BR112013019675B1 - Composições imunogênicas de bordetella bronchiseptica - Google Patents

Abstract

composições imunogênicas de bordetella bronchiseptica. a presente invenção refere-se às composições, combinações e métodos que compreendem bordetella bronchiseptica e isolado pertactina, que são eficazes no tratamento ou prevenção de infecções respiratórias, tais como tosse de canil, em animais.

Description

CAMPO DA PRESENTE INVENÇÃO

[1] A presente invenção refere-se ao campo da imunologia e, em particular, ao campo das composições imunogênicas e vacinas. Mais de forma específica, a presente descrição refere-se a composições que compreendem uma preparação de Bordetella bronchiseptica, em combinação com a pertactina, para tratamento ou prevenção de doença (s) respiratória (s) em um cão.

ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO

[2] Bordetella bronchiseptica é uma bactéria gram-negativa que coloniza no trato respiratório de cães e causa tracheobonchitis ou "tosse de canil". Hawkins, CE, Veterinary Internal Medicine (1995), pp. 767 a 811. Bordetella bronchiseptica predispõe os cães para o efeito de outros agentes respiratórios, e frequentemente existe concomitantemente com eles. Até a data, uma série de vacinas estão disponíveis para o tratamento de tracheobonchitis causada pela Bordetella bron- chiseptica, incluindo Nobivac ®, Bronchi-Shield ®, Bronchicine ® CAE, Vanguard ® B, Univac 2, Recombitek ® KC2, Naramune TM-2 e Kennel- Jec TM 2.

[3] No entanto, a maioria das vacinas comerciais existentes requer a administração intranasal pesada, bem como a adição de adjuvantes, que podem resultar em efeitos colaterais deletérios, tais como a queimadura e a irritação. Viera Scheibner et al., Nexus dezembro 2000 (Vol. 8, No1). As vacinas intranasais são impopulares com médicos veterinários, devido ao seu risco pessoal com os animais rebeldes durante a administração da vacina. As vacinas de subunidades, como as que envolvem a utilização de proteína p68 de Bordetella bronchi- septica (pertactina), têm sido exploradas, mas até a data não foram incluídas em quaisquer vacinas caninas comerciais, possivelmente devido a insuficiente imunogenicidade, a reatividade e/ou a estabilidade da formulação.

[4] Bordetella bronchisepticaé um fator significativo na com plexadoença respiratória infecciosa canina (CIRDC), que é uma doença altamente contagiosa comum em cães abrigados em condições de superlotação, tais como centros de realojamento e embarque ou canis de treinamento. A patogenia da CIRDC é considerada multifatorial, en-volvendovários tipos de vírus e bactérias. Os agentes infecciosos conhecidos por serem agentes causadores de CIRDC incluem, além da bactéria Bordetella bronchiseptica (Bemis et al., Lab. Anim. Sei., 29 : 48 a 52, 1977), o coronavírus canino respiratório (CRCoV) (Erles et al ., Virology, 310 (2) : 216 a 223, 2003), vírus da gripe canina (CIV) (Crawford et al., Ciência, 310 (5747) : 482 a 485, 2005), vírus da parainfluenza canina (CPIV) (Binn et al., Exp. Biol. Med., 126 : 140 a 145, 1967), Cynos Mycoplasma (Chalker et al., Microbiologia, 150 : 3491 a 3497, 2004) e adenovírus canino sorotipo 2 (CAV-2) (Ditchfield et al., Can. Veterinário. J., 3 : 238 a 247, 1962). Até a data, nenhuma combinação de vacina abrangente contra todos, ou a maioria, dos agentes patogênicos mencionados emergiu.

[5] Por conseguinte, continua a haver uma necessidade de uma composição imunogênica capaz de ser administrada parenteri- camente de forma segura a um cão, o que proporciona longa ação de imunoproteção contra Bordetella bronchiseptica, sem efeitos colaterais deletérios ou interferência com outros antígenos em uma vacina de combinação ou causando o risco ao praticante veterinário. A presente invenção satisfaz estas e outras necessidades relacionadas.

SUMÁRIO DA PRESENTE INVENÇÃO

[6] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona uma composição imunogênica que compreende, inter alia, Bordetella bron- chiseptica e um antígeno de pertactina isolado. Em uma outra modalidade, o referido antígeno é uma proteína pertactina recombinante. Em uma outra modalidade, o referido antígeno pertactina é a Bordetella bronchiseptica. Em uma outra modalidade, o referido antígeno pertac- tina é p68. Em uma outra modalidade, a referida composição compreende ainda um antígeno isolado Bsp22.

[7] Em uma outra modalidade, o componente de Bordetella bronchisepticaé uma bacterina ou um extrato bacteriano. Em uma outra modalidade, a referida composição é não-adjuvante. Em uma outra modalidade, a referida composição compreende ainda um adjuvante.

[8] Em uma outra modalidade, o referido antígeno pertactina está presente entre cerca de 1 μg e cerca de 30 μg. Mais particularmente, o referido pertactina está presente entre cerca de 5 mg e cerca de 20 μg, mais particularmente ainda, entre cerca de 7 mg e cerca de 15 μg, e ainda mais particularmente, de cerca de 5 μg, 10 μg, 15 μg ou 20 μg. De preferência, o referido antígeno pertactina é preparado por meio da solubilização de corpos de inclusão em ureia pertactina e, opcionalmente, purificado por meio da cromatografia de coluna. Os referidos antígenos pertactina são solúveis e de preferência substancialmente livre de agregados.

[9] Outra modalidade proporciona uma composição imunogê- nica que compreende uma pluralidade de antígenos p68 pertactina re- combinantes, em que a referida composição é substancialmente livre de agregados de p68. Mais particularmente, a referida pluralidade de antígenos p68 pertactina recombinantes são preparados por meio da solubilização de corpos de inclusão em ureia pertactina e, opcionalmente, purificado por meio da cromatografia de coluna. A presente invenção também fornece os métodos de preparação de antígenos p68 pertactina por meio da solubilização de corpos de inclusão em ureia pertactina e, opcionalmente, purificado por meio da cromatografia de coluna.

[10] Em uma outra modalidade, a referida composição é formu lada para administração parentérica, tal que compreende ainda um diluente ou excipiente para administração parentérica a um cão.

[11] Em uma outra modalidade, a referida composição compre ende ainda um antígeno de um agente patogênico respiratório canino selecionado de entre o grupo que consiste em : vírus parainfluenza canino (CPIV), adenovírus-2 canino (CAV-2), coronavírus respiratório canino (CRCoV) e vírus da gripe canina ( CIV). Em uma modalidade mais particular, a referida composição compreende pelo menos dois, três ou quatro dos antígenos dos agentes patogênicos respiratórios caninos.

[12] Em uma outra modalidade, as composições imunogênicas descritas na presente invenção não incluem os antígenos não respiratórios. Dessa maneira , uma modalidade da presente invenção proporciona uma composição tal como descrita na presente invenção, com a condição de que não incluem um antígeno não respiratório. Os antíge- nos não respiratórios não causam doença respiratória em um indivíduo. Exemplos não limitativos de tais antígenos não respiratórios incluem o vírus da raiva, parvovírus canino, coronavírus canino entico, espécies de Leptospira, e Borrelia burgdorferi.

[13] Em uma outra modalidade, o referido antígeno é a partir de coronavírus canino respiratória (CRCoV). Em uma outra modalidade, o referido antígeno é a partir do vírus da gripe canina (CIV). Em uma outra modalidade, o referido antígeno é a partir do vírus da parainfluenza canina (CPIV). Em uma outra modalidade, o referido antígeno é a partir de canino adenovírus-2 (CAV-2). Em uma outra modalidade, o referidoantígeno é a partir do vírus da parainfluenza canina (CPIV) e caninaadenovírus-2 (CAV-2).

[14] Em uma outra modalidade, a referida composição compre- ende os antígenos do vírus da parainfluenza canino (CPIV) canino, adenovírus-2 (CAV-2), coronavírus respiratório canino (CRCoV) e vírus da gripe canina (CIV).

[15] Em uma outra modalidade, a composição induz uma res posta imune a Bordetella bronchiseptica e pelo menos um dos vírus parainfluenza canino (CPIV), canino adenovírus-2 (CAV-2), coronaví- rus respiratório canino (CRCoV) e vírus da gripe canina (CIV).

[16] Outra modalidade da presente invenção proporciona uma composição imunogênica que compreende coronavírus respiratório canino (CRCoV), uma preparação de Bordetella bronchiseptica e vírus da gripe canina (CIV). Mais particularmente, a referida composição compreende um antígeno de pertactina isolado.

[17] Outra modalidade da presente invenção proporciona um método ou utilização da composição imunogênica de acordo com qualquer das modalidades anteriores para o tratamento ou prevenção de infecção por meio de um agente patogênico respiratório canino em cães. Em uma outra modalidade, a referida composição previne a infecção a partir do referido agente patogênico respiratório canino no referido cão por um período de 6 meses ou mais. Em uma outra modalidade, a referida composição previne a infecção a partir do referido agente patogênico respiratório canino no referido cão durante um período de cerca de 1 ano.

[18] Em uma outra modalidade, o agente patogênico respiratório canino é Bordetella bronchiseptica. Em uma outra modalidade, o agen-tepatogênico respiratório canino compreende ainda, pelo menos, um, dois, três ou quatro de : vírus parainfluenza canino (CPIV), adenovirus canino 2 (CAV-2), coronavírus respiratório canino (CRCoV) e vírus da gripe canina (CIV ).

[19] Outra modalidade da presente invenção proporciona um método ou utilização da composição imunogênica de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores para o tratamento ou prevenção de doença respiratória do complexo infeccioso canino (CIRDC), em que a composição trata ou previne a infecção por meio de uma pluralidade de patogênios respiratórios canino. Outra modalidade fornece para o uso ou o método de administração parentérica de uma composição imunogênica como descrita na presente invenção.

[20] Outra modalidade fornece a fabricação de um medicamento que compreende a composição imunogênica para o tratamento ou prevenção de infecção por meio de um agente patogênico respiratório canino em cães.

[21] Estas e outras modalidades, características e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada e das reivindicações anexas apresentadas na presente invenção abaixo. Entende-se que cada uma das modalidades anteriores, e a seguir podem ser combinadas em uma única modalidade.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO

[22] As definições abaixo se aplicam a esta descrição. Elas substituem quaisquer das definições contraditórias contidas em cada referência individual incorporadas na presente invenção por meio de referência. As palavras não definidas têm o significado comumente usado por uma pessoa que é versada na técnica. Além disso, a menos seja exigido de uma outra forma pelo contexto, os termos singulares devem incluir as pluralidades e os termos no plural incluem o singular.

[23] "Cerca de" ou "aproximadamente", quando utilizado em li gação com uma variável numérica mensurável, refere-se a o valor indicado da variável e para todos os valores das variáveis que estão dentro do erro experimental do valor indicado (por exemplo, dentro de 95% intervalo de confiança para a média), ou dentro de 10 por cento do valor indicado, o que for maior. Se a "cerca de" é utilizado em referência a intervalos de tempo em semanas", cerca de 3 semanas" é de 17 a 25 dias, e "cerca de 2 a cerca de 4 semanas"é de 10 a 40 dias.

[24] O termo "adjuvante", tal como é usado na presente inven ção, refere-se a qualquer substância que serve como um estimulador não-específico da resposta imunitária. Vide abaixo uma descrição mais detalhada dos adjuvantes.

[25] O termo "animal", tal como usado na presente invenção, inclui qualquer animal que é suscetível à infecção por Bordetella bron- chiseptica e/ou complexo de doença respiratória canina, incluindo mamíferos, tanto domésticos e selvagens. Preferencialmente, animal, tal como usado na presente invenção refere-se a um cão ou um ser humano.

[26] O termo "anticorpo", tal como é usado na presente inven ção, é qualquer polipeptídeo que compreende um local de ligação ao antígeno, independentemente da fonte, do método de produção, ou outras características. O mesmo refere-se a uma molécula de imuno- globulina ou um fragment do mesmo que se liga de forma específica a um antígeno como resultado de uma resposta imune a esse antígeno. As imunoglobulinas são proteínas plasmáticas, constituídas por meio das cadeias de polipeptídeos "leves" e "pesadas" que têm regiões "variáveis"e "constantes"são divididas em classes (por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM), com base na composição das regiões constantes. Um anticorpo que é "específico"para um dado antígeno indica que as regiões variáveis do anticorpo reconhecem e ligam um antígeno específico exclusivamente. O termo inclui, mas não está limitado a : um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo mo- noespecífico, um anticorpo poliespecífico, um anticorpo humanizado, um anticorpo tetrâmico, um anticorpo tetravalente, um anticorpo multi- específico, um anticorpo de cadeia simples, um anticorpo específico para o domínio , um anticorpo de domínio único, um domínio de anticorpo suprimido, uma proteína de fusão, uma proteína de fusão scfc, um anticorpo de cadeia simples, um anticorpo quimérico, um anticorpo sintético, um anticorpo recombinante, um anticorpo híbrido, anticorpo mutado, e anticorpos enxertados com CDR. Os anticorpos podem ser imunoglobulinas intactos derivados de fontes naturais ou de fontes re- combinantes, ou podem ser porções imunorreativas das imunoglobuli- nas intactas. Um "anticorpo" pode ser convertido para uma proteína de ligação ao antígeno, que inclui, mas não está limitado aos fragmentos de anticorpos, que incluem mas não estão limitados a : Fab, F (ab ') 2, um fragmento Fab' , um fragmento Fv, um fragmento Fv de cadeia simples (scFv), um fragmento Fd, um fragmento dAb, diacorpos, um peptídeo CDR3, um peptídeo restrito FR3-CDR3-FR4, um Nanoanti- corpo, um Nanoanticorpo bivalente, um pequeno imunofarmacêutico modular (SMIPs), e um minicorpo e fragmentos de qualquer um dos acima mencionados e os seus homólogos quimicamente ou geneticamente manipulados, bem como outros fragmentos de anticorpos que retêm a função de ligação ao antígeno. Tipicamente, esses fragmentos compreendem um domínio de ligação ao antígeno. Como será reconhecido por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica, qualquer uma de tais moléculas pode ser manipulada (por exemplo, "germlined") para diminuir a sua imunogenicidade, aumentar a afinidade, alterar a sua especificidade, ou similares.

[27] O termo "antígeno"ou "imunogênio", tal como é usado na presente invenção, refere-se a uma molécula que contém um ou mais epítopos (lineares, conformacional ou ambos) que, por exposição a um indivíduo induzem uma resposta imunológica que é específica para esse antígeno. Um epítopo é o local específico do antígeno que se liga a um receptor de células T ou de anticorpos específicos, e, tipicamente, compreende cerca de 3 resíduos de aminoácidos até cerca de 20 resíduos de aminoácidos. O termo antígeno refere-se a subunidade de antígenos de antígenos separados e discretos de um organismo com- pleto com o qual o antígeno está associado na natureza, bem como mortas, bactérias atenuadas ou inativadas, vírus, fungos, parasitas ou outros micróbios. O termo antígeno também se refere a anticorpos, tais como anticorpos anti-idiotipo ou os fragmentos dos mesmos, e os mimotopos de peptídeos sintéticos, que podem mimetizar um antígeno ou determinante antigênico (epítopo). O termo antígeno também se refere a um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo que expressa um antí- geno ou um determinante antigênico, in vivo, tal como em aplicações de imunização de DNA.

[28] O termo "antigenicidade", tal como é usado na presente in venção, refere-se à capacidade de uma proteína ou polipeptídeo a ser imunode forma específica ligado por meio de um anticorpo criado contra a proteína ou polipeptídeo.

[29] O termo "Bordetella bronchiseptica" ou "B. bronchiseptica" refere-se a : uma bactéria viva atenuada de Bordetella bronchiseptica, um extrato de células inteiras mortas (bacterina) de Bordetella bron- chiseptica, ou de um extrato bacteriano celular de Bordetella bronchi- septica.

[30] O termo "tampão"significa um sistema químico que evita a alteração na concentração de uma outra substância química. Os sistemas de aceitador e doador de prótons servem como amortecedores, evitando as mudanças marcantes na concentração de íons de hidrogênio (pH). Um outro exemplo de um tampão é uma solução contendo uma mistura de um ácido fraco e do seu sal (base conjugada), ou uma base fraca e o seu sal (ácido conjugado).

[31] O termo "canino", tal como usado na presente invenção, inclui o que é vulgarmente chamado de cão, mas inclui outros membros da família Canidae.

[32] O termo "linhagem celular" ou "célula hospedeira", como é usado na presente invenção, significa uma célula procariótica ou euca- riótica em que o vírus pode replicar ou pode ser mantido.

[33] O termo "cultura", tal como é usado na presente invenção, significa uma população de células ou de microrganismos que crescem na ausência de outras espécies ou tipos.

[34] O termo "dose" refere-se a uma composição imunogênica ou vacina dada a um indivíduo. A "primeira dose" ou "dose primária"refere-se à dose de uma tal composição dada no dia 0. A "segunda dose" ou uma "terceira dose" ou uma "dose anual" refere-se a uma quantidade de tal composição dada após a primeira dose, o que pode ser, mas não é necessário para ser a mesma vacina ou composição imunogênica, como a primeira dose.

[35] O termo "epítopo" é um local específico do antígeno que se liga a um receptor de células T ou de anticorpos específicos, e compreende, tipicamente, cerca de três resíduos de aminoácidos até cerca de 20 resíduos de aminoácidos.

[36] O termo "excipiente", tal como é usado na presente inven ção, refere-se a um componente transportador não-reativo de uma composição imunogênica ou vacina, que não é um antígeno. Os exci- pientes preferidos são os que são conhecidos na tecnica para a injeção parentérica.

[37] O termo "fragmento" refere-se a uma porção truncada de um gene ou proteína. O termo "fragmento funcional" e "fragmento bio-logicamente ativo" referem-se a um fragmento que retém as proprie-dadesbiológicas da proteína de comprimento completo ou o gene.

[38] O termo "homologia" ou "percentagem de homologia"refe re-seà percentagem de resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos na sequência candidata que são idênticos ou semelhantes aos resíduos na (s) sequência (s) comparadora (s), após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para atingir a sequência de homologia máxima por cento, e também considerando as substitui- ções conservadoras, como parte da homologia.

[39] O termo "homólogos"ou "espécies homólogas"incluem os genes encontrados em duas ou mais espécies diferentes que possuem substancial homologia de sequência de polinucleotídeo, e possuem os mesmos, ou semelhantes, as funções biológicas e/ou as propriedades. De preferência, as sequências polinucleotídicas que representam as espécies homólogas irão hibridar sob as condições moderadamente rigorosas, tal como é descrita na presente invenção por exemplo, e possuem as mesmas ou semelhantes atividades biológicas e/ou propriedades. Em um outro aspecto, os polinucleotídeos que representam as espécies homólogas irão partilhar mais do que cerca de 60% de homologia de sequência, maior do que cerca de 70% de homologia de sequência, maior do que cerca de 80% de homologia de sequência, maior do que cerca de 90% de homologia de sequência, maior do que cerca de 95% de homologia de sequência, maior do que cerca de 96% de homologia de sequência, maior do que cerca de 97% de homologia de sequência, maior do que cerca de 98% de homologia de sequência, ou maior do que cerca de 99% de homologia de sequência.

[40] O termo "identidade" ou "percentagem de identidade"refe re-seà percentagem de nucleotídeos ou aminoácidos na sequência candidata que são idênticas aos resíduos na sequência de comparação depois de alinhar as duas sequências e introdução de intervalos, se necessário, para atingir a máxima percentagem de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequência.

[41] O termo "resposta imunitária", tal como usado na presente invenção, refere-se a um indivíduo ao desenvolvimento de uma resposta imune humoral, uma resposta imune celular ou uma resposta humoral e uma resposta imune celular a um antígeno. Uma "resposta imune humoral" refere-se a um que é, pelo menos em parte mediada por anticorpos. Uma "resposta imune celular"é aquela mediada por meio dos linfócitos T ou de outras células brancas do sangue, ou de ambos, e inclui a produção de citocinas, quimiocinas e moléculas semelhantes produzidas por meio das células T ativadas, células brancas do sangue, ou de ambos. As respostas imunitárias podem ser determinadas usando os imunoensaios padrão e os ensaios de neutralização, que são conhecidos na técnica.

[42] O termo "imunogenicidade", tal como é usado na presente invenção, refere-se à capacidade de uma proteína ou um polipeptídeo para provocar uma resposta imune dirigida de forma específica contra uma bactéria ou vírus que causam a doença identificada.

[43] O termo "composição imunogênica" é uma preparação que contém um imunogênio, incluindo, por exemplo, uma proteína, um peptídeo, uma célula inteira, inativada, subunidade ou vírus atenuado, ou um polissacarídeo, ou sua combinação, administrada para estimular os Sistemas de imune celular e humoral do destinatário para um ou mais dos antígenos presentes na composição imunogênica. O termo "vacinação" é o processo de administração de uma composição imu- nogênica e estimular uma resposta imunitária ou imunogênica a um antígeno em um hospedeiro. Os hospedeiros preferidos são mamíferos, tais como cães. Preferivelmente, a composição imunogênica é uma vacina.

[44] O termo "quantidade imunologicamente protetora", tal como é usado na presente invenção, é uma quantidade eficaz de um antíge- no para induzir uma resposta imunogênica no receptor, que é adequada para prevenir ou melhorar sintomas ou sinais da doença, incluindo os efeitos de saúde adversos ou as suas complicações. Tanto a imunidade celular ou mediada por imunidade humoral, ou ambas, podem ser induzidas. A resposta imunogênica de um animal a uma composição pode ser avaliada, por exemplo, de uma maneira indireta através de medição de titulos de anticorpo, os ensaios de proliferação linfóci- tos ou de uma maneira direta através de monitorização de sinais e sintomasapós desafio com a cepa de tipo selvagem. A imunidade de proteção conferida por meio de uma composição ou vacina pode ser avaliada por meio da medição, por exemplo, a redução do derramamento de organismos de desafio, a redução nos sinais clínicos tais como mortalidade, morbilidade, temperatura, e da condição física geral, a saúde e o desempenho do indivíduo. A resposta imune pode compreender, sem limitação, indução de imunidade celular e/ou humoral. A quantidade de uma composição ou vacina que seja terapeuticamente eficaz pode variar, dependendo do organismo específico utilizado, ou o estado do animal a ser tratado ou vacinado, e pode ser determinada por um médico veterinário.

[45] O termo administração "intranasal", tal como é usado na presente invenção, refere-se à introdução de uma substância, tal como uma vacina ou outra composição, para dentro do corpo de um indivíduoatravés de ou através do nariz, e envolve o transporte da substância principalmente através da mucosa nasal.

[46] O termo "isolado" refere-se a uma substância que é, quer na forma substancialmente pura, por exemplo, maior do que cerca de 95 % de pureza, ou purificada ou enriquecida de alguma forma do seu ambiente natural. Referência à "pertactina isolada" indica uma proteína pertactina que é removida do seu ambiente natural, tais como a partir de um animal hospedeiro / cão, em um meio de crescimento, ou purificada a partir de um conjunto de células de preparação de Bordetella bronchiseptica e pode ser subsequentemente adicionada a uma composição de volta que compreende o extrato de Bordetella bronchisepti- ca (isto é enriquecida com pertactina isolados). O termo "isolado"engloba os imunogênios que estão em solução, com outros agentes / di- luentes / adjuvantes / excipientes / proteínas.

[47] O termo "agente medicinal" refere-se a qualquer agente que é útil na prevenção, cura, ou a melhoria de uma condição médica, ou a prevenção de uma condição fisiológica ou ocorrência.

[48] O termo "anticorpo monoclonal", tal como é usado na pre sente invenção, refere-se a anticorpos produzidos por meio de uma única linhagem celular de hibridoma, todos dirigidos para um epítopo de um antígeno específico. O antígeno utilizado para fazer o anticorpo monoclonal pode ser fornecido como uma proteína isolada do agente patogênico ou de todo o agente patogênico. Um "hibridoma"é uma linhagem celular clonal que consiste em células híbridas formadas por meio da fusão de uma célula de mieloma e uma célula produtora de anticorpo específico. Em geral, os anticorpos monoclonais são de origem murina. No entanto, o anticorpo monoclonal também se refere a uma população clonal de um anticorpo contra um epítopo feito de forma particular de um antígeno produzido por meio da tecnologia de apresentação de fagos, ou o método que é equivalente a exibição do fago, as células híbridas ou de origem de não-camundongo.

[49] O termo "oral" ou administração "peroral", tal como é usado na presente invenção, refere-se à introdução de uma substância, tal como uma vacina ou outra composição, para dentro do corpo de um indivíduo através da boca ou envolve a ingestão ou o transporte através da mucosa oral ( por exemplo, a absorção sublingual ou bucal), ou ambos. Intratraqueal é também uma forma de administração oral ou peroral.

[50] O termo administração "oronasal", tal como é usado na presente invenção, refere-se à introdução de uma substância, tal como uma composição ou vacina, para dentro do corpo de um indivíduo através de ou por meio do nariz e da boca, tal como pode ocorrer, por exemplo, por meio da colocação de uma ou mais gotículas no nariz. A administração oronasal envolve os processos de transporte associa- dos com a administração oral e intranasal.

[51] O termo "administração parentérica", tal como é usado na presente invenção, refere-se à introdução de uma substância, tal como uma composição ou vacina, para dentro do corpo de um indivíduo através de ou por meio de um percurso que não inclua o trato digestivo. A administração parenteral inclui administração subcutânea, intramuscular, intra-arterial e intravenosa. Para os fins desta descrição, a administração parentérica exclui as vias de administração que envolvem principalmente o transporte da substância através de tecido da mucosa na boca, no nariz, traqueia e os pulmões.

[52] O termo "agente patogênico"ou "microorganismo patogêni co", como é usado na presente invenção, significa um microrganismo - por exemplo, CPIV, CAV-2, CRCoV, Cynos Mycoplasma, CIV, ou Bor- detella bronchiseptica - que é capaz de induzir ou provocar uma doença, ou estado anormal no seu hospedeiro animal, de preferência uma doença respiratória, como CIRDC.

[53] O termo "pertactina", tal como é usado na presente inven ção, refere-se a uma proteína de membrana externa de B. Bordetella. De preferência, é a pertactina de B. bronchiseptica, e mais preferenci-almente,"p68", e é codificado por meio do gene, pRNA. Pertactina pode ser isolada na sua forma nativa a partir de Bordetella bronchisepti- ca, ou pode ser produzida de forma recombinante. As sequências de pertactina e exemplos são fornecidos na Patente U.S. No. 7.736.658, o conteúdo da qual é incorporado na presente invenção por meio de referência. O antígeno de pertactina usado na presente invenção inclui as formas lipidados da proteína.

[54] O termo "farmaceuticamente aceitável"refere-se às subs tâncias que, dentro do âmbito do são juizo médico, são adequados para utilização em contato com os tecidos de pacientes sem indevida to-xicidade,irritação, resposta alérgica e similares, compatíveis com uma razoável razão de benefício-risco, e eficazes para a sua utilização pretendida.

[55] O termo "anticorpo policlonal", tal como é usado na presen te invenção, refere-se a uma população mista de anticorpos produzidos contra um patogênio ou antígeno particular. Em geral, a população contém uma variedade de grupos de anticorpos, cada grupo dirigido para um epítopo específico do patogênio ou antígeno. Para produzir anticorpos monoclonais, todo o agente patogênico, ou um antígeno isolado, é introduzido por meio de inoculação ou infecção em um hospedeiro, o qual induz o hospedeiro de produzir anticorpos contra o agente patogênico ou antígeno.

[56] O termo "polinucleotídeo", como é usado na presente in venção, significa uma molécula de polímero orgânico composto de monômeros de nucleotídeos ligados de maneira covalente em uma cadeia. DNA (ácido desoxirribonucleico) e RNA (ácido ribonucleico) são exemplos de polinucleotídeos com uma função biológica distinta.

[57] O termo "polipeptídeo", como é usado na presente inven ção, significa uma molécula de polímero orgânico composta de dois ou mais aminoácidos ligados em cadeia.

[58] O termo "prevenção da infecção", como é usado na presen te invenção, significa prevenir ou inibir a replicação do vírus ou bactérias que causam a doença identificada, para inibir a transmissão de vírus ou bactérias, para evitar que as bactérias ou vírus venham a se estabelecer no seu hospedeiro, ou para aliviar os sintomas da doença causada por meio da infecção. O tratamento terapêutico é considerado se houver uma redução da carga bacteriana ou viral.

[59] O termo "proteção", "proteger", "imunidade de proteção", e semelhantes, tal como usado na presente invenção no que diz respeito a uma vacina ou outra composição, significa que a composição ou vacina impede ou reduz os sintomas da doença causada por meio do organismo a partir do qual o (s) antígeno (s) utilizado (s) na composição ou vacina é (são) derivado (s). O termo "proteção", "proteção", e similares, também significa que a composição ou vacina pode ser utilizada para "tratar" da doença, ou um ou mais sintomas da doença que já existem em um indivíduo.

[60] O termo administração "respiratória", como usado na pre sente invenção, refere-se à introdução de uma substância, tal como uma vacina ou outra composição, para dentro do corpo de um indivíduoatravés de ou por via de inalação de uma substância nebulizada (atomizada). Na administração respiratória, o principal mecanismo de transporte envolve a absorção da substância atomizada através da mucosa na traqueia, brônquios e pulmões e é, portanto, diferente do que a administração por via oral ou intranasal.

[61] Os termos "ligação específica", "liga-se de forma específi ca", e semelhantes, são definidos como duas ou mais moléculas que formam um complexo que é mensurável em condições fisiológicas ou um ensaio e é seletivo. Um anticorpo ou outro inibidor é dito que "se ligam de forma específica"a uma proteína que, em condições apropriadamente selecionadas, tal ligação não é inibida significativamente, enquanto que, ao mesmo tempo a ligação não específica é inibida. A ligação específica é caracterizada por meio de uma elevada afinidade e é seletiva para o composto ou proteína. A ligação não específica geralmente tem baixa afinidade. A ligação dos anticorpos de IgG, por exemplo, é geralmente caracterizada por meio de uma afinidade de pelo menos cerca de 10-7 M ou superior, tal como pelo menos cerca de 10-8 M ou superior, ou pelo menos cerca de 10-9 M ou superior, ou pelo menos cerca de 10-10 ou maior, ou pelo menos cerca de 10-11 M ou superior, ou pelo menos cerca de 10-12 M ou superior. O termo também é aplicável onde, por exemplo, um domínio de ligação ao an- tígeno é específico para um epítopo particular, que não é realizado por meio de inúmeros antígenos, caso em que o anticorpo transportando o domínio de ligação ao antígeno, normalmente não se ligam a outros antígenos.

[62] O termo "fragmento imunogênico específico", tal como é usado na presente invenção, refere-se a uma porção de uma sequência que é reconhecida por um anticorpo ou célula T específica para essa sequência.

[63] O termo "indivíduo", como usado na presente invenção, re fere-se a qualquer animal que tem um sistema imunitário, que inclui mamíferos, tais como cães.

[64] O termo "substancialmente idêntico", tal como é usado na presente invenção, refere-se a um grau de identidade de sequência de pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99 %.

[65] O termo "vacina de subunidade" e "composição de subuni- dades", tal como é usado na presente invenção, refere-se a um tipo de vacina ou uma composição que inclui antígenos, mas não todos os antígenos da qual são derivados ou homólogos, os antígenos de um agente patogênico de interesse, tais como um vírus, bactéria, fungo ou parasita. Tal composição ou vacina está substancialmente isenta de células intactas de agentes patogênicos ou partículas patogênicos, ou do lisado de tais células ou partículas. Dessa maneira, uma vacina de subunidade ou de composição de subunidades, podem ser preparadas a partir de polipeptídeos imunogênicos, pelo menos, parcialmente purificados, ou substancialmente purificados, do patogênio ou os análogos dos mesmos. Os métodos de obtenção de um antígeno ou antígenos na vacina de subunidade ou composição de subunidades incluem as técnicas convencionais de purificação, produção recombinante, ou por meio da síntese química. Uma "vacina de subunidade" ou "composição de subunidades", portanto, refere-se a uma vacina ou composição que consiste em um componente ou de componentes definidos antigênico de um vírus, bactéria, ou outro imunogênio. De preferência, a subuni- dade estrutural da presente invenção é produzida de forma recombi- nante e mais preferivelmente é a pertactina (p68).

[66] O termo "TCID 50" refere-se a "dose infecciosa de cultura de tecido", e é definido como a diluição de vírus necessária para infectar 50% de um dado lote de culturas de células inoculadas. Vários métodos podem ser usados para calcular a TCID50, incluindo o método de Spearman-Karber, o qual é utilizado ao longo da presente invenção. Para uma descrição do método de Spearman-Karber, consulte BW Mahy & HO Kangro, Manula de Métodos de Virologia 25 a 46 (1996).

[67] O termo "agente terapêutico", tal como é usado na presente invenção, refere-se a qualquer molécula, composto, ou o tratamento de vírus, de preferência os vírus atenuados ou mortos, ou de subuni- dade, ou composto, que auxilia no tratamento de uma infecção viral, bacteriana, parasitária, ou fúngica, doenças ou condição por ele causada.

[68] "Quantidade terapeuticamente eficaz", tal como é usado na presente invenção, refere-se a uma quantidade de um antígeno ou vacina ou composição que induz a uma resposta imunitária em um indivíduo (por exemplo, cães) que recebe o antígeno ou vacina ou composição que seja adequada para evitar ou melhorar os sinais ou os sintomas da doença, incluindo os efeitos de saúde adversos ou as suas complicações, causados por meio da infecção com um agente patogênico, tal como um vírus, bactéria, parasita ou fungo. A imunidade humoral e imunidade mediada por células, ou imunidade tanto humoral como mediada por células, podem ser induzidas. A resposta imunogê- nica de um animal a um antígeno, a vacina, ou a composição pode ser avaliada de uma maneira indireta através da medição do título de anticorpos, ensaios de proliferação de linfócitos ou de uma maneira direta através de monitorização de sinais e sintomas após desafio com a cepa de tipo selvagem. A imunidade de proteção conferida por uma vacina ou composição pode ser avaliada medindo a redução do desafio do derramamento do organismo, e/ou a redução nos sinais clínicos tais como mortalidade, morbilidade, temperatura, e da condição física geral,saúde e o desempenho do indivíduo. A quantidade de uma vacina ou composição que é terapeuticamente eficaz pode variar, dependendo do imunogênio específico utilizado, ou da condição do indivíduo, e pode ser determinada por meio de uma pessoa que é versada na técnica.

[69] O termo "tratar" ou "tratamento", tal como é usado na pre sente invenção, refere-se a reverter, aliviar, inibir o progresso de, ou prevenção de um distúrbio, doença ou condição à qual tal termo se aplica, ou para prevenir um ou mais sintomas de tal distúrbio ou condição doença.

[70] O termo "tratamento", como usado na presente invenção, refere-se ao ato de "tratar" como definido imediatamente acima.

[71] O termo "vacina" ou "composição de vacina", como usado na presente invenção, refere-se a uma composição imunogênica selecionada a partir de um vírus ou bactéria vivos, quer modificados, atenuados ou mortos, ou de uma vacina de subunidade, ou por meio de qualquer combinação dos acima mencionados. Administração da vacina a um indivíduo resulta em uma resposta imune. A vacina pode ser introduzida de uma maneira direta no indivíduo por meio de qualquer via de administração conhecida, incluindo a via parentérica, por via oral, e semelhantes. Os termos significa uma composição que previne ou reduz a infecção, ou o que impede ou reduz a um ou mais sinais ou sintomas de infecção. Os efeitos de proteção de uma composição de vacina contra um patogênio são normalmente conseguidos através da indução no indivíduo de uma resposta imune. De um modo geral, as incidências suprimidas ou reduzidas de infecção, melhoria dos sinais ou sintomas, ou eliminação acelerada do microrganismo a partir dos indivíduos infectados são indicativos dos efeitos de proteção de uma composição de vacina. As composições de vacina da presente invenção proporcionam os efeitos de proteção contra infecções provocadas por meio dos agentes patogênicos das doenças respiratórias caninas.

[72] O termo "veterinariamente aceitável", tal como é usado na presente invenção, refere-se a substâncias que são, dentro do âmbito de uma avaliação médica sólida, adequada para utilização em contato com os tecidos de pacientes veterinários sem toxicidade, irritação, resposta alérgica, e semelhantes, comensurável com uma relação benefício-risco razoável, e eficazes para a sua utilização pretendida.

[73] O termo "veículo veterinariamente aceitável", tal como é usado na presente invenção, refere-se a um meio transportador que não interfere com a eficácia da atividade biológica do ingrediente ativo, e não é tóxico para o indivíduo veterinário para quem é administrado.

Antígenos, composições imunogênicas e vacinas

[74] A presente invenção baseia-se na descoberta inesperada de que a inclusão de isolados de antígenos de pertactina em conjunto com um resultado de Bordetella bronchiseptica em preparação melhoraram de forma substancial a eficácia e segurança. Isto é, quando administrada por via parentérica a um cão antes do desafio bacteriano, a composição evita o aparecimento de tracheobonchitis e não resulta em efeitos secundários adversos.

[75] A presente invenção também proporciona as composições imunogênicas e vacinas que compreende um ou mais vírus e bactérias ou subunidades que são adequados para administração a um cão para o tratamento contra CIRDC. O coronavírus respiratório canino (CRCoV) abrangido por meio da presente invenção pode ser caracterizado como um coronavírus presente nas vias respiratórias de cães com doença respiratória contagiosa. CRCoV é filogeneticamente mais intimamente relacionado com o coronavírus bovino (BCoV), coronaví- rus (HCoV) cepa humana OC43 e hemaglutinante do vírus da encefa- lomielite (HEV), coronavírus entérico canino (CCoV) é apenas distantemente relacionado com CRCoV. Um exemplo representativo de um CRCoV adequado para utilização na presente invenção inclui uma cepa identificada como CRCoV cepa 4182 (Erles et al., Vírus Res., 124 : 78 a 87, 2007).

[76] Os antígenos de vírus influenza englobados por esta pre sente invenção podem ser qualquer cepa do vírus da gripe identificado, a partir de qualquer ave ou mamífero, incluindo, mas não se limitando a, vírus da gripe tendo o subtipo H3 hemaglutinina e neuraminidase do subtipo N8, ou do subtipo H3N8, mais vulgarmente referido como um vírus H3N8. A gripe pode ser de origem em mamíferos ou aves, incluindo, mas não limitados a suína, equina ou de origem canina. Em uma modalidade utiliza-se um antígeno da gripe canina. Em uma modalidade é utilizado um antígeno da influenza equina. Em uma modalidade, uma cepa possuindo as glicoproteínas designadas do subtipo H3 ou N8 é usada. Em uma modalidade, uma cepa com ambos os subtipos H3 e N8 das glicoproteínas é usada.

[77] Os antígenos do virus da gripe englobados por meio da presente invenção podem ser isolados a partir de cães, cavalos, porcos e aves, tanto domésticos como selvagens. Os animais escolhidos para a coleta de amostra devem apresentar as síndromes clínicas agudas e/ou sub-agudas, que podem incluir os sintomas respiratórios leves a graves e febre. Os animais também podem apresentar os sinais de anorexia e letargia. Os métodos de isolamento do vírus são bem conhecidos por meio daquelas pessoas que são versadas na téc- nica, incluindo : inoculação de culturas de células de mamífero ou aviária, inoculando s ovos embrionados com amostras de muco nasal da faringe ou a partir de amostras clínicas, a recolha por meio da raspa- gem da passagem nasal ou na garganta, ou por meio da recolha de tecidos tais como baço, pulmão, fígado e amígdalas e lavagem pulmonar. O efeito citopático do vírus pode ser observado em cultura de células. O fluido alantóico ou os lisados de células podem ser testados quanto à sua capacidade para aglutinar ser humano, galinha, peru, ou glóbulos vermelhos, cobaia evidência presuntiva para a presença de um vírus da gripe.

[78] Um exemplo representativo de uma cepa do vírus da gripe canina (CIV) adequado para utilização na presente invenção inclui uma cepa identificada como A / canine / Iowa / 9A1 / B5 / 08 / D12, que foi depositado como PTA-7694, em 29 de Junho de 2006 a American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. Uma cepa representativa do antígeno CIV é a cepa do vírus da CIV na vacina comercial, CIV Vanguard ® (Pfizer). A presente invenção também engloba as vacinas que compreendem uma cepa identificada como a cepa da Influenza Equina A / Equine / 2 / Miami / 1 / 63. Esta cepa foi depositada na ATCC, com o número de acesso VR 317. Exemplos adicionais de vírus da gripe para uso na presente invenção são A / canina / Iowa / 13628 / 2005, A / Equina / Kentucky / 1998, A / Equine / Kentucky / 15 / 2002, A / Equina / Ohio / 1 / 2003, A / Equine / Kentucky / 1 / 1994, A / Equina / Massachusetts / 213 / 2003, A / Equina / Wisconsin / 2003, A / Equina / NewYork / 1999 e A / Equine / Newmarket / A2 / 1993. Outras cepas preferidas e/ou isolados de CIV incluem os descritos na Patente dos EUA N°s 7.959.929 (particularmente as cepas de HA e as sequências identificadas na presente invenção como Jacksonville / 2005, Miami / 2005, FL / 242 / 03 e Florida / 43 / 04), 7.384.642, 7.572.620 e 7.468.187, cujo conteúdo, incluindo todas as sequências, sequências particularmente ha, e cepas, são incorporadas na presente invenção por meio de referência como se apresentados completamente aqui. Associado a isto, uma cepa CIV adequada para utilização na presente invenção inclui o isolado CIV Colorado descrito na Barrell et al. J. Vet. Intern. Med., 24 (6), 1524 a 1527 (2010), com o número de acesso ADW41784.

[79] O vírus da parainfluenza canina (CPIV) abrangido por meio da presente invenção pode ser caracterizado como um dos vírus conhecidos por ser um agente causador associado com tosse do canil. Uma cepa representativa do antígeno CPIV é a cepa de vírus atenuado IPC na vacina comercial, Vanguard ® Plus 5 (Pfizer). Outra cepa representativa do antígeno CPIV é a cepa de vírus atenuado CPI com a designação de "NL-CPI-5" (National Veterinary Laboratory Service, Ames, IA).

[80] O adenovírus canino, tipo 2 (CAV-2), abrangido por meio da presente invenção pode ser caracterizado como um dos vírus conhe-cidostambém como sendo um agente causador associado com tosse do canil. Uma cepa representativa do antígeno CAV-2 é a cepa de vírus atenuada de CAV-2 na vacina comercial, Vanguard ® Plus 5 (Pfizer). Uma cepa representativa do antígeno CAV-2 é a cepa de CAV-2 atenuada designada como a cepa "Manhattan" (National Veterinary Laboratory Service, Ames, IA).

[81] Os Cynos Mycoplasma (M. Cynos) abrangidos por esta presente invenção são descritos em Chalker et al., Microbiologia, 150 : 3491 a 3497 de 2004 e é a única espécie de micoplasma comumente associada com doença respiratória. As composições imunogênicas contra M. Cynos são descritas em EUA 2007 / 0098739, incorporado na presente invenção por meio de referência.

[82] O componente de Bordetella bronchiseptica englobado por meio da presente invenção pode ser caracterizado como o agente causador bacteriano associado a tosse do canil. As composições imu- nogênicas e vacinas englobadas por meio da presente invenção podem ser uma ou mais dos seguintes : um vírus vivo atenuado de Bor- detella bronchiseptica, um Bordetella bronchiseptica bacteriano ou de um extrato bacteriano. Além disso, a composição de preferência também inclui uma subunidade antígeno isolado de Bordetella bronchisep- tica.

[83] Em uma modalidade, Bordetella bronchisepticaé preparada como uma célula inteira sonificada purificada através de cromatografia de coluna, tal como previsto no pedido de patente FR2571618, depositado em 12 de outubro de 1984. Um outro exemplo representativo de um Bordetella bronchisepticaé o extrato bacteriano Bronchicine CAE ™ (Pfizer), que é preparado a partir de material antigênico extraído a partir de células de Bordetella bronchiseptica. Outro exemplo de Bor- detella bronchisepticaé o vírus vivo atenuado da cepa bronchiseptica B-C2 presente em Nobivac ® e/ou a cepa bronchiseptica viva de IntraTrac ®, Brônquio-Shield ®, NaramuneTM, Recombitek ®, Univac, e/ou do canil-JecTM.

[84] Adicionalmente, uma subunidade é, de preferência, tam bém presente (isto é completada), em uma combinação com o componente de Bordetella bronchiseptica. Um exemplo representativo da su- bunidade é um antígeno de pertactina isolado, de preferência, um an- tígeno p68 de Bordetella bronchiseptica, em particular o p68 de Borde- tella bronchiseptica recombinante de antígeno que é reconhecido pelo anticorpo monoclonal específico para p68 Bord 2-7 (descrito em U.S. 7.736.658, incorporado na presente invenção por meio de referência) e em uma modalidade preferida, tem uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na U.S. 7.736.658 ou tem respectiva homolo- gia.

[85] O antígeno p68 pertactina recombinante é de preferência preparado em uma forma solúvel, de tal forma que a estrutura semelhanteà nativa é preservada ou restaurada durante o processamento. Por conseguinte, um aspecto da presente invenção proporciona uma p68 pertactina recombinante que é substancialmente isenta (menos do que cerca de 80%, 90%, 95% ou mesmo 99%) dos agregados. Em uma outra modalidade da pertactina p68 recombinante é solubilizada com ureia, preferivelmente cerca de 0,1 M, 0,5 M, 1 M, 2 M, 3 M ou solução de ureia a 6 M. Depois disso, o antígeno p68 pode ser purificado, tal como através de cromatografia em coluna. Um tal processo é descrito na solubilização Surinder et al. J. Bioscience e Bioengineering, v 99 (4), páginas 303 a 310 (2005).

[86] Os antígenos de pertactina utilizados neste documento in cluem as formas lipidadas. Exemplos de produção de proteínas lipida- das são fornecidos em Erdile et al., Infection e Immunity, (1993) V.61 (1) pp. 81 a 90, incorporar por referência. Os métodos aí descritos podem ser utilizados para preparar as proteínas de pertactina pós- translacionalmente modificadas que contêm uma fração lipídica em anexo.

[87] Além disso, em uma outra modalidade, uma composição imunogênica que compreende Bordetella bronchiseptica e um antíge- no isolado Bsp22. Em uma outra modalidade, a composição imunogê- nica compreende Bordetella bronchiseptica, um antígeno pertactina isolado e compreende ainda um antígeno isolado Bsp22. O antígeno Bsp22 pode ser preparado, tal como previsto na Medhekar et al., Molecular Microbiology (2009) 71 (2), 492 a 504. De preferência, o antí- geno isolado Bsp22 está presente em conjunto com (isto é, para além de) um extrato de Bordetella bronchiseptica e um antígeno de pertacti- na isolado, de forma específica p68 recombinante. "Bsp22" inclui igualmente as formas lipidadas do antígeno. Exemplos de produção de proteínas lipidadas são fornecidos em Erdile et al., Infection e Immu nity, (1993) V.61 (1) pp. 81 a 90, incorporado na presente invenção por meio de referência. Os métodos aí descritos podem ser utilizados para preparar pós-translacionalmente as proteínas Bsp22 modificadas que contêm uma fração lipídica em anexo.

[88] Os vírus englobados por meio da presente invenção podem ser propagados em células, linhagens celulares e células hospedeiras. As referidas células, linhagens celulares ou células hospedeiras podem ser, por exemplo, mas não limitadas a, células de mamíferos e células de não-mamíferos, incluindo as células de plantas e insetos. As células, linhagens de células, e as células hospedeiras em que os vírus são englobados por meio da presente invenção podem ser propagadas sendo prontamente conhecidas e acessíveis àquelas pessoas que são versadas na técnica.

[89] As bactérias englobadas por meio da presente invenção podem ser cultivadas e propagadas utilizando vários meios de cultura conhecidos por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica, incluindo tanto o meio de cultivo em caldo (líquido) e ágar (sólido; se- missólido). Algumas bactérias podem também ser cultivadas e propagadas em células de mamífero ou em células de não-mamíferos.

[90] Os vírus e as bactérias englobadas por meio da presente invenção podem ser atenuados ou inativados antes da sua utilização em uma composição imunogênica ou vacina. Os métodos de atenuação e de inativação são bem conhecidos por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica. Os métodos para a atenuação incluem, mas não estão limitados a, passagem em série em cultura de células de uma linhagem celular adequada (vírus e algumas bactérias), passagem em série em cultura de caldo (bactérias), a irradiação ultravioleta(vírus e bactérias), e mutagênese química (vírus e de bactérias). Os métodos para a inativação viral ou bacteriana incluem, mas não estão limitados ao tratamento com formalina, betapropriolactone (BPL) ou etilenoimina binária (BEI), ou outros métodos conhecidos por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica.

[91] A inativação por meio de formalina pode ser realizada mis turando a suspensão que contém o microrganismo com formaldeído a 37% para uma concentração de 0,5% de formaldeído final. A mistura microorganismo-formaldeído é misturada por meio da agitação constante durante cerca de 24 horas à temperatura ambiente. A mistura do microrganismo inativado é então testada para os organismos vivos residuais por meio do ensaio para o crescimento de uma linhagem celular apropriada ou um meio em caldo.

[92] Para alguns antígenos, a inativação por meio deBEI pode ser realizada por meio da mistura da suspensão contendo o microorganismo da presente invenção com BEI a 0,1 M (2-bromo-etilamina em NaOH a 0,175 N) a uma concentração final de BEI a 1 mM. Para outros antígenos, a concentração final é de BEI a 2 mM. Uma pessoa que é versada na técnica saberia a concentração apropriada para uso. A mistura de vírus-BEI é misturada por meio da agitação constante durante cerca de 48 horas à temperatura ambiente, seguido por meio da adição de tiossulfato de sódio a 1,0 M para uma concentração final de 0,1 mM. A mistura é continuada durante um adicional de duas horas. A mistura contendo o microrganismo inativado é testada para o vírus vivo residual por meio do ensaio para o crescimento de uma linhagem celular apropriada ou um meio em caldo.

[93] As composições imunogênicas e as vacinas englobadas por meio da presente invenção podem incluir um ou mais agentes de suporte veterinariamente aceitáveis. Tal como usado na presente invenção, um "veículo veterinariamente aceitável"inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, adjuvantes, agentes estabilizantes, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e anti- fúngicos, agentes isotônicos, agentes de retardamento da adsorção e similares. Os diluentes podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol, e semelhantes. Os agentes isotônicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose, entre outros, conhecidos dos especialistas na técnica. Os estabilizantes incluem albumina, entre outros, conhecidos por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica. Os conservantes incluem mertiolato, entre outros, conhecidos por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica.

[94] O adjuvante pode ser metabolizável, referindo-se aos adju vantes formados por meio dos componentes que são capazes de serem metabolizados por meio das espécies alvo, tais como os adjuvantesà base de óleo vegetal. Um adjuvante metabolizável pode ser um óleo metabolizável. Os óleos metabolizáveis são gorduras e óleos que ocorrem normalmente em plantas e animais, e, geralmente, consistem basicamente em misturas de triacilgliceróis, também conhecidos como triglicerídeos ou gorduras neutras. Estas substâncias não polares, insolúveis em água são triésteres de ácidos graxos de glicerol. Os tria- cilgliceróis diferem de acordo com a identidade e colocação dos seus três resíduos de ácidos graxos ou cadeias laterais.

[95] O adjuvante pode também ser não metabolizável, referindo- se aos adjuvantes que consistem em componentes, que não podem ser metabolizados pelo corpo do indivíduo animal ao qual a emulsão é administrada. Óleos não-metabolizáveis adequados para utilização nas composições da presente invenção incluem alcanos, alcenos, al- cinos e os seus ácidos e álcoois correspondentes, os éteres e ésteres destes, e as misturas dos mesmos. Preferivelmente, os compostos individuais do óleo são compostos de hidrocarbonetos leves, isto é, tais componentes têm de 6 a 30 átomos de carbono. O óleo pode ser preparado sinteticamente ou purificado a partir de produtos petrolíferos. Os óleos não metabolizáveis preferidos para o uso em composições descritas na presente invenção incluem óleo mineral, óleo de parafina, e cicloparafinas, por exemplo. O termo "óleo mineral" refere-se a um adjuvante de óleo não metabolizável, que é uma mistura de hidrocar- bonetos líquidos obtidos a partir de vaselina através de uma técnica de destilação. O termo é sinônimo de "parafina liquefeita", "vaselina líquida" e "óleo mineral branco". O termo também pretende incluir "óleo mineral leve", isto é, o óleo, que é obtido de forma semelhante por meio de destilação de petrolato, mas o qual tem uma gravidade específica ligeiramente menor do que o óleo mineral branco. O óleo mineral pode ser obtido a partir de várias fontes comerciais, por exemplo, JT Baker (Phillipsburg, PA), USB Corporation (Cleveland, OH). Óleo mineral leve está disponível comercialmente sob o nome ®DRAKEOL.

[96] Os adjuvantes incluem, mas não estão limitados a, sistema adjuvante Emulsigen (MVP Laboratories, Ralston, NE), o sistema adjuvante RIBI (Ribi Inc., Hamilton, MT), alúmen, o gel de hidróxido de alumínio, emulsões de óleo em água, emulsões água em óleo, tais como, por exemplo, os adjuvantes completos e incompletos de Freund, Copolímero em bloco (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville, CA), adjuvante AMPHIGEN ®, saponina, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge, MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL) ou outras frações de saponina, monofosforil-lípido A, Avridine adjuvante lípido-amina, enterotoxina lá- bil ao calor de E. coli (recombinante ou de outro modo ), toxina da có-lera,dipeptídeo de muramila, esqualeno / plurônico copolímero em bloco / tensoativo (SP-óleo), sulfolipobeta-ciclodextrina (SL-CD), os lipossomas contendo um imunomodulador (por exemplo, CpG ou poli I : C), dipeptídeo de muramila (MDP) , iscomatrix (Quil A / fosfotidila de colina), o CPG / DEAE-dextrano / óleo mineral (TXO), CpG, triterpe- nóides (por exemplo, Quil A, ou outra preparação de saponina purificada ou parcialmente purificada), esteróis (por exemplo, colesterol), agentes imunomoduladores ( por exemplo, dimetil dioctadecil brometo de amônio - ADD), polímeros (por exemplo, ácido poliacrílico, tais como CARBOPOL ®), e estimulantes de Th2 (por exemplo, glicolipídios, tais como Bay R1005 ®), e as combinações dos mesmos, entre muitos outros adjuvantes conhecidos por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica.

[97] Exemplos não limitativos de diversas combinações que po dem ser utilizados incluem um triterpenóide além de um esterol (por exemplo, Quil A / colesterol, também conhecido como QAC), um triter- penóide além de um esterol, um agente imunomodulador e um polímero (por exemplo, Quil A / colesterol / DDA / CARBOPOL ®, também conhecido como QCDC), e um triterpenóide além de um esterol, um agente imunomodulador, um polímero, e um estimulante de Th2 (por exemplo, Quil A / colesterol / DDA / CARBOPOL®, e Bay R1005 ®, também conhecido como QCDCR).

[98] As quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção podem ser facilmente determinadas por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica. Em uma modalidade, a presente invenção contempla as composições imunogênicas e vacinas que compreendem desde cerca de 20 μg a cerca de 2000 μg de adjuvante. Em uma outra modalidade, adjuvante é incluído em uma quantidade desde cerca de 100 μg a cerca de 1500 μg, ou desde cerca de 250 μg a cerca de 1000 μg, ou desde cerca de 350 μg a cerca de 750 μg. Em uma outra modalidade, adjuvante é incluído em uma quantidade de cerca de 500 μg / dose de 2 ml da composição imunogênica ou da vacina.

[99] As composições imunogênicas e as vacinas podem tam bém incluir antibióticos. Tais antibióticos incluem, mas não estão limitados a, aqueles da classe dos aminoglicosídeos, cefalosporinas, carbapenemos, glicopeptídeos, macrólidos, penicilinas, polipeptídeos, quinolonas, sulfonamidas e tetraciclinas. Em uma modalidade, a pre- sente invenção contempla as composições imunogênicas e as vacinas que compreendem desde cerca de 1 μg / ml a cerca de 60 μg / ml de antibiótico. Em uma outra modalidade, as composições imunogênicas e as vacinas compreendem de cerca de 5 μg / ml a cerca de 55 μg / ml de antibiótico, ou a partir de cerca de 10 μg / ml a cerca de 50 μg / ml de antibiótico, ou desde cerca de 15 μg / ml a cerca 45 μg / ml de antibiótico, ou desde cerca de 20 μg / ml a cerca de 40 μg / ml de antibiótico, ou desde cerca de 25 μg / ml a cerca de 35 μg / ml de antibiótico. Ainda em uma outra modalidade, as composições imunogênicas e as vacinas compreendem menos do que cerca de 30 μg / ml de antibiótico.

[100] As composições imunogênicas e as vacinas englobadas por meio da presente invenção podem incluir uma ou mais moléculas polinucleotídicas que codificam para um vírus ou uma bactéria ou uma proteína virai ou bacteriana. As moléculas de DNA ou RNA podem ser usadas em composições imunogênicas ou vacinas. A molécula de DNA ou RNA podem ser administradas de ausência de outros agentes, ou pode ser administrada em conjunto com um agente tendo em vista facilitar a absorção celular (por exemplo, lipossomas ou lipídios catalíticos). O total de polinucleotídeo na composição imunogênica ou na vacina será geralmente entre cerca de 0,1 μg / ml e cerca de 5,0 mg / ml. Em uma outra modalidade, o polinucleotídeo total na composição imunogênica ou na vacina será de cerca de 1 μg / ml e cerca de 4,0 mg / ml, ou desde cerca de 10 μg / ml e cerca de 3,0 mg / ml, ou desde cerca de 100 μg / ml e cerca de 2,0 mg / ml. As vacinas e os procedimentos de vacinação que utilizam ácidos nucleicos (DNA ou RNAm) têm sido bem descritos na técnica, por exemplo, Patente dos U.S. N° 5703055, Pat. U.S. N° 5580859, Pat. U.S. No. 5.589.466, todas as quais são incorporadas na presente invenção por meio de referência.

[101] Para além dos vírus ou bactérias acima descritas, as com posições imunogênicas e as vacinas englobadas por meio da presente invenção podem incluir outros antígenos adicionais. Os antígenos podem ser sob a forma de uma preparação total ou parcial de inativação do microrganismo, ou sob a forma de moléculas antigênicas obtidas por meio das técnicas de engenharia genética ou síntese química. Outrosantígenos adequados para utilização de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, aqueles derivados a partir de vírus patogênicos tais como vírus da cinomose, herpesvírus canino, vírus da gripe canina, vírus da raiva, as bactérias patogênicas, tais como Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grip- potyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira Hardjobovis, Porphyromonas spp., Bacteriodes spp., Borrelia spp., Streptococcus spp., incluindo Streptococcus equi das subespécieszooepidemicus, Ehrlichia spp., Mycoplasma spp., incluindo Cynos Mycoplasma e Microsporum canis. Os antígenos podem também ser derivados a partir de fungos patogênicos, tais como Candida, protozoáriostais como Cryptosporidium parvum, Neospora caninum, T. gondii, Eimeria spp., Babesia spp., Giardia spp., Leishmania spp. Helmintos, ou como Taenia, Cuterebra, Echinococcus, e Paragonimus spp. Formas, dosagens, vias de administração

[102] As composições imunogênicas e as vacinas englobadas por meio da presente invenção podem ser administradas a animais para induzir uma resposta imune eficaz contra CIRDC. Por conseguinte, a presente invenção proporciona os métodos para estimular uma resposta imune eficaz por meio da administração a um animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica ou vacina descrita na presente invenção.

[103] As composições imunogênicas e as vacinas descritas na presente invenção podem ser administradas a um animal a vacinar o animal indivíduo contra CIRDC. As composições imunogênicas e as vacinas podem ser administradas ao animal para prevenir ou tratar CIRDC no animal. Dessa maneira, são descritos na presente invenção os métodos de vacinação de um animal contra CIRDC, e a prevenção ou tratamento CIRDC, que compreende a administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição imuno- gênica ou vacina descrita na presente invenção.

[104] As composições imunogênicas e as vacinas englobadas por meio da presente invenção podem ser feitas em várias formas, de-pendendo da via de administração. Por exemplo, as composições imunogênicas e vacinas podem ser feitas sob a forma de soluções ou dispersões aquosas estéreis adequadas para uso injetável, ou feitas em formas liofilizadas usando as técnicas de liofilização. As composições imunogênicas e as vacinas liofilizadas são tipicamente mantidas a cerca de 4°C, e podem ser reconstituídas em uma solução de estabilização, por exemplo, solução salina ou HEPES, com ou sem adjuvante. As composições imunogênicas e as vacinas podem também ser feitas sob a forma de suspensões ou emulsões.

[105] As composições imunogênicas e as vacinas da presente invenção incluem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais dos microrganismos descritos antes. Purificada vírus e/ou bactérias podem ser usados de uma maneira direta em uma composição imunogênica ou vacina, ou pode ser ainda mais atenuado ou inativado. Tipicamente, uma composição imunogênica ou vacina contém entre cerca de 1 x 102 a cerca de 1 x 1012 partículas virais ou bacterianas, ou entre cerca de 1 x 103 a cerca de 1 x 1011 partículas, ou entre cerca de 1 x 104 a cerca de 1 x 1010 partículas, ou entre cerca de 1 x 105 a cerca de 1 x 109 partículas, ou entre cerca de 1 x 106 a cerca de 1 x 108 partículas. A quantidade precisa de um microrganismo em uma composição imunogênica ou uma vacina eficaz para proporcionar um efeito de proteção pode ser determinada por meio de uma pessoa que é versada na técnica.

[106] As composições imunogênicas e as vacinas compreendem geralmente um transportador veterinariamente aceitável, em um volume de entre cerca de 0,5 ml e cerca de 5 ml. Em uma outra modalidade o volume do suporte é entre cerca de 1 mL e cerca de 4 ml, ou entre cerca de 2 ml e de cerca de 3 ml. Em uma outra modalidade, o volume do suporte é de cerca de 1 ml, ou é de cerca de 2 ml, ou é de cerca de 5 ml. Os transportadores veterinariamente aceitáveis adequados para utilização em composições imunogênicas e as vacinas podem ser qualquer um dos descritos anteriormente.

[107] As pessoas versadas na técnica podem facilmente determi nar se um vírus ou uma bactéria tem de ser atenuada ou inativada antes da administração. Em uma outra modalidade da presente invenção, um vírus ou uma bactéria pode ser administrado de uma maneira direta a um animal sem atenuação adicional. A quantidade de um microorganismo que seja terapeuticamente eficaz pode variar, dependendo do microrganismo particular utilizado, da condição do animal e/ou o grau de infecção, e pode ser determinada por meio de uma pessoa que é versada na técnica.

[108] Em conformidade com os métodos da presente invenção, uma única dose pode ser administrada a animais ou, de uma maneira alternativa, dois ou mais inoculações pode ocorrer com intervalos de cerca de dois a cerca de dez semanas. Os regimes de impulso podem ser necessários, e o regime de dosagem pode ser ajustado com a finalidade de proporcionar ótimo de imunização. As pessoas versadas na técnica podem facilmente determinar o regime de administração ótimo.

[109] As composições imunogênicas e vacinas podem ser admi nistradas de uma maneira direta na corrente sanguínea, no músculo, para um órgão interno, ou sob a pele. Os meios adequados para ad- ministração parentérica incluem intravenosa, intra-arterial, intramuscular e subcutânea. Os dispositivos adequados para a administração pa- rentérica incluem agulha (incluindo microagulhas), injetores e injetores sem agulha.

[110] As formulações parentéricas são tipicamente as soluções aquosas que podem conter excipientes tais como sais, hidratos de carbono, proteínas e agentes de tamponamento (preferencialmente para um pH de cerca de 3 a cerca de 9, ou desde cerca de 4 até cerca de 8, ou entre cerca de 5 a cerca de 7,5; ou de cerca de 6 a cerca de 7,5, ou cerca de 7 a cerca de 7,5), mas, para algumas aplicações, podem ser mais adequadamente formuladas como uma solução não- aquosa estéril ou como uma forma seca para ser utilizada em conjunto com um veículo adequado, tal , água apirogênica como estéril ou soro fisiológico.

[111] A preparação de formulações parenterais em condições estéreis, por exemplo, por meio da liofilização, pode ser facilmente conseguida utilizando as técnicas farmacêuticas padronizadas bem conhecidas por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica.

[112] A solubilidade dos materiais utilizados na preparação de soluções parenterais pode ser aumentada através da utilização de técnicas de formulação apropriadas conhecidos por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica, tais como a incorporação de agentes que aumentam a solubilidade, incluindo tampões, sais, tenso- ativos, lipossomas, ciclodextrinas, e similares.

[113] As composições para administração parentérica podem ser formuladas para ser de liberação imediata ou modificada. As formulações de liberação modificada incluem a liberação atrasada, pulsada, sustentada, controlada, orientada e programada. Dessa maneira, as composições imunogênicas e as vacinas podem ser formuladas como um líquido sólido, semissólido ou tixotrópico para administração como um depósito implantado, proporcionando libertação modificada das composições imunogênicas e das vacinas.

[114] Outros meios de composição imunogênica ou vacina de administração incluem a entrega por microagulha ou livre de agulha de injeção (por exemplo, Powderject ™, Bioject ™, etc.)

[115] Nos casos em que a injeção subcutânea ou intramuscular é utilizada, uma formulação isotônica é a preferida. Geralmente, os aditivos para a isotonicidade podem incluir cloreto de sódio, dextrose, ma- nitol, sorbitol e lactose. Em casos particulares, as soluções isotônicas, tais como solução salina tamponada com fosfato são usadas. As formulações podem ainda incluir estabilizantes, tais como gelatina e albumina. Em algumas modalidades, um agente vaso-constritivo é adicionadoà formulação. As preparações farmacêuticas de acordo com a presente invenção são geralmente fornecidas estéreis e isenta de pi- rogênios. No entanto, é bem conhecido por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica que as formulações para o transportador farmaceuticamente aceitável são aqueles transportadores farmacêuticos aprovados nos regulamentos promulgados pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos ou agência governamental equivalente em um país estrangeiro, tais como Canadá ou México, ou qualquer um dos países europeus, para qualquer vacina canina, composições imu- nogênicas da subunidade de polipeptídeo (antígeno) e vacinas, vacinas do vetor do vírus recombinante e vacinas de DNA. Portanto, o veículo farmaceuticamente aceitável para produção comercial das composições imunogênicas ou vacinas é um transportador que já está aprovado ou será aprovado pelo órgão governamental competente, nos Estados Unidos da América ou em um país estrangeiro. As composições imunogênicas e as vacinas podem ainda ser misturadas com um adjuvante que seja farmaceuticamente aceitável. Em certas formulações das composições imunogências e das vacinas, a composição imunogênica e a vacina é combinada com outras composições imuno- gências caninas ou vacinas que produzem um produto polivalente q epode proteger o cão contra uma ampla variedade de doenças causadas por meio de outros patógenos caninos.

Kits

[116] À medida que pode ser desejável administrar uma compo sição imunogênica ou vacina em combinação com outras composições ou compostos, por exemplo, para fins de tratamento de uma doença ou condição particular, que está dentro do âmbito da presente invenção que uma composição imunogênica ou vacina convenientemente podem ser incluídos em, ou combinados, sob a forma de um kit adequado para a administração ou a coadministração das composições.

[117] Dessa maneira, os kits abrangidos por meio da presente invenção podem compreender uma ou mais composições farmacéuti- cas separadas, pelo menos uma das quais é uma composição imuno- gênica ou uma vacina de acordo com a presente invenção, e meios para reter separadamente as referidas composições, tais como um recipiente, garrafa dividida, ou pacote de folha dividido. Um exemplo de um tal kit é uma seringa e uma agulha, e semelhantes. Um kit da presente invenção é particularmente adequado para administrar as diferentes formas de dosagem, por exemplo, oral ou parentérica, para administrar as composições separadas em intervalos de dosagem diferentes, ou para titular as composições separadas uma contra a outra. Para auxiliar uma administração de uma composição englobada por meio da presente invenção, o kit compreende tipicamente as instruções para administração.

[118] Outro kit englobado por meio da presente invenção pode compreender um ou mais reagentes úteis para a detecção de um animal infectado. O kit pode incluir os reagentes para análise de uma amostra para a presença de microrganismos inteiros, polipeptídeos, epítopos ou sequências polinucleotídicas. A presença de vírus, bacté-rias,polipeptídeos, ou sequências polinucleotídicas podem ser determinadas utilizando anticorpos, PCR, hibridação e outros métodos de detecção conhecidos por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica.

[119] Outro kit englobado por meio da presente invenção pode proporcionar os reagentes para a detecção de anticorpos contra de-terminadosepítopos. Tais reagentes são úteis para a análise de uma amostra para a presença de anticorpos, e são facilmente conhecidos e estão disponíveis para uma pessoa que é versada na técnica. A presença de anticorpos pode ser determinada usando os métodos de detecção convencionais conhecidos por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica.

[120] Em certas modalidades, os kits podem incluir um conjunto de instruções impressas, ou uma etiqueta que indica que o kit é útil para a detecção de animais infectados.

Anticorpos

[121] Os anticorpos podem ser monoclonais, policlonais, ou re- combinante. Os anticorpos podem ser preparados contra o imunogênio ou uma porção do mesmo. Por exemplo, um peptídeo sintético com base na sequência de aminoácidos do imunogênio, ou preparados de forma recombinante por meio de técnicas de clonagem, ou o produto do gene natural, e/ou partes do mesmo podem ser isolados e utilizados como imunogênio. Os imunogênios podem ser utilizados para produzir os anticorpos por meio da tecnologia de produção de anticorpos padrão bem conhecidos por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica. Os fragmentos de anticorpos podem também ser preparados a partir dos anticorpos através de métodos conhecidos por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica, e incluem os fragmentos Fab, F (ab ') 2 e Fv.

[122] Na produção de anticorpos, o rastreio para o anticorpo de sejado pode ser realizado por meio dos métodos convencionais no domínio da imunologia conhecidos na técnica. Em geral, os testes ELISA e transferência de Western são os tipos preferidos de imunoen- saios. Ambos os ensaios são bem conhecidos por meio daquelas pessoas que são versadas na técnica. Ambos os anticorpos policlonais e monoclonais podem ser utilizados nos ensaios. O anticorpo pode ser ligado a um substrato de suporte sólido, conjugado com uma porção detectável, ou ser tanto ligado e conjugado, como é bem conhecido na técnica. A ligação de anticorpos a um substrato de suporte sólido é também bem conhecida na técnica. As porções detectáveis contempladas para utilização na presente invenção podem incluir, mas não estão limitadas a, marcadores fluorescentes, enzimáticos metálicos, e radioativos, tais como biotina, ouro, ferritina, fosfatase alcalina, b-galactosidase, peroxidase, a urease, fluoresceína, rodamina trítio, 14C, e iodação.

[123] A presente invenção é ainda ilustrada por meio dos, mas de forma alguma limitada, exemplos que se seguem.

EXEMPLOS Exemplo 1: A imunogenicidade de um extrato bacteriano Bordetella bronchiseptica, a vacina de subunidade.

[124] Trinta e dois beagles de cerca de 8 semanas de idade, com baixa Bordetella bronchiseptica (Microaglutinação de títulos de anticorpo (MAT) < 16) foram incluídos no estudo. Os filhotes foram divididos aleatoriamente em dois grupos de tratamento (T1 e T2) de 16 cada. Um filhote de cachorro de T2 foi removido antes da primeira vacinação devido a uma hérnia inguinal. Tabela 1. Desenho do Estudo

[125] Os cães foram vacinados via subcutânea (SC), com a vaci na adequada nos dias 0 e 21, de acordo com o desenho do estudo apresentado na Tabela 1. As vacinas foram administradas a cada cão, na região do ombro direito, para a primeira vacinação e na região do ombro esquerdo para a segunda vacinação.

[126] No Dia 42, os cães de todos os grupos de tratamento foram desafiados por via intranasal com B. bronchiseptica em aerossol utilizando uma câmara de plexiglas durante 30 minutos. Quatro cães, 2 de T1 e 2 de T2, foram desafiados a uma hora, com a exceção de um grupo, que tinha apenas 3 animais, dois de T1 e T2 a partir de uma, porque um dos animais foi retirado antes do estudo.

[127] A variável de eficácia primária foi a tosse. Todas as outras variáveis (corrimento nasal, corrimento ocular, espirros, depressão, náusea, respiração) foram consideradas apoiar as variáveis secundárias. As observações clínicas em busca de sinais de doença respiratória, incluindo tosse, foram realizadas duas vezes por dia ("período de observação"; AM e PM), por aproximadamente 30 minutos em cada quarto por cada sessão, a partir de dia 42 e até o dia 70 (conclusão do estudo). Se um animal de tosse ou não durante dois períodos consecutivos de observação, o pós-desafio foi calculado para cada animal. Uma distribuição de tosse / não tosse durante dois períodos consecutivos de frequência de observação foi calculada para cada tratamento. Tosse / não tosse por dois períodos consecutivos de observação foi analisada com um teste Cohran-Armitage, ajustando para o quarto uma vez que não foi possível analisar os dados com um modelo linear generalizado misto. As distribuições de frequência de isolamento bac- teriano nasal (+ / -) foram calculadas para cada ponto de tratamento e tempo. Também foi determinada para cada animal se já teve ou não as bactérias isoladas pós-desafio.

[128] A distribuição para saber se um animal já teve B. bronchi- septica isolada após o desafio teve a frequência sendo calculada para cada tratamento, e foi analisada com um modelo linear generalizado misto, se possível. A duração nasal de derramamento de pós-desafio foi calculada para cada animal, e foi analisada com um modelo misto linear geral. Os títulos de anticorpos foram logaritmicamente transformados e analisados usando um modelo misto linear geral para as medidas repetidas.

[129] Resultados: Não houve dor ou febre (> 39,5°C) informado em qualquer um dos cães após a vacinação. Alguns cães em ambos os grupos de tratamento foram reportados tendo coceira no momento da vacinação. Pequenos inchaços devido ao tamanho da injeção (2x2x1 cm) foram relatados em apenas dois cães em T2 durante as primeiras 3 a 6 horas de observação após a vacinação. Os dados indicam que a vacina era segura e bem tolerada pelos cães.

[130] Toda a solução salina controla a tosse desenvolvida, indi cando desafio adequado. Os mínimos quadrados (LS) significa para a duração da tosse no grupo controle foi de 20,3. Em contraste, a vacina reduziu significativamente a duração da tosse aos meios LS de 5,2 nos vacinados com valor de p <0,0001. Além disso, outros sinais clínicos respiratórios, tais como náusea e respiração, foram reduzidos nos animais vacinados quando comparados com os controles.

[131] Dados de isolamento de bactérias após o desafio mostra ram que a vacina de teste reduziu significativamente a duração da nasal derramamento do organismo desafio no grupo vacinado (LS média de 20,5) quando comparada com os controles de solução salina (LS média de 25,3) com um valor de p 0,0061. Os dados indicam que a vacina é eficaz na redução do nível de infecção, como confirmado pela duração reduzida de desprendimento nos vacinados.

[132] As respostas de anticorpos gerados após a vacinação (Dias 21 e 42) no grupo T2 foram semelhantes aos de T1, provavelmente devido à natureza do ensaio de anticorpos aglutinantes, e não a falta de antigenicidade. A resposta anamnéstica robusta foi induzida na maioria dos vacinados após o desafio no dia 70 foi observada (LS significa 426) em relação ao controle de solução salina (LS significa 13), indicando que a imunização eficaz.

[133] Tomados em conjunto, os dados deste estudo indicam cla ramente que o extrato de bactérias Bordetella bronchisepticademonstrou a eficácia da vacina de subunidade, por meio da redução da duração de excreção nasal e tosse.

Exemplo 2: Avaliação da eficácia e segurança de uma vacina contra Bordetella bronchisepticainjetável.

[134] Cinquenta cães beagle, em cerca de 8 semanas de idade, foram incluídos no estudo. Os cães foram divididos em 5 grupos de 10 cada um. Todos os animais estavam em bom estado geral de saúde, e não recebeu qualquer tipo de vacina Bordetella. As amostras de soro pré-screen foram negativas para B. bronchiseptica, com títulos < 16 por meio do teste de aglutinação Micro (MAT) antes da primeira vacinação. Todos os animais foram determinados livres de B. bronchisep- tica por meio de um teste de isolamento nasal bacteriano antes da primeira vacinação (Dia 0). Tabela 2. Desenho do Estudo

[135] Os animais foram vacinados com a vacina adequada nos dias 0 e 21, de acordo com o desenho do estudo apresentado na Tabela 2. As vacinas para os grupos de T01, T02, T03, e T04 foram administrados por via subcutânea a cada cão, na região do ombro direito, para a primeira vacinação e na região do ombro esquerdo para a segundavacinação. Grupo T05 receberam uma única vacinação intranasal de uma vacina intranasal disponível comercialmente no Dia 0. Este grupo foi vacinado passado para impedir a propagação da vacina viva no local, e os cães deste grupo foram alojados separadamente em uma sala diferente para evitar a exposição a outros grupos.

[136] No Dia 42, os cães de todos os grupos de tratamento foram desafiados por via intranasal com Bordetella bronchiseptica por aerossol em uma câmara de Plexiglas com um total de 30 minutos. Cinco cães da mesma caneta (uma de cada grupo de tratamento) foram desafiados a uma hora.

[137] A variável de eficácia primária foi tosse, o isolamento bacte- riano foi a variável secundária. As observações clínicas em busca de sinais de doença respiratória, incluindo tosse, foram realizadas duas vezes por dia ("período de observação"; AM e PM), por aproximada- mente 30 minutos em cada quarto por cada sessão, a partir de dia 42 e até o dia 62 e uma vez (am) em Dia 63 (conclusão do estudo). Antes de analisar a tosse, a percentagem de períodos de observação de tosse foi transformada com uma transformação raiz quadrada arcsine. O percentual transformado em períodos de observação, e número de dias com tosse foram analisados com um modelo misto linear geral. A percentagem de um período de observação pós-desafio em um animal, tosses e o número de dias após o desafio com tosse, foi calculada para cada animal.

[138] Resultado: leve a moderado inchaços foram observados nos locais de injeção em cães do grupo de tratamento T02 e T04 (dados não mostrados). A severidade das reações e o número de cães envolvidos aumentaram após a segunda vacinação. As reações no local da injeção leves foram observadas em alguns cães no tratamento T03 grupo. Nenhuma injeçção mensurável de inchaço foi observada no grupo de solução salina T01. Não houve febre clínica (> 39,5°C) observada, com exceção de um cão no Grupo T02 no dia 4 pós- vacinação. Não foi relatada nenhuma dor em qualquer um dos cães vacinados.

[139] A tosse induzida por meio da inoculação do desafio de B. bronchiseptica em todos os controles não vacinados (53,3 % e 14,7 dias de tosse), indicando que o desafio era adequado para avaliar as vacinas de teste. Os resultados obtidos para o Grupo T05, que receberam a vacina intranasal comercial (controle positivo), exibiu 4,6% de tosse observado 2 dias após o desafio, sugerindo que o nível de desafio é ótimo e não excessivo.

[140] Três formulações de teste foram avaliadas neste estudo. T02 teve 16,1% de tosse observada 6 dias após o desafio, T03 teve 34,7% de tosse observada até 10,5 dias após o desafio e T04 tinha 34,5% de tosse observada até 10,7 dias após o desafio. Por conse- guinte, todos os grupos vacinados apresentaram contagens reduzidas de tosse quando em comparação com os controles não vacinados. O grupo T02 vacinado com um extrato de bactérias B. bronchiseptica, enriquecido com pertactina e com adjuvante QCDC, demonstrando uma redução estatisticamente significativa nos critérios de pontuação para a tosse. Dessa maneira, a eficácia da formulação testada em T02 pareceu eficaz.

Exemplo 3. Segurança e Eficácia de Vacinas contendo Bordetella bronchiseptica em cães.

[141] Cinquenta (50) cães, divididos em 5 grupos de tratamento, foram selecionados para o estudo. Os animais foram determinados a estar apto para o estudo com base em um exame físico no dia 4,

[142] As amostras de sangue (cerca de 8 ml) para serologia fo ram recolhidas em tubos de aço inoxidável de todos os animais nos Dias de Estudo 2, 21 e 28 antes de cada vacinação. As amostras de soro coletadas no dia 2 foram usadas para confirmar se os animais estavam livres de B. bronchiseptica. Esfregaços nasais foram recolhidos antes da vacinação no dia 0, e testados para a presença de B. bronchiseptica. As temperaturas Timpânicas foram recolhidas começando no Dia 4, para estabelecer uma linha de base antes da vacinação.

[143] Os animais foram vacinados com a vacina adequada nos dias 0, 21 e 28 de acordo com o desenho do estudo apresentado na Tabela 3. As vacinas foram administradas por via subcutânea a cada cão, na região do ombro direito, para a primeira vacinação e na região do ombro esquerdo para a segunda vacinação. Tabela 3. Desenho do Estudo

1 produto veterinário Investigational (PIV) foi administrado (SC), por via subcutânea. 2 dose de desafio alvo de 10 A 9 organismos de cepa de Bordetella bronchiseptica.

[144] Todos os animais foram observados nos dias de vacinação de 0, 21, e 28 para as reações no local da injeção após a vacinação. Eles foram observados diariamente para reações de injeção pós- vacinação de Dias 1 a 7 e 22 a 35. A temperatura timpânica foi coletada nos dias 0 a 7 e 21 a 35.

[145] As amostras de sangue (cerca de 6 ml) foram recolhidas para serologia no dia 55, um dia antes do desafio. A temperatura tim- pânica foi coletada nos dias 54, 55 e 56, antes do desafio. Os esfrega- ços nasais foram recolhidos no dia 55, um dia antes do desafio, e tes- tado para a presença de B. bronchiseptica. Os animais foram observados duas vezes ao dia (manhã e tarde), de aproximadamente 30 minutos cada sessão nos dias 54 e 55, e na manhã de dia 56, para sinais clínicos de doença respiratória, a fim de estabelecer os valores basais.

[146] A cepa Bordetella bronchiseptica de desafio foi usada para preparar uma dose de desafio alvo de 109 UFC / ml 4 / cão. No Dia 56, os cães de todos os grupos de tratamento foram desafiados por via intranasal com B. bronchiseptica por aerossol em uma câmara de Plexiglas com um total de 30 minutos para cada caneta desafiado. Cinco cães da mesma espécie (um de cada grupo de tratamento) foram desafiados a uma hora.

[147] A temperatura timpânica foi gravada uma vez por dia após o desafio de dias 56 a 77 anos. As observações clínicas foram realizadas duas vezes ao dia (manhã e tarde), por aproximadamente 30 minutos em cada quarto por cada sessão, a partir de dia 56 e até o dia 76 e depois (AM) no dia 77. Resumidamente, tosse, corrimento nasal, espirro, secreção ocular, vômito e depressão foram observados usando o seguinte sistema de pontuação : ausente (0), leve (1), moderado (2) e grave (3). Os esfregaços nasais foram coletados nos dias 59, 62, 66, 69, 74, 76 e 77, para determinar o derramamento de organismos de desafio.

[148] As amostras de sangue (cerca de 6 mL) para sorologia fo ram coletadas no dia 77. Os esfregaços nasais para isolamento de B. bronchiseptica foram coletados com esfragaços e meios de transporte.

[149] Os anticorpos aglutinantes para B. bronchiseptica foram determinados por meio do teste de aglutinação de Micro (MAT). As amostras de soro a partir de grupos de tratamento T04 e T05 entre os Dias 0, 28, 55, e 77 foram tituladas para os anticorpos de neutralização CRCoV do soro e IFA, e para CIV por HAI. O isolamento de B. bronchiseptica a partir de esfregaços nasais foi realizado de acordo com o procedimento-padrão. Cada amostra foi testada qualitativamente quanto à presença ou ausência de bactérias.

[150] Resultados. Cinquenta (50) cachorros Beagle saudáveis de aproximadamente 8 semanas de idade, foram confirmados por isolamento nasal em cultura como estando livres de organismos de B. bronchiseptica, no dia 0. As amostras de soro avaliadas por meio dos anticorpos de aglutinantes B. bronchiseptica pelo MAT confirmou que todos os filhotes foram sensíveis com títulos de MAT < 8 no Dia 2.

[151] Todas as vacinas experimentais avaliadas neste estudo produziram leve a nenhum inchaço devido à injeção após a primeira vacinação. Os inchaços devido à injeção foram limitados a estudar 0 dias para a maioria dos animais vacinados. Leve a nenhum inchaço devido à injeção também foi relatado após a segunda vacinação. As reações no local da injeção, quando ocorreram, resolveram entre um a três dias após a segunda vacinação. A coceira foi relatada predominantemente no grupo da combinação 5 (T04). Não houve febre clínica relatada após a vacinação. Não foram relatados inchaços devido à injeção no grupo de solução salina. Os dados confirmaram a segurança das vacinas.

[152] A colônia da contagem realizada antes e após o desafio da inoculação confirmou que uma média de 1,45 x 108 UFC Bordetella por cão foi aerossol na câmara. O desafio de inoculação da tosse induzido em todos os cães de controle da solução salina (T02), com um percentual médio de observação de tosse de 43,5% e 12,2 dias de tosse. Grupo de tratamento T05, vacinado com viral 4-maneiras apenas (CRCoV / CIV / CPIV / CAV2) sem antígeno Bordetelladesenvolveu tosse semelhante ao controle de solução salina com uma observação média percentual de tosse de 43,4% e 12,2 dias de tosse. Estes resultados indicam que o desafio era adequado e consistente para avaliar as vacinas de teste.

[153] Os cães de tratamento do grupo T01 vacinado com a vaci na de Bordetella foram significativamente protegidos contra o desafio (3,6 dias de tosse, p < 0,0001) quando comparados com o grupo de controle (12,2 dias de tosse). A mesma vacina também protegeu significativamentecães em T03, quando administrados a 3 semanas de regime ide ntervalo (5,8 dias de tosse, p = 0,0004). A redução nas contagens de tosse nestes dois grupos (T01 vs T03) não foi significativamente diferente (p-valor = 0,1883) indicando que o nível de proteção para a vacina administrada com um intervalo de 3 a 4 semanas, é semelhante.

[154] Cães em T04 que receberam a vacina de combinação de 5 vias não adjuvante eram significativamente (p = 0,0016) protegidos contra o desafio de Bordetella (6,6 dias de tosse) quando comparado com os controles de solução salina (12,2 dias de tosse), e quando comparado com o receptor recebendo a combinação viral de 4 vias (CRCoV / CIV / CPIV / CAV2) (12,1 dias de tosse, p = 0,0019), indicando a eficácia da fração Bordetella na vacina combinada sem adjuvante.

[155] A avaliação sorológica das frações virais da vacina de combinação de 5 vias foi possível para apenas duas frações, o CIV e CRCoV, onde os cães foram confirmados em estudo soronegativos dia -2. A resposta CIV HAI no grupo de vacina de 4 vias (T04) em estudo ao dia 56 foram numericamente semelhantes ao do grupo de vacina de 5 vias (T05) e indicam a ausência de interferência por parte da fração do antígeno de Bordetella CIV. As respostas CRCoV SN no estudo dia 56 foram numericamente maiores no grupo da vacina de 4 vias (T04) do que no grupo da vacina de 5 vias (T05), indicando uma possível interferência pela Bordetella na fração CRCoV. No entanto, estes resultados não são conclusivos visto que estas vacinas não foram adjuvante e a formulação não foi otimizada e nenhum desafio CRCoV foi conduzido para testar a eficácia.

[156] A vacina monovalente Bordetella foi confirmada para ser segura e eficaz. A eficácia da vacina monovalente foi demonstrada quando a vacina foi administrada em intervalos de 21 ou 28 dias. A fração de Bordetella foi também demonstrada ser eficaz quando aplicada na combinação de vacina de 5 vias sem adjuvante.

Exemplo 4. Estudo de sorologia multivalente

[157] Quarenta cães, cerca de 8 semanas de idade e em bom estado geral, foram pré-selecionados para Bordetella bronchiseptica por Micro teste de aglutinação (MAT), e por coronavírus respiratório canino (CRCoV) através do teste de imunofluorescência indireta (IFA). A neutralização do soro (SN), também foi utilizada com a finalidade de avaliar os níveis de anticorpos. No Dia 0, todos os cães eram negativos para anticorpos para Bordetella bronchiseptica, conforme determinado pelo MAT (< 16), e negativos para anticorpos para CRCoV como determinado por IFA (< 40). Todos os cães eram livres também de Bordetella bronchiseptica e CRCoV, tal como determinado por um teste de isolamento do esfregaço nasal antes da primeira vacinação (Dia 0).

[158] Os cães foram divididos em 5 grupos de 8 animais cada tratamento, e vacinados de acordo com o desenho do estudo apresentado na Tabela 4. As vacinas foram administradas a cada cão, na região do ombro direito, para a primeira vacinação e na região do ombro esquerdo para a segunda vacinação. Tabela 4. Desenho do Estudo

1 EMA = etileno anidrido maléico

[159] Após a segunda vacinação, devido a complicações, os gru pos T04 e T05 foram retirados do estudo. Os cães nos grupos restantes (T01, T02 e T03) foram observados diariamente para reações pós- vacinação, e monitorizados para a temperatura do corpo (timpânica) durante 7 dias após cada vacinação. As amostras de sangue foram coletadas de cães nos dias 0, 21, 42 e 56 para medir as respostas de anticorpos.

[160] As amostras de soro a partir do dia 0, 21, 42 e 56 foram testadas para os anticorpos aglutinantes de Bordetella bronchiseptica pelo ensaio MAT. As amostras de soro dos mesmos dias também foram titulados para anticorpos CRCoV por meio da soroneutralização, para CIV por HAI, e para anticorpos CAV-2 e CPI por meio da soro- neutralização. Os títulos médios de anticorpos Geométicos foram obtidos para cada grupo de tratamento.

Resultados:

[161] As vacinas de teste em grupos de T02 e T03 induziram as respostas de anticorpos em todos (100%) os cães vacinados após a segunda dose, indicando a imunização ativa contra os antígenos virais. O aumento da resposta de anticorpos após a segunda vacinação, na maioria dos cães vacinados, indicando um efeito de reforço da segundavacinação. É importante salientar que as respostas dos anticorpos entre as frações virais foi conseguida na presença de vários antí- genos virais e bacterianas (B. bronchiseptica), indicando ausência de interferência imunológica. A sorologia MAT não é correlativa à proteção contra Bordetella, mas é sim uma ferramenta valiosa para se inscrever os animais de estudo adequados. Em conclusão, com base na resposta imunológica em cães vacinados, a eficácia dos antígenos viraisestá prevista na forma de vacina de 5 vias.

Exemplo 5. Duração da imunidade do estudo Monovalente:

[162] O objetivo deste estudo é demonstrar a duração da imuni dade de uma vacina da subunidade de extrato Bordetella bronchisepti- ca em cães de 8 semanas de idade, contra desafio virulento de B. bronchiseptica.

[163] Todos os animais estão em bom estado geral de saúde, e não tem recebido qualquer tipo de vacina Bordetella. Os animais têm baixo (<16), ou nenhum anticorpo para B. bronchiseptica, tal como determinado pelo teste de aglutinação de Micro (MAT) antes da primeira vacinação. Todos os animais são também livres de B. bronchiseptica, tal como determinado por meio de um teste de isolamento de bactérias nasal compressas antes da primeira vacinação.

[164] Os cães são divididos em dois grupos de tratamento: um grupo recebe uma vacina de placebo, e o outro de um extrato de B. bronchiseptica, suplementado com um antígeno recombinante. O antí- geno é a pertactina, Bsp22, ou ambos. Os animais são vacinados duas vezes, cerca de 3 a 4 semanas de intervalo. Eles são observados para as reações no local da injeção após cada vacinação.

[165] Cerca de 6 a 12 meses após a vacinação, os cães de todos os grupos de tratamento são desafiados por aerossol com Bordetella bronchiseptica. A dose de desafio e a pureza do inóculo de desafio são determinadas antes e depois do desafio. As observações clínicas são realizadas conduzindo a e após o desafio.

[166] Os esfregaços nasais para isolamento de B. bronchiseptica são coletados. O sangue de cada animal é coletado para soro. Os anticorpos aglutinantes para B. bronchisepticasão determinados pelo MAT. Os soros são titulados para uma resposta específica de pertacti- na de ELISA usando anticorpos IgG. O isolamento de B. bronchisepti- ca a partir de esfregaços nasais é realizado de acordo com o procedimento-padrão.

[167] A tosse, o isolamento de Bordetella(pós-desafio) e pós- vacinação à resposta serológica são os critérios utilizados para determinar a eficácia da vacina no estudo.

Multivalente:

[168] O objetivo deste estudo é demonstrar a duração da imuni dade da vacina multivalente em combinação respiratória em cães. A vacina contém os seguintes componentes : os antigênicos vivos modificados de CAV-2, CPIV vivo modificado, CIV inativado, CRCoV inati- vado Bordetella bronchiseptica e um extrato complementado com um antígeno recombinante, ou pertactina, Bsp22, ou ambos.

[169] Todos os animais estão em bom estado geral de saúde, e não tem recebido qualquer tipo de vacina para nenhum dos agentes patogênicos que a vacina é destinada a proteger contra. Os cães são divididos em múltiplos conjuntos de grupos de tratamento. Cada conjuntoé constituído por meio de dois grupos de tratamento, um grupo de controle que recebeu uma vacina de placebo, e um grupo que recebeu a vacina teste. Os animais são vacinados duas vezes, cerca de 2 a 4 semanas de intervalo. Eles são observados para as reações no local da injeção após cada vacinação.

[170] Aproximadamente, 6 a 12 meses após a vacinação, cada conjunto de dois grupos de tratamento (vacinados e controles) são desafiados com um dos agentes patogênicos para os quais a vacina se destina a proteger contra. As observações clínicas são realizadas con- duzindo a e após o desafio. Os esfregaços nasais para isolamento do desafio patógeno são coletados durante o período pós-desafio. O sangue de cada animal é recolhido para a obtenção de soro, que é utilizado para a análise de análise subsequente. Os sinais clínicos de doença respiratória, após o desafio do derramamento patógeno e respostas sorológicas são usados como critério para julgar a eficácia das vacinas.

[171] Tendo assim sido descritas em detalhe as várias concreti zações da presente invenção, é para ser entendido que a presente invenção definida por meio das reivindicações anexas não deve ser limitada aos detalhes específicos estabelecidos na descrição acima de como muitas variações dos mesmos são possíveis aparentes sem se afastarem do espírito ou âmbito da presente invenção.

[172] Todas as referências anteriores são incorporadas na pre sente invenção por meio de referência como se apresentados completamente em toda a invenção.

Claims (14)

1. Composição imunogênica para uso no tratamento ou prevenção de infecção de um organismo patogênico respiratório canino em cães, caracterizada pelo fato de que compreende bacterina Bordetella bronchiseptica e uma proteína pertactina p68 de Bordetella bronchiseptica isolada adicionada, em que a dita pertactina p68 está presente entre 5 μg ±10% e 20 μg ±10%.

2. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita pertactina p68 está presente a 10 μg ±10%.

3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende ainda 1 mL a 4 mL de um veículo veterinariamente aceitável.

4. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita pertactina p68 está presente a 7 μg ±10% a 15 μg ±10%.

5. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o dito volume é 2 mL ±10%.

6. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o dito volume é 1 mL.

7. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a dita composição previne a infecção a partir do referido patogênio respiratório canino no referido cão por um período de 6 meses.

8. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a referida composição compreende ainda um diluente ou excipiente para administração parentérica a um cão.

9. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a referida composição compreende ainda um antígeno isolado Bsp22, opcionalmente lipidado.

10. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a referida composição compreende ainda um antígeno de um agente patogênico respiratório canino selecionado do grupo que consiste em: vírus parainfluenza canino (CPIV), adenovírus canino -2 (CAV-2), coronavírus canino respiratória (CRCoV) e vírus da gripe canina (CIV).

11. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a referida composição compreende pelo menos dois, três ou quatro dos antígenos do organismo patogênico respiratório canino.

12. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a referida composição compreende os antígenos do vírus da parainfluenza canina (CPIV), adenoví- rus canino 2 (CAV-2), coronavírus respiratório canino (CRCoV) e vírus da gripe canina (CIV).

13. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o agente patogênico respiratório canino compreende ainda, pelo menos, um, dois, três ou quatro de: vírus parainfluenza canino (CPIV), adenovírus canino 2 (CAV-2), coronavírus respiratório canino (CRCoV) e vírus da gripe canina (CIV).

14. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que o agente patogênico respiratório canino é um membro de uma pluralidade de agentes patogênicos causando o complexo da doença respiratória infecciosa canina (CIRDC), e em que a composição trata ou previne a infecção por meio de uma pluralidade dos referidos agentes patogênicos.