cuadrados de las temperaturas rectales (ºC) en perros a continuación de una vacunación contra Bordetella con solución salina o con p68 (después de la segunda vacunación^{a})
28
Se observó una diferencia significativa en las temperaturas rectales entre T02 (con solución salina IM) y T04 (con 60 \mug IM) en el Día 1 después de la primera vacunación. No se encontró ninguna diferencia significativa en las temperaturas rectales entre ningún grupo en ningún día después de la segunda vacunación.
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Títulos por ELISA de p68
Los datos obtenidos por ELISA de p68 antes de la estimulación se recopilan en la Tabla 29. Debido a la respuesta de los perros del Grupo I en T06 en el Día 19, se observó un efecto debido al grupo en el análisis de los datos de los títulos por ELISA de p68. El efecto era pequeño y no influía sobre otros puntos de tiempo analizados. Por lo tanto, los datos procedentes de los Grupos I y II se combinan para finalidades de informe.
Debido al considerable título de la respuesta a p68 en los perros vacunados, se usaron diversos mínimos de titulación en diferentes puntos de tiempo en el estudio. Las titulaciones para los Días -1 y 19 se comenzaron en 50. Para los Días 50 hasta 195, las titulaciones se comenzaron en 200. Las titulaciones para las muestras recogidas en los Días 201 y 211 se comenzaron en 1.000. Cualquier valor informado como "menor que" fue dividido por 2 antes del análisis. La subida incremental observada en los valores obtenidos por ELISA de p68 para los grupos testigo (T01 y T02) durante el curso del estudio es debida a estos valores mínimos de titulación. Los títulos de aglutinación, excepto cuando se señala con anterioridad, permanecieron < 4.
Todos los perros vacunados con un placebo tenían unos títulos de p68 < 200 en el Día 50. Todos los animales vacunados con p68 demostraron un aumento por lo menos cuatro veces mayor en los títulos después de la segunda vacunación (Día 0 frente al Día 50) cuando se compararon con los animales vacunados con un placebo.
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TABLA 29 Media geométrica y errores típicos de los títulos de punto final por ELISA con p68 en perros a continuación de una vacunación contra Bordetella con p68 en el Día 0 y en el Día 20
29
Las diferencias significativas para la media por mínimos cuadrados de los títulos de ELISA después de la vacunación se enumeran en la Tabla 30. No se observó ninguna diferencia significativa en los títulos por ELISA de p68 entre los testigos SC y los vacunados SC o los testigos IM y los vacunados IM antes de la vacunación (en el Día -1).
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TABLA 30 Valores de significancia para contrastes a priori entre la media de mínimos cuadrados de los títulos de puntos finales por ELISA de p68 después de una vacunación
50
Los títulos por ELISA de p68 medidos durante el curso del estudio se recopilan en la Tabla 31 y se ilustran en la Figura 3.
Durante el curso del estudio se realizaron todos los intentos de coordinar las actividades entre los Grupos I y II. Para los puntos de tiempo pivotantes de recogida de datos (es decir, sucesos que rodean a la vacunación y a la estimulación), esto se consiguió. En tres casos durante el período de tiempo intermedio del estudio, la recogida de sangre y de frotes traqueales variaba en 1 ó 2 días entre grupos. Con el fin de recopilar los datos por ELISA de p68, e informar sobre ellos, para este período de tiempo intermedio, se combinaron los datos procedentes de estos días. Por lo tanto, el Día 79 contiene datos combinados procedentes del Día 79 (Grupo I) y del Día 81 (Grupo II). El Día 111 corresponde al Día 110 (Grupo II) y al Día 111 (Grupo I) y el Día 169 corresponde al Día 169 (Grupo II) y al Día 170 (Grupo I). Según el protocolo, no se llevaron a cabo análisis de datos en el caso de los datos por ELISA de p68 más allá del Día 50.
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TABLA 31 Sumario de las medias geométricas de los títulos de punto final por ELISA de p68 en perros no vacunados y en perros vacunados contra Bordetella con p68 después de la vacunación y de la estimulación por un aerosol con Bordetella bronchiseptica
51 
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Observaciones de Tos
La estimulación por un aerosol para ambos grupos se realizó a los 181 días a continuación de la segunda vacunación. Para cumplir con las recomendaciones de la USDA, los criterios de tos se corrigieron a observaciones durante aproximadamente 45 minutos, aproximadamente con un intervalo de doce horas en los días tercero hasta octavo después de la estimulación. Las observaciones de tos están recopiladas en las Tablas 32 y 33.
TABLA 32 Porcentaje medio de puntos de tiempo con tos en perros sin vacunar y perros vacunados contra Bordetella con p68 después de la estimulación por un aerosol con Bordetella bronchiseptica
52
TABLA 33 Porcentaje medio de puntos de tiempo con tos por tratamiento en perros sin vacunar y perros vacunados contra Bordetella con p68 después de la estimulación por un aerosol con Bordetella bronchiseptica
53
La reducción porcentual en perros que tosen cuando se comparaban con el testigo salino era de 51,55% para los grupos con 15 \mug/dosis y de 11,09% para los grupos con 60 \mug/dosis. Las diferencias significativas estadísticamente se recopilan en la Tabla 34.
TABLA 34 Valores de significancias para constrastes a priori entre las medias de mínimos cuadrados para el porcentaje de puntos de tiempo con tos
54
Amiloide A de Suero
Los valores de SAA se determinaron en los Días 0, 1, 3, 5, 7 y 9 a continuación de la estimulación. Los valores de Amiloide A de Suero se presentan en la Tabla 35 y se representan en la Figura 4.
TABLA 35 Medias geométricas y errores típicos de los títulos de Amiloide A de Suero en perros sin vacunar y perros vacunados contra Bordetella con p68 después de la estimulación por un aerosol con Bordetella bronchiseptica
55
Las diferencias significativas en los títulos de SAA se recopilan en la Tabla 36.
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TABLA 36 Valores de significancia para contrastes a priori entre las medias de mínimos cuadrados de títulos de Amiloide A de Suero después de la estimulación
56
Discusión
El estudio se diseñó para demostrar la seguridad y la eficacia a los seis meses de una vacuna contra Bordetella con p68 recombinante en perros. Se demostró la seguridad tanto con la vacuna de 15 \mug/dosis como con la vacuna de 60 \mug/dosis. La eficacia y la duración de 6 meses de la inmunidad de los 15 \mug/dosis estaban bien justificadas en el estudio.
La seguridad se examinó usando observaciones en los sitios de inyección y de las temperaturas rectales. El análisis de las mediciones de las reacciones en los sitios de inyección demostró que no había reacciones en los grupos vacunados IM y había reacciones mínimas en los grupos vacunados tanto con 15 \mug/dosis como con 60 \mug/dosis. Las reacciones que se observaron tendían a ser más pequeñas en los perros vacunados SC con 15 \mug/dosis. Dichas reacciones que se observaron eran transitorias, disipándose generalmente en 14 días o menos. La magnitud de estas reacciones quedaría lo más probablemente sin observar en perros en los que los sitios de inyección no habían sido afeitados. Las temperaturas rectales después de la vacunación eran inobservables y se encontraban dentro de los límites normales para todos los perros en todos los grupos.
La eficacia y la duración de la inmunidad se examinaron a los 181 días a partir de la vacunación usando observaciones de tos y la medición de títulos de punto final por ELISA de p68. El porcentaje de animales que tosían en los testigos salinos (78,26%) indicó que la estimulación administrada a los animales en estudio era aceptable. El porcentaje de puntos de tiempo con tos para el grupo con 15 \mug/dosis (37,92%) demostró una reducción de 51,55% en animales que tosían en comparación con los testigos, satisfaciendo los requisitos de eficacia establecidos por la USDA. No se demostró ninguna protección en el grupo con 60 \mug/dosis (69,58%) demostrando los perros una reducción mínima en la tos cuando se compararon con los testigos.
Aunque no se compararon estadísticamente, se observó a partir de las Tablas 29 y 31 que los vacunados SC tendían a tener más altas respuestas de anticuerpos cuando se compararon con los vacunados IM. Para las finalidades de la discusión, los comentarios adicionales concernientes a los grupos de dosis diferentes combinan los resultados de las vías IM y SC de administración.
Independientemente de la vía de administración, se demostró una excelente respuesta a anticuerpos de p68 en ambos grupos vacunados en el Día 50 y se mantuvo por los vacunados a lo largo del curso del estudio. Una buena respuesta anamnésica se observó en los vacunados después de la estimulación.
La comparación de los títulos por ELISA de p68 de los grupos con 15 \mug/dosis y con 60 \mug/dosis durante el curso del estudio indicó que el grupo con 60 \mug/dosis mostró una respuesta ligeramente más alta a los títulos (Figura 3). Esta respuesta, aunque excelente, no se correlaciona con la protección después de la estimulación por un aerosol. Las respuestas a títulos por ELISA de p68 eran variables en perros que se apartaron del estudio con frotes traqueales positivos o con títulos de aglutinación en aumento. Tres de los seis testigos apartados del estudio con cultivos de frotes traqueales positivos y/o títulos de aglutinación en aumento mantuvieron unos títulos por ELISA de p68 de < 200. No parece que hay ninguna correlación de los títulos por ELISA de p68 con el estado de frotes traqueales o títulos de aglutinación de los perros apartados del estudio.
El examen de la respuesta a SAA en perros vacunados contra Bordetella con p68 y no vacunados después de la estimulación indicó un aumento mucho menor en los valores de SAA en los grupos con 15 \mug/dosis especialmente en los días 5 y 7 después de la estimulación.
Conclusiones
En este estudio, se examinó la eficacia en las dosis de 15 \mug/dosis y de 60 \mug/dosis de una vacuna contra Bordetella canina con p68 usando un modelo de estimulación de perros a los 6 meses después de la vacunación. Ambas vacunas eran seguras, como se demostraba por la temperatura rectal normal y las reacciones mínimas en los sitios de inyección. Aunque los perros vacunados tanto con 15 \mug/dosis como con 60 \mug/dosis mostraron una buena respuesta serológica a la vacunación, tal como se midió por los títulos por ELISA de p68, la respuesta no se correlaciona con una protección clínica en los perros vacunados con 60 \mug/dosis. Los perros vacunados con 60 \mug/dosis no demostraron ninguna diferencia significativa en tos cuando se compararon con los testigos no vacunados. Se demostró una buena eficacia de la vacuna con 15 \mug/dosis por una reducción mayor que 50% en animales con tos cuando se compararon con los testigos. Se postula que unos niveles aumentados de SDS en la vacuna con 60 \mug/dosis pueden dar como resultado la diferencia demostrada en cuanto a protección. La comparación de los valores de SAA demostró una diferencia entre vacunados y testigos.
Ejemplo 4 Seguridad y Eficacia de VANGUARD® Plus 5/CV-L
La VANGUARD® Plus 5/CV-L es una preparación liofilizada de cepas atenuadas de virus de CD, CAV-2, virus de CPI, CPV y cultivos enteros inactivados de L. canicola y L. icterohaemorrhagiae, más una preparación líquida de CCV inactivados con un adyuvante. Todos los virus fueron propagados en linajes celulares establecidos y consagrados. La fracción de CPV fue atenuada por pasada baja en el linaje de células caninas que le dio las propiedades inmunológicas capaces de contrarrestar la interferencia de anticuerpos maternales en los niveles indicados en la Tabla 38. El componente líquido se usó para volver a hidratar el componente liofilizado, que se había envasado con un gas inerte en lugar de en vacío.
La evaluación en el laboratorio demostró que la VANGUARD® Plus 5/CV-L inmunizaba a perros contra CD, ICH, una enfermedad respiratoria debida a CAV-2 y CPI, una enteritis causada por CCV y CPV y una leptospirosis causada por L. canicola y L. icterohaemorrhagiae, y que no existía ninguna diferencia inmunológica entre las fracciones de vacunas. Extensas pruebas de seguridad en el campo mostraron que éstas eran seguras y estaban esencialmente libres de reacciones en perros tan jóvenes como con una edad de 6 semanas en condiciones de uso normal.
Se demostró también que la vacuna con CAV-2 protege de modo cruzado contra ICH causada por CAV-1. Los estudios demostraron que los CAV-2 no solamente protegen frente a ICH sino también asimismo frente a una enfermedad respiratoria causada por CAV-2. El virus de estimulación por adenovirus canino del tipo 2 no fue recuperado de los perros vacunados con CAV-2 en los ensayos realizados.
La fracción de CPV en VANGUARD® Plus 5/CV-L se sometió a ensayos comprensivos de seguridad y eficacia. Se mostró que ésta era segura y estaba esencialmente libre de reacciones en ensayos de laboratorio y en pruebas clínicas en condiciones de campo. La seguridad del producto se demostró adicionalmente por un estudio de retropasada que incluía la administración por vía oral de múltiples dosis de la cepa de vacuna a perros susceptibles, la totalidad de los cuales permanecieron normales.
La investigación demostró que 3 dosis de la vacuna con un título aumentado de virus de CPV puede superar los títulos de neutralización de suero (SN, de Serum Neutralization) asociados con un anticuerpo maternal. Se mostró por otros autores que unos títulos de neutralización de suero tan bajos como el de 1:4 interfieren con una inmunización activa usando vacunas vivas modificadas convencionales. Se realizó una prueba clínica con cincuenta cachorros con una edad de 6 semanas [25 vacunados (intervalo de títulos de SN -256) y 25 testigos no vacunados (intervalo de títulos de SN 4-1.024)] (Tabla 37). El grupo de vacunados recibió 3 dosis, siendo administradas las vacunaciones con una separación de 3 semanas comenzando con una edad de 6 semanas. Después de 1 vacunación, 13 de 25 cachorros exhibieron un aumento 4 veces mayor en el título de SN por CPV (seroconversión) (Tabla 38). Doce de estos 13 cachorros tenían títulos de SN maternales \leq 1:16 en el momento de la primera vacunación teniendo el cachorro remanente un título de SN de 1:64. Otros 9 cachorros con títulos de SN iniciales comprendidos entre 1:16 y 1:256 fueron seroconvertidos después de la segunda vacunación. Sus títulos de SN por anticuerpos maternales habían disminuido hasta \leq 1:64 en el momento de la segunda vacunación. Similarmente, los últimos 3 vacunados con títulos de SN iniciales de 1:128, fueron seronconvertidos después de la tercera vacunación, después de que su título de CPV de anticuerpos maternales hubiera descendido a \leq1:64. Por lo tanto, en este estudio, cuando se administraron 3 dosis de vacuna comenzando a las 6 semanas de edad, todos los 25 vacunados, incluso los que tenían los más altos niveles de anticuerpos maternales, resultaron inmunizados activamente (GM = 1:1.176; intervalo de títulos de SN 128-4.096). La totalidad de los 50 perros fueron estimulados 3 semanas después de la tercera vacunación con un virus de estimulación de CPV heterólogo. Catorce de 25 perros testigos no vacunados murieron o mostraron una enfermedad lo suficientemente grave para justificar una eutanasia, mientras que todos los 25 vacunados permanecieron esencialmente sanos. El virus de vacuna con baja pasada y de alto título existente en VANGUARD® Plus 5/CV-L era por lo tanto altamente inmunogénico y capaz de estimular una inmunidad activa en la presencia de anticuerpos maternales.
La eficacia de la fracción de CCV de VANGUARD® Plus 5/CV-L se demostró en un extenso estudio de estimulación y vacunación. Dieciséis cachorros con una edad de 7 a 8 semanas fueron vacunados con VANGUARD® Plus 5/CV-L (vacunados) y 17 fueron vacunados con VANGUARD® Plus 5/CV-L (testigos). Todos los cachorros recibieron tres dosis de 1 ml a intervalos de 3 semanas. A las tres semanas a continuación de la tercera vacunación, los cachorros fueron estimulados con una cepa virulenta de CCV (CV-6). Las observaciones clínicas, las temperaturas, los pesos y los parámetros de sangre se vigilaron durante 21 días a continuación de la infección. Los vacunados contra CCV demostraron una reducción en la aparición de diarreas y la cantidad de CCV virulentos que se esparcieron cuando se compararon con los testigos. A los 21 días después de la estimulación, una tinción fluorescente para anticuerpos de CCV virulentos de pequeñas secciones intestinales demostró una reducción significativa (P) en cuanto a antígenos detectables de CCV entre los vacunados contra CCV y los testigos (Tabla 39).
TABLA 37 Títulos iniciales de neutralización de suero (SN) de perros vacunados y testigos
57 
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TABLA 38 Media geométrica (intervalo)^{a} de títulos de neutralización de suero (SN) después de la vacunación
58
TABLA 39 Tinción fluorescente de anticuerpos de pequeñas secciones intestinales a los 21 días después de la estimulación
59
Conclusiones
En este estudio, se mostró que una vacuna en combinación a la que se habían añadido adyuvantes, que contenía virus de CD, CAV-2, virus de CPI, CPV y cultivos enteros inactivados de L.canicola y L. icterohaemorrhagiae y CCV, era a la vez segura y eficaz como vacuna cuando se usó en cachorros. Se mostró también que la vacuna en combinación superaba los títulos de neutralización de suero (SN) asociados con un anticuerpo maternal.
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Ejemplo 5 Estudio de inmunogenicidad de p68 nativo procedente de Bordetella canina Animales
El estudio incluía dos camadas de perros beagle SPF y dos camadas de perros de orígenes aleatorios. Los perros se asignaron aleatoriamente a grupos vacunados o no vacunados. El estudio incluía un total de 10 perros vacunados y de 11 perros no vacunados.
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Preparación de una Vacuna Experimental
Se recogió B. bronchiseptica (cepa 110H) a partir de placas diseminadas de agar con sangre de Bordet-Genou a las 48 horas lavando la superficie de las placas con 5 a 10 ml de un tampón de extracción por calor. Alternativamente, las células que crecieron en ambos cultivos (Medio Definido de Charlote Parker) se cosecharon por centrifugación, desechando la fracción sobrenadante. Las células cosechadas se suspendieron en 25 mM de Tris-HCl, de pH 8,8, y se incubaron a 60ºC durante 1 hora. Los desechos celulares se separaron del extracto por calor mediante centrifugación a 20.000 x g a 4ºC durante 30 minutos. Se añadió aziduro de sodio (0,01%) a la fracción sobrenadante extraída por calor, que luego se clarificó adicionalmente mediante filtración en microporos.
Una resina de afinidad con anticuerpos monoclonales se preparó por conjugación de un anticuerpo monoclonal (designado como Bord 2-7) con Sepharose 4B activado por CNBr usando procesos clásicos. Aproximadamente 30,35 mg del anticuerpo monoclonal se conjugaron con 1 gramo de resina de afinidad. La fracción sobrenadante extraída por calor y clarificada (anterior) y la resina de afinidad con Bord 2-7 se combinaron en una relación aproximada de 1 litro de extracto por 20 ml de resina.
La fijación de la p68 nativa a la resina fue facilitada incubando la mezcla a la temperatura ambiente, con suave sacudimiento durante una noche, seguido por sedimentación de la resina y aspiración de la fracción sobrenadante. Luego la resina se empaquetó dentro de una columna con un diámetro de 2,6 cm, y la columna se lavó consecutivamente con PBS (de Phosphate Buffered Saline = solución salina tamponada con fosfato), de pH 7,5, y con 10 mM de un tampón de fosfato, de pH 8,0, a un caudal de 5 ml/min. Cuando la absorbencia a 280 nm alcanzó un nivel de línea de base, el material fijado fue eluido usando 100 mM de trietilamina, y las fracciones situadas por debajo del único pico grande de absorbencia a 280 nm se recogieron y se ensayaron en cuanto a la presencia de p68 mediante un ELISA. Las fracciones que contenían p68 se agruparon y dializaron frente a PBS para eliminar la trietilamina.
Una vacuna experimental formulada en serie se formuló para que contuviese aproximadamente 100 microgramos de p68 purificado y 1% de gel de hidróxido de aluminio. Se usó formalina (al 0,01%) como agente conservante en un volumen de dosis final de vacuna de 1 ml.
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Inóculo de Estimulación
El material de estimulación se preparó esencialmente tal como se ha descrito en los ejemplos anteriores.
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Proceso del Estudio
Veintiuno (21) cachorros seronegativos y negativos en cultivo se asignaron aleatoriamente a uno de dos grupos de tratamiento. Once perros se asignaron al grupo testigo no vacunado y diez perros se asignaron al grupo vacunado. El Día 0 se designó como el día de la primera vacunación. Se administró 1 ml de vacuna por vía subcutánea en el Día 0 y se repitió 21 días más tarde. Se recogió la sangre para realizar un ELISA serológico de p68 antes de las vacunaciones primera y segunda.
En el Día 35, catorce días después de la segunda vacunación, se administró una estimulación por un aerosol de B. bronchiseptica a todos los perros, tal como se describe anteriormente. Los animales se vigilaron en cuanto a tos durante 14 días después de la estimulación, tal como se describe en los ejemplos anteriores.
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Resultados
El sumario de las observaciones clínicas y las respuestas serológicas a p68 se presenta en la Tabla 40.
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TABLA 40 Sumario de observaciones clínicas y respuestas serológicas
60 
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Discusión
En este estudio, 10 de 10 perros testigos tosieron en por lo menos dos días consecutivos. Se considera que un perro es clínicamente enfermo si tose durante dos días consecutivos. Según este criterio, un 100% de los perros testigos no vacunados estaban enfermos. En el grupo de vacunados, un perro tosía en el Día 4 después de la estimulación y un perro tosía en los Días 4 y 6 después de la estimulación. Dos perros tosían en el Día 14. Ninguno de los perros vacunados tosía durante dos días consecutivos. Por lo tanto, se estimo que un 100% de los perros en el grupo vacunado con p68 nativo permanecían normales después de la estimulación.
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Conclusiones
Esta prueba demuestra la capacidad de una vacuna con p68 nativo para proteger frente a una enfermedad causada por B. bronchiseptica.
<110> Dominowski, Paul J.
\hskip1.05cmFrantz, Joseph C.
\hskip1.05cmKrebs, Richard L.
\hskip1.05cmShields, Shelly L.
\hskip1.05cmSorensen, Robert G.
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<120> VACUNAS CANINAS CONTRA BORDETELLA BRONCHISEPTICA 
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<130> 16112 (PC25496A)
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<140> 60/443,418
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<141> 2003-01-29
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<160> 3
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<170> PatentIn versión 3.2
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<210> 1
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<211> 602
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<212> PRT
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<213> Bordetella bronchiseptica 
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<400> 1
61
62
63 
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<210> 2
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<211> 1806
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<212> ADN
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<213> Bordetella bronchiseptica 
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<400> 2
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64
65 
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<210> 3
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<211> 599
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<212> PRT
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<213> Bordetella bronchiseptica 
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<400> 3
66
67
68
69

Claims (14)

1. Uso de un antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica y de un adyuvante para la producción de una composición de vacuna para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o de un trastorno en perros, que se ha causado por infección con Bordetella bronchiseptica.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 1, y se produce por vía recombinante.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho adyuvante comprende Quil A y colesterol.
4. Una vacuna en combinación para inmunizar a perros contra patógenos caninos, que comprende una preparación de una cepa atenuada de virus del moquillo canino (CD), una cepa atenuada de adenovirus caninos del tipo 2 (CAV-2), una cepa atenuada de virus de parainfluenza canina (CPI) y una cepa atenuada de parvovirus caninos (CPV); una preparación de células enteras o parciales inactivadas de una cepa de coronavirus caninos (CCV), una proteína p68 procedente de Bordetella bronchiseptica, y un adyuvante.
5. La vacuna en combinación de la reivindicación 4, en la que dicho antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 1, y se produce por vía recombinante.
6. La vacuna en combinación de la reivindicación 4, en la que dicho adyuvante comprende Quil A y colesterol.
7. Una vacuna en combinación para inmunizar a perros contra patógenos caninos, que comprende una preparación de una cepa atenuada de virus del moquillo canino (CD), una cepa atenuada de adenovirus caninos del tipo 2 (CAV-2), una cepa atenuada de virus de parainfluenza canina (CPI) y una cepa atenuada de parvovirus canino (CPV), una preparación de células enteras o parciales inactivadas de una cepa de coronavirus caninos (CCV); una proteína p68 procedente de Bordetella bronchiseptica, una preparación de células de Leptospira depor lo menos una especie de Leptospira seleccionada entre el grupo que consta de Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterhaemorrhagiae y Leptospira pomona; y un adyuvante.
8. La vacuna en combinación de la reivindicación 7, en la que dicha preparación de células de Leptospira comprende una preparación de células de Leptospira Bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterhaemorrhagiae y Leptospira pomona.
9. La vacuna en combinación de la reivindicación 7, en la que dicho antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 1, y se produce por vía recombinante.
10. La vacuna en combinación de la reivindicación 7, en la que dicho adyuvante comprende Quil A y colesterol.
11. Una vacuna en combinación para inmunizar a perros contra patógenos caninos, que comprende una preparación de una cepa atenuada de virus del moquillo canino (CD), una cepa atenuada de adenovirus caninos del tipo 2 (CAV-2), una cepa atenuada de virus de la parainfluenza canina (CPI) y una cepa atenuada de parvovirus canino (CPV); una proteína p68 procedente de Bordetella bronchiseptica, una bacterina de Leptospira que comprende una preparación de células de por lo menos una especie de Leptospira seleccionada entre el grupo que consta de Leptospira Bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterhaemorrhagiae y Leptospira pomona; y un adyuvante.
12. La vacuna en combinación de la reivindicación 11, en la que dicha bacterina de Leptospira comprende una preparación de células de Leptospira Bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterhaemorrhagiae y Leptospira pomona.
13. La vacuna en combinación de la reivindicación 11, en la que dicho antígeno de p68 procedente de Bordetella bronchiseptica comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 1, y se produce por vía recombinante.
14. La vacuna en combinación de la reivindicación 11, en la que dicho adyuvante comprende Quil A y colesterol.
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