ES2370750T3 - Vacunas multivalentes caninas contra leptospira bratislava y otros patógenos. - Google Patents

Vacunas multivalentes caninas contra leptospira bratislava y otros patógenos. Download PDF

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Abstract

Una composición de vacuna para usar en la inmunización de perros contra la infección causada por Leptospira bratislava, que comprende una preparación celular de Leptospira de Leptospira bratislava y un vehículo.

Description

Vacunas multivalentes caninas contra Leptospira bratislava y otros pat6genos
Campo de la invención
La presente invenci6n se refiere a vacunas que contienen Leptospira bratislava y al uso de las mismas para proteger a los perros contra infecciones causadas por Leptospira bratislava. La presente invenci6n tambien se refiere a vacunas de combinaci6n que contienen Leptospira bratislava y uno o mas antigenos de otro pat6geno canino, tal como el virus del moquillo canino (CD), el adenovirus canino de tipo 2 (CAV-2), el virus de la parainfluenza canina (CPI), el coronavirus canino (CCV), el parvovirus canino (CPV), Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae o Leptospira pomona. La presente invenci6n se refiere adicionalmente a u na combinaci6n de vacunas de dichos antigenos sin Leptospira Bratislava. Tambien se proporcionan procedimientos para proteger a los perros contra enfermedades producidas por pat6genos caninos usando las vacunas de combinaci6n.
Antecedentes de la invención
El actual producto de vacuna canina contra Bordetella bronchiseptica disponible comercialmente esta compuesto por una bacterina de celulas enteras de Bordetella bronchiseptica inactivada no adyuvada. Dicha bacterina de celulas enteras puede producir reacciones posvacunaci6n relacionadas con las proteinas celulares. La proteina p68 de B. bronchiseptica es antigenicamente similar a la proteina de membrana externa (PME) de B. pertussis y a la PME de
B. parapertussis (Shahin y col., "Characterization of the Protective Capacity and Immunogenicity of the 69-kD 0uter Membrane Protein of Bordetella pertussis", J. Exp. Med., 171: 63-73, 1990). Se ha demostrado una funci6n protectora de esta PME para ratones (Shahin y col., supra; Novotny y col., "Biologic and Protective Properties of the 69-kD 0uter Membrane Protein of Bordetella pertussis: A Novel Formulation for a Acellular Pertussis vaccine", J. Infect. Dis. 164:114-22, 1991), seres humanos (He y col., "Protective Role of Immunoglobulin G Antibodies to Filamentous Hemagglutinin and Pertactin of Bordetella pertussis in Bordetella parapertussis Infection", Eur. J Clin Microbiol Infect Dis. 10:793-798, 1996) y cerdos (Kobisch y col., "Identification of a 68-Kilodalton 0uter Membrane Protein as the Major Protective Antigen of Bordetella bronchiseptica by Using Specific-Pathogen-Free Piglets", Infect. Immun. 58(2):352-357, 1990).
El CD es una enfermedad virica universal con manifestaciones variables que tiene una mortalidad elevada. Aproximadamente el 50 % de los perros no vacunados no inmunes infectados con el virus CD desarrolla signos clinicos y aproximadamente el 90 % de dichos perros muere.
La hepatitis canina infecciosa o ICH, causada por el adenovirus canino de tipo 1 (CAV-1) es una enfermedad virica universal, en ocasiones mortal, de perros que se caracteriza por lesiones hepaticas y endoteliales generalizadas. El CAV-2 produce enfermedad respiratoria, que, en los casos graves, puede incluir neumonia y bronconeumonia.
El CPI es una frecuente enfermedad virica de las vias respiratorias superiores. La CPI sin complicaciones puede ser leve o subclinica, en la que los signos se convierten en mas graves si existe una infecci6n concurrente con otros pat6genos respiratorios.
La infecci6n por CPV tiene como resultado una enfermedad enterica que se caracteriza por un inicio repentino de v6mitos y diarrea, a menudo hemorragica. Habitualmente los signos clinicos se acompanan de leucopenia. Puede afectar a perros susceptibles de cualquier edad, pero la mortalidad es mayor en los cachorros. En los cachorros de 4-12 semanas de eda d, el CPV puede producir, en ocasiones, miocarditis que puede dar como resultado insuficiencia cardiaca despues de una enfermedad breve e inadvertida. Tras la infecci6n, muchos perros son resistentes a la enfermedad durante un ano o mas. De forma similar, las perras seropositivas pueden transmitir a sus cachorros anticuerpos contra el CPV que pueden interferir en la inmunizaci6n activa de los cachorros hasta las 16 semanas de edad.
El CCV tambien produce enfermedad enterica en perros susceptibles de todas las edades en todo el mundo. El virus, altamente contagioso, se transmite principalmente mediante contacto directo con heces infecciosas y puede producir enteritis clinica en un plazo de 1-4 dias desde la exposici6n. La gravedad de la enfermedad se puede agravar por la infecci6n concurrente con otros agentes. Los principales signos de infecci6n por CCV incluyen anorexia, v6mitos y diarrea. La frecuencia de los v6mitos suele disminuir en uno o dos dias desde el inicio de la diarrea, pero la diarrea puede extenderse a lo largo de la infecci6n y las heces en ocasiones pueden contener rastros de sangre. Con la infecci6n por CCV, la mayoria de los perros permanecen afebriles y en los casos sin complicaciones no se observa leucopenia.
La leptospirosis se produce en perros de todas las edades, generalmente con una amplia gama de signos clinicos y nefritis cr6nica tras la infecci6n aguda.
Se han desarrollado algunas vacunas de combinaci6n, incluidas las comercializadas con la marca Vanguard®. El documento W0 2004/067031 describe vacunas de combinaci6n que protegen a los perros contra Bordetella bronchiseptica y uno o mas de otros pat6genos caninos, tales como el virus CD, el CAV-2, el virus CPI, CPV, CCV y especies de Leptospira tales co mo L. bratislava, L. canicola, L. grippotyphosa, L icterohaemorrhagiae and L. pomona. No obstante, no ha habido ninguna vacuna de combinaci6n eficaz que comprenda L. Bratislava contra estos otrospat6genos caninos pero sin Bordetella bronchiseptica. Un problema en el desarrollo de vacunas de combinaci6n implica interferencia en la eficacia, a saber un fallo de uno o mas antigenos en una composici6n de combinaci6n para mantener o conseguir eficacia por la presencia delos demas antigenos en la composici6n. Se cree que es un resultado de la interferencia con un antigeno en la composici6n administrada a un huesped, por ejemplo un perro, en la respuesta inmunol6gica, antigenica de anticuerpo o protectora, tal como la inducida por el antigeno en el huesped debido a los otros antigenos presentes en la composici6n. No obstante, para otros huespedes, tales como gatos, se conocen vacunas de combinaci6n. Se cree que la interferencia de la eficacia en perros se debe a alguna peculiaridad del sistema biol6gico canino o debido a la reacci6n de los antigenos con el sistema biol6gico canino.
Por tanto, existe la necesidad de desarrollar una vacuna de combinaci6n adecuada para administrar a perros contra Leptospira bratislava y uno o mas pat6genos caninos distintos, que no exhiba interferencia en la eficacia en caninos sin Bordetella bronchiseptica. Seria todavia mas ventajoso si dichas vacunas de combinaci6n son seguras para administrar a los cachorros y proporcionar protecci6n a largo plazo.
Sumario de la invención
La presente invenci6n pr oporciona v acunas y procedimientos p ara proteger a l os p erros contra enfermedades causadas por pat6genos caninos.
La presente invenci6n proporciona vacunas contra Leptospira bratislava adecuadas para la administraci6n a perros y capaces de proteger a los perros contra enfermedades causadas por Leptospira bratislava. Dichas vacunas incluyen una preparaci6n de celulas de Leptospira bratislava y un vehiculo veterinario aceptable, tal como un adyuvante.
En el presente documento tambien se describen procedimientos de proteger a los perros contra enfermedades causadas por Leptospira bratislava administrando a un perro una vacuna que incluye una preparaci6n de celulas de Leptospira bratislava y un vehiculo veterinario aceptable, tal como un adyuvante.
Una combinaci6n preferida incluye dos o mas antigenos de pat6genos caninos capaces de inducir una respuesta inmunitaria protectora en perros contra la enfermedad causada por dicho(s) pat6geno(s). Dichos pat6genos se pueden seleccionar del virus del moquillo canino (CD), el adenovirus de tipo 2 (CAV-2), el virus de la parainfluenza canina (CPI), el parvovirus canino (CPV), el coronavirus canino (CCV), el herpesvirus canino, el virus de la rabia,
Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira hardjobovis, Porphyromonas spp., Bacteriodes spp., Leishmania spp., Borrelia spp., Ehrlichia spp., Mycoplasma spp. y Microsporum canis.
0tra vacuna de combinaci6n preferida incluye cepas atenuadas del virus del moquillo canino (CD), el adenovirus de tipo 2 (CAV-2), el virus de la parainfluenza canina (CPI) y el parvovirus canino (CPV); y una preparaci6n inactivada de una c epa del co ronavirus canino ( CCV); y un a preparaci6n ce lular d e c inco s erovariedades de L eptospira (Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona).
0tra vacuna de combinaci6n preferida incluye cepas atenuadas del virus del moquillo canino (CD), el adenovirus de tipo 2 (CAV-2), el virus de la parainfluenza canina (CPI) y el parvovirus canino (CPV); y una preparaci6n inactivada de una cepa del coronavirus canino (CCV); y una preparaci6n de celulas inactivadas de cuatro serovariedades de Leptospira (Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona).
0tra vacuna de combinaci6n preferida mas incluye cepas atenuadas del virus CD, el virus CAV-2, el virus CPI y una cepa de CPV.
0tra vacuna de combinaci6n preferida incluye cepas atenuadas del virus CD, el virus CAV-2, el virus CPI, una cepa de CPV y una preparaci6n de celulas inactivadas de Leptospira canicola y Leptospira icterohaemorrhagiae.
0tra vacuna de combinaci6n preferida mas incluye cepas atenuadas del virus CD, el virus CAV-2, el virus CPI, una cepa de CPV y una preparaci6n de celulas inactivadas de cinco serovariedades de Leptospira (Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona).
0tra vacuna de combinaci6n preferida mas incluye cepas atenuadas del virus CD, el virus CAV-2, el virus CPI, una cepa de CPV y una preparaci6n de celulas inactivadas de cuatro serovariedades de Leptospira (Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona).
Por tanto, en un primer aspecto, la presente invenci6n proporciona una composici6n de vacuna para usar en la inmunizaci6n de perros contra la infecci6n causada por Leptospira bratislava, que comprende una preparaci6n celular de Leptospira de Leptospira bratislava y un vehiculo. Preferentemente, dicha una preparaci6n celular de Leptospira comprende a demas una pr eparaci6n ce lular de al m enos uno de Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae o Leptospira pomona, en la que la cantidad de cada cepa de Leptospira en la composici6n de vacuna esta en el intervalo de aproximadamente 100-3500 unidades nefelometricas por dosis de vacuna.
En un segundo aspecto, la presente invenci6n proporciona una vacuna de composici6n para usar en la inmunizaci6n de perros contra pat6genos caninos, que comprende la composici6n del primer aspecto y ademas comprende una cepa atenuada del virus del moquillo canino (CD), una cepa atenuada del adenovirus canino de tipo 2 (CAV-2), una cepa atenuada del virus de la parainfluenza canina (CPI), una cepa atenuada del parvovirus canino (CPV) yun vehiculo, en la que la cantidad de cada cepa atenuada de virus en dicha vacuna esta en el intervalo de 102 a 109 de TCDI50 por dosis. Preferentemente, dicha vacuna de combinaci6n comprende ademas una preparaci6n de celulas parciales o enteras inactivadas de una cepa del coronavirus canino (CCV). Mas preferentemente, la cantidad de la preparaci6n c elular d e d icha ce pa d e C CV en dicha vacuna es de al m enos aproximadamente 100 unidades relativas por dosis.
En un tercer aspecto, la presente invenci6n proporciona una vacuna de combinaci6n para usar en la inmunizaci6n de perros contra pat6genos caninos, que comprende una preparaci6n celular de Leptospira de Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae, y Leptospira pomona y que ademas comprende una cepa atenuada del virus del moquillo canino (CD), una cepa atenuada del adenovirus canino de tipo 2 (CAV-2), una cepa atenuada del virus de la parainfluenza canina (CPI), una cepa atenuada del parvovirus canino (CPV) yun vehiculo. Preferentemente, dicha vacuna de combinaci6n comprende ademas una preparaci6n de celulas parciales
o ent eras inactivadas de u na ce pa de l co ronavirus canino ( CCV). Mas preferentemente, l a ca ntidad de l a preparaci6n c elular d e d icha ce pa d e C CV en dicha vacuna es de al m enos aproximadamente 100 unidades relativas por dosis.
Preferentemente, en el primer o tercer aspecto de la presente invenci6n, la cantidad de cada cepa de Leptospira esta en el intervalo de aproximadamente 100 a 3500 unidades nefelometricas por dosis.
Preferentemente, en el primero, segundo o tercer aspecto de la presente invenci6n, la cantidad de cada cepa de Leptospira esta en el intervalo de aproximadamente 200-2000 unidades nefelometricas por dosis.
Preferentemente, en el tercer aspecto de la presente invenci6n, la cantidad de dicha cepa atenuada para el virus del CD en dicha vacuna esta en el intervalo de 102 a 109 TCID50 por dosis, la cantidad de dicha cepa atenuada del CAV2 endicha vacuna esta en el intervalo de 102a 109 TCID50por dosis, la cantidad de dicha cepa atenuada del virus CPI en dicha vacuna esta en el intervalo de 102a 109 TCID50por dosis y/o la cantidad de dicha cepa atenuada del CPV en dicha vacuna esta en el intervalo de 102 a 109 TCID50 por dosis.
Tambien se proporciona la composici6n de vacuna de acuerdo con cualquiera del primero, segundo o tercer aspecto de la presente invenci6n, en la que el vehiculo comprende saponina y tensioactivo. Preferentemente, la saponina es Quil A y el tensioactivo es colesterol. Mas preferentemente, la cantidad de Quil A esta en el intervalo de 1 a 1000 !g por dosis.
Tambien se proporciona la composici6n de vacuna de acuerdo con cualquiera del primero, segundo o tercer aspecto de la presente invenci6n, en la que el vehiculo comprende hidr6xido de aluminio.
Tambien se proporciona ademas la composici6n de vacuna de acuerdo con cualquiera del primero, segundo o tercer aspecto de la presente invenci6n, en la que dicha composici6n se administra por via intravenosa, intranasal, oral, intramuscular o subcutanea.
Tambien se proporciona la composici6n de vacuna de acuerdo con cualquiera del primero, segundo o tercer aspecto de la presenteinvenci6n, en la que dicho perrorecibe dicha composici6n dos o tres veces con un intervalo de aproximadamente 24- semanas entre las administraciones.
Descripción breve de las figuras
Figura 1. Resumen de la media geometrica de los titulos finales del ELISA del p68 en perros no vacunados y vacunados frente a p68 de Bordetella (15 !g/dosis) con exposici6n a aerosol con Bordetella bronchiseptica. Figura 2. Resumen de los titulos del amiloide A en suero en perros tras la exposici6n en aerosol a Bordetella bronchiseptica. Figura 3. Resumen de la media geometrica de los titulos finales del ELISA del p68 en perros no vacunados y vacunados frente a p68 de Bordetella tras vacunaci6n y exposici6n a aerosol con Bordetella bronchiseptica. Figura 4. Resumen de los titulos del amiloide A en suero en perros tras la exposici6n en aerosol a Bordetella bronchiseptica. Figura 5. Transferencia de tipo western que muestra la reactividad del anticuerpo monoclonal frente a p68 Bord 2-7 al lisado de celulas enteras p68.
Descripción detallada de la invención
En una realizaci6n, la presente solicitud describe vacunasmonovalentes adecuadas para administraci6n a perros capaces de proteger a l os perros contra enfermedades ca usadas por Bordetella bronchiseptica. Las vacunas monovalentes incluyen un antigeno p68 de Bordetella bronchiseptica producido de forma r ecombinante y u n vehiculo veterinario aceptable, tal como un adyuvante.
En otra realizaci6n, la presente solicitud describe procedimientos de proteger a los perros contra enfermedades causadas por Bordetella bronchiseptica administrando a un perro una vacuna monovalente que incluye un antigeno p68 de Bordetella bronchiseptica producido de forma recombinante y un vehiculo veterinario aceptable, tal como un adyuvante.
En otra realizaci6n mas, la presente solicitud describe vacunas de combinaci6n adecuadas para administrar a perros. Las vacunas de combinaci6n de la presente invenci6n incluyen un antigeno p68 de Bordetella bronchiseptica producido de forma recombinante en combinaci6n con al menos otro antigeno capaz de inducir una respuesta inmunitaria protectora en perros contra una enfermedad producida por dicho otro antigeno. 0tra realizaci6n incluye dos o mas antigenos de pat6genos caninos capaces de inducir una respuesta inmunitaria protectora en perros contra la enfermedad causada por dicho(s) pat6geno(s).
Una vacuna de combinaci6n preferida incluye cepas atenuadas del virus del moquillo canino (CD), el adenovirus de tipo 2 (CAV-2), el virus de la parainfluenza canina (CPI) y el parvovirus canino (CPV); y una preparaci6n inactivada de una cepa del coronavirus canino (CCV); y una preparaci6n de cuatro serovariedades de Leptospira (Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona).
0tra vacuna de combinaci6n preferida incluye cepas atenuadas del virus del moquillo canino (CD), el adenovirus de tipo 2 (CAV-2), el virus de la parainfluenza canina (CPI) y el parvovirus canino (CPV); y una preparaci6n inactivada de una cepa del coronavirus canino (CCV); y una preparaci6n de cinco serovariedades de Leptospira (Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona).
0tra vacuna de combinaci6n preferida mas incluye cepas atenuadas del virus CD, el virus CAV-2, el virus CPI, una cepa de CPV y una preparaci6n de cuatro serovariedades de Leptospira (Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona).
0tra vacuna de combinaci6n preferida incluye cepas atenuadas del virus CD, el virus CAV-2, el virus CPI, una cepa de CCV y una preparaci6n de Leptospira canicola y Leptospira icterohaemorrhagiae.
0tra vacuna de combinaci6n preferida mas incluye cepas atenuadas del virus CD, el virus CAV-2, el virus CPI, una cepa de CPV y una preparaci6n de cinco serovariedades de Leptospira (Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona).
Para fines de claridad de la divulgaci6n, y no a modo de limitaci6n, la descripci6n detallada de la invenci6n se divide en las subsecciones que describen o ilustran ciertas caracteristicas, realizaciones o aplicaciones de la invenci6n.
Definiciones y Abreviaturas
La expresi6n "proteger a un perro contra una enfermedad causadapor un pat6geno canino", como se usa en el presente documento significa reducir o eliminar el riesgo de infecci6n por el pat6geno, mejorar o aliviar los sintomas de una infecci6n, o acelerar la recuperaci6n de una infecci6n. La protecci6n se consigue si hay una reducci6n de la carga viral o b acteriana, una reducci6n en la diseminaci6n viral o b acteriana, una d isminuci6n de la incidencia o duraci6n de las infecciones, menores niveles sericos de proteinas de fase aguda, menores temperaturas rectales y/o incremento de la captaci6n de alimento y/o crecimiento, por ejemplo.
La expresi6n "antigeno p68" se refiere a una proteina con un peso molecular de 68 kDa determinado mediante electroforesis en gel de SDS poliacrilamida que es reconocida por el anticuerpo monoclonal especifico de p68 Bord 2-7 (n° ATCC) y que tiene una secuencia de aminoacidos tal como se indica en la SEC ID N° 1 o una secuencia de aminoacidos que es sustancialmente identica a la SEC ID N° 1.
Por "sustancialmente identica" se quiere decir un grado de identidad de secuencia de al menos aproximadamente 90 %, preferentemente de al menos aproximadamente 95 % o, mas preferentemente, de al menos aproximadamente 98 %.
La expresi6n "vacuna monovalente", como se usa en el presente documento, se refiere a una vacuna que tiene un componente antigenico principal. Por ejemplo, una vacuna monovalente de p68 incluye un antigeno p68 de Bordetella bronchiseptica como el componente antigenico principal de la vacuna y es capaz de proteger al animal al que se administra la vacuna contra enfermedades causadas por Bordetella bronchiseptica. 0tro ejemplo de una vacuna monovalente incluye una preparaci6n de celulas de Leptospira bratislava como el componente antigenico principal de la vacuna y es capaz de proteger al animal al que se administra la vacuna contra enfermedades causadas por Leptospira bratislava.
La expresi6n "vacuna de combinaci6n" quiere decir una combinaci6n bivalente o multivalente de antigenos que son capaces de inducir una respuesta inmunitaria protectora en perros. Los efectos protectores de una vacuna de combinaci6n c ontra un pat 6geno o p at6genos n ormalmente s e c onsiguen i nduciendo en el a nimal s ujeto u na respuesta inmunitaria, una respuesta inmunitaria bien celular o bien humoral, o una combinaci6n de ambas.
Con "inmunogenico" se quiere decir la capacidad de una composici6n para provocar una respuesta inmunitaria en perros contra un pat6geno concreto. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria celular mediada principalmente por linfocitos T citot6xicos y linfocitos T productores de citocinas, o una respuesta inmunitaria humoral mediada principalmente por linfocitos T colaboradores, que, a su vez, activan los linfocitos B que conducen a la producci6n de anticuerpos.
La e xpresi6n "cantidad t erapeuticamente eficaz" o " cantidad ef icaz" s e r efiere a una ca ntidad d e una va cuna monovalente o de combinaci6n suficiente para producir una respuesta inmunitaria protectora en el perro al que se le administra, La respuesta inmunitaria puede comprender, sin limitaciones, la inducci6n de inmunidad celular y/o humoral. La c antidad d e un a va cuna q ue es terapeuticamente eficaz pued e va riar depe ndiendo del a ntigeno concreto usado en la vacuna, la edad y la afecci6n del perro y/o el grado de infecci6n, y puede ser determinada por un medico veterinario.
Vacunas de p68
La presente solicitud divulga que una composici6n de vacuna que contiene un antigeno p68 de Bordetella bronchiseptica protegia con eficacia a los perros contra la enfermedad causada por Bordetella bronchiseptica. La composici6n de vacuna no produce reacciones posvacunales significativas, es segura para administrar a cachorros e induce inmunidad protectora en perros que dura un periodo prolongado de tiempo.
De acuerdo con esto, la solicitud divulga una composici6n de vacuna que contiene un antigeno p68 de Bordetella bronchiseptica (o "una vacuna de p68") que es adecuado para administrar a los perros y que es capaz de proteger a los perros contra la enfermedad causada por Bordetella bronchiseptica, por ejemplo la traqueobronquitis infecciosa ("tos de las perreras").
Para los fines de la presente invenci6n, la expresi6n "antigeno p68" se refiere a una proteina (vease la figura 5) con un peso molecular de 68 kDa determinado mediante electroforesis en gel de SDS poliacrilamida que es reconocida por el anticuerpo monoclonal especifico de p68 Bord 2-7 (n° ATCC) y que tiene una secuencia de aminoacidos tal como se indica en la SEC ID N° 1 o una secuencia de aminoacidos que es sustancialmente identica a la SEC ID N°
1. Por "sustancialmente identica" se quiere decir un grado de identidad de secuencia de al menos aproximadamente 90 %, preferentemente de al menos aproximadamente 95 % o, mas preferentemente, de al menos aproximadamente 98 %. Un ejemplo de un antigeno p68 que tiene una secuencia de aminoacidos sustancialmente identica a la SEC ID N° 1 es el antigeno p68 descrito en el documento W0 92/17587, que se indica en la SEC ID N° 3. El anticuerpo monoclonal e specifico de p68 de l a p resente i nvenci6n reconoce proteinas p68 nativas, proteinas p68 recombinantes y proteinas p68 sobre la superficie de las bacterias, por ejemplo.
Los antigenos p6 8 a decuadas para usar i ncluyen pr oteinas p68 n ativas (es d ecir, pr oteinas p 68 naturales purificadas de Bordetella bronchiseptica) y proteinas p68 producidas de forma recombinante.
La purificaci6n de p68 nativo de Bordetella bronchiseptica se describe en, por ejemplo, Montaraz y col., Infection and Immunity 47: 744-751 (1985) y tambien se ilustra en los ejemplos que se proporcionan a continuaci6n en el presente documento. La producci6n recombinante de p68 se puede conseguir usando una cualquiera de las tecnicas de expresi6n recombinante y de clonaci6n molecular conocidas para los expertos en la tecnica. Por ejemplo, se puede introducir una molecula de acido nucleico que codifica p68 en una celula huesped adecuada, tal como una bacteria, una celula de levadura(p. ej., una celula de Pichia), unacelula deinsecto o una celula de mamifero (p, ej., una celula CH0). La molecula de acido nucleico que codifica p68 se puede introducir en un enlace operable a un promotor capaz de efectuar la expresi6n del antigeno p68 en la celula huesped. p68, que se expresa en la celula huesped, se puede expresar facilmente usando tecnicas de purificaci6n proteica rutinarias.
En una realizaci6n preferida, la secuencia de nucle6tidos como se indica en la SEC ID N°: 2 que codifica el antigeno p68 que tiene la secuencia de aminoacidos de SEC ID N° 1, se clona en un vector de expresi6n y se introduce en un enlace operable a un promotor sensible a la temperatura. El vector de expresi6n se introduce en Escherichia coli y el antigeno p68 se expresa tras la inducci6n de calor. Las celulas se lisan y los cuerpos de inclusi6n en los que se acumula el antigeno p68 se separan mediante centrifugaci6n. El p68 recombinante en los cuerpos de inclusi6n se solubiliza us ando S DS u ot ros agentes de so lubilizaci6n co nocidos en l a t ecnica, t ales como ur ea, guan idina clorhidrato, colato s6dico, taurocolato y desoxicolato s6dico. De acuerdo con la presente invenci6n, una proteina p68 nativa o recombinante purificada se combina con un vehiculo veterinario aceptable para formar una composici6n de vacuna de p68.
La expresi6n "vehiculo veterinario aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersi6n, recubrimientos, ad yuvantes, age ntes estabilizantes, diluyentes, c onservantes, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isot6nicos y retardantes de la absorci6n, y similares. Los diluyentes pueden incluir agua, soluci6n salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isot6nicos pueden incluir cloruro s6dico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen albumina, entre otros.
Adyuvantes adecuados para usar de acuerdo con la presenteinvenci6n incluyen, entre otros, varias clases de adyuvantes tales como sales minerales, por ejemplo alumbre, hidr6xido de aluminio, fosfato de aluminio y fosfato de calcio; agentes de superficie activa y microparticulas, por ejemplo tensioactivos de polimeros de bloque no i6nicos
(p. ej., colesterol), virosomas, saponinas (p. ej., Quil A, QS-21 and GPI-0100), proteosomas, complejos estimulantes inmunitarios, cocleatos, aminas cuaternarias (bromuro de dimetildioactadecil am6nico (DDA)), avridina, vitamina A, vitamina E; productos bacterianos tales como el sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc.), esqueleto de la pared celular de Mycobacterum phlei (Detox®), dipeptidos (MDP) y tripeptidos (MTP) de muramilo, lipido monofosforilo A, bacilo de Calmete-Guerin, ent erotoxinas termolabiles de E . co li, t oxina del c6 lera, di micolato de t rehalosa, oligodesoxinucle6tidos de CpG; citocinas y hormonas, p. ej., interleucinas (IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18), factor estimulante de co lonias de gr anulocitos-macr6fagos, des hidroepiandrosterona, 1, 25-dihidroxi vi tamina D 3; polianiones, por ejemplo dextrano; poliacrilicos (p. ej., polimetilmetacrilato, Carbopol 934P); vehiculos, por ejemplo toxoide del tetanos, toxoide difterico, subunidad B de la toxina del c6lera, enterotoxina mutante termolabil de E. coli enterotoxigenica (rmLT), proteinas del shock termico; emulsiones de aceite en agua, por ejemploAMPHIGEN® (Hydronics, USA); y emulsiones de agua en aceite, tales como, por ejemplo, adyuvantes completos e incompletos de Freund.
Adyuvantes preferidos para usar en las vacunas de la presente invenci6n incluyen Quil A y colesterol.
El antigeno p68 y el vehiculo veterinario aceptable se pueden combinar de cualquier modo conveniente y practico para formar una composici6n de vacuna, por ejemplo mediante mezcla, soluci6n, suspensi6n, emulsificaci6n, encapsulaci6n, absorci6ny similares, y se puede constituir en formulaciones tales como comprimidos, capsulas, polvo, j arabe, su spensiones qu e s on adecuadas para i nyecciones, i mplantaciones, i nhalaciones, i ngestiones o similares. Preferentemente, la vacuna se formula de tal modo que se puede administrar a l os perros mediante inyecci6n en una dosis de aproximadamente 0,1 a 5 ml, o, preferentemente, aproximadamente 0,5 a 2,5 ml, o incluso mas preferentemente, en una dosis de aproximadamente 1 ml. Cuando sea adecuado, las composiciones farmaceuticas de la presente invenci6n se deben esterilizar mediante procedimientos bien conocidos.
La cantidad de p68 en las vacunas debera ser eficaz para inmunizaci6n y, en general, esta en el intervalo de 0,5 a 1000 !g por dosi s. Preferentemente, l a ca ntidad de p 68 esta en el intervalo de 1 -260 !g p or dosi s. M as preferentemente, la cantidad de p68 esta en el intervalo de 10-100 !g por dosis. Incluso mas preferentemente, la cantidad de p68 es de aproximadamente 15 a 25 !g por dosis.
La cantidad de adyuvantes adecuada para usar en las vacunas depende de la naturaleza del adyuvante usado. Por ejemplo, c uando Q uil A y c olesterol s e u san co mo a dyuvante, Q uil A est a, en g eneral, en una ca ntidad d e aproximadamente 1-1000 !g por dosis, preferentemente 30-100 !g por dos is y , mas preferentemente, aproximadamente 50-75 !g por dosis; y el colesterol esta, en general, en una cantidad de aproximadamente 1-1000 !g por dosis, preferentemente 30-100 !g por dosis y, mas preferentemente, aproximadamente 50-75 !g por dosis.
En otra realizaci6n, la solicitud describe procedimientos de proteger perros contra la enfermedad causada por Bordetella bronchiseptica administrando a un perro una composici6n de vacuna de p68, tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento. La composici6n de vacuna de p68 proporciona a los perros una inmunidad a largo plazo durante al menos aproximadamente 4 meses, preferentemente durante al menos aproximadamente 6 meses o, incluso mas referentemente, durante aproximadamente un ano, la vacuna de p68 puede administrarse a un perro por cualquier via conocida, incluidas las vias oral, intranasal, mucosa, t6pica, transdermica y parenteral (p. ej., intravenosa, intraperitoneal, intradermica, subcutanea o intramuscular). La administraci6n tambien se puede realizar usando dispositivos de liberaci6n sin agujas. La administraci6n se puede realizar usando una combinaci6n de vias, por ejemplo primera administraci6n usando una via parental y la posterior administraci6n usando una via mucosa.
Las vias de administraci6n preferidas incluyen las administraciones subcutanea e intramuscular.
La co mposici6n de l a v acuna co n p68 se pue de a dministrar a p erros de al m enos 6 s emanas de edad, preferentemente de al menos 7 semanas de edad y, mas preferentemente, de al menos 8 o 9 semanas de edad. Los perros pueden vacunarse con una dosis o mas de una dosis de una vacuna de p68. Preferentemente se administran a los perros dos dosis de una vacuna de p68 con un intervalo de aproximadamente 2-4 semanas, preferentemente aproximadamente 3 semanas, entre las dos administraciones. Si se vacuna a los perros antes de los 4 meses de edad se recomienda que se les vuelva a vacunar con una unica dosis despues de los 4 meses de edad, ya que los anticuerpos de la madre pueden interferir en el desarrollo de una respuesta inmunitaria adecuada en cachorros menores de 4 meses de edad. Se puede volver a vacunar a los perros anualmente con una unica dosis. Cuando es probable la e xposici6n a B. bronchiseptica, co mo e n s ituaciones d e cria, r esidencias o e xhibici6n, se puede administrar un refuerzo adicional en un plazo de 1 ano o, preferentemente, de 6 meses, tras la aparici6n de estos acontecimientos.
Vacunas de combinaci6n
En otra realizaci6n, la presente solicituddescribe vacunas de combinaci6ny procedimientos para proteger a los perros contra Bordetella bronchiseptica y/o un o o m as de ot ros pat6genos administrando dichas va cunas de combinaci6n. Las composiciones de la vacuna de combinaci6n de la presente invenci6n no muestran interferencia en la eficacia y son seguras para administrar a cachorros.
Las vacunas de combinaci6n incluyen el antigeno p68 de Bordetella bronchiseptica, que se puede producir como se ha descrito anteriormente en el presente documento, en combinaci6n con al menos un antigeno de otros pat6genos caninos capaz de i nducir una respuesta inmunitaria protectora en p erros contra una enfermedad producida por dichos otros pat6genos. Dichas vacunas de combinaci6n tambien incluyen combinaciones de dos o mas de otros pat6genos caninos sin el antigeno p68.
Dichos otros pat6genos incluyen, entre otros, el virus del moquillo canino (CD), el adenovirus canino de tipo 2 (CAV2), el virus de la parainfluenza canina (CPI), el parvovirus canino (CPV), el coronavirus canino (CCV), el herpesvirus canino y el virus de la rabia. Antigenos de estos pat6genos para usar en las composiciones de vacuna pueden estar en forma de una preparaci6n de virus vivosmodificados o una preparaci6n de virus inactivados. En la tecnica se conocen procedimientos de atenuar cepas virulentas de estos virus y procedimientos de fabricar una preparaci6n de virus inactivados y se describen en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 4.567.042 y 4.567.043.
0tros pat6genos tambien incluyen Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira hardjobovis, Porphyromonas spp., Bacteriodes spp., Leishmania spp., Borrelia spp., Ehrlichia spp., Mycoplasma ssp. y Microsporum canis. Los antigenos de estos pat6genos para usar en las composiciones de vacuna pueden estar en forma de una preparaci6n de celulas enteras
o parciales inactivadas usando procedimientos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, en la tecnica se conocen los procedimientos de fabricaci6n de una preparaci6n de celulas enteras o parciales de Leptospira inactivadas y se describen en, por ejemplo, Yan, K-T, "Aspects of Immunity to Leptospira borgpetersenii serovar hardjo", PhD Thesis, Appendix I, 1996. Faculty of Agriculture and Food Science, The Queen's Universityof Belfast; Mackintosh y col., "The use of a hardjo-pomona vaccine to prevent leptospiruria in cattle exposed to natural challenge with Leptospia interrogans serovar hardjo", New Zealand Vet. J. 28:174-177, 1980;Bolin y col., "Effect of vaccination with a pentavalent leptopsiral vaccine on Leptospira interrogans serovarhardjo type hardjo-boivs infection of pregnant cattle", Am. J. Vet. Res. 50:161-165, 1989.
De acuerdo con la presente invenci6n, las vacunas de combinaci6n generalmente incluyen un vehiculo veterinario aceptable. Como se ha descrito anteriormente en el presente documento, un vehiculo veterinario aceptable incluye todos ycada uno d e los disolventes, medios de dispersi6n, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isot6nicos y retardantes de la absorci6n, y similares. Los diluyentes pueden incluir agua, soluci6n salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isot6nicos pueden incluir cloruro s6dico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen albumina, entre otros.
Adyuvantes adecuados para usar de acuerdo con la presenteinvenci6n incluyen, entre otros, varias clases de adyuvantes tales como sales minerales, por ejemplo alumbre, hidr6xido de aluminio, fosfato de aluminio y fosfato de calcio; agentes de superficie activa y microparticulas, por ejemplo tensioactivos de polimeros de bloque no i6nicos
(p. ej., colesterol), virosomas, saponinas (p. ej., Quil A, QS-21 and GPI-0100), proteosomas, complejos estimulantes inmunitarios, cocleatos, aminas cuaternarias (bromuro de dimetildioactadecil am6nico (DDA)), avridina, vitamina A, vitamina E; productos bacterianos tales como el sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc.), esqueleto de la pared celular de Mycobacterum phlei (Detox®), dipeptidos (MDP) y tripeptidos (MTP) de muramilo, lipido monofosforilo A, bacilo de Calmete-Guerin, ent erotoxinas termolabiles de E . co li, t oxina del c6 lera, di micolato de t rehalosa, oligodesoxinucle6tidos de CpG; citocinas y hormonas, p. ej., interleucinas (IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18), factor estimulante de co lonias de gr anulocitos-macr6fagos, des hidroepiandrosterona, 1, 25-dihidroxi vi tamina D 3; polianiones, por ejemplo dextrano; poliacrilicos (p. ej., polimetilmetacrilato, Carbopol 934P); vehiculos, por ejemplo toxoide del tetanos, toxoide difterico, subunidad B de la toxina del c6lera, enterotoxina mutante termolabil de E. coli enterotoxigenica (rmLT), proteinas del shock termico; emulsiones de aceite en agua, por ejemploAMPHIGEN® (Hydronics, USA); y emulsiones de agua en aceite, tales como, por ejemplo, adyuvantes completos e incompletos de Freund.
Adyuvantes preferidos para usar en las vacunas de combinaci6n de acuerdo con la presente invenci6n incluyen 1) Quil A mas colesterol y 2) hidr6xido de aluminio. La cantidad de adyuvantes adecuada para usar en las vacunas depende de la naturaleza del adyuvante usado. Por ejemplo, cuando Quil A y colesterol se usan como adyuvante, Quil A esta, en general, en una cantidad de aproximadamente 1-1000 !g por dosis, preferentemente 30-100 !g por dosisy, mas preferentemente, aproximadamente 50 -75 !g por dos is; y el colesterol esta, en ge neral, en un a cantidad de aproximadamente 1-1000 !g por dosis, preferentemente 30-100 !g por dosis y, mas preferentemente, aproximadamente 50-75 !g por dosis.Cuando se usa hidr6xido de aluminio como adyuvante, en general esta en una cantidad de aproximadamente 0,5-20 %, preferentemente aproximadamente 0,5-10 % y, mas preferentemente, aproximadamente 1-2 %.
El antigeno p68, uno o mas antigenos de otros pat6genos y/o el vehiculo veterinario aceptable se pueden combinar de cualquier modo conveniente y practico para formar una composici6n de vacuna de combinaci6n, por ejemplo mediante mezcla, soluci6n, suspensi6n, emulsificaci6n, encapsulaci6n, absorci6n y similares, y se puede constituir en f ormulaciones tales como co mprimidos, ca psulas, pol vo, j arabe, su spensiones que so n a decuadas para inyecciones, implantaciones, inhalaciones, ingestiones o similares. Preferentemente, la vacuna se formula de tal modo que se puede administrar a los perros mediante inyecci6n en una dosis de aproximadamente 0,1 a 5 ml, o, preferentemente, aproximadamente 0,5 a 2,5 ml, o incluso mas preferentemente, en una dosis de aproximadamente 1 ml.
Las vacunas de combinaci6n se pueden preparar rehidratando una preparaci6n liofilizada de las cepas virales atenuadas (o una preparaci6n fabricada mediante otros procedimientos tales como liofilizaci6n o desecaci6n) y una preparaci6n viral con una preparaci6n liquida, en la que la preparaci6n liquida esta compuesta por los antigenos de Leptospira disueltos en soluci6n salina esteril y adyuvada con Quil A y colesterol. Dicha vacuna de combinaci6n tambien se p ueden pr eparar r ehidratando un a pr eparaci6n l iofilizada de las cepas virales atenuadas y u na preparaci6n viral de Leptospira (o una preparaci6n fabricada mediante otros procedimientos tales como liofilizaci6n o desecaci6n) con una soluci6n esteril o rehidratando dicha preparaci6n liofilizada con CCV mas diluyente.
De acuerdo con la presenteinvenci6n se puede administrar vacunas de combinaci6n a perros de al menos 6 semanas de edad, preferentementede al menos 7 semanas de edad y, mas preferentemente, de al menos 8o 9 semanas de edad. Las vacunas de combinaci6n se pueden administrar en de 2 a 4 dosis, preferentemente en de 2 a 3 dosis. Las dosis se pueden administrar con de 2 a 6 semanas entre cada dosis, preferentemente con de 2 a 4 semanas entre cada dosis.
La a dministraci6n se puede r ealizar por cualquier vi a conocida, i ncluidas las vias i ntranasal, m ucosa, t 6pica, transdermica y parenteral (p. ej., intravenosa, intraperitoneal, intradermica, subcutanea o intramuscular). La administraci6n tambien se puede realizar usando dispositivos de liberaci6n sin agujas. La administraci6n tambien se puede realizar usando una combinaci6n de vias, por ejemplo primera administraci6n usando una via parental y la posterior administraci6n usando una via mucosa. Las vias de administraci6n preferidas incluyen las administraciones subcutanea e intramuscular.
Vacunas de combinaci6n preferidas y procedimientos de vacunaci6n
Una vacuna de combinaci6n preferida incluye una cepa atenuada del virus CD, una cepa atenuada de CAV-2, una cepa atenuada del virus CPI, una cepa atenuada de CPV, una preparaci6n inactivada de una cepa de CCV y un antigeno p68 de Bordetella bronchiseptica.
Una vacuna de combinaci6n especialmente preferida incluyela cepa atenuada del virus CD designada la cepa " Snyder Hill" (National VeterinaryService Laboratory, Ames, IA), la cepa atenuada de CAV-2 designada cepa "Manhattan" ( National V eterinary S ervice Lab oratory, A mes, I A), l a c epa at enuada del vi rus CPI, que t iene l a designaci6n del "NLCPI-5" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), la cepa atenuada de CPV que tiene la designaci6n "NL-35-D" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), una preparaci6n inactivada de la cepa de CCV que tiene la designaci6n "NL-18" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA) y el antigeno p68 recombinante de Bordetella bronchiseptica que tiene la secuencia de SEC ID N° 1. Dicha vacuna de combinaci6n, tambien denominada en el presente documento "vacuna de combinaci6n p68/5CV-2" se prepara, preferentemente, rehidratando una preparaci6n liofilizada de las cepas virales atenuadas y la preparaci6n viral con una preparaci6n liquida, en la que la preparaci6nliquida esta compuesta por el antigeno p68 disuelto en soluci6n salina esteril y adyuvado con Quil A y colesterol. Esta combinaci6n sin el antigeno p68 se denomina en el presente documento combinaci6n 5 CV. D icha v acuna d e co mbinaci6n se p repara, pr eferentemente, r ehidratando u na pr eparaci6n liofilizada de las cepas virales atenuadas y la preparaci6n viral con una preparaci6n liquida, en la que la preparaci6n liquida esta compuesta por soluci6n salina esteril y adyuvada con Quil A y colesterol.
0tra vacuna de combinaci6n especialmente preferida incluye los componentes antigenicos de la vacuna de combinaci6n p68/5CV, asi como preparaciones de celulas enteras inactivadas de cinco especies de Leptospira: Leptospira bratislava (p. ej., una cepa de Leptospira bratislava que se puede obtener en National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), Leptospira canicola (p. ej., la cepa C-5, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), Leptospira grippotyphosa (p. ej., la cepa MAL 1540, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA.), Leptospira icterohaemorrhagiae (p. ej., la cepa NADL 11403, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA) y Leptospira pomona (p. ej., la cepa T262, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA). Dicha vacuna de combinaci6n, tambien denominada en el presente documento "vacuna de combinaci6n p68/5CV-Leptospira" se prepara, preferentemente, r ehidratando un a pr eparaci6n l iofilizada de l as ce pas virales atenuadas (o u na pr eparaci6n fabricada m ediante ot ros procedimientos, t ales como l iofilizaci6n o des ecaci6n) y la preparaci6n vi ral co n u na preparaci6n liquida, en la que la preparaci6n liquida esta compuesta por el antigeno p68 y Leptospira/antigenos, disuelto en soluci6n salina esteril y adyuvado con Quil A y colesterol. Esta combinaci6n sin el antigeno p68 se denomina en el presente documento combinaci6n 5CV-5Leptospira. Esta combinaci6n si el antigeno p68 y sin Leptospira bratislava se denomina en el presente documento combinaci6n 5CV-4Leptospira. La combinaci6n 5CV sin el antigeno p68 y con Leptospira canicola y Leptospira icterohaemorrhagiae se denomina en el presente documento combinaci6n 5CV-2Leptospira. Dichas vacunas de combinaci6n se preparan, preferentemente, rehidratando una preparaci6n liofilizada de las cepas virales atenuadas (o una preparaci6n fabricada mediante otros procedimientos tales como liofilizaci6n o desecaci6n) y una preparaci6n viral con una preparaci6n liquida, en la que la pr eparaci6n l iquida est a compuesta po r l os antigenos de Leptospira disueltos en so luci6n s alina est eril y adyuvada con Quil A y colesterol. Dichas vacunas de combinaci6n tambien se preparan, preferentemente, rehidratando una preparaci6n liofilizada de las cepas virales atenuadas y una preparaci6n viral de Leptospira (o una preparaci6n fabricada mediante otros procedimientos tales como liofilizaci6n o desecaci6n) con una soluci6n esteril o rehidratando dicha preparaci6n liofilizada con CCV mas diluyente.
Las vacunas de combinaci6n p68/SCV, p68/5CV-Leptospira, 5C V, 5C V-5Leptospira, 5CV-4Leptospira y 5CV2Leptospira se pued en a dministrar a per ros sanos de 4 se manas de eda d o m ayores, pr eferentemente de 6 semanas de edad o mayores y, preferentemente, en 3 dosis, cada una administrada separadas por 3 semanas. Se puede volver a vacunar a los perros anualmente con una unica dosis. Cuando es probable la exposici6n a B. bronchiseptica y/o virus canino como en situaciones de cria, residencias o exhibici6n, se puede administrar un refuerzo adicional en un plazo de 1 ano o, preferentemente, de 6 meses, tras la aparici6n de estos acontecimientos.
0tra vacuna de combinaci6n preferida mas incluye una cepa atenuada del virus CD, una cepa atenuada de CAV-2, una cepa atenuada del virusCPI, una cepa atenuada de CPV y un antigeno p68 recombinante de Bordetella bronchiseptica.
Una vacuna de combinaci6n especialmente preferida incluyela cepa atenuada del virus CD designada la cepa " Snyder Hill" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), la cepa atenuada de CAV-2 designada cepa "Manhattan" ( National V eterinary S ervice Lab oratory, A mes, I A), l a c epa at enuada del vi rus CPI, que t iene l a designaci6n del "NLCPI-5" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA), la cepa atenuada de CPV designada "NL-35-D" ( National V eterinary S ervice Laboratory, A mes, I A) y e l a ntigeno p6 8 r ecombinante de Bordetella bronchiseptica que tiene la secuencia de SEC ID N° 1. Dicha vacuna de combinaci6n, tambien denominada en el presente documento " vacuna d e co mbinaci6n p 68/DA2PP" se pr epara, pr eferentemente, r ehidratando u na preparaci6n liofilizada de las cepas virales atenuadas (o una preparaci6n fabricada mediante otros procedimientos, tales como liofilizaci6n o desecaci6n) con una preparaci6n liquida, en la que la preparaci6n liquida esta compuesta por el ant igeno p68 di suelto en so luci6n sa lina est eril y ad yuvado co n Q uil A y co lesterol. E sta va cuna d e combinaci6n sin el antigeno p68 se denomina en vacuna de combinaci6n DA2PP. Dicha vacuna de combinaci6n se prepara, preferentemente, rehidratando una preparaci6n liofilizada de las cepas virales atenuadas (o una preparaci6n fabricada mediante otros procedimientos tales como liofilizaci6n o desecaci6n) con una preparaci6n liquida, e n l a que la preparaci6n l iquida esta co mpuesta por s oluci6n sa lina est eril y adyuvada con Q uil A y colesterol.
0tra vacuna de combinaci6n especialmente preferida incluye los componentes antigenicos de la vacuna de combinaci6n p68/DA2PP, asi como preparaciones de celulas enteras inactivadas de cinco especies de Leptospira: Leptospira canicola (p. ej ., l a c epa C -51, N ational V eterinary S ervice Laboratory, A mes, I A) y Leptospira icterohaemorrhagiae ((p. ej ., l a ce pa, N ADL 11 403, N ational V eterinary S ervice La boratory, Ame s, I A). C omo alternativa, un a va cuna d e combinaci6n p referida pu ede i ncluir l os componentes antigenicos de l a va cuna d e combinaci6n p68/DA2PP, asi como preparaciones de celulas enteras inactivadas de cinco especies de Leptospira: Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona. Estas vacunas de combinaci6n, tambien denominada en el presente documento "vacuna de combinaci6n p68/DA2PP-Leptospira" se preparan, preferentemente, rehidratando una preparaci6n liofilizada de las cepas virales atenuadas (o una preparaci6n fabricada mediante otros procedimientos, tales como liofilizaci6n o desecaci6n) y la preparaci6n viral con una preparaci6n liquida, en la que la preparaci6n liquida esta compuesta por el antigeno p68 y antigenos de Leptospira, disueltos en soluci6n salina esteril y adyuvado con Quil A y colesterol.
Como alternativa, otra vacuna de combinaci6n preferida incluye los componentes antigenicos de la vacuna de combinaci6n D A2PP, asi co mo pr eparaciones de ce lulas enteras inactivadas de ci nco esp ecies de Leptospira: Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona. 0tra vacuna de combinaci6n preferida incluye los componentes antigenicos de la vacuna de combinaci6n DA2PP, asi c omo pr eparaciones de ce lulas enteras inactivadas de cuatro esp ecies de Leptospira: Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona. Estas vacunas de combinaci6n, tambien denominadas en el presente documento "vacunas de combinaci6n DA2PP-Leptospira" se preparan, pr eferentemente, rehidratando una pr eparaci6n l iofilizada de l as cepas vi rales atenuadas (o u na preparaci6n fabricada mediante otros procedimientos, tales como liofilizaci6n o desecaci6n) yla preparaci6n viral con una preparaci6n liquida, en l a que la preparaci6n liquida esta compuesta por los antigenos de Leptospira, disueltos en soluci6n salina esteril y adyuvado con Quil A y colesterol.
De acuerdo con la presente divulgaci6n, las vacunas de combinaci6n p68/DA2PP, p68/DA2PP-Leptospira, DA2PP, y DA2PP-Leptospira se pueden administrar a perros sanos de 6 semanas de edad o mayores, o, preferentemente, de 8 semanas de edad o mayores y, preferentemente, en 2 dosis, cada una administrada separadas por 3 semanas. Una unica dosis puede ser suficiente si se administra a un perro de al menos 12 semanas de edad. Se puede volver a vacunar a losperros anualmente con una unica dosis. Cuando es probable la exposici6n a B. bronchiseptica y/o virus canino como en situaciones de cria, residencias o exhibici6n, se puede administrar un refuerzo adicional en un plazo d e 1 a no o, preferentemente, de 6 m eses, t ras l a a parici6n d e est os acontecimientos. 0 tra v acuna d e combinaci6n preferida incluye un antigeno p68, preferentemente el antigeno p68 recombinante que tiene la SEC ID N° 1, en combinaci6n con una cepa atenuada de CPI.
0tra vacuna de combinaci6n preferida mas incluye un antigeno p68, preferentemente el antigeno p68 recombinante que tiene la SEC ID N° 1, una cepa atenuada de CPI y al menos dos especies de Leptospira, tales como Leptospira canicola (p. ej., la cepa C-51, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA) y Leptospira icterohaemorrhagiae ((p. ej., la cepa, NADL 11403, National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA).
La cantidad del antigeno p68 y el(los) antigeno(s) de uno o mas de otros pat6genos en las vacunas de combinaci6n debe ser eficaz en la inmunizaci6n. En general, el antigeno p68 en una vacuna de combinaci6n debera estar en una 5 cantidad de al menos aproximadamente 0,5 !g por dosis. El virus de CD atenuado debera estar en una cantidad de al menos aproximadamente 102 a aproximadamente 109 por dosis TCID50(dosis infecciosa en cultivo tisular a la que se produce el 50 % del efecto citopatico) por dosis y, preferentemente, en el intervalo de aproximadamente 104 a aproximadamente 106 TCID50 por dosis. El virus de CAV-2 atenuado debera estar en una cantidad de al menos aproximadamente 102 TCID50 a aproximadamente 109 TCID50 por dosis, preferentemente, en el intervalo de 10 aproximadamente 104,0 a aproximadamente 106,0 TCID50 por dosis. El virus de CPI atenuado debera estar en una cantidad de al menos aproximadamente 102 TCID50aaproximadamente 109TCID50por dosis y preferentemente, en el intervalo de 106 a aproximadamente 108 TCID50 por dosis. El virus de CPV atenuado debera estar en una cantidad de al menos aproximadamente 102 TCID50 a aproximadamente 108 TCID50 por dosis, preferentemente una cantidad en el intervalo de 107 a aproximadamente 109 TCID50 por dosis. La cantidad de CCV en una preparaci6n viral
15 inactivadadebera ser de al menosaproximadamente100 unidadesrelativas por dosis y, preferentemente, en el intervalo de 1000-4500 unidades relativas por dosis.Cada especie de Leptospira en la vacuna debera estar en el intervalo de aproximadamente 100-3500 UN (unidades nefelometricas) por dosis de vacuna y, preferentemente, en el intervalo de 200-2000 UN por dosis.
Las vacunas de combinaci6n se formulan de tal modo que las vacunas se pueden administrar a los perros en una 20 dosis de 0,1 a 5 ml, o, preferentemente de 0,5 a 2,5 ml, y, mas preferentemente, de aproximadamente 1 ml.
La presente invenci6n se ilustra de forma adicional mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1
ESTUDIO DE TITULACIÓN DE DOSIS DEL ANTÍGENO p68 RECOMBINANTE DE BORDETELLA CANINA
VACUNA:
25 El antigeno de la vacuna experimental era una proteina de membrana externa p68 recombinante (SEC ID N° 1) de
B. bronchiseptica producida por la cepa de E. coli LW68. La vacuna contenia niveles variables de p68 solubilizado en SDS (dodecilsulfato s6dico) adyuvado con 50 !g de QAC (Quil A/50 !g de colesterol) en una dosis de 1 ml.
MATERIAL DE EXPOSICIÓN:
Como material de exposici6n se us6 un aerosol de Bordetella bronchiseptica, aislado de perro n° 85B, pase n° 3, lote 30 n° 051597. El recuento medio por placa fue de 1,59 X 108 UFC/ml.
ANIMALES:
Sesenta cachorros de perro de ambos sexos fueron asignados aleatoriamente a uno de seis grupos de tratamiento (10 cachorros por grupo). Se extrajo sangre de los cachorros y se tomaron exudados traqueales 41 dias antes de la primera vacunaci6n y, de nuevo, 28 dias antes de la primera vacunaci6n, se retiraron del estudio todos los animales
35 seropositivos o con cultivos positivos-
Los animales fueron asignados aleatoriamente a t ratamientos y cu artos de acuerdo con u n di seno de bloque completo aleatorizado. Las observaciones posvacunaci6n se realizaron sin conocer los grupos de asignaci6n de la vacuna.
DISEÑO:
Grupo Nivel de dosis Via1 Numero de animales T01 Control salino (0,9 % soluci6n salina como una dosis de 1 ml) SC 9 T02 1 !g de p68 SC 8 T03 4 !g de p68 SC 8 T04 16 !g de p68 SC 9 T05 64 !g de p68 SC 9 T06 256 !g de p68 SC 9 SC= subcutanea
PROCEDIMIENTO:
Administración IVP
Se vacun6 a los animales el dia 0 con placebo o con la vacuna experimental. El dia 21 se realiz6 una segunda 11
vacunaci6n. La primera vacunaci6n se administr6 por via subcutaneaen la parte derecha del cuelloy la segunda vacunaci6n se administr6 por via subcutanea en la parte izquierda del cuello.
Administración por exposición:
Todos los animales fueron expuestos a los 28 dias de l a s egunda va cunaci6n a un aerosol de Bordetella bronchispetica. Se vigil6 en los animales la aparici6n de tos durante un periodo de 30 minutos, dos veces al dia (una vez por la manana y una vez por la tarde) los dias dos a catorce tras la exposici6n ( del dia 51 al 63)
Observaciones y obtención de muestras:
Durante siete dias despues de la vacunaci6n (del dia 0 al 7 y del 21 al 28) y a los 14 dias de cada vacunaci6n (dias 14 y 35) se palparon todos los puntos en los que se realiz6 la inyecci6n y se midieron en tres dimensiones.
Las temperaturas rectales se registraron el dia de la vacunaci6n y durante tres dias tras cada vacunaci6n (dias 0 a 3 y 21 a 24).
Se extrajo sangre los dias de la vacunaci6n (dias 0 y 21) y los dias 42 50 y 63, y se analiz6 mediante ELISA para determinar los anticuerpos especificos contra la proteina p68 purificada de B. bronchispetica. Tambien se extrajo sangre los dias 42, 49, 50, 52, 54, 56 y 58 y se analiz6 para determinar los niveles de amiloide A serico (SAA).
En t odos los animales se r ealiz6 u n e xudado t raqueal par a a islar B. bronchispetica y s e e xtrajo sa ngre para determinar los titulos de aglutinaci6n de B. bronchispetica antes de la vacunaci6n (en el proveedor, el dia -41 y el dia -28). Y en el dia 49.
ELISA DAB de titulación de anticuerpos frente a p68 de Bordetella en perro y ratón
El p68 nativo purificado se diluy6 hasta 600 ng/ml en tamp6n borato 0,01M y se anadi6 a cada pocillo a 100 !l/pocillo. Las placas se incubaron durante la noche a 4 °C. Despues, las placas se lavaron una vez con PBS-Tween 20 en exceso. Se anadi6 a las placas 1%de leche desecada desnatada en PBS a 200 !l/pocillo. Despues, las placas se incubaron durante 1 hora a 37 °C. A continuaci6n, las placas se lavaron una vez con PBS-Tween 20 en exceso.
En la hilera superior de las placas de ELISA se anadi6 suero de perro o rat6n a una diluci6n de 1:50 y en el resto de la p laca s e a nadi6 s uero a una diluci6n en se rie por dos. Las pl acas se i ncubaron d urante 1 hora a 3 7 ° C. Posteriormente, las placas se lavaron 3 veces con PBS-Tween 20 en exceso.
A las anteriores placas incubadas con suero de perro se anadi6 IgG (H + L) de cabra anti-perromarcada con peroxidasa diluida a una diluci6n de 1:2000, a 100 !l/pocillo. Despues, las placas se incubaron durante 1 hora a 37°C. A las placas incubadas con el suero de rat6n anterior anadi6 IgG (H + L) de cabra anti-rat6nmarcada con peroxidasa diluida a una diluci6n de 1:4000, a 100 !l/pocillo. Despues, las placas se incubaron durante 1 hora a 37 °C. A continuaci6n, las placas se lavaron tres veces con PBS-Tween 20 en exceso.
Se anadi6 sustrato ABTS a 100 !l/pocillo. Aproximadamente 20 minutos despues, las placas se leyeron con un lector de placas de Molecular Devices o equivalente a 405-490 nm.
ANALISIS DE DAT0S:
Las diferencias de tratamiento en el numero de perros que tosian se analizaron usando la prueba exacta de Fisher. Se us6 un nivel de significaci6n del 5 %.
Los titulos de ELISA se transformaron logaritmicamente antes del analisis usando un modelo mixto lineal general. Se us6 un nivel d e co nfianza de l 9 5 % para ev aluar l as diferencias de t ratamiento. Las observaciones de l a exposici6n se controlaron dos veces al dia durante 30 minutos cada vez.
RESULTADOS:
Cultivo del exudado traqueal y títulos de aglutinación
Se evaluaron los cultivos de los exudados traqueales y los titulos de aglutinaci6n para controlar el estado de B. bronchiseptica de los animales reclutados en el estudio. Una serie de perros mostraron titulos mayores a varios puntos de tiempo, pero ningun titulo aument6 por encima de 128 antes de la exposici6n.
Observaciones en el lugar de la inyección
Las reacciones en el lugar de la inyecci6n tras la primera vacunaci6n se presentan en la Tabla 1. Las mayores reacciones en el lugar de la inyecci6n se observaron en los animales vacunados de T05 (64 !g), de las que la mayor reacci6n media en el lugar de la inyecci6n midi6 s6lo 14,69 cm3 (dos dias despues de la vacunaci6n). Los animales vacunados de T03 (4 !g), T04 (16 !g) y T06 (256 !g) mostraron reacciones variables en el lugar de la inyecci6n hasta 7 dias despues de la vacunaci6n. Los animales vacunados de T02 (1 !g) s6lo mostraron reacciones el dia 1 tras la vacunaci6n. Al septimo dia tras la vacunaci6n no habia diferencias estadisticamente significativas en las reacciones del lugar de la inyecci6n entre los grupos de tratamiento. Para el dia 14, todas las reacciones en el lugar de la inyecci6n se habian disipado.
Las reacciones en el lugar de la inyecci6n tras la segunda vacunaci6n se presentan en la Tabla 2. Tras la segunda vacunaci6n, las mayores reacciones medias en el lugar de la inyecci6n se observaron en T06 (256 !g), de las que la mayor reacci6n media en el lugar de la inyecci6n midi6 50,03 cm3 (un dia despues de la vacunaci6n). Las reacciones en el lugar de la inyecci6n se demostraron en los animales de T05 (64 !g) y T04 (16 !g) hasta 7 dias despues de la segunda vacunaci6n. Se demostraron reacciones en el lugar de la inyecci6n minimas en los animales de T03 (4 !g) y T02 (1 !g) hasta 7 dias despues de la vacunaci6n. Se demostraronreacciones en el lugar de lainyecci6n no estadisticamente diferentes de las del grupo de pl acebo en T 02 (1!g) y T03 (4 !g) despues de la vacunaci6n. Catorce dias despues de la segunda vacunaci6n no se observaron reacciones en el lugar de la inyecci6n.
La frecuencia de las reacciones en el lugar de la inyecci6n tras la primera vacunaci6n se presenta en la Tabla 3. La LSM de la frecuencia global mayor, 76 %, de los lugares de la inyecci6n que exhibian una reacci6n en cualquier momento despues de la primera vacunaci6n se observ6 tras la vacunaci6n con T06 (256 !g). La siguiente mas frecuente fue 72 % de los lugares de la inyecci6n que mostraban una reacci6n tras la primera vacunaci6n con T05 (64 !g), 69 % tras la primera vacunaci6n con t04 (16 !g) y 63 % tras la primera vacunaci6n con T03 (4 !g). La frecuencia menor, 38 %, sigui6 a la primera vacunaci6n de T02 (1 !g).
La frecuencia de las reacciones en el lugar de la inyecci6n tras la segunda vacunaci6n se presenta en la Tabla 4. La LSM de la frecuencia global para cada vacuna fue consistente con la observada tras la primera vacunaci6n.
La incidencia y la duraci6n de las reacciones en el lugar de la inyecci6n tras la vacunaci6n se resumen en la Tabla 5. La incidencia (o el numero de perros que muestran una reacci6n en algun momento) de una reacci6n medible en el lugar de la inyecci6n fue del 100 % para T03, T04, T05 y T06 (4 !g, 16 !g, 64 !g y 256 !g, respectivamente) tras la primera y l a s egunda va cunaci6n. Los animales que r ecibieron T 02 ( 1 !g) m ostraron l a m enor i ncidencia d e reacciones en el lugar de la inyecci6n tras la vacunaci6n (57,1 %).
La duraci6n de la reacci6n (expresada como la media de minimos cuadrados de los dias con una reacci6n mostrada en la Tabla 5) fue mayor para los animales vacunados con T04, T05 y T06 (16 !g, 64 !g y 256 !g, respectivamente) tras la primera y la segunda vacunaci6n (de 2,7 a 5,1 dias tras la primera vacunaci6n y de 6,0 a 6,7 dias tras la segunda vacunaci6n). Los animales vacunados con T02 y T03 (1 !g y 4 !g, respectivamente) mostraron el menor numero de dias con una reacci6n en el lugar de la inyecci6n tras la primera y la segunda vacunaci6n (0,3 y 1,3 dias tras la primera vacunaci6n y 1,9 y 4,5 dias tras la segunda vacunaci6n).
Temperaturas rectales
Las mediciones de la temperatura rectal media se resumen en la Tabla 6. La LSM de la temperatura rectal para T02 (1 !g) los dias 1 y 24, para T03 (4 !g) los dias 1, 21 y 24, para T04 (16 !g) los dias 2 y 24, para T05 (64 !g) el dia 23 y para T06 (256 !g) los dias 0, 1 y 24 fueron significativamente diferentes de las del grupo de placebo. El dia 23, ninguna comparaci6n era estadisticamente significativa (P> 0,05) con respecto al placebo.
Serología de p68 mediante ELISA
En la Tabla 7 se presenta un resumen de los datos del ELISA para p68. La media geometrica de los titulos de virus antes de la vacunaci6n de los anticuerpos especificos de p68 en el ELISA en todos los grupos fue baja (intervalo de 24,9 a 28,9) y los titulos para el placebo permanecieron bajos a lo largo de todo el estudio. Veintiun dias despues de la primera vacunaci6n, la media geometrica de los titulos de p68 en el ELISA habia aumentado en el tratamiento de vacunaci6n (intervalo 55,2 a 4.411,7), no obstante el titulo con T02 (1 !g) no fue estadisticamente diferente del placebo (T01). Cuarenta y dos dias despues de la segunda vacunaci6n, la media geometrica de los titulos aument6 mas en todos los grupos vacunados (intervalo 674,6 a 48.382,0), lo que demostr6 una buena respuesta serol6gica a la vacunaci6n.
Serología del amiloide sérico A (SAA)
Los titulos de SAA se resumen en la Tabla 8. antes de la exposici6n, la media geometrica de los titulos de SAA eran bajos en todos los grupos de tratamiento (intervalo de 0,1 a 0,5). Tras la exposici6n, los titulos de GMT con T01 variaron de 1,5 a 14 6.0,y en los grupos de t ratamiento con p68 variaron de 0,3 a 23,1. Todos los grupos de tratamiento eran estadisticamente diferentes al placebo los dias 50, 52, 54 y 56. No se demostraron diferencias estadisticas entre las vacunas con p68 con la excepci6n de T02 (1 !g) el dia 52, momento en que se demostr6 una media geometrica estadisticamente diferente de todos los demas grupos de tratamiento con p68.
Respuesta a la exposición
Los datos de la respuesta a la exposici6n se presentan en la Tabla 9. La respuesta se determin6 vigilando la tos tras la exposici6n y las observaciones se analizaron usando dos procedimientos: media de minimos cuadrados del numero de dias con tos y dos dias consecutivos con tos (incidencia de la enfermedad).
El analisis del numero medio de dias con tos no mostr6 una diferencia estadisticamente significativa entre los grupos de tratamiento con p68; pero, los perros vacunados con placebo tosieron una media de 8,6 dias, mientras que los perros a los que se administr6 las vacunas con p68 tosieron significativamente menos, variando las medias entre 2,2 y 4,7 dias.
Cuando se evalu6 a los perros usando la Incidencia de la Enfermedad, se observ6 que todos los perros con T01 (placebo) tosian durante dos dias consecutivos (100 % de Incidencia de la Enfermedad). Los perros vacunados con T04 (16 !g) and T05 (64 !g) presentaron una Incidencia de la Enfermedad del 55,6 % y 66,7 %, respectivamente. Se observ6 que s6lo el 28,6 % de los perros vacunados con T02 (1 !g), el 50 % con T03 (4 !g) y el 33,3 % con T06 (256 !g) tosian durante dos dias consecutivos.
DISCUSIÓN:
En este estudio, el objetivo era establecer una relaci6n entre la dosis del antigeno, la respuesta inmunitaria y la protecci6n en perros. Las dosis del antigeno p68 analizadas fueron 1 !g, 4 !g, 16 !g, 64 !g y 256 !g.
El analisis de las mediciones de las reacciones en el lugar de la inyecci6n demostr6 una reacci6n insignificante en los grupos de tratamiento con p68, con la excepci6n de T06 (256 !g) el primer dia tras la segunda vacunaci6n. Las reacciones que se observaron tendian a ser pequenas, en general de tamano decreciente durante los periodos de observaci6n. El tamano de estas reacciones fue clinicamente insignificante y muy probablemente pasaria inadvertido en perros sin afeitar.
Las temperaturas rectales tras la vacunaci6n fueron poco importantes y estaban dentro de los limites normales para todos los perros en todos los grupos.
La respuesta serol6gica a la vacunaci6n fue excelente en los grupos T03 a T06. En estos grupos de tratamiento, todos mostraron titulos de p68 en el ELISA significativamente mayores en comparaci6n con el placebo, desde el dia 21 al dia 63. Se demostr6 que T02 (1 !g) presentaba titulos de p68 en el ELISA significativos en comparaci6n con T01 (placebo) desde el dia 42 al dia 63. Los titulos mas altos se observaron en T05 (64 !g) y T06 (256 !g).
El analisis de la respuesta de SAA en todos los perros vacunados con p68 tras la exposici6n indic6 una elevaci6n mucho menor en el SAA tras la exposici6n en comparaci6n con los perros control. No se demostraron diferencias entre los niveles de dosis de la vacuna con p68 tras la exposici6n, con la excepci6n de T02 (1 !g) el dia 52, que mostr6 una media geometrica estadisticamente diferente de todos los demas grupos de tratamiento con p68.
Las observaciones de la tos tras la exposici6n se analizaron usando la media de minimos cuadrados (LSM) del numero de dias con tos o dos dias consecutivos con tos (incidencia de la enfermedad). Usando la LSM de los dias con tos se demostr6 una diferencia significativa entre el placebo y todos los grupos vacunados con p68, aunque no se demostr6 diferencia alguna entre los diferentes niveles de dosis de la vacuna con p68. Usando la Incidencia de la Enfermedad, los perros vacunados con T02 (1 ug), T03 (4 ug) y T06 (256 ug) tosian significativamente menos que los que recibieron placebo.
CONCLUSIONES:
El estudio se realiz6 para establecer una relaci6n entre la dosis del antigeno, la respuesta inmunitaria y la protecci6n en perros. Las dosis del antigeno p68 analizadas fueron 1 !g, 4 !g, 16 !g, 64 !g y 256 !g.
Todas las vacunas eran seguras, lo que se demostr6 por la aparici6n de reacciones minimas en el lugar de la inyecci6n, temperaturas rectales normales y ausencia de respuesta adversa a la vacunaci6n. El tamano de las reacciones en el l ugar d e l a i nyecci6n y la d uraci6n de est as r eacciones fueron m enores en los grupos de tratamiento antigenico menor. La respuesta serol6gica a la vacunaci6n medida mediante los titulos de ELISA fue excelente con los grupos de dosis antigenicas mayores, lo que demuestra respuestas serol6gicas mayores. Al usar la LSM de los dias con tos como procedimiento de comparaci6n, todos los grupos de tratamiento mostraron una reducci6n significativa de la tos en comparaci6n con el placebo. No se observaron diferencias entre los grupos de tratamiento. Cuando se us6 la tos durante dos dias consecutivos (o la Incidencia de la Enfermedad) para comparar, los perros vacunados con T02 (1 !g), T03 (4 !g) y T06 (256 !g) tosian significativamente menos que los que recibieron placebo.
Tabla 1. Volumen de la reacción en el lugar de la inyección en perros tras la primera vacunación con antígeno p68 o placebo
Media LS del tamano (cm3) de las reacciones en el lugar de la inyecci6n tras la primera vacunaci6n por dia del estudio1:
Tratamiento(N) 0 1 2 3 4 5 6 7 14 T01 Placebo (9) 0,00a 0, 00a 0, 00a 0, 00a 0, 00a 0, 00a 0, 00a 0, 00a 0, 00a T02 p68, 1 !g (7) 0,00a 4, 00b 0, 00a,b 0, 00a 0, 00a 0, 00a 0, 00e,b 0, 00a 0, 00a T03 p68, 4 !g 8) 0,00a 0, 00ac 0, 64a,b 4,56b 1, 14a,b 0, 39a 0, 00a 0, 00a 0, 00a T04 p68, 16 !g (9) 0,00a 0, 00a 3, 56b 4,28b 1,32a,b 1, 79a,b 2, 36a,b 0, 38a 0, 00a T05 p68, 64 !g (9) 0,00a 10,44b 14,69c 10,56c 4, 01b,c 4, 40b 2, 82a,b 1, 15a 0, 00a T06 p68, 256 !g (9) 0,00a 7, 00e 8, 53d 7, 50b,c 5, 62c 4, 36b 3, 56b 1, 24a 0, 00a
Tabla 2. Volumen de la reacción en el lugar de la inyección en perros tras la segunda vacunación con 5 antígeno p68 o placebo
Media LS del tamano (cm3) de las reacciones en el lugar de la inyecci6n tras la segunda vacunaci6n por dia del estudio1:
Tratamiento (N) 0 (21) 1 (22) 2 (23) 3 (24) 4 (25) 5 (26) 6 (27) 7 (28) 14 (35) T01 Placebo (9) 0,00a 0, 00a 0, 00a 0, 00a 0, 00a 0, 00a 0, 00a 0, 00a 0, 00a T02 p68, 1 !g (7) 0,00a 0, 54a 2, 36a,b 1, 14a 0, 45a 0, 61a 0, 50a 0, 16a 0, 00a
33a,b,c 59a,b89a,b23a,b
T03 p68, 4 !g 8) 0,00a 0, 00a 5, 4,20a 2, 2, 1, 53a 1, 0, 00a T04 p68, 16 !g (9) 0,00a 0, 00a 7, 58b,c 10,67b 7,25b,c 7, 28c 7, 97b 5, 14a,b 0, 00a T05 p68, 64 !g (9) 0,00a 2, 89a 10,99c 14,28b 9, 79c 9, 75c 11,14b 6, 50b 0, 00a T06 p68, 256 !g (9) 0,00a 50,03b 8, 58b,c 13,44b 11,32c 7,42b,c 9,51b 2, 69a,b 0, 00a
1Los valores con superindices diferentes son estadisticamente diferentes (P : 0,05)
Tabla 3. Frecuencia de la reacción en el lugar de la inyección tras la primera vacunación con antígeno p68 o placebo
Porcentaje medio LS de perros por Pen2 con reacci6n tras la primera vacunaci6n por dia del estudio3:
Tratamiento (N)
0 1 2 3 4 5 6 7 14
T01 Placebo (9) 0,00 a, 000 a, 000 a, 000 a, 000 a, 000 a, 000 a, 000 a, 000 a T02 p68, 1 !g (7) 0,00a 100,00b 83,33b 50,00b 25,00a 12,50� 37,50b 37,50b, 000 a T03 p68, 4 !g (8) 0,00a 90,00b,c 80,00b 90,00c 80,00b 63,33b 80,00c 80,00c, 000 a T04 p68, 16 !g (9) 0,00a 62,50c 87,50b 100,00c 100,00b 77,50b,c 87,50c 100,00c 10,00a T05 p68, 64 !g (9) 0,00a 90,00b,c 100,00b 100,00c 90,00b 90,00b,c 90,00c 90,00c, 000 a T06 p68, 256 !g (9) 0,00a 100,00b,d 100,00b 100,00c 100,00b 100,00c 87,50c 100,00c, 000 a
Tabla 4. Frecuencia de la reacción en el lugar de la inyección tras la segunda vacunación con antígeno p68 o placebo
Porcentaje medio LS de perros por Lapiz' con reacci6n tras la segunda vacunaci6n por dia del estudio2:
Tratamiento (N)
0 (21) 1 (22) 2 (23) 3 (24) 4 (25) 5 (26) 6 (27) 7 (28) 14 (35) T01 Placebo (9) 0,00 a, 000 a 20,00a 10,00a, 000 a, 000 a, 000 a, 000 a, 000 a T02 p68, 1 !g (7) 0,00a 58,33b 58,33b 58,33b 45,83b 41,67b 41,67b 29,17b, 000 b T03 p68, 4 !g (8) 0,00a 83,33b 100,00d 100,00c 90,00c 73,33c 73,33c 73,33c, 000a T04 p68, 16 !g (9) 0,00a 90,00c,d 100,00d 100,00c 100,00c 100,00d 100,00d 100,00d, 000a T05 p68, 64 !g (9) 0,00a 100,00d 100,00d 100,00c 100,00c 100,00d 100,00d 100,00d, 000a T06 p68, 256 !g (9) 0,00a 100,00d 100,00d 100,00c 100,00c 100,00d 100,00d 87,50c,d, 000a
2Dos lapices por tratamiento
3Los valores con superindices diferentes son estadisticamente diferentes (P : 0,05)
Tabla 5: Duración de las reacciones en el lugar de la inyección tras la vacunación con antígeno p68 o placebo
Tratamiento (N) Reacci6n medible Media LS de dias Media LS de dias (en cualquier con reacci6n4 (tras con reacci6n1 (tras momento) la primera la segunda vacunaci6n) vacunaci6n)
T01 Placebo (9) 0/9 0,0a -0, 0a (0 %) T02 p68, 1 !g (7) 4/7 0,3a 1, 9b
(57,1 %) T03 p68, 4 !g (8) 8/8 (100 %) 1,3a,b 4, 5c T04 p68, 16 !g (9) 9/9 (100 %) 2,7b 6, 0d T05 p68, 64 !g (9) 9/9 (100 %) 4,9c 6,3d T06 p68, 256 !g (9) 9/9 (100 %) 5,1c 6, 7d
4Los valores con superindices diferentes son estadisticamente diferentes (P : 0,05)
Tabla 6. Temperaturas rectales medias para perros tras la vacunación con antígeno p68 o placebo
Tratamiento (N) Media LS de la temperatura rectal por dia de estudio5 0 1 2 3 2122 2324
9a,b 9a,b
T01 Placebo (9) 38,9a,b 38, 9a 38, 39, 0a 39, 0a 38, 8a 38, 39, 0a
7a,b6b,c
T02 p68, 1 !g (7) 39,0a,b 38, 5b 38, 8a 38, 4b 38, 7a 38, 6a 38, 38, 7a,b a
T03 p68, 4 !g (8) 39,0a 38, 38,6� 39,0a 38,6b 38,6a 38,6 38,4c T04 p68, 16 !g (9) 39,0a 39,0a 38,9b 38,7a,b 38,7a 38,8a 38,7a,b 38,6b,c T05 p68, 64 !g (9) 38,9a,b 38,9� 38,9a,b 38,8� 38,7a 38,7a 39,0b 38,7� ,b T06 p68, 256 !g (9) 38,7b 39,3c 38,8a,b 39,0a 38,8a 38,8a 38,9a,b 38,6b,c
Tabla 7. Títulos de p68 en la serología con ELISA DAB en perros tras la vacunación con antígeno p68 o placebo6
Media geometrica de los titulos del virus para ELISA de p68 por dia de estudio2:
Tratamiento (N) 0 21 42 49 63 T01 Placebo (9) 25,2� 48,3� 30,0a 28,2a 230,4a T02 p68, 1 !g (7) 25,5a 55,2� 674,6b 294,4b 1301,7b T03 p68, 4 !g (8) 25,3� 310,9b 7865,0c 4414,8c 10580,1c T04 p68, 16 !g (9) 28,9� 515,4b 12180,4c 5824,4c 11429,3c T05 p68, 64 !g (9) 25,3� 1699,5c 36460,6d 17593,9d 22689,3c,d T06 p68, 256 !g (9) 24,9� 4411,7d 48382,0d 25980,9d 30594,3d 1 Las vacunaciones se administraron los dias del estudio 0 y 2 1. Los va lores con superindices diferentes son estadisticamente diferentes (P : 0,05)6 Las vacunaciones se administraron los dias del estudio 0 y 21 y la exposici6n se realiz6 el dia 49 del estudio. 2Los valores con superindices diferentes son estadisticamente diferentes (P : 0,05)
Tabla 8. Títulos de amiloide sérico A (SAA) en perros tras la exposición de los perros vacunados a antígeno 10 p68 o placebo
Tratamiento (N) Media geometrica de los titulos de amiloide serico a por dia de estudio tras la exposici6n7: 49 50 52 54 56 58
T01 Placebo (9) 0,2a 146,0a 87,2a 153,6a 14,7a 1, 5a T02 p68, 1 !g (7) 0,2a 8,3b 1,2b 0,7b 0,6b 0,3a T03 p68, 4 !g (8) 0,2a 9,9b 6,4c 2,3b 1,2b 1,8a T04 p68, 16 !g (9) 0,1a 163b 11,6c 3, 0b 1, 6b 1, 4a T05 p68, 64 !g (9) 0,5a 11,4b 8, 0c 3, 4b 1, 3b 1, 2a T06 p68, 256 !g (9) 0,5a 23,1b 16,4c 3, 8b 1, 1b 0, 4a
1Los valores con superindices diferentes son estadisticamente diferentes (P : 0,05)
Tabla 9. Índice y duración de la tos en perros tras la exposición de los perros vacunados a antígeno p68 o placebo
Tratamiento (N) Incidencia de la enfermedad8,2 Media LS de dias con tos2 T01 Placebo (9) 9/9� 8,6 (100 %) T02 p68, 1 !g (7) 2/7B 2,2b (28,6 %) T03 p68, 4 !g (8) 4/8b 3,8b (50 %) T04 p68, 16 !g (9) 5/9a,b 3,7b (55,6 %) T05 p68, 64 !g (9) 6/9a,b 4,7b (66,7 %) T06 p68, 256 !g (9) 3/9b 3,0b
(33,3 %) 8 Basado en tos dos dias consecutivos. 2Los valores con superindices diferentes son estadisticamente diferentes (P : 0,05)
EJEMPLO 2
5 ESTUDIO DE INMUNOGENICIDAD CON P68 DE BORDETELLA CANINA Animales
Se adquirieron cuarenta y cinco perros machos y hembras de raza mixta. Se administr6 una v acuna contra el parvovirus MLV a todos los cachorros el dia en que los cachorros llegaron al centro del estudio. No se administr6 a los cachorros ninguna otra vacuna, aparte de l os productos experimentales, durante el estudio. Los perros tenian
10 aproximadamente 9 semanas de edad (± 1 semana) el dia 0 (dia de la primera vacunaci6n).
Se mantuvo a los perros en una instalaci6n de aislamiento, necesario para prevenir la exposici6n a Bordetella y a otros pat6genos caninos antes de la e xposici6n. D espues de l a e xposici6n m ediante aerosol Bordetella se continuaron los procedimientos de aislamiento para prevenir la exposici6n a otros pat6genos caninos.
Vacunas
15 En los grupos de tratamiento T01 y T02 se us6 soluci6nsalina esteril como vacunaplacebo. La vacuna de p68 recombinante canina de Bordetella Bronchiseptica se us6 en los grupos de tratamiento T03 y T04. El gen estructural del antigeno p68 se clon6 en Escherichia coli y la expresi6n del gen se regi6 mediante un promotor sensible a la temperatura. L as celulas se l isaron y l os cu erpos de inclusi6n s e s epararon m ediante ce ntrifugaci6n. E l p6 8 recombinante en los cuerpos de inclusi6n se solubiliz6 mediante tratamiento con SDS. El p68 recombinante (15 !g
20 por ml) se combin6 con 50 !g de Quil A y 50 !g de colesterol por ml en soluci6n salina esteril como diluyente. Cada dosis de un ml contenia 0,28 % de etanol y 0,01 % de timerosal.
Inóculo de exposición
La cepa Bihr Cat de Bordetella bronchiseptica se prepar6 como in6culo de exposici6n usando el procedimiento actualmente empleado por Biologics Control Laboratories-Microbiology. Placas de agar Bordet-Genou se sembraron 25 con un crecimiento confluente de Bordetella bronchiseptica, cepa Bihr Cat, y se incubaron durante 48 horas a 37,5 ± 2,5 °C. Las colonias virulentas de la fase I se seleccionaron y se sembraron mediante raspado en agar Bordet-Genou y se incubaron durante 24 horas a 37,5 ± 2,5 °C. Tras la incubaci6n se us6 soluci6n salina de Bordetella para lavar las colonias del agar yel antigeno se diluy6 hasta una densidad 6ptica de 0,80 a 600 nm . Se realiz6 un recuento de celulas antes y despues de la exposici6n para confirmar la lectura del nefel6metro. La concentraci6n
30 diana paraexposici6n fue de aproximadamente 1 x 109 UFC. La concentraci6n pre-exposici6nfue de 2,37 x 108 UFC (100 % fase I) y el recuento de la concentraci6n postexposici6n fue de 1,35 x 109 UFC (100 % fase I).8 UFC
Diseño del estudio
Tabla resumen Aleatorizaci6n/Enmascaramiento
Grupo de tratamiento
Tratamiento Via Numero de animales
T01
Control salino Intramuscular 8
T02
Control salino Subcutanea 7
T03
p68 15 !g/dosis Subcutanea 15
T04
p68 15 !g/dosis Intramuscular 15
Durante el periodo de tiempo desde la vacunaci6n hasta el dia de la exposici6n, los animales fueron asignados a tratamientos de acuerdo con un diseno de bloque generalizado. Los tratamientos fueron asignados al azar a los cuartos. El dia de la exposici6n, se asign6 aleatoriamente a los animales a los cuartos de exposici6n por bloque.
Individuos cualificados, que no conocian los grupos de tratamiento asignados, realizaron ensayos microbiol6gicos y serol6gicos, y evaluaciones de los lugares de la inyecci6n, mediciones de las temperaturas rectales y observaciones de la tos.
Analisis de Datos
Las variables de la respuesta a la vacunaci6n consistian en los datos del lugar de lainyecci6n, las temperaturas rectales y los titulos en el ELISA de p68. Los datos del lugar de la inyecci6n se resumieron de los siguientes modos: 1) numero de animales que tienen una reacci6n medible por tratamiento y dia de estudio, 2) numero de puntos de tiempo del animal que tiene una reacci6n medible por tratamiento, 3) numero de animales que tiene una reacci6n medible por tratamiento en cualquier punto de tiempo por tratamiento.
Por separado de la primera y la segunda vacunaci6n, los datos del volumen del lugar de la inyecci6n (cm cubicos), las temperaturas rectales y del log natural transformada del titulo de ELISA p68 se analizaron usando un modelo mixto lineal general.
Se construyeron contrastes lineales a priori del tratamiento por media de minimos cuadrados del punto de tiempo de observaci6n para analizar lasdiferencias del grupode tratamiento en cada punto de tiempo de observaci6n y comparar los puntos de tiempo dentro de cada tratamiento. Para todas las comparaciones se us6 un nivel de significaci6n del 5 %.
Las variables de la respuesta postexposici6n consistian en observaciones diarias de la tos, los titulos de ELISA p68 y los titulos de amiloide serico A. El numero de dias de tos durante el periodo de postexposici6n se analiz6 usando un modelo mixto lineal general.
Se construyeron contrastes a priori de la media de minimos cuadrados del tratamiento para analizar las diferencias por grupo de tratamiento. Para todas las comparaciones se us6 un nivel de significaci6n del 5 %.
Por separado de la primera y la segunda vacunaci6n, la prueba exacta de Fisher se us6 para comparar los grupos de tratamientos para la incidencia de dos dias consecutivos de tos. Para todas las comparaciones se us6 un nivel de significaci6n del 5 %.
Para los datos de los titulos de amiloide serico A (SAA) tras la exposici6n se aplic6 la transformaci6n log natural a los valores del titulo antes del analisis usando un modelo mixto lineal general.
Se construyeron contrastes lineales a priori del tratamiento por media de minimos cuadrados del punto de tiempo de observaci6n para analizar las diferencias del grupode tratamiento en cada punto de tiempo de observaci6n y comparar los puntos de tiempo dentro de cada tratamiento. Para todas las comparaciones se us6 un nivel de significaci6n del 5 %.
Procedimiento del estudio
Procedimientos detallados del animal
Cuarenta y cinco (45) cachorros seronegativos y con cultivos negativos fueron asignados aleatoriamente a uno de 4 grupos de tratamiento. 0cho y siete perros se asignaron a los grupos control intramuscular (IM) o subcutaneo (SC) respectivamente, para un tota de 15 perros control. Quince perros se asignaron al grupo de tratamiento SC con p68 y 15 perros se asignaron al grupo de tratamiento IM con p68. Los grupos de tratamiento se detallan en la secci6n Diseno del estudio anterior.
El dia 0 se design6 como el dia de la primera vacunaci6n. Las vacunaciones se administraron el dia 0 y se repitieron 21 dias despues. Para la primera vacunaci6n se us6 el lado derecho del cuello y para la segunda vacunaci6n se us6 el lado izquierdo del cuello. Las inyecciones intramusculares se administraron en el musculo semimembranoso derecho e izquierdo para la primera y la segunda vacunaci6n, respectivamente. Todos los lugares de la inyecci6n se midieron en tres dimensiones durante siete dias tras cada vacunaci6n con una medici6n de seguimiento realizada 14 dias despues de la vacunaci6n. Las temperaturas rectales se monitorizaron el dia dela vacunaci6n (antes de la vacunaci6n) y durante tres dias tras cada vacunaci6n.
El dia 35, de todos los animales se obtuvo un exudado traqueal para cultivo de B. bronchiseptica y se extrajo sangre para los titulos de aglutinaci6n. Todos los animales dieron negativo en el exudado traqueal y eran serol6gicamente negativos a Bordetella, y se estim6 que eran aptos para la exposici6n.
El dia 45, veinticuatro dias despues de la segunda vacunaci6n se administr6 a todos los perros una exposici6n en aerosol de B. bronchiseptica. Los perros sedados fueron expuestos usando un cono nasal desechable, que se ajust6 bien sobre el hocico del perro sedado. Elcono nasal se fij6 aun nebulizador que estaba fijado a una bombade presi6n de vacio fijada a 0,04 a 0,041MPa. Unmldelmaterialdeexposici6n se introdujo en el nebulizadory el material de exposici6n aerosolizado se administr6 a cada perro durante 4 minutos. El personal querealizaba las
5 observaciones desconocia las asignaciones del grupo de tratamiento.
Se monitoriz6 la tos de los animales durante 14 dias despues de la exposici6n (dias 46-59). Las observaciones se realizaron en 2 (dos) periodos de aproximadamente 30 minutos aproximadamente a la misma hora del dia, una por la manana y otra por la noche, y se registraron los resultados.
0btenci6n de sangre
10 La sangre para los titulos de aglutinaci6n se obtuvo antes de la primera vacunaci6n yantes de la exposici6n. La sangre para la evaluaci6n en ELISA de anti-p68 se obtuvo antes de la vacunaci6n los dias 0 y 21 y los dias 35, 45 y
59. La sangre para el ensayo para el amiloide serico A (SAA) se obtuvo el dia de la exposici6n (dia 45) y los dias 46, 48, 50, 52 y 54.
Pruebas realizadas con las muestras
15 Se evaluaron los exudados traqueales para detectar la presencia de B. bronchiseptica mediante cultivo. Cada exudado traqueal se sembr6 sobre una placa de agar selectivo para Bordetella. Se incluyeron controles positivos y negativos. Las placas se incubaron a 37,5 ± 2.5 °C durante 48 ± 4 horas. Las colonias resultantes en cada placa se compararon con el control positivo y cualquier colonia que pareciera identica al control positivo se analiz6 despues para confirmar la presencia de B. bronchiseptica. Las pruebas conformacionales incluyeron el uso de TSI, citrato y
20 agar urea y medio con rojo nitrato.
Los sueros se evaluaron para detectar los titulos de aglutinaci6n, analisis de ELISA p68 o analisis de SAA usando los procedimientos siguientes.
Titulos de aglutinaci6n- Los sueros se diluyeron en serie en placas de microtitulaci6n usando soluci6n salina de Bordetella. En cada placa se incluyeron controles positivos o negativos. La cepa 87 (cultivada en agar Bordet
25 Genou, recogida, inactivada y diluida al 20 % T a 630 nm) se us6 como antigeno de aglutinaci6n y se anadi6 a cada pocillo. Las placas se agitaron e i ncubaron a 35 ± 2 °C durante 2 horas. Las placas se leyerondespuesde una segunda incubaci6n a temperatura ambiente durante 22 horas. El titulo final se determin6 usando el ultimo pocillo para mostrar 50 % de aglutinaci6n.
Titulos de ELISA p68- El antigeno p68 recombinante se captur6 en una placa de microtitulaci6n de 96 pocillos
30 recubierta con un antisuero policlonal especifico del antigeno p68 de Bordetella. A la placa se anadieron diluciones en serie al doble del suero canino y se incub6. En cada placa se incluyeron controles positivos y negativos a una diluci6n de 1:1000. Se us6 un conjugado indicador de IgG anti-perro de cabra purificado por afinidad marcado con peroxidasa p ara det ectar an ticuerpos especificos para el ant igeno p 68. D espues se ana di6 un su strato A BTS cromogenico y se ley6 la placa cuando los pocillos control positivo tenian una D0 de 1,2 + 0,2. Se calcul6 el titulo de
35 una muestra dada como el reciproco de la ultima diluci6n con una densidad 6ptica superior a la media de la diluci6n de suero control negativo mas cinco desviaciones estandar.
Titulos de SAA - Los titulos de amiloide serico A canino se evaluaron usando un kit adquirido en Accuplex Co., University of Nebraska Medical Center, 0maha, NE 68198. Brevemente, el SAA canino se captur6 en una placa de microtitulaci6n revestida con un anticuerpo monoclonal anti-SAA canino. Se anadieron a la placa muestras diluidas
40 del suero salino, seguido deun conjugado de anticuerpoanti-canino marcado con biotina. Tras la incubaci6nse anadi6 un sustrato cromogenico conjugado con estreptavidina peroxidasa. La placa se ley6 tras 30 minutos.
Resultados
Temperaturas rectales
El resumen de las mediciones de la temperatura rectal se presenta en las tablas 10 y 11.
45 Tabla 10: Media de mínimos cuadrados de las temperaturas rectales (ºC) en perros tras vacunación con solución salina o p68 de Bordetella (tras la primera vacunacióna)
Temperaturas rectales (°C)
Tratamiento
Dia del estudio Error Est.
01 23
T01 salino IM 38,2 38,2 38,2 38,2 0,08
T02 salino SC 38,0 38,3 38,2 38,2 0,09 T03 p68 SC 38,1 38,3 38,1 38,0 0,06 T04 p68 IM 38,2 38,4 38,2 38,2 0,06 a Primera vacunaci6n administrada el dia 0.
Tabla 11: Media de mínimos cuadrados de las temperaturas rectales (ºC) en perros tras vacunación con solución salina o p68 de Bordetella (tras la segunda vacunacióna)
Temperaturas rectales (°C)
Tratamiento
Dia del estudio Error Est.
21 22 23 24 T01 salino IM 38,1 38,3 38,2 38,2 0,10 T02 salino SC 38,5 38,5 38,2 38,2 0,10
T03 p68 SC 38,0 38,3 38,1 38,1 0,08 T04 p68 IM 38,1 38,4 38,4 38,4 0,08 a Segunda vacunaci6n administrada el dia 21.
No se observaron diferencias significativas entre cualquiera de los grupos cualquier dia tras la primera vacunaci6n.
5 Se observ6 una diferencia significativa entre los perros vacunados con soluci6n salina y todos los perros vacunados con p68 (p= 0,0053 para T01T02 v T03T04) el dia 21. Se demostr6 una diferencia significativa (p= 0,0124) entre los vacunados SC e IM con p68 el dia 24.
Reacciones en el lugar de la inyecci6n
Las reacciones en el lugar de la inyecci6n se resumen en las Tablas 12 y 13. Debido a un descuido tecnico no se 10 realizaron observaciones en el lugar de la inyecci6n en la observaci6n a los 14 dias tras la segunda vacunaci6n (Dia 35).
Se observaron reacciones medibles en el lugar de la inyecci6n en T03 (p68 SC) y fueron de tamano minimo. En un perro de T04 (p68 IM) se observ6 una pequena reacci6n en el lugar de la inyecci6n al dia 3, pero el minimo impacto de la medici6n no se refleja en la media global para el grupo.
15 Tabla 12: Media de mínimos cuadrados (cm cúbicos) de las reacciones en el lugar de la inyección en perros tras vacunación con solución salina o p68 (15 g/dosis) de Bordetella (tras la primera vacunacióna)
Tamano medio (cm cubicos) de las reacciones en el lugar de la inyecci6n Tratamiento b Dia de estudio
1
2 3 4 5 6 7 14
T01 salino IM
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
T02 salino SC
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
T03 p68 SC T04 p68 IM
7,4 0,0 4,3 0,0 6,8 0,0c 3,4 0,0 2,5 0,0 2,6 0,0 1,9 0,0 0,1 0,0
a Primera vacunaci6n administrada el dia 0 bError estandar para T01= 0,80, T02=0,84, T03=0,70, y T04=0,70 cUn perro present6 una pequena reacci6n en el lugar de lainyecci6n (0,5 cm 2) pero debido al redondeado, el impacto minimo del valor no se refleja en la media global.
Tabla 13. Media de mínimos cuadrados (cm cúbicos) de las reacciones en el lugar de la inyección en perros tras vacunación con solución salina o p68 (15 !g/dosis) de Bordetella (tras la segunda vacunacióna)
Tratamientob Tamano medio (cm cubicos) de las reacciones en el lugar de la inyecci6n Día del estudio
22 23 24 25 26 27 28 T01 salino IM 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 T02 sa lino 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 SC T03 p68 SC 8,6 9,2 9,5 7,3 5,2 4,7 5,1 T04 p68 IM 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 a Segunda vacunaci6n administrada el dia 21 bError estandar para T01= 1,12, T02 = 1,19, T03 = 0,92, y T06 = 0,92
En la Tabla 14 se resumen las diferencias significativas en las mediciones de los lugares de la inyecci6n. Se observ6 una diferencia significativa en las mediciones de los lugares de la inyecci6n entre T02 (salino SC) frente a T03 (p68 15 !g S C) du rante se is dias tras la pr imera va cunaci6n. E l di a 7 y de nuev o el di a 14 ( la observaci6n d e reevaluaci6n de dos semanas) no se observaron diferencias significativas entre ningun grupo de tratamiento.
25 Se observ6 una diferencia significativa en las mediciones de los lugares de la inyecci6n entre T02 (salino SC) frente a T03 (p68 15 !g SC) durante siete dias tras la segunda vacunaci6n.
Tabla 14. Valores de significación para contrastes a priori entre la media de mínimos cuadrados de las mediciones de la reacción en el lugar de la inyección.
Dia de estudio
Contrastes (tratamiento frente a tratamiento) Valor p
1
T02 v T03 0,0001
T03 v T04
0,0001
T01T02 v T03T04
0,0001
2
T02 v T03 0,0007
T03 v T04
0,0008
T01T02 v T03T04
0,0101
3
T02 v T03 0,0001
T03 v T04
0,0001
T01T02 v T03T04
0,0002
4
T02 v T03 0,0044
T03 v T04
0,0042
T01T02 v T03T04
0,0339
5
T02 v T03 0,0313
T03 v T04
0,0253
22
T02 v T03 0,0001
T03 v T04
0,0001
T01T02 v T03T04
0,0002
23
T02 v T03 0,0001
T03 v T04
0,0001
T01T02 v T03T04
0,0001
24
T02 v T03 0,0001
T03 v T04
0,0001
T01T02 v T03T04
0,0001
25
T02 v T03 0,0001
T03 v T04
0,0001
T01T02 v T03T04
0,0013
26
T02 v T03 0,0013
T03 v T04
0,0007
T01T02 v T03T04
0,0172
27
T02 v T03 0,0035
T03 v T04
0,0019
T01T02 v T03T04
0,0313
S6lo se presentan los contrastes significativos (P< 0,05).
Titulos de p68 en ELISA
5 Los datos de ELISA de p68 se resumen en la Tabla 15 y la Figura 1. debido a la considerable respuesta de titulos a p68 en los perros vacunados se usaron varios minimos de titulaci6n a diferentes puntos de tiempo en el estudio. Las titulaciones para los dias 0 y 21 comenzaron a 50. Para los dias 35, 45 y 59, las titulaciones comenzaron a 200. Cualquier valor indicado como &quot;menor que&quot; se dividi6 por dos antes del analisis. El aumento incremental observado en los valores de p68 ELISA para los grupos control (T01 y T02) durante el curso del estudio se debe a estos valores
10 minimos de titulaci6n. Los titulos de aglutinaci6n permanecieron < 4.
Todos los animales vacunados con p68 mostraron un incremento por al menos cuatro de los titulos desde el primer dia de la vacunaci6n hasta el dia de la exposici6n (dia 0 frente al dia 45) cuando se compar6 con los animales vacunados con placebo.

Tabla 15. Media geométrica y errores estándar de los títulos finales de ELISA de p68 (15 g/dosis) en perros tras vacunación con solución salina o p68 (15 !g/dosis) y después de la exposición a aerosol de B. bronchiseptica.
Tratamiento
Dia del estudiob
0
Error 21 Error 35 Error 45 Error 59 Error
Est.
Est.
Est.
Est.
Est.
T01 sa lino
25,0 4,78 25,0 4,78 125,4 23,96 100,0 18,14 130,0 32,24
IM
T02 sa lino
25,0 5,06 25,0 5,06 113,5 23,00 100,0 19,39 100,0 26,50
SC
T03 p68 SC
25,0 3,93 189,5 29,77 10688,7 1679,20 4555,1 603,43 8796,0 1592,43
T04 p68 IM
25,0 3,93 121,4 19,08 11023,7 1731,85 4419,2 585,44 13718,1 2483,54
aLas titulaciones para los dias 0 y 21 comenzaron a 50. Las titulaciones para los dias 35, 45 y 59,las titulaciones comenzaron a 200. Cualquier valor indicado como &quot;menor que&quot; se dividi6 por dos antes del analisis. bLa primera vacunaci6n se produjo el dia 0; la segunda vacunaci6n se produjo el dia 21 y la exposici6n se realiz6 el dia 45.
Las diferencias significativas para la media de minimos cuadrados de los titulos de ELISA posvacunaci6n y postexposici6n se indican en la Tabla 16. No se observaron diferencias significativas entre los animales vacunados con p68 SC y p68 IM tras completar la vacunaci6n.

Tabla 16: Valores de significación para los contrastes a priori entre la media de mínimos cuadrados de los títulos finales de ELISA p68 posvacunación y postexposición.
Dia de estudio
Contraste Valor p
21
T01 v T04 0,0001
35 45
T02 v T03 T03 v T04 T01 v T04 T02 v T03 T01 v T04 0,0001 0,0491 0,0001 0,0001 0,0001
59
T02 v T03 T01 v T04 T02 v T03 0,0001 0,0001 0,0001
S6lo se presentan los contrastes significativos (P< 0,05).
Titulos de amiloide serico A
Los valores de SAA se determinaron los dias 0, 1, 3, 5, 7 y 9 tras la exposici6n. Los valores de amiloide serico A se
presentan en la Tabla 17 y se representan en la figura 2.
Tabla 17: Media geométrica y errores estándar de los títulos de amiloide sérico A en perro vacunados con 15 solución salina y p68 (15 !g/dosis) de Bordetella tras la exposición en aerosol a Bordetella bronchiseptica
Media geometrica y errores estandar del amiloide serico A Dia del estudioa
45
46 48 50 52 54
TRT
Media Error Media Error Media Error Media Error Media Error Media Error
est.
est.
est.
est.
est.
est.
T01
0,1 0,02 277,3 125,30 82,4 42,17 69,8 28,60 6,0 2,24 1,2 0,33
T02
0,4 0,06 384,5 185,63 128,9 70,46 215,9 94,56 28,0 11,23 3,7 1,11
T03
0,5 0,05 31,7 10,51 6,0 2,25 2,3 0,68 0,8 0,23 1,3 0,27
T04
0,3 0,04 50,0 16,58 8,6 3,22 5,0 1,50 2,4 0,65 0,7 0,14
aExposici6n administrada el dia 45
Las diferencias significativas en los titulos de SAA se resumen en la Tabla 18. Los controles salinos mostraron mayores titulos de SAA que los perros vacunados los dias 1, 3 y 5 tras la exposici6n. Los controles salinos SC continuaron para demostrar titulos significativamente mayores de SAA en comparaci6n con los perros vacunados
20 SC los dias 7 y9 tras la exposici6n.
Tabla 18. Valores de significación para contrastes a priori entre la media de mínimos cuadrados de los títulos de amiloide sérico A postexposición.
Dia de estudio 46
Contraste T01 v T04 0,0025 Valor p
T02 v T03
0,0001
48
T01 v T04 0,0007
T02 v T03
0,0001
50
T01 v T04 0,0001
T02 v T03
0,0001
52
T01 v T04 0,0093
T02 v T03
0,0001
54
T02 v T03 0,0493
S6lo se presentan los contrastes significativos (P< 0,05).
0bservaciones de tos
5 La exposici6n al aerosol para todos los grupos de tratamiento se produjo 24 dias despues de la segunda vacunaci6n (Dia 45). Las observaciones de tos se analizaron usando dos procedimientos, El estado de la enfermedad en base a dos dias consecutivos de tos (presentado en la Tabla 19) y el porcentaje de dias con tos (presentado en las Tablas 20 y 21). Cuando se evalu6 a los perros usando los criterios de dos dias consecutivos de tos, el 80 % de los perros vacunados con p68 (SC e IM) tosieron al menos dos dias consecutivos, mientras que los perros vacunados con
10 salino SCy salino IM tosi6 el 100 % y el 87,5 %,respectivamente. Cuando se evalu6 a los perros usando el porcentaje de dias en los que se observ6 tos, de los perros vacunados con p68 SC e IM tosi6 el 38,72 % y el 41.05 % de los dias observados, respectivamente. De los perros vacunados con salino SC y salino IM tosi6 el 69,04 % y el 62,66 %, respectivamente.
Tabla 19. Resumen del estado de la enfermedad en perros vacunados con solución salina y p68 (15 g/dosis) 15 de Bordetella en base a dos días consecutivos con tos tras la exposición en aerosol a Bordetella bronchiseptica
Numero de tratamiento N° de perros Porcentaje de perros con tos durante dos dias consecutivos
T01 salino IM 8 87,5
T02 Salino SC 7 100,0 T03 p68 15 !g/dosis SC 15 80,0 T04 p68 15 !g/dosis IM 15 80,0
No se demostraron diferencias significativas entre los perros vacunados con soluci6n salina y con p68 cuando el estado de la enfermedad se basaba en dos dias consecutivos con tos.
Tabla 20. Porcentaje medio de días con tos en perros vacunados con solución salina y p68 (15 !g/dosis) de Bordetella tras la exposición en aerosol a Bordetella bronchiseptica
Tratamiento Numero de perros Media Error est. T01 Salino IM 8 62,66 % 8,67 T02 Salino SC 7 69,04 % 8,86 T03 p68 15 !g/dosis SC 15 38,72 % 6,38 T04 p68 15 !g/dosis IM 15 41,05 % 6,44
Se demostr6 una diferencia significativa (p= 0,0112) entre T02 (salino SC) y T03 (p68 15 !g SC). No se demostraron diferencias significativas entre T01 (salino IM) y T04 (p68 15 !g IM).
Tabla 21. Porcentaje medio de días con tos por tratamiento en perros vacunados con solución salina y p68 (15 !g/dosis) de Bordetella tras la exposición en aerosol a Bordetella bronchiseptica
Parametro Estimaci6n Error est.
Media de salino (T01 y T02) 65,89 % 1,10 15 !g/dosis, media (T03 y T04) 39,88 % 4,34
Se demostr6 una diferencia significativa (p= 0,0022) entre los controles de soluci6n salina y los perros vacunados con p68.
Discusión
El estudio se disen6 para demostrar la seguridad y la eficacia de una vacuna de 15 !g/dosis de p68 de Bordetella en perros.
La seguridad se analiz6 usando las observaciones en el lugar de la inyecci6n y de la temperatura rectal. El analisis de las mediciones de la reacci6n en el lugar de la inyecci6n demostr6 una reacci6n insignificante en el grupo vacunado IM y reacciones minimas en el grupo vacunado SC. Las reacciones que se observarontendian a ser pequenas, en general de tamano decreciente durante los periodos de observaci6n. El tamano de estas reacciones muy probablemente pasaria inadvertido en perros sin afeitar. Aunque se observ6 una diferencia significativa entre la soluci6n salina y la vacunaci6n el dia 21 y entre los vacunados IM y SC el dia 24, las temperaturas rectales eran clinicamente no importantes y estaban dentro de los limites para todos los perros en todos los grupos.
La eficacia se analiz6 usando las observaciones de la medici6n de los titulos finales de p68 en ELISA y la tos. Con independencia de la via de administraci6n se demostr6 una buena respuesta de anticuerpos a p68 en los grupos vacunados con p68 el dia 35. Se observ6 una buena respuesta anamnesica en perros vacunados tras la exposici6n. Aunque tradicionalmente se han obtenido respuestas de anticuerpos mas altas con la via IM mas vascular y menos grasa en comparaci6n con la via SC, la diferencia entre los vacunados con p68 SC e IM no fue significativa a lo largo del curso del estudio.
El analisis de la respuesta de SAA en los perros vacunados con p68 de Bordetella y no vacunados tras la exposici6n indic6 una elevaci6n mucho menor en los valores de SAA en los grupos de animales vacunados, especialmente los dias 1, 3 y 5 tras la exposici6n.
Conclusiones
En este estudio se analiz6 la eficacia de una vacuna de p68, 15 !g/dosis, de Bordetella canina usando un modelo de exposici6n canino 24 dias despues de la exposici6n. La vacuna era segura, tal como lo demuestran las temperaturas rectales normales, la aparici6n de reacciones minimas en el lugar de la inyecci6n, y la eficacia se demostr6 en los grupos combinados de IM y SC. La comparaci6n de los valores de SAA demostr6 una diferencia significativa entre los perros vacunados con soluci6n salina y con p68 los dias 1, 3 5 tras la exposici6n al aerosol.
Ejemplo 3
DURACIÓN DE SEIS MESES DEL ESTUDIO DE INMUNIDAD DE LA VACUNA DE p68 DE BORDETELLA CANINA
Animales
Se adquirieron noventa perros machos y hembras de raza mixta y la mayoria de los cachorros tenian 9 semanas (± 1 semana) el dia de la primera vacunaci6n.
Se administr6 una vacuna contra el parvovirus MLV a todos los cachorros a su llegada al centro del estudio. Para ser aptos para el estudio, se determin6 que losanimales eran negativos para B. bronchiseptica mediante exudado traqueal y el titulo de aglutinaci6n. Durante el estudio no se administr6 ninguna otra vacuna, aparte de los productos experimentales.
Se mantuvo a los perros en una instalaci6n de aislamiento, necesario para prevenir la exposici6n a B. bronchiseptica y a otros pat6genos caninos antes de la exposici6n. Despues de la exposici6n mediante aerosol B. bronchiseptica se continuaron los procedimientos de aislamiento para prevenir la exposici6n a otros pat6genos caninos.
Vacunas
En los grupos de tratamiento T01 y T02 se us6 soluci6n salina esteril como vacuna placebo. La vacuna de p68 recombinante canina de Bordetella Bronchiseptica se us6 en los grupos de tratamiento T03 y T04. El gen estructural del antigeno p68 se clon6 en Escherichia coli y la expresi6n del gen se regi6 mediante un promotor sensible a la temperatura. L as celulas se l isaron y l os cu erpos de inclusi6n s e s epararon m ediante ce ntrifugaci6n. E l p6 8 recombinante en los cuerpos de inclusi6n se solubiliz6mediante tratamiento con SDS.Por separado, 15 !g de el p68 y 60 !g de p68 se combinaron con 50 !g de Quil A y 50 !g de colesterol por ml en soluci6n salina de Lepto esteril como diluyente. Los componentes combinados se mezclaron a 4 °C durante 24 horas y se pasaron tres veces por u n m icrofluidificador. C ada dosis de un m l c ontenia 2,7 !l de et anol y 0,0001 % d e t imerosal. Las concentraciones de p68 en las vacunas experimentales se midieron mediante ELISA de p68. Todos los ensayos se realizaron por duplicados de cinco (5). Todas las vacunas se usaron en un plazo de 6 meses desde su preparaci6n.
Inóculo de exposición
Placas de agar Bordet-Genou se sembraron con Bordetella bronchiseptica, cepa Bihr Cat, y se incubaron durante 48 horas a 37,5 ± 2,5 °C. Las colonias virulentas de la fase I se seleccionaron y se sembraron mediante raspado en
agar Bordet-Genou y se incubaron durante 24 horas a 37,5 ± 2,5 °C. Tras la incubaci6n se us6 soluci6n salina de Bordetella para lavar las colonias del agar y las celulas se diluyeron hasta una densidad 6ptica de 0,80 a 600 nm. Se realiz6 un recuento de celulas antes y despues de la exposici6n para confirmar la lectura del nefel6metro. La concentraci6n diana para exposici6n fue de aproximadamente 1 x 109 UFC. Para el grupo 1, el recuento de la concentraci6n antes de la exposici6n fue de 1,94 x 109 y el recuento de la concentraci6n postexposici6n fue de 1,43 x 109. Para el grupo II el recuento de la concentraci6n antes de la exposici6n fue de 2,55 x 109 y el recuento de la concentraci6n postexposici6n fue de 2,13 x 109.
Diseño del estudio
Tabla resumen
Grupo de tratamiento
Tratamiento Via Numero de animales Dia de la primera vacunaci6n
Dia 0 (grupo I)
Dia 20 (Grupo II) Numero total de animales
T01
Control salino Subcutanea 8 7 15
T02
Control salino Intramuscular 8 7 15
T03
p68 60 !g/dosis Subcutanea 8 7 15
T04
p68 60 !g/dosis Intramuscular 8 7 15
T05
p68 15 !g/dosis Subcutanea 8 7 15
T06
p68 15 !g/dosis Intramuscular 8 7 15
El estudio se realiz6 en dos fases o grupos, compuestos por 48 perros en el Grupo I y 42 perros en el Grupo II.
La vacunaci6n n° 1 se realiz6 el dia 0 para cada grupo. La vacunaci6n n° 2 se produjo 20 dias despues. Los acontecimientosdel grupo 1 se desviaron de los acontecimientos del grupo II en aproximadamente 15 dias. Los perros fueron expuestos al aerosol de B. bronchiseptica 181 dias despues de la ultima vacunaci6n.
15 Aleatorizaci6n/Enmascaramiento
Los animales fueron asignados aleatoriamente a tratamientos y cuartos de acuerdo con un diseno de aleatorizaci6n completa.
Durante el periodo de tiempo desde la vacunaci6n n° 1 hasta el dia de la exposici6n en cada grupo de estudio, los animales fueron asignados de forma aleatoria a tratamientos y cuartos (3 a 5 perros por cuarto) usando un plan de
20 aleatorizaci6n.
El dia de la exposici6n, los animales tratados previamente se aleatorizaron a los cuartos de exposici6n dentro del grupo de estudio usando un diseno de bloque generalizado.
Individuos cualificados, que no conocian los grupos de tratamiento asignados, realizaron ensayos microbiol6gicos y serol6gicos, y evaluaciones de la tos y de los lugares de la inyecci6n.
25 Analisis de Datos
Las variables de la respuesta a la vacunaci6n consistian en los datos del lugar de lainyecci6n, las temperaturas rectales ylos titulos en el ELISA de p68. Los datos del lugar de la inyecci6n se resumieron del siguiente modo: 1) numero de animales que tienen una reacci6n medible por tratamiento y dia de estudio, 2) numero de puntos de tiempo del animal que tiene una reacci6n medible por tratamiento, 3) numero de animales que tiene una reacci6n
30 medible por tratamiento en cualquier punto de tiempo por tratamiento, 4) duraci6n de una reacci6n medible para cada animal.
Por separado de la primera y la segunda vacunaci6n, los datos del volumen del lugar de la inyecci6n (cm cubicos), las temperaturas rectales y del log natural transformada del titulo de ELISA p68 se analizaron usando un modelo mixto lineal general.
35 Se construyeron contrastes lineales a priori del tratamiento por media de minimos cuadrados del punto de tiempo de observaci6n para analizar lasdiferencias del grupode tratamiento en cada punto de tiempo de observaci6n y comparar los puntos de tiempo dentro de cada tratamiento. Las comparaciones especificas de interes fueron T01 vs. T03, T01 vs. T05, T03 vs. T05, T02 vs. T04, T02 vs. T06 y T04 vs. T06. Si el termino de interacci6n del punto de tiempo por tratamiento por grupo de estudio era significativo a P < 0,05, los contrastes entre los grupos de
40 tratamiento en cada punto de tiempo y entre los puntos de tiempo dentro de los grupos de tratamiento estaban dentro de cada grupo de estudio, de lo contrario estos contrastes se basaron en la media de minimos cuadrados del efecto de interacci6n por p unto d e t iempo por t ratamiento. P ara t odas las comparaciones se us 6 un ni vel d e significaci6n del 5 %.
Las variables de la respuesta postexposici6n consistian en los titulos de ELISA p68, los titulos de amiloide serico A y las observaciones diarias de la tos. Los titulos de ELISA p68 postexposici6n se analizaron como se ha descrito previamente. Para los datos de los titulos de amiloide serico A (SAA) tras la exposici6n se aplic6 la transformaci6n log natural a los valores del titulo antes del analisis usando un modelo mixto lineal general.
El analisis de la tos se modific6 para reflejar los requisitos de la USDA. Para cada perro, se calcul6 el porcentaje de los periodos de observaci6n durante los que se observ6 tos. Antes del analisis, el porcentaje se transform6 usando la transformaci6n de la raiz cuadrada del arcoseno. Para el analisis de la tos se us6 un modelo mixto lineal general.
La media de minimos cuadrados de este analisis se retrotransform6 en los porcentajes y el porcentaje de reducci6n de la tos se calcul6 como:
Reducción del porcentaje= 100 X (media del grupo control – media del grupo de tratamiento)
(media del grupo control)
Se construyeron contrastes lineales a priori de la media de minimos cuadrados del tratamiento para analizar las diferencias por grupo de tratamiento. Las comparaciones especificas de interes fueronT01 vs. T03, T01 vs. T05, T03 vs. T05, T02 vs. T04, T02 vs. T06, y T04 vs. T06. Si el termino de interacci6n tratamiento por grupo de estudio era significativo a P < 0,05, los contrastes entre los grupos de tratamiento en cada grupo de estudio, de lo contrario estos contrastes se basaron en la media de minimos cuadrados del efecto principal del tratamiento. Para todas las comparaciones se us6 un nivel de significaci6n del 5 %.
Procedimiento del estudio
Procedimientos detallados del animal
Antes de la llegada a las instalaciones del estudio y antes de la primera vacunaci6n, se obtuvo un exudado traqueal de los cachorros para cultivo de B. bronchiseptica y se extrajo sangre para los titulos de aglutinaci6n. Todos los animalesdieronnegativo en el exudadotraqueal y eranserol6gicamente negativos a Bordetella, yse estim6 que eran aptos para el estudio. Cuarenta y ocho cachorros se asignaron aleatoriamente a uno de seis grupos de tratamiento para el grupo I. El procedimiento se repiti6 usando cuarenta y dos perros para el grupo II. Se aclimat6 a los animales al centro de estudio durante al menos cinco dias.
Los grupos y tratamientos se detallan en la secci6n 7.4.A. Debido a las restriccionesde la instalaci6n y para potenciar la precisi6n de las observaciones de tos tras la exposici6n, la vacunaci6n y los respectivos periodos de exposici6n se fraccionaron en 15 dias para generar los dos grupos de perros. El dia 0 se refiere al dia de la vacunaci6n n° 1 para los Grupos I y II. El dia 0 se refiere al dia de la vacunaci6n n° 1 para los Grupos I y II. Los tratamientos T01, T03 y T05 se administraron por via subcutanea. Los tratamientos T02, T04, y T06 se administraron por via intramuscular. Las inyecciones subcutaneas se administraron en la cara dorsolateral del cuello. Para la primera vacunaci6n se us6 el lado derecho del cuello y para la segunda vacunaci6n se us6 el lado izquierdo del cuello. Lasinyecciones intramusculares se administraron en el musculo semimembranoso derecho e izquierdo para la primera va cunaci6n y l a s egunda vacunaci6n, r espectivamente. T odos los lugares de la inyecci6n se midieron en tres dimensiones durante siete dias tras cada vacunaci6n con una medici6n de seguimiento realizada 14 dias despues de la vacunaci6n. Las temperaturas rectales se monitorizaron el dia dela vacunaci6n (antes de la vacunaci6n) y durante tres dias tras cada vacunaci6n. La sangre se extrajo antes de cada vacunaci6n (el dia -1 y el dia 19) y el dia 50 para la determinaci6n de los titulos de p68 ELISA.
Cada mes se realiz6 un exudado traqueal de todos los perros para cultivo de B. bronchiseptica en sedaci6n para confirmar el estado negativo para B. bronchiseptica. Tambien se extrajo sangre para los titulos de aglutinaci6n y ELISA. El procedimiento se repiti6 7 dias antes de la exposici6n para cada grupo. Signos de cultivo de exudado traqueal positivo o una elevaci6n del titulo de aglutinaci6n eran motivo de exclusi6n del animal del estudio.
La exposici6n se administr6 a los perros 181 dias despues de la segunda vacunaci6n. Los perros sedados fueron expuestos usando un cono nasal desechable, que se ajust6 bien sobre el hocico del perro sedado. El cono nasal se fij6 a un nebulizador que estaba fijado a una bomba de presi6n de vacio fijada a 0,04 a 0,041 MPa. Un ml del material de exposici6n se introdujo en el nebulizador y el material de exposici6n aerosolizado se administr6 a cada perro durante 4 minutos.
Las observaciones de tos postexposici6n se modificaron antes de la exposici6n para cumplir las recomendaciones de la USDA. Despues de la exposici6n, se observ6 a cada grupo de perros entre el tercero y el decimo dia tras la exposici6n, durante un total de 8 dias. Se observ6 a los animales dos veces al dia por tos durante aproximadamente 45 minutos en cada periodo de observaci6n. El intervalo entre los periodos de observaci6n fue de aproximadamente 12 horas. El personal que realizaba las observaciones de la tos desconocia las asignaciones de los grupos de tratamiento.
0btenci6n de sangre
La sangre para los titulos de aglutinaci6n se obtuvo antes de la primera vacunaci6n, mensualmente y antes de la exposici6n para cada grupo.
La sangre para la evaluaci6n de anti-p68 ELISA se obtuvo el dia antes de la vacunaci6n n° 1 y n° 2 el dia 50 y a intervalos de aproximadamente de 30 dias despues para cada grupo. Tambien se obtuvo sangre el dia de la exposici6n y el ultimo dia de la observaci6n postexposici6n.
Se extrajo sangre para el ensayo de los niveles de amiloide serico A (SAA) el dia de la exposici6n (antes de la exposici6n) y a los 1, 3, 5, 7 y 9 dias de la exposici6n para cada grupo.
Pruebas realizadas con las muestras
Se evaluaron los exudados traqueales para detectar la presencia de B. bronchiseptica mediante cultivo. Cada exudado traqueal se sembr6 sobre una placa de agar selectivo para Bordetella. Se incluyeron controles positivos y negativos. Las placas se incubaron a 37,5 ± 2.5 °C durante 48 ± 4 horas. Las colonias resultantes en cada placa se compararon con el control positivo y cualquier colonia que pareciera identica al control positivo se analiz6 despues para confirmar la presencia de B. bronchiseptica. Las pruebas conformacionales incluyeron el uso de TSI, citrato y agar urea y medio con rojo nitrato.
Los sueros se evaluaron para detectar los titulos de aglutinaci6n, analisis de ELISA p68 o analisis de SAA usando los procedimientos siguientes.
Titulos de aglutinaci6n- Los sueros se diluyeron en serie en placas de microtitulaci6n usando soluci6n salina de Bordetella. En cada placa se incluyeron controles positivos o negativos. La cepa 87 (cultivada en agar Bordet Genou, recogida, inactivada y diluida al 20 % T a 630 nm) se us6 como antigeno de aglutinaci6n y se anadi6 a cada pocillo. Las placas se agitaron e i ncubaron a 35 ± 2 °C durante 2 horas. Las placas se leyeron despues de una segunda incubaci6n a temperatura ambiente durante 22 horas. El titulo final se determin6 usando el ultimo pocillo para mostrar 50 % de aglutinaci6n.
Titulos de ELISA p68- El antigeno p68 recombinante se captur6 en una placa de microtitulaci6n de 96 pocillos recubierta con un antisuero policlonal especifico del antigeno p68 de Bordetella. A la placa se anadieron diluciones en serie al doble del suero canino y se incub6. En cada placa se incluyeron controles positivos y negativos a una diluci6n de 1:1000. Se us6 un conjugado indicador de IgG anti-perro de cabra purificado por afinidad marcado con peroxidasa para detectar anticuerpos especificos para el antigeno rp68. Despues se anadi6 un sustrato ABTS cromogenico y se ley6 la placa cuando los pocillos control positivo tenian una D0 de 1,2 ± 0,2. Se calcul6 el titulo de una muestra dada como el reciproco de la ultima diluci6n con una densidad 6ptica superior a la media de la diluci6n de suero control negativo mas cinco desviaciones estandar.
Titulos de SAA- El amiloide serico A canino se captur6 en una placa de microtitulaci6n de 96 pocillos recubierta con un anticuerpo monoclonal anti-SAA canino. A la placa se anadieron muestras diluidas del suero canino y se incub6. Se anadi6 un patr6n de referencia para obtener una curva estandar de 0,31 !g/ml a 20 ng/ ml. Se anadi6 un conjugado de anticuerpo anti-canino marcado con biotina. Tras la incubaci6n del anticuerpo anti-canino marcado con biotina se anadi6 un conjugado de estreptavidina con peroxidasa. Se anadi6 un sustrato cromogenico TMB y la placa se ley6tras 30 minutos. La concentraci6n de amiloide serico A se determin6 mediante comparaci6n de la muestra con la curva estandar y la multiplicaci6n por el factor de diluci6n adecuado.
Resultados
A menos que se indique lo contrario, los resultados son los datos combinados del grupo I y II.
Cultivo del exudado traqueal y titulos de aglutinaci6n
Se demostraron cultivos positivos del exudado traqueal y/o titulos de aglutinaci6n en aumentoen once perros durante el curso del estudio. Estos perros y cualquier perro estabulado con los perros positivos fueron retirados del estudio, lo que tuvo como resultado una perdida de 20 perros. El numero de perros retirados de cada grupo fue: T01-4 perros, T02-2 perros, T03-3 perros, T04-1 perro, T05-5 perros, T06-5 perros.
0bservaciones en el lugar de la inyecci6n
Las reacciones en el lugar de la inyecci6n se resumen en las Tablas 22-25. No se recogi6 informaci6n del lugar de la inyecci6n para el perro 81595 el dia 21 para el grupo I debido a restricciones tecnicas. El protocolo se modific6 de modo que losdatos de reacci6n en el lugar de la inyecci6n no se recogieran para losperros del grupo II el dia 22, por tanto el resumen de los datos del dia 22 s6lo contiene informaci6n de los ocho perros por grupo de tratamiento en el Grupo I.No se observaron reacciones en el lugar dela inyecci6n para ningun perro que recibiera tratamiento IM. Las mediciones en el lugar de la inyecci6n fueron minimas para los grupos de tratamiento de vacunados SC (T03 y T05).
Tabla 22. Media de mínimos cuadrados (cm cúbicos) de las reacciones en el lugar de la inyección en perros tras vacunación con solución salina o p68 de Bordetella (tras la primera vacunacióna)
Tamano medio (cm cubicos)b Tratamiento Dia de estudio 12 3 4 5 6 714
T01 salino SC 0 0 0 0 0 0 0 0 T02 salino IM 0 0 0 0 0 0 0 0 T03 60 !g SC 5,8 6,4 7,3 6,3 5,0 4,9 2,7 0 T04 60 !g IM 0 0 0 0 0 0 0 0 T05 15 !g SC 4,4 4,6 3,1 2,1 1,2 0,9 0,7 0 T06 15 !g IM 0 0 0 0 0 0 0 0 a Vacunaci6n n° 1 administrada el dia 0 bError estandar para todas las medias = 0,64
Tabla 23. Media de mínimos cuadrados (cm cúbicos) de las reacciones en el lugar de la inyección en perros 5 tras vacunación con solución salina o p68 de Bordetella (tras la segunda vacunacióna)
Tamano medio (cm cubicos)b Tratamiento Dia de estudio 21b 22c 23b 24b 25b 26b 27b 34b
T01 salino SC
0 0 0 0 0 0 0 0
T02 salino IM
0 0 0 0 0 0 0 0
T03 60 !g SC
5,0 3,2 4,2 5,8 5,9 5,8 4,3 0
T04 60 !g IM
0 0 0 0 0 0 0 0
T05 15 !g SC T06 15 !g IM
3,7 0d 2,4 0 2,2 0 2,6 0 2,1 0 2,0 0 1,6 0 0 0
a Vacunaci6n n° 2 administrada el dia 20 bError estandar para las medias este dia = 0,55 cError estandar para las medias este dia = 0,70dError estandar para T06 el dia 21= 0,57
Tratamiento Porcentaje de reacci6n medible n 1 2 3 4 5 6 714

Tabla 24. Porcentaje de perros que tienen una reacción en el lugar de la inyección medible tras vacunación con solución salina o p68 de Bordetella (tras la primera vacunacióna)
T01 sa lino
15 0 0 0 0 0 0 0 0
SC
T02 sa lino
15 0 0 0 0 0 0 0 0
IM
T03 60 !g
15 66,7 73,3 73,3 73,3 73,3 66,7 0
SC
T04 60 !g
15 0 0 0 0 0 0 0 0
IM
T05 15 !g
15 73,3 73,3 60,0 60,0 53,3 46,7 46,7 0
SC
T06 15 !g
15 0 0 0 0 0 0 0 0
IM
a Vacunaci6n n° 1 administrada el dia 0
Tabla 25. Porcentaje de perros que tienen una reacción en el lugar de la inyección medible tras vacunación con solución salina o p68 de Bordetella (tras la segunda vacunacióna)
Tratamiento Porcentaje de reacci6n medible
Dia del estudio n 21 22b23 24 25 26 27 34
T01 sa lino
15 0 0 0 0 0 0 0 0
SC
T02 sa lino
15 0 0 0 0 0 0 0 0
IM
T03 60 !g
15 80,0 50,0 66,7 66,7 80,0 80,0 80,0 6,7
SC
T04 60 !g
15 0 0 0 0 0 0 0 0
IM
T05 15 !g
15 73,3 50,0 73,3 73,3 73,3 73,3 66,7 0
SC
T06 15 !g
15 0c 0 0 0 0 0 0 0
IM
a Vacunaci6n n° 2 administrada el dia 0
bn= 8 el dia 22
cn=14 para T06 el dia 21
En la Tabla 26 se resumen las diferencias significativas en las mediciones de los lugares de la inyecci6n. Se observ6
5 una diferencia significativa en las mediciones de los lugares de la inyecci6n entre T01 (salino SC) frente a T03 (60 !g SC) durante siete dias tras la primera vacunaci6n. Se observ6 una diferencia significativa entre T01 (salino SC) y T05 (15 !g SC) s6lo durante los primeros cuatro dias despues de la primera vacunaci6n. Desde el dia 3 al 7 se encontr6 u na diferencia si gnificativa entre T03 ( 60 !g SC) y T05 (15 !g SC). El dia 14 (la observaci6n de reevaluaci6n de dos semanas) no se observaron diferencias significativas entre ninguno de los grupos.
10 Se observ6una diferencia significativa (P= 0,0138) en las mediciones de los lugares de la inyecci6n entre T01 (salino SC) frente a T03 (60 !g SC) y T05 (15 !g SC) durante siete dias tras la segunda vacunaci6n. Desde el dia 23 al 27 se encontr6 una diferencia significativa entre T03 (60 !g SC) y T05 (15 !g SC). El dia 34 (la observaci6n de reevaluaci6n de dos semanas) no se observaron diferencias significativas entre ninguno de los grupos.

Tabla 26. Valores de significación para contrastes a priori entre la media de mínimos cuadrados de las 15 mediciones de la reacción en el lugar de la inyección.
Dia del estudio
Contrastes (tratamiento frente a tratamiento) Valor P
1
T01 v T03 0,0001
T01 v T05
0,0001
2
T01 v T03 0,0001
T01 v T05
0,0001
3
T01 v T03 0,0001
T01 v T05
0,0006
4
T01 v T03 0,0001
T01 v T05
0,0214
5
T01 v T03 0,0001
T01 v T05
0,0001
6
T01 v T03 0,0001
T01 v T05
0,0001
7
T01 v T03 0,0031
T01 v T05
0,0258
21
T01 v T03 0,0001
T01 v T05
0,0001
22
T01 v T03 0,0010
T01 v T05
0,0166
23
T01 v T03 0,0001
T01 v T05
0,0055
T03 v T05
0,0113
24
T01 v T03 0,0001
T01 v T05
0,0008
T03 v T05
0,0001
(cont.)
25 26
T01 v T03 T01 v T05 T03 v T05 T01 v T03 0,0001 0,0067 0,0001 0,0001
27
T01 v T05 T03 v T05 T01 v T03 0,0104 0,0001 0,0001
T01 v T05 T03 v T05
0,0475 0,0004
S6lo se presentan los contrastes significativos (P< 0,05).
Temperatura rectal
Las mediciones de la temperatura rectal se resumen en las Tablas 27 y 28. El protocolo se modific6 de modo que no se recogieran datos de la temperatura rectal para los perros del grupo II el dia 22, por tanto el resumen de los datos del dia 22 contiene unicamente informaci6n de los perros por grupo de tratamiento en el Grupo I.
Tabla 27. Media de mínimos cuadrados de la temperatura rectal (º C) en perros tras la vacunación con solución salina o p68 de Bordetella (tras la primera vacunacióna)
Temperatura rectal (° C)b
Tratamiento Dia del estudio 0 12 3
T01 salino SC
38,5 38,4 38,3 38,2
T02 salino IM
38,4 38,2 38,4 38,2
T03 60 !g SC
38,4 38,5 38,2 38,3
T04 60 !g IM
38,4 38,5 38,4 38,4
T05 15 !g SC
38,5 38,5 38,2 38,2
T06 15 !g IM
38,5 38,4 38,3 38,4
a Vacunaci6n n° 1 administrada el dia 20
bError estandar = 0,09
Tabla 28. Media de mínimos cuadrados de la temperatura rectal (º C) en perros tras la vacunación con solución salina o p68 de Bordetella (tras la segunda vacunacióna)
Temperatura rectal (° C)b
Tratamiento Dia del estudio 20b 21b 22c 23b
T01 salino SC
38,6 38,5 38,3 38,4
T02 salino IM
38,6 38,6 38,3 38,4
T03 60 !g SC
38,7 38,6 38,6 38,4
T04 60 !g IM
38,8 38,7 38,5 38,5
T05 15 !g SC
38,6 38,6 38,5 38,4
T06 15 !g IM
38,7 38,7 38,4 38,5
a Vacunaci6n n° 2 administrada el dia 20
bError estandar
= 0,08
cError estandar
= 0,11
Se observ6 una diferencia significativa en las temperaturas rectales entre T02 (soluci6n salina IM) y T04 (60 !g IM) el dia 1 tras la primera vacunaci6n. No se observaron diferencias significativas en las temperaturas rectales entre
15 cualquiera de los grupos cualquier dia tras la segunda vacunaci6n.
Titulos de p68 en ELISA
Los datos de ELISA de p68 preexposici6n se resumen en la Tabla 29. Debido a la respuesta de los perros del grupo I en T06 el dia 19 se observ6 un efecto debido al grupo en el analisis de los datos de los titulos de ELISA p68. El efecto fue pequeno y no influy6 sobre otros puntos de tiempo analizados. Por tanto, los datos del Grupo I y II se
20 combinan con fines de notificaci6n.
Debido a la considerable respuesta de titulos a p68 en los perros vacunados se usaron varios minimos de titulaci6n a diferentes puntos de tiempo en el estudio. Las titulaciones para los dias -1 y 19 comenzaron a 50. Para los dias 50 a 195, l as titulaciones comenzaron a 2 00. Las titulaciones para l as m uestras obtenidas los dias 201 y 211 comenzaron a 1000. Cualquier valor indicado como &quot;menor que&quot; se dividi6 por dos antes del analisis. El aumento incremental observado en los valores de p68 ELISA para los grupos control (T01 y T02) durante el curso del estudio se debe a estos valoresminimos de titulaci6n. Los titulos de aglutinaci6n, excepto los indicados anteriormente, permanecieron < 4.
Todos los perros vacunados con placebo presentaron titulos de p68 < 200 el dia 50. Todos los animales vacunados con p68 mostraron al menos un incremento por cuatro de los titulos despues de la segunda vacunaci6n (dia 0 frente a dia 50) cuando se compar6 con los animales vacunados con placebo.
Tabla 29. Media geométrica y errores estándar de los títulos finales de ELISA de p68 en perros tras vacunación con p68 de Bordetella el día 0 y el día 20.
Dia del estudio Tratamiento -1a 19a 50b
Media Error est. Media Error est. Media Error est.
T01 Salino SC 31,4 5,06 30,5 4,92 100,0 16,14
T02 Salino IM 27,7 4,47 25,0 4,03 100,0 16,14
T03 P68 60 !g 29,8 4,80 507,6 81,92 10633,5 1715,94 SC
T04 P68 60 !g 26,7 4,31 249,7 40,29 4722,2 762,02 IM
T05 P68 15!g 25,0 4,03 268,7 43,36 5622,8 907,35 SC
T06 P68 15 !g 33,4 5,40 91,8 14,81 3528,9 569,46 IM
aLas titulaciones para los dias -1 y 19 comenzaron a 50. Cualquier valor indicado como &quot;menor que&quot; se dividi6 por dos antes del analisis. bLas titulaciones para el dia 50 comenzaron a 200. Cualquier valor indicado como &quot;menor que&quot; se dividi6 por dos antes del analisis.
10 Las diferencias significativas para la media de minimos cuadrados de los titulos de ELISA posvacunaci6n se indican en la Tabla 30. No se observaron diferencias significativas en los titulos de ELISA P68 entre los controles SC y los animales vacunados SC o los controles IM y los vacunados IM antes de la vacunaci6n (Dia -1).
Tabla 30. Valores de significación para contrastes a priori entre la media de mínimos cuadrados posvacunación de los títulos de p68 ELISA.
Dia del estudio 19
Contraste T01 v T03 Valor p 0,0001
T01 v T05
0,0001
T02 v T04
0,0001
T02 v T06
0,0001
T03 v T05
0,0061
T04 v T06
0,0001
50
T01 v T03 0,0001
T01 v T05
0,0001
T02 v T04
0,0001
T02 v T06
0,0001
T03 v T05
0,0059
S6lo se presentan los contrastes significativos (P< 0,05). 15
Los titulos de ELIS p68 medidos durante el curso del estudio se resumen en la Tabla 31 y se ilustran en la Figura 3.
Durante el curso del estudio se realizaron todos los intentos para coordinar las actividades entre los grupos I y II. Para los puntos de tiempo de recolecci6n de datos centrales (es decir, acontecimientos que rodean a la vacunaci6n y la exposici6n) se consigui6. En tres casos durante el estudio, la obtenci6n de sangre y del exudado traqueal vari6
20 en 1 o 2 dias entre grupos. Con el fin de resumir y comunicar los datos del ELISA p68 para este periodo intermedio, se combinaron los datos de estos dias. Por tanto, el dia 79 contiene datos combinados del dia 79 (grupo I) y el dia 81 (grupo II), e dia 111 corresponde al dia 110 (grupo II) y el dia 111 (grupo I) y el dia 169 corresponde al dia 169 (grupo II) y el dia 170 (grupo I). Segun el protocolo, no se realiz6 analisis de datos con datos del ELISA p68 mas alla del dia 50.
Tabla 31. Resumen de la media geométrica de los títulos finales del ELISA del p68 en perros no vacunados y vacunados frente a p68 de Bordetella tras vacunación y exposición a aerosol con Bordetella bronchiseptica.
Media geometrica de los titulos de ELISA P68a Tratamiento Dia del estudiob,c
79 110 140 169 195 201
T01 Salino SC 100,00 154,92 106,00 108,59 117,18 109,14 500,0 T02 Salino IM 112,85 145,33 130,61 115,51 113,43 112,37 500,0 T03 60 !g SC 3434,24 2884,97 1861,64 1895,56 3097,24 2408,61 81564,79 T04 60 !g IM 1508,60 1164,81 933,12 987,64 1142,01 1547,87 59940,47 T05 15!g SC 1699,20 1511,80 1229,35 1312,62 2248,63 2244,47 29869,29 T06 15 !g IM 974,18 916,21 573,51 876,15 1505,01 1458,16 11503,28
aLas titulaciones para los dias 50 a 195 comenzaron a 200. Las titulaciones para las muestras obtenidas los dias 201 y 211 comenzaron a 1000. Cualquier valor indicado como &quot;menor que&quot; se dividi6 por dos antes del analisis.b Las vacunaciones n° 1 y 2 se administraron los dias 0 y 20, respectivamente. La exposici6n se administr6 el dia
201. cDurante el curso del estudio se realizaron todos los intentos para coordinar las actividades entre los grupos I y II. En los tres casos, la obtenci6n de sangre para los grupos vari6 en 1 o 2 dias. Los datos de estos dias se combinaron para el resumen de datos. No se realiz6 analisis con los valores de los titulos de ELISA p68 mas alla del dia 50. El dia 79 corresponde a los dias 79 y 81, el dia 110 corresponde a los dias 110 y 111, el dia 169 corresponde a los dias 169 y 170.
0bservaciones de tos
5 La exposici6n al aerosol p ara ambos gr upos 18 1 dias despues d e l a s egunda v acunaci6n. P ara cu mplir las recomendaciones de la USDA, se modificaron los criterios para la tos a observaciones de aproximadamente 45 minutos, separadas por aproximadamente doce horas, del tercer al octavo dia tras la exposici6n. Las observaciones de tos se resumen en las Tablas 32 y 33.
Tabla 32. Porcentaje medio de puntos de tiempo con tos en perros no vacunados y en perros vacunados con 10 p68 de Bordetella tras la exposición en aerosol a Bordetella bronchiseptica
Tratamiento Numero de perros Media Error est. T01 Salino SC 11 75,44% 7,73 T02 Salino IM 13 80,50% 6,64
T03 p68 60 !g SC 12 67,30% 8,12 T04 p68 60 !g IM 14 71,81% 7,32 T05 p68 15!g SC 10 36,30% 9,19 T06 p68 15 !g IM 10 39,55% 9,18
Tabla 33. Porcentaje medio de puntos de tiempo con tos por tratamiento en perros no vacunados y en perros vacunados con p68 de Bordetella tras la exposición en aerosol a Bordetella bronchiseptica
Parametro Estimaci6n Error est.
Media salino (T01 y T02) 78,26% 5,28 60 !g/dosis, media (T03 y T04) 69,58% 5,68 15 !g/dosis, media (T05 y T06) 37,92% 6,70
15 El porcentaje de reducci6n en la tos en comparaci6n con el control salino fue 51,55 % para los grupos de 15 !g/dosis y 11,09 % para los grupos de 60 !g/dosis. Las diferencias estadisticas significativas se resumen en la Tabla
34.
Tabla 34. Valores de significación para los contrastes a priori entre la media de mínimos cuadrados para el porcentaje de puntos de tiempo con tos
Contraste T01 v T05
Valor p 0,0041
T03 v T05
0,0199
T02 v T06
0,0019
T04 v T06
0,0119
20
T01 y T02 v T05 y T06 0,0001
(S6lo se presentan los contrastes significativos (P< 0,05). Amiloide serico A Los valores de SAA se determinaron los dias 0, 1, 3, 5, 7 y 9 tras la exposici6n. Los valores de amiloide serico A se
presentan en la Tabla 35 y se representan en la Figura 4. Tabla 35: Media geométrica y errores estándar de los títulos de amiloide sérico A en perros no vacunados y en perros vacunados con p68 de Bordetella tras la exposición en aerosol a Bordetella bronchiseptica
Media geometrica y errores estandar del amiloide serico Aa
TX
Dia del estudio
201
202 204 206 208 210
Media
Error Media Error Media Error Media Error Media Error Media Error
est.
est.
est.
est.
est.
est.
T01
1,1 0,33 257,3 84,61 371,6 116,44 548,7 171,93 68,0 21,31 9,4 2,95
T02
1,0 0,28 114,0 32,83 111,9 32,21 108,9 31,36 15,6 4,48 1,7 0,49
T03
0,8 0,25 135,7 40,55 119,7 35,75 74,5 22,25 10,9 3,38 1,0 0,30
T04
0,8 0,23 134,7 39,20 156,0 43,59 174,8 48,86 34,6 9,67 1,9 0,54
T05
0,8 0,28 68,4 22,85 88,3 29,50 9,3 3,12 1,9 0,64 2,0 0,66
T06
0,8 0,27 45,7 14,94 54,0 17,67 9,4 3,07 1,9 0,63 0,8 0,27
aExposici6n administrada el dia 201.
Las diferencias significativas en los titulos de SAA se resumen en la Tabla 36.

Tabla 36. Valores de significación para contrastes a priori entre la media de mínimos cuadrados de los títulos de amiloide sérico A postexposición.
Dia del estudio
Contraste (tratamiento v tratamiento) Valor p
202
T01 v T05 0,0054
T02 v T06
0,0393
T04 v T06
0,0154
204
T01 v T03 0,0097
T01 v T05
0,0020
T04 v T06
0,0154
206
T01 v T03 0,0001
T01 v T05
0,0001
T02 v T06
0,0001
T03 v T05
0,0001
T04 v T06
0,0001
208
T01 v T03 0,0001
T01 v T05
0,0001
T02 v T06
0,0001
T03 v T05
0,0023
T04 v T06
0,0001
210
T01 v T03 0,0002
T01 v T05
0,0068
S6lo se presentan los contrastes significativos (P< 0,05).
Discusión
El estudio se disen6 para demostrar la seguridad y la eficacia a seis meses de una vacuna recombinante de p68 de
15 Bordetella en perros. Se ha demostrado la seguridad de las vacunas de 15 !g/dosis y de 60 !g/dosis. El estudio aval6 la eficacia y la duraci6n de 6 meses de la inmunidad de la vacuna de 15 !g/dosis.
La seguridad se analiz6 usando las observaciones en el lugar de la inyecci6n y de la temperatura rectal. El analisis de las mediciones de la reacci6n en el lugar de la inyecci6n demostr6 ausencia de reacciones en los grupos vacunados IM y reacciones minimas los grupos vacunados con 15 !g/dosis y de 60 !g/dosis SC. Las reacciones que
20 se observaron tendian a ser pequenas en los perros vacunados con 15 !g/dosis SC. Dichas reacciones observadas fueron transitorias que, en general, se resolvian en 14 dias o menos. El tamano de estas reacciones muy probablemente pasaria inadvertido en los perros en los que no se hubiera afeitado los lugares de la inyecci6n. Las temperaturas rectales tras la vacunaci6n fueron poco importantes y estaban dentro de los limites normales para todos los perros en todos los grupos.
La eficacia y la duraci6n de la inmunidad se analizaron 181 despues de la vacunaci6n usando las observaciones de tos y la medici6n de los titulos finales de p68 en ELISA. El porcentaje de tos en los controles salinos (78,26 %) indic6 que la exposici6n administrada a los animales del estudio era aceptable. El porcentaje de puntos de tiempo con tos para el grupo de 15 !g/dosis (37,92 %)demostr6 una reducci6nde 51,55 % en la tos en comparaci6n con los controles, lo que satisface los requisitos de eficacia exigidos por la USDA. No se demostr6 protecci6n en el grupo de 60 !g/dosis (69,58 %), mostrando los perros una reducci6n minima de la tos en comparaci6n con los controles.
aunque no se compararon estadisticamente, a partir de lasTablas 29 y 31 sepuede ver que los vacunados SC tendian a tener mayores respuestas de anticuerpo en comparaci6n con los vacunados IM. Con fines de discusi6n, comentarios adicionales conrespecto a los diferentes grupos de dosis combinan los resultados delas vias de administraci6n IM y SC.
Con independencia de l a via de a dministraci6n se demostr6 una excelente respuesta de ant icuerpos a p68 en ambos grupos vacunados el dia 50 y los vacunados la mantuvieron durante el curso del estudio. En los vacunados se observ6 una buena respuesta anamnesica tras la exposici6n.
La comparaci6n de los titulos de p68 ENISA de 15 !g/dosis y 60 !g/dosis durante el curso del estudio indic6 que el grupo de 60 !g/dosis mostraba una respuesta de titulo ligeramente mayor (Figura 3). Esta respuesta, aunque excelente, no se correlacion6 con protecci6n tras la exposici6n al aerosol. Las respuestas del titulo de ELISA p68 eran variables en los perrosretirados del estudio con exudados traqueales positivos o titulos de aglutinaci6n en aumento. Tres de los seis controles retirados del estudio con cultivos positivos del exudado traqueal y/o titulos de aglutinaci6n en aumento mantuvieron titulos de p68 ELISA <200. Parece no existir correlaci6n alguna entre titulos de p68 ELISA y el exudado traqueal o el estado del titulo de aglutinaci6n de los perros retirados del estudio.
El analisis de la respuesta de SAA en los perros vacunados con p68 de Bordetella y no vacunados tras la exposici6n indic6 una elevaci6n mucho menor en los valores de SAA en los grupos de 15 !g/dosis, especialmente los dias 5 y 7 tras la exposici6n.
Conclusiones
En este estudio se analiz6 la eficacia de una vacuna de p68, 15 !g/dosis y de 60 !g/dosis de Bordetella canina usando un modelo de exposici6n canino 6 meses despues de la vacunaci6n. Ambas vacunas eran seguras, lo que se demostr6 por la aparici6n de reacciones minimas en el lugar de la inyecci6n, temperaturas rectales normales y minimas reacciones en el lugar de la inyecci6n. Aunque los perros vacunados tanto con 15 !g/dosis como con 60 !g/dosis mostraron una buena respuesta serol6gica a la vacunaci6n, media por los titulos de p68 ELISA, la respuesta no se correlacion6 con protecci6n clinica en los perros vacunados con 60 !g/dosis. Los perros vacunados con 60 !g/dosis no mostraron diferencias significativas en la tos en comparaci6n con los controles no vacunados. Se demostr6 buena eficacia de la vacuna de 15 !g/dosis por una reducci6n superior al 50 % de la tos en comparaci6n con los controles. Se ha postulado que niveles mayores de SDS en la vacuna de 60 !g/dosis pueden tener como resultado la diferencia demostrada en la protecci6n. La comparaci6n de los valores de SAA mostr6 una diferencia entre los vacunados y los controles.
Ejemplo 4
Seguridad y eficacia de VANGUARD® Plus 5/CV-L
VANGUARD@ Plus 5/CV-L es una preparaci6n liofilizada de cepas atenuadas del virus del CD, CAV-2, virus de CPI, CPV y cultivos enteros inactivados de L. canicola y L. icterohaemorrhagiae, mas una preparaci6n liquida de CCV inactivada con un adyuvante. Todos los virus se propagaron en lineas celulares establecidas. La fracci6n de CPV se atenu6 mediante pase bajo en la linea celular canina, que le dio propiedades inmunogenicas capaces de superar la interferencia de los anticuerpos maternos a los niveles indicados en la Tabla 38. El componente liquido se us6 para rehidratar el componente liofilizado, que se habia envasado con gas inerte en lugar de vacio.
La evaluaci6n de laboratorio demostr6 que VANGUARD® Plus 5/CV-L inmunizaba a los perros contra la enfermedad respiratoria causada por CD, ICH, CAV-2 y CPI, la enteritis causada por CCV y CPV y la leptospirosis causada por
L. canicola y L. icterohaemorrhagiae y que no existia interferencia inmunol6gica entre las fracciones de la vacuna. Mediante ensayos de seguridad en campo amplios se mostr6 que era segura y esencialmente libre de reacciones en perros tan j6venes como de 6 semanas de edad en condiciones normales de uso.
Tambien se demostr6 que la vacuna contra CAV-2 protege de forma cruzada contra ICH causada por el CAV-1. Los estudios demostraron qu e CAV-2 n o s 6lo pr otege co ntra I CH si no t ambien co ntra la enfermedad r espiratoria producida por el CAV-2. En los ensayos realizados no se recuper6 el virus de exposici6n adenovirus canino de tipo 2 de perros vacunados con CAV-2.
La fracci6n de CPV en VANGUARD® Plus 5/CV-L se someti6 a exhaustivas pruebas de seguridad y eficacia. En las pruebas de laboratorio y los ensayos clinicos en condiciones de campo normales se demostr6 que era segura y esencialmente si n r eacciones. L a s eguridad d el producto se dem ostr6 a dicionalmente m ediante un estudio de retropase que incluy6 la administraci6n oral de multiples dosis de la cepa de la vacuna a perros susceptibles, todos los cuales permanecieron normales.
La investigaci6n demostr6 que 3 dosis de la vacuna con mayor titulo del virus CPV pueden superar los titulos de neutralizaci6n en suero(SN) asociados con los anticuerpos maternos. 0tros investigadores han mostrado que los 5 titulos de neutralizaci6n en suero tan bajos como de 1:4 interfieren en la inmunizaci6n activa usando vacunas vivas modificadas convencionales. Se realiz6 un ensayo clinico con cincuenta cachorros de 6 semanas de edad [25 vacunados (intervalo del titulo SN -256) y 25 controles no vacunados (intervalo del titulo SN 4-1024)] (Tabla 37). El grupo de vacunados recibi6 3 dosis, administrandose las vacunaciones separadas por 3 semanas comenzando a las 6 semanas de edad. Tras 2 vacunaci6n, 13/25 cachorros exhibieron un incremento por 4 o mayor del titulo SN de 10 CPV (seroconversi6n) (Tabla 38). Doce de estos 13 cachorros tenian titulos SN maternos : 1:16 en el momento de la primera vacunaci6n con el cachorro restante que tiene un titulo SN de 1:64. 0tros 9 cachorros con titulos SN iniciales entre 1:16 y 1:256 se seroconvirtieron tras la segunda vacunaci6n. Sus titulos SN de anticuerpos maternos habian disminuido a : 1;64 en el momento de la segunda vacunaci6n. De forma similar, los ultimos 3 vacunados, con t itulos SN i niciales de 1:128 s e seroconvirtieron tras la t ercera vacunaci6n, d espues de que su t itulo de
15 anticuerpos maternos frente a CPV habia disminuid a : 1:64. Por tanto, en este estudio, cuando se administraron 3 dosis de v acuna a partir de l as 6 s emanas de edad, l os 25 v acunados, i ncluso c on l os mayores niveles de anticuerpos maternos, quedaron activamente inmunizados (GM= 1:1176; intervalo de los titulos SN 128-4096). Los 50 perros fueron expuestos 3 semanas despues de la tercera vacunaci6n al virus de exposici6n CPV heter6logo, Catorce de 25 perros control no vacunados murieron o mostraron enfermedad lo bastante grave como para hacer
20 necesaria la eutanasia, mientras que los 25 vacunados permanecieron esencialmente sanos. Por tanto, el virus de vacuna de pase bajo y titulo alto en VANGUARD® Plus 5/CV-L era altamente inmunogenico y capaz de estimular la inmunidad activa en presencia de anticuerpos maternos.
La eficacia de la fracci6n de CCV en VANGUARD® Plus 5/CV-L se demostr6 en un amplio estudio de exposici6n a la vacunaci6n. Dieciseis cachorros de 7 a 8 semanas de edad fueron vacunados con VANGUARD®Plus 5/CV-L 25 (vacunados) y 17 con Vanguard® Plus 5/L (controles). Todos los cachorros recibieron tres dosis de 1 ml a intervalos de 3 semanas. Tres semanas tras la tercera vacunaci6n se expuso a los cachorros a una cepa virulenta de CCV (CV-6). Las observaciones clinicas, temperaturas, pesos y parametros sanguineos se monitorizaron durante 21 dias tras la infecci6n. Los vacunados con CCV mostraron una reducci6n en la aparici6n de diarrea y la cantidad de CCV virulento diseminado en comparaci6n con los controles. A los 21 dias de la exposici6n, la tinci6n con anticuerpos
30 fluorescentes para CCV virulento de secciones de intestino delgado mostr6 una reducci6n significativa (P) del antigeno CCV detectable entre los vacunados con CCV y los controles (Tabla 39).
Tabla 37. Títulos de neutralización sérica inicial (SN) de vacunados y controles
Titulos SN
N° vacunados incluidos N° controles incluidos
<1:2
3 0
1:4
4 3
1:8
1 3
1:16
4 1
1:32
2 5
1:64
3 1
1:128
6 3
1:256
2 3
1:512
0 5
1:1024
0 1

Tabla 38. Media geométrica de los títulos de neutralización sérica posvacunación (SN) (Intervalo)a
Grupos
N Prevacunaci6n Posvacunaci6n
1
2 3b
Todos los perros vacunados
25 1:24 (<2-256) 1:108 (8-1024) 1:605 (8-4096) 1:1176 (128->4096)
Respondedores tras la 1 � vacunaci6n
13 :6 (<2-64) 1:460 (64-1024) 1:1745 (256-4096) 1:1410 (256-4096)
Respondedores tras la 2� vacunaci6n
9 1:87 (16-256) 1:20 (8-64) 1:376 (256-1024) 1:1625 (256-4096)
Respondedores tras la 3 � vacunaci6n
3 1:128 (128) 1:32 (16-64) 1:25 (8-64) 1:203 (128-256
Perros control no vacunados
25 1:64 (4-1024) 1:9 (<2-64) 1:3 (<2-64) <1:2 (<2-4)
aPerros vacunados a las 6, 9 y 12 semanas de edad.bTitulos SN preexposici6n
Tabla 39. Tinción con anticuerpos fluorescentes de secciones de intestino delgado 21 días después de la exposición
Sección de intestino
% Perros positivos para anticuerpos fluorescentes
Vacunados
Controles
Duodeno Yeyuno Íleon
1 0 89
2
0 100
3
0 100
4
0 89
5
0 100
6
12,5 56
7
0 78
8
12,5 78
9
0 67
10
12,5 56
Conclusiones
5 En este estudio, se mostr6 que una vacuna de combinaci6n adyuvada que contiene el virus del CD, CAV-2, el virus de CPI, CPV y cultivos enteros inactivados de . canicola y L. icterohaemorrhagiae y CCV, era segura y eficaz como vacuna cuando se us6 en cachorros. Asimismo se mostr6 que la vacuna de combinaci6n superaba los titulos de neutralizaci6n en suero (SN) asociados con los anticuerpos maternos.
Ejemplo 5
10 ESTUDIO DE INMUNOGENICIDAD CON P68 NATIVO DE BORDETELLA CANINA Animales
El estudio incluy6 dos camadas de perros sabuesos SPF y dos camadas de perros de fuente aleatoria. Los perros fueron asignados aleatoriamente a grupos de vacunados y no vacunados. El estudio incluy6 un total de 10 perros vacunados y 11 no vacunados.
15 Preparación de la vacuna experimental
Se recogi6 B. bronchispetica (cepa 110H) de placas con agar sangreBordet-Gengou de 48 hor as lavando la superficie de la placa con de 5 a 10 ml de tamp6n de extracci6n por calor. Como alternativa, las celulas cultivadas en ambos cultivos (medio definido de Charlotte Parker) se recogieron mediante centrifugaci6n, desechando la fracci6n sobrenadante. Las celulas recogidas se suspendieron en Tris-HCl 25 mM, a pH 8,8, y se incubaron a 60 °C durante
20 1 hora. Los residuos celulares se separaron del extracto termico mediante centrifugaci6n a 20.000 x g a 4 °C durante 30 minutos. Se anadi6 azida s6dica (0,01 %) a la fracci6n sobrenadante extraida con calor, que se aclar6 despues mediante filtraci6n microporosa.
La resina de afinidad de anticuerpos monoclonales se prepar6 mediante conjugaci6n del anticuerpo monoclonal (designado Bord 2-7) a sefarosa 4B activada con CNBr usando procedimientos estandar. Aproximadamente 30,35
25 mg de anticuerpo monoclonal se conjugaron con 1 gramo de resina de afinidad. La fracci6n de sobrenadante extraida co n c alor ac larada (anteriormente) y l a r esina de af inidad B ord 2 -7 se co mbinaron a u na pr oporci6n aproximada de 1 litro de extracto con 20 ml de resina.
La uni6n del p68 nativoa la resina se facilit6 incubando la mezcla a temperatura ambiente con agitaci6n suave, durante la noche, seguido de fijaci6n en la resina y aspiraci6n de la fracci6n sobrenadante. Despues, la resina se
30 empaquet6 en una columna de 2,6 cm de diametro y la columna se lav6 secuencialmente con PBS, pH 7,5 y tamp6n fosfato 10 mM, pH 8,0, a un caudal de 5 ml/min. Cuando la absorbancia a 280 nm alcanz6 un nivel basal, el material unido se eluy6 usando trietilamina 100 mM y las fracciones bajo el unico pico grande de absorbancia de 280 nm se recogieronyanalizaron para detectar la presenciade p68 mediante ELISA. Las fracciones que contenian p68 se combinaron y dializaron contra PBS para eliminar la trietilamina.
35 Se formul6 en serie una vacuna experimental de modo que contuviera aproximadamente 100 microgramos de p68 purificado y 1 % de gel de hidr6xido de aluminio. Seus6 formalina (0,01%) como conservante en un volumen final de dosis de la vacuna de 1 ml.
Inóculo de exposición
El material de exposici6n se prepar6 esencialmente como se ha descrito en los ejemplos anteriores.
Procedimiento del estudio
Veintiuno (21) cachorros seronegativos ycon cultivos negativos fueron asignados aleatoriamente a uno de dos
5 grupos de tratamiento. 0nce perros fueron asignados al grupo control no vacunado y diez perros al grupo vacunado. El dia 0 se design6 como el dia de la primera vacunaci6n. Un ml de la vacuna se administr6 por via subcutanea el dia 0 y se repiti6 21 dias despues. La sangre se extrajo para el ELISA serol6gico de p68 antes de la primera y la segunda vacunaci6n.
El dia 35, catorce dias despues de la segunda vacunaci6n se administr6 a todos los perros una exposici6n en
10 aerosol de B. bronchiseptica, como se ha descrito anteriormente. Se monitoriz6 la tos de los animales durante 14 dias despues de la exposici6n como se ha descrito en los ejemplos previos.
Resultados
Resumen de las observaciones clinicas y las respuestas serol6gicas a p68 se presentan en la Tabla 40.

Tabla 40: Resumen de observaciones clínicas y respuestas serológicas
GRUP0
N N�MER0 DE T0SES EN D0S D�AS C0NSECUTIV0S N0RMAL T0TAL T�TUL0 (GMT) PREVAC. T�TUL0 (GMT) PREEXP. T�TUL0 (GMT) P0STEXP.
VACUNA
10 0 10/10 5,08 348,15 391,30
C0NTR0L
11 11 0/11 6,10 6,45 18,81
Discusión
En este estudio, 10 de 10 perros controltosieron en almenos dos dias consecutivos. Un perrose considera clinicamente enfermo si tose durante dos dias consecutivos. Con este criterio, el 100% de los perros control no vacunados estaba enfermo. En el grupo vacunado, un perro tosi6 el dia 4 despues de la exposici6n y un perro tosi6
20 los dias 4 y 6 tras la exposici6n. Dos perrostosieron el dia 14. Ninguno de los perros vacunados tosi6 durante dos dias consecutivos. Por tanto, el 100 % de los perros en el grupo vacunado con p68 nativo se consider6 que permanecian normales tras la exposici6n.
Conclusiones
Este ensayo demostr6 la capacidad de una vacuna de p68 nativo para proteger contra la enfermedad por B. 25 bronchiseptica .
Ejemplo 6
Eficacia de las vacunas multivalentes caninas contra la exposici6n a Leptospira bratislava
El prop6sito de este estudio era demostrar la eficacia de las vacunas que contienen fracciones frente a Leptospira serovariedades bratislava, canicola, grippotyphosa, icterohaemorrhagiae y pomona contra la exposici6n a L. 30 bratislava en perros.
MATERIALES
Vacunas: Las vacunas usadas fueron las siguientes:
1. Se us6 una vacuna liofilizada que comprende los antigenos del virus del moquillo canino, adenovirus de tipo 2,
parainfluenza y parvovirus (VANGUARD ® PLUS 5). La vacuna contenia niveles de antigeno de liberaci6n. C6digo 35 del producto 13D1.22
2.
Se us6 una vacuna contra el coronavirus canino en una formulaci6n de diluyente liquido (FIRSTD0SE® CV). La vacuna contenia niveles de antigeno de liberaci6n. C6digo del producto 14P5.20
3.
Se us6 una vacuna liofilizada que comprende los antigenos del virus del moquillo canino, adenovirus de tipo 2, parainfluenza, parvovirus, bratislava, canicola, grippotyphosa, icterohaemorrhagiae y pomona (VANGUARD ® PLUS
40 5). La vacuna contenia aproximadamente 600 neflos de cada serovariedad de Leptospira; y niveles de antigeno de liberaci6n de las fracciones de virus vivo modificado (adenovirus canino, virus del moquillo, virus de la parainflueza, parvovirus) C6digo del Producto 4637.2A
Animales del estudio: Se usaron cachorros de sabueso de aproximadamente 5-6 semanas de edad de cualquier sexo. En el momento de la vacunaci6n eran seronegativos (< 1:8) para las serovariedades de Leptospira bratislava, canicola, grippotyphosa, icterohaemorrhagiae y pomona. Se les permiti6 acceso a alimentos comerciales y al agua de la ciudad a demanda.
Organismo de exposición: A cada se le administr6 una dosis de aproximadamente 2 ml (diluci6n 10-1 de tejido de higado de hamster infectado) de Leptospira Bratislava como inyecci6n intraperitoneal.
Diseño del estudio
Nº
Descripción de Vía Nº de Día de Leptospira Exposición** Días de extracción de muestras de sangre
de tto
la vacuna* perros la vac. Día Dosis Dilución
T1
Control SC 10 0 y 21 49 2 ml 10-1 0, 21, 35, 48, 50, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70
T2
Control IM 10 0 y 21 49 2ml 10-1 0, 21, 35, 48, 50, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70
T3
Leptospira SC 10 0 y 21 49 2 ml 10-1 0, 21, 35, 48, 50, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70
T4
Leptospira IM 10 0 y 21 49 2 ml 10-1 0, 21, 35, 48, 50, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70
PROCEDIMIENTOS
Fase de vacunación: Los dias de estudio 0 y 21 se administr6 a 40 perros en grupos de vacunados (10 10 animales/grupo) una inyecci6n del control o las vacunas de prueba, tal como se indica mas adelante:
T1: 1 ml de la vacuna control que contiene la vacuna del moquillo canino, adenovirus de tipo 2, parainfluenza, parvovirus reconstituida con diluyente de coronavirus canino y administrada por inyecci6n subcutanea (SC). (C6digo del producto 13D1.22 reconstituido con el c6digo del producto 14P5.20)
T2: 1 ml de la vacuna control que contiene la vacuna del moquillo canino, adenovirus de tipo 2, parainfluenza, 15 parvovirus reconstituida co n di luyente d e co ronavirus canino y adm inistrada por i nyecci6n i ntramuscular (I M). (C6digo del producto 13D1.22 reconstituido con el c6digo del producto 14P5.20)
T3: 1 ml de la vacuna de Leptospira que contiene la vacuna del moquillo canino, adenovirus de tipo 2, parainfluenza, parvovirus, bratislava, canicola, grippotyphosa, icterohaemorrhagiae y pomona reconstituida con diluyente de coronavirus canino y administrada por inyecci6n SC. (C6digo del producto 46J7.2A; una combinaci6n de los c6digos
20 del producto 4637.2A y 14P5.20)
T4: 1 ml de la vacuna de Leptospira que contiene la vacuna del moquillo canino, adenovirus de tipo 2, parainfluenza, parvovirus, bratislava, canicola, grippotyphosa, icterohaemorrhagiae y pomona reconstituida con diluyente de coronavirus canino y administrada por inyecci6n IM. (C6digo del producto 46J7.2A; una combinaci6n de los c6digos del producto 4637.2A y 14P5.20)
25 Las observaciones posvacunaci6n de reacciones sistemicas no deseadas se realizaron aproximadamente 1 hora y 5 horas tras la vacunaci6n.
Exposición a Leptospira: Los dias del estudio 49, los animales de prueba fueron expuestos a una dosis de aproximadamente 2ml de L. bratislava mediante inyecci6n intraperitoneal.
Extracción de muestras de sangre: Las muestras de suero se obtuvieron de animales disponibleslos dias de 30 estudio 0, 21, 35, 48, 50, 52, 55, 58, 61, 64, 67 y 70. De forma similar, las muestras de plasma se obtuvieron los dias de estudio 48, 50, 52, 55, 58, 61, 64, 67 y 70.
Serología bacteriana: Las muestras de suero obtenidas los dias de estudio 0, 21, 35, 48, 58 y 70 se analizaron mediante una prueba de microaglutinaci6n para los anticuerpos circulantes frente a L. bratislava.
Espiroquetemia: Las muestras de plasma obtenidas los dias de estudio 48, 50, 52, 55, 58, 61, 64, 67 y 70 se 35 analizaron mediante microscopia de campo oscuro para detectar espiroquetas y cultivo para reaislar Leptospira.
Recuento sanguíneo completo/Panel de bioquímica en suero: Las muestras de plasma obtenidas los dias de estudio 48, 50, 52, 55, 58, 61, 64, 67 y70 se analizaron para, entre otras cosas, contar el numero de plaquetas y determinar la tasa de sedimentaci6n. Las muestras de suero, obtenidas a esos mismos intervalos de tiempo, se analizaron para, entre otras cosas, determinar los niveles de amilasa, alanina, aminotransferasa (ALT), aspartato 40 aminotransaminasa (AST) y creatinina. No se realiz6 un CBC y la tasa de sedimentaci6n para 2 animales (n° QPH3, RVG3) el dia del estudio 55, para un animal (N° RBH3) el dia del estudio 58, para 3 animales (N° QPH3, RVG3) el dia del estudio 61, ni para un animal (N° 0WG3) el dia del estudio 70, porque las muestras de plasma obtenidas se
coagularon antes del analisis.El dia del estudio 67 no se realiz6 una tasa de sedimentaci6n para 2 animales (n° 0UH3, SAG3) porque la cantidad de muestra de plasma no era suficiente para el analisis. Dichos resultados no tuvieron ningun impacto sobre estos parametros del estudio.
Temperaturas corporales rectales: Las temperaturas corporales rectales se registraron los dias del estudio 47-70. Tras la exposici6n (dia del estudio 50), una temperatura corporal elevada de � 39,2 °C se consider6 indicativa de leptospirosis.
Cultivos de orina: Las muestras de orina obtenidas los dias del estudio 48, 55 y 70 se cultivaron para Leptospira y se sometieron a analisis de orina. El dia del estudio 48 no se realiz6 un analisis de orina para un animal (n° CBC3) porque la cantidad de orina disponible en el momento de la obtenci6n no era suficiente para el analisis. El dia del estudio 55 n o se realiz6 un analisis de orina para 2 animales (n° 0PH3, RXG3) porque la cantidad de or ina disponible en el momento de la obtenci6n no era suficiente para el analisis. El dia del estudio 70 no se realiz6 una tasa de sedimentaci6n para 10 animales (n° 0YG3, PIG3, PUG3, QHG3, QQH3, QSG3, RDG3, RUG3, RVG3, RYG3) ya que las cantidades de orina disponibles en el momento de la obtenci6n no eran suficientes para el analisis. Dichos resultados no tuvieron ningun impacto sobre este parametro del estudio.
Necropsia y aislamiento de Leptospira: Los animales sacrificados durante o al final del periodo postexposici6n se sometieron a una necropsia. Los fluidos y tejidos corporales (es decir, higado, rin6n y orina) se recogieron y presentaron a BCL para reaislar Leptospira. El dia del estudio 55 no se complet6 el reaislamiento de la bacteria para 2 animales (n° 0PH3, RXG3) porque la cantidad de orina disponible en el momento de la obtenci6n no era suficiente para el analisis. El dia del estudio 70 no se complet6 el reaislamiento de la bacteria para 4 animales (n° 0YG3, PUG3, QSG3, RUG3) ya que las cantidades de orina disponibles en el momento de la obtenci6n no eran suficientes para el analisis. Dichos resultados no tuvieron ningun impacto sobre este parametro del estudio.
Observaciones del estado de salud: Se monitoriz6 a los animales a diario para determinar su estado de salud general.
Resumen y análisis de datos
Los datos se analizaron con un modelo mixto o un procedimiento categ6rico SAS/STAT Software Changes and Enhancements through Release 6.12, SAS Institute, Cary, North Carolina). Se us6 un modelo mixto lineal general de medidas repetidas (los terminos del modelo de efecto fijo son Tratamiento, dia de estudio y tratamiento por dia se estudio) para analizar latemperatura, los titulos de anticuerpo en suero, el recuento de plaquetas, la tasa de sedimentaci6n, l os niveles de am ilasa, A lanina, am inotransferasa ( ALT), asp artato am inotransferasa ( AST) y creatinina. S e r ealizaron c ontrastes de i nteres despues de det ectar un t ratamiento si gnificativo ( P : 0,05) o tratamiento por dia del efecto de interacci6n del estudio. Los titulos se transformaron logaritmicamente segun lo adecuado para el analisis y, una vez transformados, las medias de minimos cuadrados se retrotransformaron a las medias geometricas para la presentaci6n. Las observaciones no analizadas (es decir, los resultados de la necropsia y las observaciones posvacunaci6n) no se introdujeron en la base de datos para el resumen.
Para cada tratamiento se calcularon las distribuciones de frecuencia de los animales con recuentos de plaquetas <200 al menos una vez y los animales con temperaturas rectales superiores o iguales a 39,2 °C. Los animales se clasificaron como normales o enfermos cada dia postexposici6n durante el estudio. La presencia de cualquiera de los signos siguientes dieron como resultado una clasificaci6n de enfermo: Conjuntivitis, depresi6n, inapetencia, temblores musculares, secreci6n nasal, pirexia (� 39,2 °C) u ojos acuosos.
Se us6 un modelo mixto lineal general (el termino del modelo de efecto mixto es tratamiento) para analizar el numero de dias postexposici6n que un animal se clasific6 como enfermo. La variable binomial muerto o sacrificado se analiz6 con la prueba exacta de Fisher. La espiroquetemia y el reaislamiento de la bacteria en la orina, el rin6n y el higado se analizaron usando la prueba exacta de Fisher para comparar los grupos de tratamiento.
En ausencia de una diferencia significativa entre las vias de administraci6n y la via por interacci6n del tratamiento (P(� 0,05 bilateral), se usaron contrastes para comparar la media de los tratamientos T1 y T2 con la media de los tratamientos T3 y T4 (P : 0,05 unilateral). Si el analisis fue un analisis de medidas repetidas, la comparaci6n se realiz6 en cada punto de tiempo en el que se recogieron datos. En caso contrario, los contrastes se usaron para comparar T1 con T3 y T2 con T4 (P: unilateral). Estas comparaciones se realizaron en cada punto de tiempo si el analisis era de medidas repetidas.
La ef icacia de l a va cuna d e Lept ospira c ontra L. bratislava se d emostr6 por un a i ncidencia menor ( P: 0,05; unilateral) de la enfermedad en los animales vacunados. Las siguientes variables avalan la eficacia de la vacuna de Leptospira: (1) El recuento medio de plaquetas fue significativamente mayor (P: 0,05; unilateral) para los vacunados;
(2) la tasa de sedimentaci6n media fue significativamente(P: 0,05; unilateral) menor para los vacunados; (3) La incidencia de la espiroquetemia fue significativamente (P: 0,05; unilateral) menor para los vacunados.
RESULTADOS
Signos clínicos postexposición: El numero medio de dias que los animales mostraron signos clinicos indicativos de leptospirosis (p. ej., conjuntivitis, depresi6n, diarrea, hematuria, ictericia, inapetencia, moribundo, temblores musculares, pirexia, v6mitos) se presenta en la Tabla 1. Tras la exposici6n (dias de estudio 50-70), el numero medio de dias que los controles T1 y T2 estaban enfermos fue de 4,3 y 3,3, respectivamente. Por el contrario, las medias para los vacunados de T3 y T4 eran 0,7 y 0,5, y dichos resultados mejoraron significativamente (P< 0,05) cuando se compararon con los controles T1-T2. El porcentaje de animales que presentan signos clinicos tras la exposici6n tambien se proporciona en la Tabla 1. El 75 % de los controles T-1-T2 mostraron signos de leptospirosis, mientras que si gnos si milares se ob servaron u nicamente en el 30 5 d e los vacunados T3-T4. E l num ero de an imales infectados que requirieron eutanasia durante la fase de exposici6n del estudio tambien se presenta en la Tabla 1. Cinco animales (25 %) en los grupos control T1-T2 mostr6 signos graves de leptospirosis y fueron sacrificados. Por el co ntrario, l os vacunados T 3-T4 per manecieron por l o dem as sanos durante e l m ismo i ntervalo y d icha comparaci6n (T1-T2 vs T3-T4) mejor6 significativamente (P<0,05) para los vacunados. En la Tabla 2 se presenta una representaci6n de las temperaturas corporales medias tras la exposici6n. Durante los primeros 9 dias tras la exposici6n (dias de estudio 50-58), las temperaturas medias para los controles T1-T2 variaron de 37,8 a 39,4 °C. Durante el mismo intervalo, las temperaturas medias para los vacunados T3-T4 variaron de 38,2 a 38,7 °C. Es notable el h echo d e q ue las t emperaturas m edias para los vacunados T 3-T4 er an s ignificativamente m enores (P<0,05) a 2, 3 y 5 dias trasla exposici6n cuando se compararon con las temperaturas medias de T1-T2. La frecuencia de animales con al menos una temperatura 39,2 °C tambien se presenta en la Tabla 2. Una temperatura corporal elevada de 39,2 °C se consider6 indicativa de infecci6n por Leptospira. Durante el curso del periodo de observaci6n postexposici6n, el 60-70% de los controles T1-T2 present6 una temperatura 39,2 °C. Por el contrario, solo el 30 % de los vacunados T3-T4 present6 dicho signo clinico.
Espiroquetemia postexposición: La frecuencia de espiroquetemia se presenta en laTabla 3. La presencia de espiroquetas en l a sa ngre ( detectadas mediante c ultivo bact eriano) es un r esultado cl inico que m uestra leptospirosis. Un dia despues de la exposici6n (dia del estudio 50) se estableci6 espiroquetemia en el 90 % de los controles T1, el 60 % de los controles T2, el 60 % de los vacunados T3 y el 70 % de los vacunados T4. Cabia esperar un r eaislamiento de l a bact eria e n l a sa ngre a l as 24 horas de l as inyecciones intraperitoneales con independencia del estado de vacunaci6n. Despues se estableci6 espiroquetemia para los controles T1 del siguiente modo: 100 % el dia 3 tras la exposici6n (dia del estudio 52, 56 % el dia 6 (dia de estudio 55) y 33 % el dia 9 (dia de estudio 58). De forma similar se estableci6 espiroquetemia para los controles T2 del siguiente modo: 60% el dia 3 tras la exposici6n, 50% el dia 6 y 29% el dia 9. Por el contrario, se estableci6 en los vacunados T3-T4 durante el mismo periodo postexposici6n no durante el resto del periodo postexposici6n (es decir, los dias de estudio 50-70).
En general, el porcentaje de los animales positivos para espiroquetemia, incluido un dia despues de la exposici6n (dias del estudio 50-70) fue 60%-100% para los controles T1�2 y 60%-70% de los vacunados T3-T4. En contraste, el porcentaje de los animales positivos excluido un dia despues de la exposici6n (dias del estudio 52-70) fue 60%100% para los controles T1-T2 y 0% de los vacunados T3-T4.
Reaislamiento de leptospira de fluidos y tejidos corporales tras la exposición: El reaislamiento de leptospira en muestras de sangre, orina, rin6n e higado se presenta en la tabla 4. En la secci6n anterior se proporciona un resumen de los resultados del reaislamiento de leptospira en sangre. A partir de 3 dias despues de la exposici6n (es decir, excluyendo el dia 1 tras la exposici6n) se estableci6 espiroquetemia en el 60-100 % de los controles T1-T2 y no se estableci6 en los vacunados T3-T4 durante el mismo periodo. Es notable el hecho de que la comparaci6n (T1-T2 vs T3-T4) mejor6 significativamente (P<0,05) para los vacunados.
En la necropsia se obtuvieron muestras de rin6n. Se reaisl6 leptospira del 50 % de las muestras de rin6n obtenidas de los controles T1 y T2. No se reaisl6 de muestras derivadas de los vacunados T3-T4. Dicha comparaci6n (T1-T2 vs T3-T4) mejor6 significativamente (P<0,05) para los vacunados.
En la necropsia se obtuvieron muestras de higado. Se reaisl6 leptospira del 10% y el 20 % de las muestras de higado obtenidas de los controles T1 y T2, respectivamente. No se reaisl6 de muestras derivadas de los vacunados T3-T4. Dicha comparaci6n (T1-T2 vs T3-T4) mejor6 significativamente (P<0,05) para los vacunados.
Las muestras de orina se obtuvieron a 2 i ntervalos tras la exposici6n en la necropsia. Se reaisl6 leptospira de 2 controles T1 a los 6 dias de la exposici6n (dia del estudio 55). No se reaisl6 Leptospira de ninguna muestra de los controles T2 ni de los vacunados T3-T4.
Recuentos de plaquetas tras la exposición: Los recuentos medios de plaquetas se presentan en la Tabla 5. Una disminuci6n del numero de plaquetas en sangre (trombocitopenia) es un resultado clinico indicativo de leptospirosis. Las concentraciones medias para los controles T1-T2 variaron entre 61 y 937. Durante el mismointervalo, los recuentos medios para los vacunados T3-T4 variaron entre 400 y 566. Es notable el hecho de que los recuentos de plaquetas para los vacunados T3-T4 mejoraron significativamente (P<0,05) a los 3, 6 y 9 dias de la exposici6n en comparaci6n con los controles T1-T2.
La frecuencia de animales con al menos un recuento de plaquetas < 200 tambien se presenta en la Tabla 5. Durante el curso del periodo postexposici6n, se determin6 que el 90 % de los controles T1 y el 60 % de los controles T2 eran trombocitopenico (recuento de plaquetas < 200). Por el contrario, s6lo el 10 % de los vacunados T3 y ninguno de los vacunados T4 era trombocitopenico tras la infecci6n.
Tasas de sedimentaci6n tras la exposici6n: Las tasas de sedimentaci6n medias se presentan en la Tabla 6. Un incremento de la tasa de sedimentaci6n es un resultado clinico indicativo de leptospirosis.
Las tasas medias para los controles T1-T2 variaron entre 2,4 y 16,0. Durante el mismo intervalo, las tasas medias para los vacunados T3-T4 variaron entre 1,5 y 6,3. Es notable el hecho de que las tasas para los vacunados T3-T4 eran significativamente menores (P<0,05) a los 3, 6, 9, 12, 15, 18 y 21 dias despues de la exposici6n cuando se compararon con las de los controles T1-T2.
Concentraciones de ALT tras la exposición: Las concentraciones medias de alanina aminotransferasa (ALT) se presentan en la Tabla 7. Un incremento de ALT es un resultado clinico indicativo de la infecci6n bacteriana (es decir, a medida que la funci6n hepatica se deteriora, los niveles de ALT aumentan). Las concentraciones medias para los controles T1-T2 variaron entre 22 y 79. Durante el mismo intervalo, las concentraciones medias para los vacunados T3-T4 variaron entre 21 y 61. Es notable el hecho de que las concentraciones para los vacunados T3-T4 fueron significativamente (P<0,05) menores a los 3, 6, 9 y 12 dias de la exposici6n en comparaci6n con los controles T1-T2.
Concentraciones de creatinina tras la exposición: Las concentraciones medias de creatinina se presentan en la Tabla 8. Un incremento de las concentraciones de creatinina es un resultado clinico indicativo de la infecci6n bacteriana (es decir, a medida que la funci6n renal se deteriora por la leptospirosis, los niveles de creatinina aumentan). Las concentraciones medias para los controles T1 (es decir, administraci6n SC) variaron entre 0,30 y 99. Durante el m ismo i ntervalo, l as concentraciones medias par a l os vacunados T3 ( es decir, a dministraci6n S C) variaron ent re 0,26 y 0,40. E s notable el hec ho de que l as concentraciones para l os vacunados T3 er an significativamente menores (P<0,05) a los 1, 6, 9, 12, 15, 18 y 21 dias despues de la exposici6n cuando se compararon con las de los controles T1. Las concentraciones medias para los controles T2 (es decir, administraci6n IM) variaron entre 0,30 y 1,31. Durante el mismo intervalo, las concentraciones medias para los vacunados T4 (es decir, administraci6n IM) variaron entre 0,32 y 0,46. No se observaron diferencias significativas entre los valores de T2 y T4 tras la exposici6n.
Amilasa, AST y análisis de orina tras la exposición: No se obse rvaron di ferencias significativas en l as concentraciones medias para los vacunados T3-T4 cuando se compararon con los controles T1-T2. No obstante, en general, las concentraciones postexposici6n aumentaron de forma mas espectacular para los controles T1-T2. No se observaron cambios granes postexposici6n en los niveles de AST (aspartato aminotransaminasa)y los resultados del analisis de orina para los animales de prueba T1-T4. Los resultados para estos 3 parametros no se tabulan de otro modo en el presente documento.
Títulos de anticuerpos en suero: Los titulos medios en suero del anticuerpo frente a L. bratislava se presentan en la Tabla 4. Durante la fase de vacunaci6n de la investigaci6n (dias del estudio 0-48), los titulos medios para los controles T1-T2 eran aproximadamente 2 (es decir, seronegativo). De forma correspondiente, las medias para los vacunados T3-T4 variaron entre 2 (prevacunaci6n) y1181 (posvacunaci6n). Es notable el hecho de que los titulos medios para los vacunados T3-T4 eran significativamente mayores (P<0,05) a los 21, 35 y48 dias despues de la exposici6n cuando se compararon con los titulos medios T1-T2.
Durante la fase de exposici6n de la investigaci6n (dias de estudio 58 y 70), los titulos medios para los controles T1-T2 variaron entre 2135 y 41160. De forma correspondiente, los titulos medios para los vacunados T3 y T4 variaron entre 727 y 10891, y fueron significativamente (P<0,05) menores el dia del estudio 58 (es decir, 9 dias tras la exposici6n) y 70 dias tras la vacunaci6n (es decir, dia 21 PC) en comparaci6n conlos controles T1-T2. Como resultado, los controles mostraron una espectacular respuesta primaria a L. bratislava postexposici6n (es decir, infecci6n establecida), mientras que la respuesta para los vacunados T3-T4 fue menos s6lida (es decir, la tipica respuesta anamnesica).
Reacciones sistémicas posvacunación: No se observaron reacciones sistemicas posvacunaci6n en los animales de prueba T1-T4 cuando se evaluaron 1 y 5 horas despues de las vacunaciones primaria y de refuerzo. Dicho resultado no esta tabulado en el presente documento.
CONCLUSIÓN
La eficacia de una vacuna multivalente de Leptospira administrada mediante inyecci6n SC o IM contra L. bratislava se demostr6 tras la exposici6n mediante, entre otros: (1) una incidencia significativamente menor de enfermedad asociada con Leptospira, (2) una incidencia significativamente menor de espiroquetemia, (3) recuentos de plaquetas significativamente mayores y (4) tasas de sedimentaci6n medias significativamente menores, en comparaci6n con los controles.

Tabla 41: Resumen de signos clinicos tras la exposici6n con L. bratislava para perros inmunizados con un control o con una vacuna multivalente de Leptospira
Grupos de tratamiento (vacunado)
Nº de animales expuestos Número de días que muestran signos clínicos de leptospirosis postexposición Porcentaje de animales con signos clínicos postexposición† Porcentaje de animales infectados que requieren eutanasia†
Media†
Mínimo Máximo
T1
C0NTR0L (SC) 10 4,3 0 9 90% N = 9/10 10% N=1/10
T2
C0NTR0L (IM) 10 3,3 0 10 60% N=6/10 40% N=4/10
T3
VACUNA LEPT0 (SC) 10 0,7 0 4 30% N=3/10 0% N=0/10
T4
VACUNA LEPT0 (IM) 10 0,5 0 3 30% N=3/10 0% N=0/10
�porcentaje o tratamiento, medias de minimos cuadrados. La media de los controles (T1-T2) es significativamente diferentes (P: 0,05) de la media de los vacunados (T3-T4).

Tabla 42: Temperaturas corporales medias tras la exposición con L. bratislava para perros inmunizados con un control o con una vacuna multivalente de Leptospira
Temperaturas medias por día de estudio** (día tras la exposición)
Frecuencia(%) con una temperatura 39,2 ºC
Grupo de tratamiento (vacunados)
49 (0) 50 (1) 51 (2)† 52 (3)† 53 (4) 54 (5)† 55 (6) 56 (7) 57 (8) 58 (9)
T1
C0NTR0L(SC) 38,1 1N= 10 38,6N= 10 39,4N= 10 38,9N= 10 38,5N= 10 38,8N= 9 38,6N= 9 38,2N= 9 38,2N= 9 38,3N= 9 70N= 7/10
T2
C0NTR0L(IM) 38,3N= 10 38,5N= 10 39,4N= 10 38,9N= 10 38,7N= 10 38,6N= 8 38,3N= 8 37,8N= 8 38,2N= 7 38,1N= 7 60N= 6/10
T3
VACUNALEPT0. (SC) 38,2N= 10 38,4N= 10 38,5N= 10 38,3N= 10 38,7N= 10 38,5N= 10 38,5N= 10 38,2N= 10 38,5N= 10 38,4N= 10 30N= 3/10
T4
VACUNALEPT0. (IM) 38,2N= 10 38,5N= 10 38,5N= 10 38,3N= 10 38,5N= 10 38,5N= 10 38,3N= 10 38,3N= 10 38,4N= 10 38,6N= 10 30N= 3/10
��Medias de minimos cuadrados del tratamiento. N= numero de animales o numero con temperaturas postexposici6n 39,2 °C/numero de animales.�La media de los controles (T1-T2) es significativamente diferente (P: 0,05) de la media de los vacunados (T3-T4).

Tabla 43: Frecuencia de espiroquetemia tras la exposición con L. bratislava para perros inmunizados con un control o con una vacuna multivalente de Leptospira
Grupo de tratamiento (vacunado)
Frecuencia (%) de espiroquetemia por día de estudio** (día postexposición)
48 (-1)
50 (1) 52 (3) 55 (6) 58 (9) 61 (12) 64 (15) 67 (18) 70 (21)
T1
C0NTR0L(SC) 0N=0/10 90N=9/10 100N=10/10 56N=5/9 33N=3/9 0N=0/9 0N=0/9 0N=0/9 0N=0/9
T2
C0NTR0L(IM) 0N=0/10 60N=6/10 60N=6/10 50N=4/8 29N=2/7 0N=0/6 0N=0/6 0N=0/6 0N=0/6
T3
VACUNA LEPT0. (SC) 0N=0/10 60N=6/10 0N=0/10 0N=0/10 0N=0/10 0N=0/10 0N=0/10 0N=0/10 0N=0/10
T4
VACUNA LEPT0. (IM) 0N=0/10 70N=7/10 0N=0/10 0N=0/10 0N=0/10 0N=0/10 0N=0/10 0N=0/10 0N=0/10
��N = numero positive para espiroquetemia/numero de animales.

Tabla 44: Frecuencia de reaislamiento de Leptospira de fluidos y tejidos corporales tras la exposición con L. bratislava para perros inmunizados con un control o con una vacuna multivalente de Leptospira
Grupos de tratamiento (vacunado)
Frecuencia (%) de reaislamiento de leptospira de fluidos y tejidos corporales**
Sangre†
Orina Riñón†† Hígado††
Incluido día +1 postexposición
Excluido día +1 postexposición††
T1
C0NTR0L (SC) 100 N=10/10 100 N=10/10 22 N=2/9 50 N=5/10 10 N=1/10
T2
C0NTR0L (IM) 60 N=6/10 60 N=6/10 0 N=0/7 50 N=5/10 20 N=2/10
T3
VACUNA LEPT0. (SC) 60 N=6/10 0 N=0/10 0 N=0/10 0 N=0/10 0 N=0/10
T4
VACUNA LEPT0. (IM) 70 N=7/10 0 N=0/10 0 N=0/10 0 N=0/10 0 N=0/10
��N = numero positive para espiroquetemia/numero de animales.�Bacteria prevista en la circulaci6n sanguinea a las 24 horas de la inyecci6n intraperitoneal con independencia del estado de vacunaci6n. Por tanto, los datos de reaislamiento tambien se resumen, excluyendo los resultados obtenidos 1 dia despues de la exposici6n (dia del estudio 50). ��La media de los controles (T1-T2) es significativamente diferente (P: 0,05) de la media de los vacunados (T3-T4).
Tabla 45: Recuentos medios de plaquetas tras la exposición con L. bratislava para perros inmunizados con un control o con una vacuna multivalente de Leptospira
Grupo de tratamiento (vacunado)
Recuentos medios de plaquetas por día de estudio** (día postexposición) Frecuencia (%) con un recuento de plaquetas < 200
48 (-1)
50 (1) 52 (3)† 55 (6) † 58 (9)† 61 (12) 64 (15) 67 (18) 70 (21)
T1
C0NTR0L (SC) 534 N=1 0 426 N=1 0 61 N=1 0 128 N=8 499 N=8 937 N=9 724 N=9 586 N=9 490 N=8 90 N=9/10
T2
C0NTR0L (IM) 549 N=10 451 N=10 174 N=1 0 204 N=8 480 N=7 738 N=5 735 N=6 604 N=6 498 N=6 60 N=6/10
T3
VACUNA LEPT0. (SC) 557 N=10 450 N=10 463 N=10 560 N=10 538 N=10 506 N=9 490 N=10 458 N=10 465 N=10 10 N=1/10
T4
VACUNA LEPT0. (IM) 521 N=10 442 N=10 400 N=10 552 N=9 566 N=10 483 N=9 478 N=10 472 N=10 472 N=10 0 N=0/10
��Medias de minimos cuadrados del tratamiento. N= numero de animales o numero con recuentos de plaquetas postexposici6n < 200 /numero de animales.�La media de los controles (T1-T2) es significativamente diferente (P: 0,05) de la media de los vacunados (T3-T4).

Tabla 46: Tasas de sedimentación medias tras la exposición con L. bratislava para perros inmunizados con un control o con una vacuna multivalente de Leptospira
Grupo de tratamiento (vacunado)
Tasas de sedimentación medias por día de estudio** (día postexposición)
48 (-1)
50 (1) 52 (3)† 55 (6)† 58 (9) † 61 (12)† 64 (15)† 67 (18)† 70 (21)†
T1
C0NTR0 L (SC) 1,3 N=10 6,7 N=10 10,4 N=10 9,0 N=8 6,8 N=8 4,5 N=9 4,6 N=9 3,0 N=9 2,4 N=8
T2
C0NTR0 L (IM) 1,2 N=10 5,7 N=10 10,2 N=10 9,7 N=8 16,0 N=7 5,9 N=5 5,1 N=6 3,6 N=6 3,3 N=6
T3
VACUNA LEPT0. (SC) 1,1 N=10 5,3 N=10 2,9 N=10 3,0 N=10 3,3 N=10 2,3 N=9 2,1 N=10 1,9 N=9 1,5 N=10
T4
VACUNA LEPT0 (IM) 1,3 N=9 6,3 N=10 3,8 N=10 4,3 N=9 3,9 N=10 2 N=9 2,4 N=10 2,5 N=9 2,1 N=10
��Medias de minimos cuadrados del tratamiento. N=numero de animales. �La media de los controles (T1-T2) es significativamente diferente (P: 0,05) de la media de los vacunados (T3-T4).
Tabla 47: Concentraciones medias de ALT (alanina aminotransferasa) tras la exposición con L. bratislava para perros inmunizados con un control o con una vacuna multivalente de Leptospira
Grupo de tratamiento (vacunado)
Concentraciones de ALT por día de estudio** (día postexposición)
48 (-1)
50 (1) 52† (3) 55† (6) 58† (9) 61† (12) 64 (15) 67 (18) 70 (21)
T1
C0NTR0L (SC) 33 N=10 66 N=10 79 N=10 32 N=9 34 N=9 26 N=9 24 N=9 22 N=9 24 N=9
T2
C0NTR0L (IM) 35 N=10 60 N=10 63 N=10 30 N=8 32 N=7 34 N=6 26 N=6 24 N=6 24 N=6
T3
VACUNA LEPT0. (SC) 30 N=10 57 N=10 27 N=10 22 N=10 23 N=10 22 N=10 23 N=10 21 N=10 22 N=10
T4
VACUNA LEPT0 (IM) 32 N=10 61 N=10 30 N=10 22 N=10 25 N=10 26 N=10 26 N=10 24 N=10 25 N=10
��Medias de minimos cuadrados del tratamiento. N=numero de animales. �La media de los controles (T1-T2) es significativamente diferente (P: 0,05) de la media de los vacunados (T3-T4).

Tabla 48: Concentraciones medias de creatinina tras la exposición con L. bratislava para perros inmunizados con un control o con una vacuna multivalente de Leptospira
Grupo de tratamiento (vacunado)
Concentraciones medias de creatinina por día de estudio** (día postexposición)
48 (-1)
50 (1) 52 (3) 55 (6) 58 (9) 61 (12) 64 (15) 67 (18) 70 (21)
T1
C0NTR0L (SC) 0,32a N=10 0,33a N=10 0,30a N=10 0,80a N=9 0,99a N=9 0,70a N=9 0,63a N=9 0,52a N=9 0,39a N=9
T3
VACUNA LEPT0. (SC) 0,31a N=10 0,26b N=10 0,32a N=10 0,37b N=10 0,39b N=10 0,33b N=10 0,40b N=10 0,36b N=10 0,27b N=10
T2
C0NTR0L (IM) 0,31a N=10 0,33a N=10 0,30a N=10 1,318 N=8 1,08a N=7 0,51a N=6 0,51a N=6 0,42a N=6 0,30a N=6
T4
VACUNA LEPT0 (IM) 0,33a N=10 0,32a N=10 0,33a N=10 0,41a N=10 0,43a N=10 0,36a N=10 0,46a N=10 0,39a N=10 0,32a N=10
��Medias de minimos cuadrados del tratamiento. N=numero de animales. a,b Los valores en columnas (para T1 vs T3 y T2 vs T4) con superindices diferentes son significativamente diferentes (P : 50,05).
Tabla 49: Títulos medios de anticuerpo frente a L. bratislava en suero para perros inmunizados con un control o con una vacuna multivalente de Leptospira
Grupo de tratamiento (vacunado)
Títulos medios de anticuerpos frente a L. bratislava ** (día de estudio postexposición)
0
21† 35† 48† 58† 70†
T1
C0NTR0L (SC) 2 N=10 3 N=10 2 N=10 2 N=10 41160 N=9 4770 N=9
T2
C0NTR0L (IM) 2 N=10 2 N=10 2 N=10 3 N=10 22571 N=7 2135 N=6
T3
VACUNA LEPT0. (SC) 2 N=10 56 N=10 1032 N=10 159 N=10 10891 N=10 1106 N=10
T4
VACUNA LEPT0 (IM) 2 N=10 97 N=10 1181 N=10 257 N=10 8819 N=10 727 N=10
��Medias geometricas del tratamiento. N=numero de animales.�La media de los controles (T1-T2) es significativamente diferente (P: 0,05) de la media de los vacunados (T3-T4)
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<213> Bordetella bronchiseptica
20 <400> 1
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<211> 1806
<212> ADN
<213> Bordetella bronchiseptica
<400> 2
<210> 3
<211> 599
<212> PRT
<213> Bordetella bronchiseptica 54
<400> 3

Claims (19)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una composici6n de vacuna para usar en la inmunizaci6n de perros contra la infecci6n causada por Leptospira bratislava, que comprende una preparaci6n celular de Leptospira de Leptospira bratislava y un vehiculo.
  2. 2.
    La composici6n de vacuna de la reivindicaci6n 1, en la que dicha preparaci6n celular de Leptospira comprende ademas una preparaci6n celular de al menos uno de Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae o Leptospira pomona, en la que la cantidad de cada cepa de Leptospira en la composici6n de vacuna esta en el intervalo de aproximadamente 100-3500 unidades nefelometricas por dosis de vacuna.
  3. 3.
    Una vacuna de composici6n para usar en la inmunizaci6n de perros contra pat6genos caninos, que comprende la composici6n de la reivindicaci6n 2 y que ademas comprende una cepa atenuada del virus del moquillo canino (CD), una cepa atenuada del adenovirus canino de tipo 2 (CAV-2), una cepa atenuada del virus de la parainfluenza canina (CPI), una cepa atenuada del parvovirus canino (CPV) y un vehiculo, en la que la cantidad de cada cepa atenuada de virus en dicha vacuna esta en el intervalo de 102 a 109 de TCDI50por dosis.
  4. 4.
    La vacuna de combinaci6n de la reivindicaci6n 3, que comprende ademas una preparaci6n de celulas parciales o enteras inactivadas de una cepa del coronavirus canino (CCV).
  5. 5.
    Una vacuna de composici6n para su uso en la inmunizaci6n de perros contra pat6genos caninos, que comprende una preparaci6n ce lular de L eptospira de Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae, y Leptospira pomona y que ademas comprende una cepa atenuada del virus del moquillo canino (CD), una cepa atenuada del adenovirus canino de tipo 2 (CAV-2), una cepa atenuada del virus de la parainfluenza canina (CPI), una cepa atenuada del parvovirus canino (CPV) y un vehiculo.
  6. 6.
    La vacuna de combinaci6n de la reivindicaci6n 5, que comprende ademas una preparaci6n de celulas parciales o enteras inactivadas de una cepa del coronavirus canino (CCV).
  7. 7.
    La composici6n de vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1, 5y6, en la que la cantidad de cada de Leptospira esta en el intervalo de aproximadamente 100 a 3500 unidades nefelometricas por dosis.
  8. 8.
    La composici6n de vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la cantidad de c ada de Leptospira esta en el intervalo de aproximadamente 200 a 2000 unidades nefelometricas por dosis.
  9. 9.
    La vacuna de combinaci6n de la reivindicaci6n 5 o la reivindicaci6n 6, en la que la cantidad de dicha cepa de virus CD en dicha vacuna esta en el intervalo de 102 a 109 TCID50 por dosis.
  10. 10.
    La vacuna de combinaci6n de la reivindicaci6n 5 o la reivindicaci6n 6, en la que la cantidad de dicha cepa de virus CAV-2 en dicha vacuna esta en el intervalo de 102 a 109 TCID50 por dosis.
  11. 11.
    La vacuna de combinaci6n de la reivindicaci6n 5 o la reivindicaci6n 6, en la que la cantidad de dicha cepa de virus CPI en dicha vacuna esta en el intervalo de 102 a 109 TCID50 por dosis.
  12. 12.
    La vacuna de combinaci6n de lareivindicaci6n 5 o la reivindicaci6n 6, enla que la cantidadde dicha cepa atenuada de CPV en dicha vacuna esta en el intervalo de 102 a 109 TCID50 por dosis.
  13. 13.
    La vacuna de combinaci6n de cualquiera de las reivindicaciones 4 y 6, en la que la cantidad de la preparaci6n celular de dicha cepa de CCV en dicha vacuna es de al menos aproximadamente 100 unidades relativas por dosis.
  14. 14.
    La composici6n de vacuna de c ualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el vehiculo comprende saponina y un tensioactivo.
  15. 15.
    La composici6n de vacuna de la reivindicaci6n 14, en la que la saponina es Quil A y el tensioactivo es colesterol.
  16. 16.
    La composici6n de vacuna de la reivindicaci6n 15, en la que la cantidad de Quil A esta en el intervalo de 1 a 1000 !g por dosis y la cantidad de colesterol esta en el intervalo de 1 a 1000 !g por dosis.
  17. 17.
    La composici6n de vacuna de c ualquiera de l as reivindicaciones 1 a 6, en la que el vehiculo comprende hidr6xido de aluminio.
  18. 18.
    La c omposici6n de v acuna de cu alquiera d e l as reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha co mposici6n s e administra mediante una via intravenosa, intranasal, oral, intramuscular o subcutanea.
  19. 19.
    La composici6n de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho perro recibe dicha composici6n dos o tres veces con un intervalo de aproximadamente 2-4 semanas entre administraciones.
    Figura 1: Resumen de la media geométrica de los títulos finales de P68 ELISA en perros no vacunados y vacunados con p68 de Bordetella (15 g/dosis) en exposición en aerosol a Bordetella Bronchiseptica
    Figura 2: Resumen de los títulos de amiloide A sérico en perros tras la exposición en aerosol a Bordetella Bronchiseptica
    Figura 3. Resumen de la media geométrica de los títulos finales de p68 ELISA en perros no vacunados y vacunados con p68 de Bordetella tras la vacunación y la exposición en aerosol con Bordetella Bronchiseptica Figura 4. Resumen de los títulos de amiloide A sérico en perros tras la exposición en aerosol a Bordetella bronchiseptica
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