ES2303833T3 - Polipeptidos que contienen polimorfismos de las regiones repetidas de pertactina en bordetella pertussis, bordetella parapertussis y bordetella bronchiseptica, su uso en diagnostico y en composiciones inmunogenicas. - Google Patents
Polipeptidos que contienen polimorfismos de las regiones repetidas de pertactina en bordetella pertussis, bordetella parapertussis y bordetella bronchiseptica, su uso en diagnostico y en composiciones inmunogenicas. Download PDFInfo
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Abstract
Composición inmunogénica que comprende una mezcla de al menos dos pertactinas o fragmentos de pertactina de Bordetella bronchiseptica, en la que dichas pertactinas o fragmentos contienen al menos la región II, o tanto la región I como la región II y en la que dichas pertactinas o fragmentos difieren entre sí, en sus respectivas secuencias de aminoácidos, en al menos la región II o las regiones I y II.
Description
Polipéptidos que contienen polimorfismos de las
regiones repetidas de pertactina en Bordetella pertussis,
Bordetella parapertussis y Bordetella bronchiseptica, su
uso en diagnóstico y en composiciones inmunogénicas.
Esta invención se refiere a proteínas y
polipéptidos de la proteína de la membrana externa de
Bordetella denominada pertactina y a los polinucleótidos que
codifican para ellos. Esta invención también se refiere al uso de
estas proteínas y polipéptidos en composiciones inmunogénicas,
métodos de diagnóstico y kits de diagnóstico.
El género Bordetella incluye siete
especies. Las especies más estudiadas son B. pertussis, B.
parapertussis y B. bronchiseptica. La B.
pertussis es responsable de infecciones respiratorias sólo en
seres humanos. La B. parapertussis produce infecciones en
seres humanos y ovejas y la B. bronchiseptica infecta muchas
especies de animales, incluyendo seres humanos.
Estos patógenos producen una serie de factores
de virulencia, cuya síntesis está regulada por el sistema de dos
componentes, bvg AS (2, 21). Estos factores incluyen toxinas,
tales como toxina de la tos ferina, que es la única toxina
específica de B. pertussis, citotoxina traqueal, adenilato
ciclasa-hemolisina, y adhesinas, tales como
hemaglutinina filamentosa, fimbrias y pertactina (PRN).
La PRN es una proteína de la membrana externa
con un peso molecular aparente de 69 kDa en B. pertussis, 70
kDa en B. parapertussis y 68 kDa en B. bronchiseptica
(5, 14, 15). Los precursores de PRN tienen 91,5 kDa, 93 kDa y 92,5
kDa de tamaño, respectivamente. En B. pertussis, se ha
demostrado que la PRN es un aglutinógeno (4), promoviendo la unión
a ciertas células eucariotas por medio de un motivo
Arg-Gly-Asp (RGD) (13).
Los anticuerpos específicos para la PRN de B.
bronchiseptica se detectan con alto título en lechones
inmunizados, mientras que se detectan pocos, si alguno, de estos
anticuerpos en animales no protegidos (19). La síntesis de la PRN
por B. bronchiseptica se correlaciona con protección (16). La
inmunización de ratones o lechones con preparaciones de la PRN
induce inmunidad protectora frente a la infección por B.
bronchiseptica (12, 19) y anticuerpos monoclonales
administrados pasivamente previenen la muerte de los animales
expuestos a B. bronchiseptica (16). También se ha demostrado
que la PRN de B. pertussis induce inmunidad protectora frente
a exposiciones intracerebral, en aerosol e intranasal a B.
pertussis en ratones (11, 18, 20).
Por consiguiente, la PRN se incluye ahora en
algunas vacunas acelulares contra la tos ferina (es decir, vacunas
compuestas por proteínas bacterianas purificadas) (9). Sin embargo,
las proteínas PRN de estas tres especies, aunque estén claramente
relacionadas, tienen diferentes propiedades inmunogénicas. Por
ejemplo, las preparaciones de PRN de B. pertussis protegen a
los ratones frente a la exposición intranasal a B. pertussis
pero no frente a la exposición intranasal a B. parapertussis
(11). También protegen a los ratones frente a la exposición
intracerebral a B. pertussis, mientras que la proteína PRN de
B. bronchiseptica no lo hace (18).
La comparación de los aminoácidos deducidos de
las tres proteínas, PRN de B. pertussis, PRN de B.
parapertussis y PRN de B. bronchiseptica, revela un alto
grado de similitud, siendo las proteínas de B. bronchiseptica
y B. parapertussis más similares entre sí que la proteína
PRN de B. pertussis (5, 14, 15). La referencia 14 enseña que
las principales diferencias entre las pertactinas de las tres
especies se producen en el número de repeticiones de las dos
familias (GGXXP)_{n} y (PQP)_{n} de motivos de
secuencia reiterados.
Las secuencias de las tres proteínas difieren en
el número de repeticiones en las regiones I y II (figura 1a).
Usando anticuerpos monoclonales, Charles et al.,
identificaron y caracterizaron un epítopo inmunodominante protector
de la proteína PRN P.69 (6). Este epítopo abarca las secuencias de
repetición (Pro-Gln-Pro)5
situadas en la región II. Las diferencias en esta región pueden
explicar la observación de que los sueros de lechones que reconocen
PRN de B. bronchiseptica no reaccionan con PRN de B.
pertussis a pesar del alto grado de similitud entre estas
proteínas (12) y la falta de protección cruzada proporcionada por
las tres proteínas (11, 18, 20).
Se ha mostrado recientemente que la PRN
producida por aislados clínicos de B. pertussis varía. Las
secuencias del gen prn de diversos aislados clínicos
revelaron tres tipos principales de variante de PRN (17). Se ha
sugerido que las epidemias en los Países Bajos resultan de cambios
en las secuencias de los genes que codifican para PRN y PT porque
las proteínas presentes en los aislados clínicos actualmente en
circulación difieren en la secuencia de aquellas observadas en las
cepas vacunales usadas en este país (17).
Para PRN de B. pertussis, las diferencias
de aminoácido observadas se sitúan en la región I. Los tipos de
prn alélicos A=1 y C=3 son muy similares, difiriendo sólo en
dos aminoácidos, mientras que el tipo B=2 es bastante diferente,
teniendo una inserción de cinco aminoácidos en la misma región
(17).
Se encontró que sólo un tipo difería en la
región II. Este tipo (A*=6) lo produce la cepa de referencia de la
OMS 18323 de B. pertussis y un aislado clínico francés (3).
Sin embargo, no parece ser común porque se ha detectado en sólo un
aislado clínico (3). La producción por esta cepa de B.
pertussis de este tipo inusual de PRN refleja las muchas
propiedades comunes compartidas con las especies B.
parapertussis y B. bronchiseptica. No se encontraron
diferencias en el fenotipo y comportamiento en el modelo animal de
aislados clínicos de B. pertussis con diferentes PRN (3).
Existe una necesidad en la técnica de
composiciones que contienen proteínas y polipéptidos de pertactinas
de Bordetella que puedan usarse en composiciones
inmunogénicas para proteger frente a la infección por
Bordetella y para tratar sujetos infectados con
Bordetella. Idealmente, las proteínas, polipéptidos y los
polinucleótidos que codifican para ellos podrían ser útiles también
en el diagnóstico de infección por Bordetella y en kits para
el diagnóstico de tal infección.
Esta invención ayuda en satisfacer estas
necesidades en la técnica. En una realización, esta invención
proporciona una composición inmunogénica que comprende una mezcla
de al menos dos pertactinas o fragmentos de pertactina de
Bordetella bronchiseptica, en la que dichas pertactinas o
fragmentos contienen al menos la región 11, o tanto la región I
como la región II y en la que dichas pertactinas o fragmentos
difieren entre sí, en sus respectivas secuencias de aminoácidos, en
al menos la región II o las regiones I y II. La composición
inmunogénica también puede comprender pertactina de Bordetella
pertussis en una cantidad suficiente para inducir una respuesta
inmunitaria celular o humoral frente a Bordetella pertussis
en un animal al que se le administra la composición inmunogénica.
La solicitud también describe una composición inmunogénica que
comprende una mezcla de pertactinas de especies de
Bordetella, en la que dicha composición comprende: (a)
pertactina de Bordetella parapertussis y (b) pertactina de
Bordetella bronchiseptica, en cantidades suficientes para
inducir una respuesta inmunitaria celular o humoral frente a
Bordetella parapertussis y Bordetella bronchiseptica
en un animal al que se le administra la composición inmunogénica,
así como una composición inmunogénica de la invención que comprende
una mezcla de pertactinas de especies de Bordetella o
fragmentos de las mismas. Específicamente, en la mezcla de la
invención, cada variante de pertactina de Bordetella
bronchiseptica comprende 6, 7, 8 ó 9 secuencias de aminoácidos
PQP de repetición en la región II de las mismas. Las variantes de
pertactina de Bordetella bronchiseptica están presentes en
cantidades suficiente para inducir una respuesta inmunitaria
celular o humoral frente a Bordetella bronchiseptica en un
animal al que se le administra la composición inmunogénica. Esta
composición inmunogénica también puede comprender pertactinas de
Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, o mezclas de
las mismas, en cantidades suficiente para inducir una respuesta
inmunitaria celular o humoral frente a Bordetella
parapertussis o Bordetella pertussis en un animal al que
se le administra la composición inmunogénica.
En una realización adicional de la invención en
la composición inmunogénica de la invención, cada variante de
pertactina de Bordetella bronchiseptica comprende 1, 2 ó 3
secuencias de aminoácidos GGXXP de repetición en la región I de las
mismas. Las variantes de pertactina de Bordetella
bronchiseptica están presentes en cantidades suficientes para
inducir una respuesta inmunitaria celular o humoral frente a
Bordetella bronchiseptica en un animal al que se le
administra la composición inmunogénica. Esta composición
inmunogénica también puede comprender pertactinas de Bordetella
parapertussis, Bordetella pertussis, o mezclas de las mismas,
en cantidades suficientes para inducir una respuesta inmunitaria
celular o humoral frente a Bordetella parapertussis o
Bordetella pertussis en un animal al que se le administra la
composición inmunogénica.
Las composiciones tal como se describen en la
solicitud pueden comprender una mezcla de fragmentos de las
pertactinas de especies de Bordetella. Las composiciones
inmunogénicas también pueden comprender al menos un polipéptido de
la invención en una cantidad suficiente para inducir una respuesta
inmunogénica o protectora in vivo, y un excipiente
farmacéuticamente aceptable para el mismo. Además, la composición
inmunogénica puede comprender una cantidad neutralizante de al
menos un polipéptido de la invención.
Una composición inmunogénica dada a conocer en
la solicitud comprende una mezcla de pertactinas de especies de
Bordetella bronchiseptica o fragmentos de las mismas, en la
que las pertactinas o fragmentos de las mismas comprenden una
mezcla de variantes de pertactina de Bordetella
bronchiseptica en la que al menos una de las variantes de
pertactina de Bordetella bronchiseptica comprende la región
II de pertactina de Bordetella bronchiseptica que tiene 6,
7, 8 ó 9 secuencias de aminoácidos PQP de repetición en la región
II de las mismas, y al menos otra de las variantes de pertactina de
Bordetella bronchiseptica comprende la región I de
pertactina de Bordetella bronchiseptica que tiene 1, 2 ó 3
secuencias de aminoácidos GGXXP de repetición en la región I de la
misma.
Una composición inmunogénica descrita en la
solicitud consiste esencialmente en (A) un polipéptido que comprende
la región I y la región II, o un polipéptido que comprende la
región I y un polipéptido que comprende la región II, de una
pertactina de Bordetella pertussis; (B) un polipéptido que
comprende la región I y la región II, o un polipéptido que
comprende la región I y un polipéptido que comprende la región II,
de una pertactina de Bordetella parapertussis; (C) un
polipéptido que comprende la región I y la región II, o un
polipéptido que comprende la región I y un polipéptido que
comprende la región II, de una pertactina de Bordetella
bronchiseptica cepa 9.73 y un polipéptido que comprende la
región I y la región II, o un polipéptido que comprende la región I
y un polipéptido que comprende la región II, de una pertactina de
Bordetella bronchiseptica de la cepa SEI.
La solicitud da a conocer polinucleótidos que
codifican para las proteínas y polipéptidos, así como los
anticuerpos que reconocen las proteínas y polipéptidos. También se
da a conocer un chip de ADN, en el que dicho chip comprende al
menos un polinucleótido tal como se da a conocer en el presente
documento o fragmento del mismo o un microalineamiento que
comprende microcuentas, en los que las microcuentas soporta cada una
múltiples copias de un polinucleótido tal como se da a conocer en
el presente documento o un fragmento del mismo y en los que el
polinucleótido o fragmento del mismo es diferente de una cuenta a
otra.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monoclonales o policlonales. Los anticuerpos monoclonales pueden
usarse para tratar infecciones por Bordetella. También se
proporcionan complejos inmunológicos que comprenden una proteína o
polipéptido de la invención y un anticuerpo que reconoce
específicamente la proteína o polipéptido.
Además, la solicitud da a conocer un método para
detectar la infección por Bordetella. El método comprende
proporcionar una composición que comprende un material biológico que
se sospecha que está infectado con Bordetella y someterlo a
ensayo para determinar la presencia de una proteína o polipéptido,
tal como se da a conocer en el presente documento. Puede someterse
a ensayo el polipéptido, por ejemplo, mediante electroforesis o
mediante inmunoensayo con anticuerpos que son inmunológicamente
reactivos con el polipéptido.
El método también puede comprender poner en
contacto el antígeno con un líquido biológico durante un tiempo y
en condiciones suficientes para que el antígeno y los anticuerpos en
el líquido biológico formen un complejo
antígeno-anticuerpo, y detectar la formación del
complejo. El método puede incluir opcionalmente medir la formación
del complejo antígeno-anticuerpo. En realizaciones
preferidas, se detecta la formación del complejo
antígeno-anticuerpo mediante inmunoensayo basado en
la técnica de inmunotransferencia de tipo Western, ELISA, ensayo de
inmunofluorescencia indirecta o ensayo de inmunoprecipitación.
Además, la solicitud describe un kit de
diagnóstico para la detección de la presencia o la ausencia de
anticuerpos, que se unen a una proteína o polipéptido de la
invención o mezclas de los mismos. El kit puede comprender un
antígeno que comprende la proteína o polipéptido, o mezclas de las
proteínas y polipéptidos, y medios para detectar la formación de
complejos inmunitarios entre el antígeno y los anticuerpos. Los
medios están presentes en una cantidad suficiente para realizar la
detección.
Otro método para detectar la presencia o la
ausencia de Bordetella comprende (1) poner en contacto una
muestra que se sospecha que contiene material genético de
Bordetella con al menos una sonda nucleotídica, y (2)
detectar la hibridación entre la sonda nucleotídica y el material
genético en la muestra. La sonda nucleotídica es complementaria a
una secuencia de polinucleótido tal como se describe en el presente
documento.
Se describirá esta invención con mayor detalle
con referencia a los dibujos, en los que:
La figura 1a es un mapa de las dos regiones de
repeticiones, la región I y la región II, en la proteína de la
membrana externa pertactina de Bordetella bronchiseptica.
La figura 1b es una alineación de la región I de
la proteína de la membrana externa pertactina de diferentes cepas de
B. bronchiseptica.
La figura 1c es una alineación de la región II
de la proteína de la membrana externa pertactina de diferentes cepas
de B. bronchiseptica.
Se ha demostrado anteriormente que miembros
específicos de la especie de la familia de la pertactina son
proteínas de la membrana externa (PME). En B.
bronchiseptica, la pertactina es el producto del gen prn
y se representa como una proteína con un M_{r} de 68 kDa
(P.68), en B. pertussis como una proteína con un
M_{r} de 69 kDa (P.69), y en B. parapertussis como
una proteína con un M_{r} de 70 kDa (P.70). Las secuencias
de nucleótidos de las pertactinas de estas tres especies se incluyen
en la lista de secuencias adjunta como SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 y
SEQ ID NO:3, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos
correspondientes codificadas por estas secuencias de nucleótidos se
incluyen en la lista de secuencias como SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5 y
SEQ ID NO:6, respectivamente.
Una comparación de las secuencias de proteína
deducidas para las proteínas P.68, P.69. y P.70 demuestra el alto
grado de homología entre las proteínas. Una comparación entre las
proteínas P.68 y P.70 muestra sólo 17 diferencias de aminoácido,
mientras que una comparación similar entre P.68 y P.69 muestra 80
diferencias, y 79 diferencias entre P. 69 y P.70. La mayoría de las
diferencias de aminoácido entre las tres secuencias de proteína
deducidas se producen en el número de unidades de repetición en las
dos familias de secuencias de repetición presentes en las tres
proteínas. P.68 tiene tres copias de la repetición
Gly-Gly-Xaa-Xaa-Pro
(es decir, GGXXP en la figura 1b), mientras que P.70 tiene cuatro y
P.69 cinco. De manera similar, P.68 tiene siete repeticiones
Pro-Gln-Pro (es decir, PQP en la
figura 1c), P.70 tiene nueve y P.69 tiene cinco.
Se ha mostrado recientemente que la PRN
producida por aislados clínicos de B. pertussis varía. Las
secuencias del gen prn de diversos aislados clínicos
revelaron tres tipos principales de variante de PRN. Se ha sugerido
que las epidemias en los Países Bajos resultan de cambios en las
secuencias de los genes que codifican para PRN y PT porque las
proteínas presentes en los aislados clínicos actualmente en
circulación difieren en la secuencia de aquellas observadas en las
cepas vacunales usadas en este país.
Un objetivo de las investigaciones, que
condujeron a la presente invención, fue analizar si el polimorfismo
en PRN observado en la especie B. pertussis también se
produce en B. parapertussis y en B. bronchiseptica.
Se secuenciaron y se compararon las dos regiones repetidas de los
genes prn de 10 aislados de B. parapertussis de
origen humano y de 40 aislados de B. bronchiseptica de origen
humano o animal. (Figura 1a).
La tabla I contiene una lista de los aislados y
tipos de pertactina correspondientes usados en esta invención.
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\vskip1.000000\baselineskip
Al llevar a cabo esta invención, se extrajo ADN,
se amplificó mediante PCR y se secuenció, tal como se describió
anteriormente (3). Se purificaron y se secuenciaron los productos de
PCR amplificados por la empresa ESGS (ESGS, Cybergene group, Evry,
Francia). Se analizaron las secuencias de aminoácidos deducidas con
software GCG (paquete Wisconsin Versión 9.1, Genetics Computer
Group, Madison, WI, EE.UU.). Se compararon las secuencias de
aminoácidos deducidas de las regiones I y II y se crearon múltiples
alineaciones de las secuencias de aminoácidos con el programa
CLUSTAL W de GCG (10), para cada región (figuras 1b, c).
No se encontró ninguna diferencia entre las
secuencias de las regiones I y II de la PRN producida por los 10
aislados de B. parapertussis y la secuencia publicada (15).
Sin embargo, se encontraron tres tipos diferentes entre los 40
genes prn de B. bronchiseptica analizados con
diferencias en el número de repeticiones (1 a 3) en la región I
(figura 1b). El grupo más grande correspondió a secuencias con tres
copias de la secuencia repetida, idéntica a la secuencia
anteriormente notificada (14). No se encontró ninguna correlación
entre el patrón de variación y el origen del aislado.
Se observó un mayor grado de variabilidad en la
segunda región repetida de la PRN de B. bronchiseptica
(figura 1c). Se observaron nueve variantes. Entre estas nueve
variantes el número de repeticiones es de desde 6 hasta 9.
Ninguna de las variantes de B.
bronchiseptica presentó el mismo patrón que las variantes de
B. pertussis. Además, no se observó ninguna asociación
especial entre un tipo de región I y un tipo de región II. No se
hizo una observación en ninguna de las tres especies de un patrón
similar a aquellos de la cepa 18323 y el aislado CZ (3), que se
considerase intermedia entre B. pertussis, B. bronchiseptica
y parapertussis. Estos datos concuerdan con los genes
prn de B. parapertussis y de B. bronchiseptica
que son más similares entre sí que al gen prn de B.
pertussis (1). No se observó especificidad del huésped con
respecto al tipo de PRN.
Se ha mostrado que la región II desempeña un
papel importante en la inducción de inmunidad protectora (6). La
falta de protección cruzada entre PRN de B. pertussis, B.
parapertussis y PRN de B. bronchiseptica concuerda con
esto, porque las principales diferencias entre estas proteínas se
producen en esta región. No se observó ninguna variación en esta
región para la PRN producida por los aislados de B.
pertussis. Estos datos sugieren que treinta años de vacunación
pueden haber inducido una variación en una región de repetición
inmunodominante, pero no en la región más implicada en la inducción
de inmunidad protectora. La variación en la región II de PRN de
B. pertussis puede indicar una disminución en la eficacia de
la vacuna contra B. pertussis.
Por el contrario, el análisis de la PRN de B.
bronchiseptica mostró polimorfismo en ambas regiones. Esto
puede explicar la incapacidad de vacunas contra B.
bronchiseptica para inducir protección de larga duración. Este
polimorfismo puede relacionarse también con la capacidad de B.
bronchiseptica para inducir infecciones crónicas (7, 8, 22).
Puede proporcionar medios para que esta bacteria escape de las
respuestas inmunitarias del huésped.
Esta invención, que resultó de estos
experimentos y observaciones, implica así composiciones que
contienes ciertas pertactinas de Bordetella y fragmentos de
las mismas. Estas pertactinas y fragmentos de pertactina, así como
los polinucleótidos que codifican para los mismos, son útiles en
composiciones inmunogénicas y en aplicaciones de diagnóstico.
En particular, esta invención es el resultado
del descubrimiento de que existen diferentes especies de la
pertactina de longitud completa de Bordetella bronchiseptica,
concretamente, especies que contienen 6, 7, 8 ó 9 secuencias de
aminoácidos PQP de repetición en la región II de las mismas, y
especies de pertactina de longitud completa de B.
bronchiseptica que contienen 1, 2 ó 3 secuencias de aminoácidos
GGXXP de repetición en la región I de las mismas, en las que XX
puede ser FD, FG o AV. Se proporcionan así mediante esta invención,
estas pertactinas de longitud completa y mezclas de estas
pertactinas en cualquier combinación de las secuencias de
repetición.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "pertactina de Bordetella bronchiseptica"
significa una proteína de la membrana externa de Bordetella
bronchiseptica, que es un factor de virulencia, y que tiene un
peso molecular aparente de aproximadamente 68 kDa, y que contiene
las dos regiones de pertactina de Bordetella bronchiseptica
conocidas como región I y región II. Se identifican la región I y la
región II de las pertactinas de diferentes cepas de
Bordetella entre corchetes en SEQ ID NOS: 1 a 6. Se entenderá
que las pertactinas de diferentes aislados de Bordetella
bronchiseptica pueden tener secuencias de aminoácidos que
difieren entre sí, por ejemplo, en la región I, la región II, o
tanto en la región I como en la región II, así como en otras
regiones.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "variantes de pertactina de Bordetella
bronchiseptica" significa pertactinas de Bordetella
bronchiseptica, o fragmentos de pertactinas de Bordetella
bronchiseptica que contienen al menos la región I, la región
II, o tanto la región I como la región II, en las que las
pertactinas de Bordetella bronchiseptica o los fragmentos de
las mismas difieren entre sí en al menos la región I, la región II,
o tanto en la región I como en la región II, en sus respectivas
secuencias de aminoácidos. Se han descubierto las siguientes
variantes de pertactina especiales de Bordetella
bronchiseptica.
Tal como se usa en el presente documento las
expresiones "fragmentos de pertactina de Bordetella
bronchiseptica", "fragmentos de pertactina de
Bordetella parapertussis" y "fragmentos de pertactina de
Bordetella pertussis" se refieren a polipéptidos que son
partes de proteínas pertactinas de longitud completa y que pueden
inducir una respuesta inmunitaria celular o humoral frente a
infecciones por Bordetella.
En realizaciones específicas, el polipéptido
contenido en la composición inmunogénica de la invención comprende
una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:7,
SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16,
SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21
o SEQ ID NO: 22. El polipéptido puede consistir en los aminoácidos
en SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:14, SEQ ID
NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:19, SEQ
ID NO:20, SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:22 o fragmentos de las mismas.
La solicitud da a conocer polinucleótidos que codifican para uno de
estos polipéptidos y una secuencia purificada de ADN o ARN que
hibrida en condiciones de rigurosidad moderada o alta con los
polinucleótidos o al menos con 15 nucleótidos de los mismos.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "mezcla de variantes de pertactina de Bordetella
bronchiseptica" significa dos o más variantes de pertactina
de Bordetella bronchiseptica en mezcla en forma de
suspensión, emulsión, líquida o sólida. Al menos dos de las
variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica en la
mezcla, por supuesto, diferirán entre sí en al menos la región I, la
región II, o tanto en la región I como en la región II, en sus
respectivas secuencias de aminoácidos.
Resultará evidente de inmediato que la solicitud
da a conocer fragmentos de polipéptido de la pertactina de B.
bronchiseptica, en los que los fragmentos comprenden 6, 7, 8 ó 9
secuencias de aminoácidos PQP de repetición en la región II de los
mismos o 1,2 ó 3 secuencias de aminoácidos GGXXP de repetición en la
región I de los mismos. Las mezclas de estos fragmentos de
polipéptido en cualquier combinación de las secuencias de repetición
están también dentro del alcance de esta invención.
Cuando un fragmento de polipéptido comprende
sólo la región I de una pertactina de B. bronchiseptica, el
fragmento de polipéptido contiene normalmente al menos de
aproximadamente 46 a aproximadamente 56 aminoácidos, lo que incluye
las secuencias de repetición de la región I. Cuando el fragmento de
polipéptido de la invención comprende sólo la región II, el
fragmento de polipéptido contiene normalmente al menos de
aproximadamente 48 a aproximadamente 60 aminoácidos, lo que incluye
las secuencias de repetición de la región II. Cuando el fragmento
de polipéptido de la invención comprende tanto la región I como la
región II de B. bronchiseptica, el fragmento contiene
normalmente al menos de aproximadamente 906 a aproximadamente 928
aminoácidos, lo que incluye las secuencias de repetición de las
regiones I y II.
Así, en una realización ilustrativa, esta
invención proporciona una composición que comprende una mezcla de
variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica, en la
que cada variante de pertactina de Bordetella bronchiseptica
comprende la región II de pertactina de Bordetella
bronchiseptica, y además en la que cada variante de pertactina
de Bordetella bronchiseptica comprende 6, 7, 8 ó 9 secuencias
de aminoácidos PQP de repetición en la región II de las mismas y
las variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica
difieren en el número de las secuencias de aminoácidos PQP de
repetición contenidas en las mismas. La composición también puede
comprender pertactinas de Bordetella parapertussis,
Bordetella pertussis, o mezclas de las mismas. El polipéptido
puede ser una pertactina de longitud completa o un fragmento de la
misma.
En otra realización, esta solicitud da a conocer
una composición que comprende una mezcla de variantes de pertactina
de Bordetella bronchiseptica, en la que cada variante de
pertactina de Bordetella bronchiseptica comprende la región
I de una pertactina de Bordetella bronchiseptica, y además en
la que cada variante de pertactina de Bordetella
bronchiseptica comprende 1, 2 ó 3 secuencias de aminoácidos
GGXXP de repetición en la región I de las mismas, y las al menos
dos de las variantes de pertactina de Bordetella
bronchiseptica difieren en el número de las secuencias de
aminoácidos GGXXP de repetición contenidas en las mismas. Esta
composición también puede comprender pertactinas de Bordetella
parapertussis, Bordetella pertussis, o mezclas de las mismas.
Las variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica
pueden ser de longitud completa o un fragmento.
En una realización adicional, la solicitud da a
conocer una composición que comprende una mezcla de variantes de
pertactina de Bordetella bronchiseptica, en la que una de las
variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica
comprende la región II de pertactina de Bordetella
bronchiseptica que tiene 6, 7, 8 ó 9 secuencias de aminoácidos
PQP de repetición en la región II de la misma, y otra de las
variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica
comprende la región I de pertactina de Bordetella
bronchiseptica que tiene 1, 2 ó 3 secuencias de aminoácidos
GGXXP de repetición en la región I de la misma. Esta composición
también puede comprender pertactinas de Bordetella parapertussis,
Bordetella pertussis, o mezclas de las mismas. Las variantes de
pertactina de Bordetella bronchiseptica pueden ser de
longitud completa o un fragmento.
En una realización preferida, el polipéptido
contenido en la composición de la invención comprende una secuencia
seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o
SEQ ID NO:9.
En otra realización preferida, el polipéptido
contenido en la composición de la invención comprende una secuencia
seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15,
SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID
NO: 20, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 22.
Las composiciones según la invención producen
una respuesta inmunitaria humoral y una respuesta inmunitaria
celular. Tras la infección por B. bronchiseptica, hay
inducción de una inmunidad humoral y de una inmunidad celular, tal
como en el caso de una infección por B. pertussis y B.
parapertussis. Además, tras la vacunación con composiciones de
esta invención, hay inducción de una inmunidad tipo humoral y
celular similar a la que se induce tras la infección o
reinfección.
En una realización de la invención, se
proporciona una composición para vacunación que comprende como
principio activo una composición inmunogénica de la invención, en
combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y, cuando
sea apropiado, con un adyuvante.
Como las vacunas contra la tos ferina
disponibles actualmente en el mercado, la composición inmunogénica
según la invención puede combinarse con otros principios activos de
vacunación, por ejemplo, aquellos de la vacuna contra la difteria,
poliomielitis, o enfermedades producidas por Haemophilus o,
en términos generales, con cualquier constituyente inmunogénico, por
ejemplo, una toxina o agente patógeno inactivado particular.
Una composición para vacunación según la
invención puede ser específica de la especie y, en consecuencia,
puede inducir protección frente a B. pertussis o B.
parapertussis o B. bronchiseptica. Alternativamente,
puede ser una mezcla que comprende como principio activo una
composición inmunogénica frente a B. bronchiseptica, tal
como se definió anteriormente, y una composición inmunogénica frente
a B. parapertussis y/o B. pertussis.
Como un resultado de técnicas recientes en
biología molecular, se han caracterizado varios factores
involucrados en la virulencia de B. pertussis y se ha
comprendido la regulación de su expresión. Estos factores pueden
clasificarse en dos categorías, los que participan en el síndrome
infeccioso (adhesinas) y los que desempeñan un papel en el síndrome
inducido por toxina (toxinas). Las adhesinas y toxinas relacionadas
con Bordetella pueden incluirse en las composiciones de esta
invención. Ejemplos de las adhesinas son:
hemaglutinina filamentosa o FHA, que se
considera que desempeña un papel importante en la adhesión de la
bacteria al epitelio ciliado;
los dos aglutinógenos o AGG de B.
pertussis, que permiten que se clasifiquen las cepas en
serotipos; y
toxina de la tos ferina o PTX, una toxina
A-B de tipo secretada que, además de sus efectos
citopatógenos, participa en la adhesión a través de su subunidad
B.
Ejemplos de las toxinas para su uso en la
invención son:
toxina de la tos ferina o PTX, que se
secreta;
toxina dermonecrótica o DNT, cuya función aún no
se ha caracterizado bien, y citotoxina traqueal o TCT, una
glucoproteína pequeña secretada de la familia del
muramil-péptido, derivado del peptidoglucano de la
bacteria, que parecen actuar en conjunto para destruir la células
ciliadas del aparato respiratorio del huésped;
adenilato ciclasa-hemolisina o
Ac-Hly, una proteína bifuncional que tiene actividad
adenilato ciclasa y actividad hemolítica, que ha descubierto que
pertenece a la familia de toxinas denominadas ``RTX para
"repeticiones en toxinas".
De manera similar, se han identificado los
factores involucrados en la virulencia de B. parapertussis y
B. bronchiseptica y pueden incluirse en las composiciones de
la invención.
Los resultados publicados muestran que las
vacunas acelulares sometidas a prueba, monovalente (PTX), bivalente
(PTX, FHA), trivalente (PTX, FHA, PRN), o pentavalente (PTX, FHA,
PRN, AGG2, AGG3) inducen muy pocos efectos secundarios, todas son
inmunogénicas y todas tienen una eficacia frente a la enfermedad
(según la definición de la OMS) que es superior o igual al 70%. Las
composiciones de la invención pueden incluirse en estas vacunas y
otras vacunas acelulares. Por ejemplo, la composición inmunogénica
puede comprender además al menos una adhesina de Bordetella
seleccionada del grupo que consiste en FHA, AGG2, AGG3, y/o al menos
una toxina de Bordetella seleccionada del grupo que consiste
en PTX, DNT, TCT y Ac-Hly.
Las proteínas y polipéptidos de las
composiciones de esta invención pueden estar en forma purificada. El
término "purificado(a)" tal como se usa en el presente
documento, significa que las pertactinas y fragmentos de las mismas
están esencialmente libres de asociación con otras proteínas o
polipéptidos, por ejemplo, como un producto de purificación de
cultivo de células huésped recombinantes o como un producto
purificado de una fuente no recombinante. El término
"sustancialmente purificado(a)" tal como se usa en el
presente documento, se refiere a una mezcla que contiene
pertactinas o fragmentos de las mismas y está esencialmente libre de
asociación con otras proteínas o polipéptidos, excepto por la
presencia de proteínas conocidas que pueden eliminarse usando un
anticuerpo específico, y cuyos polipéptidos de pertactina
sustancialmente purificados pueden usarse como antígenos.
Dentro de un aspecto de la solicitud, pueden
utilizarse la pertactina y fragmentos de la misma para preparar
anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos de
pertactina. El término "anticuerpos" pretende incluir
anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de
los mismos, tales como fragmentos F(ab')2 y Fab, así como
parejas de unión producidos de modo recombinante. Se define que los
anticuerpos se unen específicamente si se unen a pertactinas y
fragmentos de las mismas con un K_{a} superior o igual a
aproximadamente 10^{7} M^{-1}. Pueden determinarse fácilmente
las afinidades de las parejas de unión o anticuerpos usando técnicas
convencionales, por ejemplo, las descritas por Scatchard et
al., Ann. N.Y Acad Sci., 51:660 (1949). Los anticuerpos
policlonales puede generarse fácilmente a partir de una variedad de
fuentes, por ejemplo, caballos, vacas, cabras, ovejas, perros,
pollos, conejos, ratones o ratas, usando procedimientos que se
conocen bien en la técnica.
La solicitud da a conocer además fragmentos y
oligonucleótidos aislados derivados de la secuencia de nucleótidos
de las pertactinas dadas a conocer en la solicitud. B.
bronchiseptica, B. pertussis y B. parapertussis (SEQ ID
NO:1, SEQ ID NO:2, y SEQ ID NO:3) que codifican para 6, 7, 8 ó 9
secuencias de aminoácidos PQP de repetición en la región II de las
mismas y/o 1, 2 ó 3 secuencias de aminoácidos GGXXP de repetición en
la región I de las mismas. La solicitud también da a conocer
polipéptidos codificados por estos fragmentos y oligonucleótidos.
Las mezclas pueden comprender secuencias de nucleótidos que
contienen secuencias de repetición en las que cada entidad en la
mezcla se selecciona independientemente de los polinucleótidos dados
a conocer en la solicitud.
Las secuencias de ácidos nucleicos incluyen
secuencias aisladas de ADN y ARN que hibridan con los ácidos
nucleicos de pertactina nativa dados a conocer en el presente
documento en condiciones de rigurosidad moderada o intensa, y que
codifican para polipéptidos de pertactina. Tal como se usa en el
presente documento, las condiciones de rigurosidad moderada, tal
como conocen los expertos en la técnica, y tal como se define por
Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2
ed. Vol. 1, págs. 1.101-104, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, (1989), incluyen el uso de una disolución de
prelavado para los filtros de nitrocelulosa 5X SSC, SDS al 0,5%,
EDTA 1,0 mM (pH 8,0), condiciones de hibridación de formamida al
50%, 6X SSC a 42ºC (o otra disolución de hibridación similar, tal
como disolución de Stark, en formamida al 50% a 42ºC), y condiciones
de lavado de aproximadamente 60ºC, 0,5X SSC, SDS al 0,1%. Las
condiciones de rigurosidad alta se definen como condiciones
hibridación como anteriormente, y con lavado a 68ºC, 0,2X SSC, SDS
al 0,1%. El experto en la técnica reconocerá que la temperatura y
la concentración de sal de la disolución de lavado pueden ajustarse
según sea necesario de acuerdo con factores tales como la longitud
de la sonda.
Debido a la conocida degeneración del código
genético, en la que más de un codón puede codificar para el mismo
aminoácido, una secuencia de ADN puede variar y aún codificar para
un polipéptido de pertactina que tiene la secuencia de aminoácido
de SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO:24. Tales secuencias de ADN variantes
pueden resultar de mutaciones silenciosas (por ejemplo, que se
producen durante la amplificación por PCR), o puede ser el producto
de mutagénesis deliberada de una secuencia nativa.
La solicitud describe secuencias de ADN aisladas
equivalentes, que codifican para polipéptidos de pertactina,
seleccionadas de: (a) ADN derivado de la región codificante de un
gen de pertactina nativa; (b) ADNc que comprende la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID NO:7 a SEQ ID NO:24; (c) ADN que puede
hibridar con un ADN de (a) en condiciones de rigurosidad moderada y
que codifica para polipéptidos de pertactina; y (d) ADN que es
degenerado como resultado del código genético de un ADN definido en
(a), (b) o (c) y que codifica para polipéptidos de pertactina.
También se dan a conocer los polipéptidos de pertactina codificados
por tales secuencias equivalentes de ADN.
Se entenderá que la presente solicitud da a
conocer las proteínas y polipéptidos descritos anteriormente en
forma aislada o purificada, ya se obtengan usando las técnicas
descritas en el presente documento u otros métodos. En una
realización preferida, los polipéptidos de pertactina están
sustancialmente libres de tejido humano o de otro animal y de
componentes de tejido humano o de otro animal, ácidos nucleicos,
proteínas y lípidos extraños y microorganismos adventicios, tales
como bacterias y virus. También se entenderá que se describen
también proteínas equivalentes que tienen sustancialmente las mismas
propiedades biológicas e inmunogénicas. Por tanto, esta solicitud
describe variantes serotípicas de los polipéptidos tal como se dan a
conocer en el presente documento.
Dependiendo del uso que vaya a hacerse de los
polipéptidos de pertactina, puede ser deseable marcarlos. Ejemplos
de marcadores adecuados son marcadores radiactivos, marcadores
enzimáticos, marcadores fluorescentes, marcadores
quimioluminiscentes y cromóforos. Los métodos para el marcaje no
difieren en esencia de los usados ampliamente para marcar
inmunoglobulina. Puede evitarse la necesidad de marcar usando un
anticuerpo marcado frente al antígeno o
anti-inmunoglobulina frente a los anticuerpos frente
al antígeno como marcador indirecto.
Una vez que se han obtenido los polipéptidos de
pertactina, pueden usarse para producir anticuerpos policlonales y
monoclonales reactivos con los mismos. Por tanto, puede usarse una
proteína o polipéptido para inmunizar un huésped animal mediante
técnicas conocidas en la técnica. Tales técnicas normalmente
implican la inoculación, pero puede implicar otros modos de
administración. Se administra una cantidad suficiente de la proteína
o del polipéptido para producir una respuesta inmunogénica en el
huésped animal. Puede usarse cualquier huésped que produzca
anticuerpos frente al antígeno de la invención. Una vez que se ha
inmunizado el animal y ha pasado tiempo suficiente para que empiece
a producir anticuerpos frente al antígeno, pueden recuperarse los
anticuerpos policlonales. El método general comprende extraer
sangre del animal y separar el suero de la sangre. El suero, que
contiene anticuerpos frente al antígeno, puede usarse como un
antisuero frente al antígeno. Alternativamente, pueden recuperarse
los anticuerpos del suero. La purificación por afinidad es una
técnica preferida para recuperar los anticuerpos policlonales
purificados frente al antígeno, del suero.
Pueden prepararse también los anticuerpos
monoclonales frente a los antígenos dados a conocer anteriormente.
Un método para producir anticuerpos monoclonales reactivos con los
antígenos comprende las etapas de inmunizar un huésped con el
antígeno; recuperar las células productoras de anticuerpo del bazo
del huésped; fusionar las células productoras de anticuerpo con
células de mieloma deficientes en la enzima
hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa para
formar hibridomas; seleccionar al menos uno de los hibridomas
mediante crecimiento en un medio que comprende hipoxantina,
aminopterina y timidina; identificar al menos uno de los hibridomas
que produce un anticuerpo frente al antígeno, cultivar el hibridoma
identificado para producir anticuerpo en una cantidad recuperable;
y recuperar los anticuerpos producidos por hibridoma en cultivo.
Pueden usarse estos anticuerpos policlonales o
monoclonales en una variedad de aplicaciones. Entre éstas se
encuentra la neutralización de proteínas correspondientes. Pueden
usarse también para detectar antígenos de Bordetella en
preparaciones biológicas o en la purificación de proteínas,
glucoproteínas correspondientes o mezclas de las mismas, por
ejemplo cuando se usa en columnas de cromatografía por afinidad.
Pueden usarse los polipéptidos de pertactina tal
como se definen en el presente documento como antígenos para
identificar anticuerpos frente a Bordetella en materiales y
para determinar la concentración de los anticuerpos en esos
materiales. Por tanto, pueden usarse los antígenos para la
determinación cualitativa o cuantitativa de Bordetella en un
material. Tales materiales, por supuesto, incluyen tejido humano o
de otro animal y células humanas o de otro animal, así como
líquidos biológicos, tales como líquidos corporales humanos o de
otro animal, incluyendo sueros humanos. Cuando se usa como reactivo
en un inmunoensayo para determinar la presencia o la concentración
de los anticuerpos frente a Bordetella, los antígenos tal
como se definieron anteriormente proporcionan un ensayo que es
conveniente, rápido, sensible y específico.
Más particularmente, pueden emplearse los
antígenos tal como se definieron anteriormente para la detección de
Bordetella por medio de inmunoensayos que se conocen bien
para su uso en la detección o cuantificación de componentes
humorales en líquidos. Por tanto, pueden observarse directamente
interacciones antígeno-anticuerpo o determinarse
mediante reacciones secundarias, tales como precipitación o
aglutinación. Además, pueden emplearse también técnicas de
inmunoelectroforesis. Por ejemplo, puede utilizarse la combinación
clásica de electroforesis en agar seguida por reacción con
antisuero, así como electroforesis bidimensional, electroforesis de
Rocket e inmunomarcaje de patrones en gel de poliacrilamida
(inmunotransferencia o transferencia de tipo Western) Otros
inmunoensayos en los que pueden emplearse los antígenos tal como se
definieron anteriormente incluyen, pero no se limitan a,
radioinmunoensayo, ensayo de inmunoprecipitación competitiva,
inmunoensayo enzimático y ensayo de inmunofluorescencia. Se
entenderá que pueden emplearse técnicas turbidimétricas,
colorimétricas y nefelométricas. Se prefiere un inmunoensayo basado
en una técnica de inmunotransferencia de tipo Western.
Pueden llevarse a cabo los inmunoensayos
mediante la inmovilización de uno de los inmunorreactivos, o bien
un antígeno tal como se definió anteriormente o bien un anticuerpo
frente al antígeno, sobre una superficie portadora mientras se
retiene la inmunorreactividad del reactivo. El inmunorreactivo
recíproco puede estar sin marcar o marcarse de tal manera que se
retiene también la inmunorreactividad. Estas técnicas son
especialmente adecuadas para su uso en inmunoensayos enzimáticos,
tales como ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) e
inmunoensayo enzimático de inhibición competitiva (CIEIA).
Cuando o bien el antígeno tal como se definió
anteriormente o bien el anticuerpo frente al antígeno se une a un
soporte sólido, el soporte es normalmente material de vidrio o de
plástico. Se prefieren materiales de plástico moldeados en forma de
placas, tubos, perlas o discos. Ejemplos de materiales de plástico
adecuados son poliestireno y poli(cloruro de vinilo). Si el
inmunorreactivo no se une fácilmente al soporte sólido, puede
interponerse un material portador entre el reactivo y el soporte.
Ejemplos de materiales portadores adecuados son proteínas, tales
como albúmina de suero bovino, o reactivos químicos, tales como
glutaraldehído o urea. Puede llevarse a cabo el recubrimiento de la
fase sólida usando técnicas convencionales.
La invención proporciona polipéptidos de
pertactina inmunogénicos, y más particularmente, polipéptidos
protectores para su uso en la preparación de composiciones de
vacuna contra Bordetella. Por tanto, pueden emplearse estos
polipéptidos como vacunas administrando los polipéptidos a un
mamífero propenso a infección por Bordetella. Pueden
emplearse modos de administración convencionales. Por ejemplo, la
administración puede llevarse a cabo por las vías oral,
respiratoria o parenteral. Se prefieren las vías de administración
intradérmica, subcutánea e intramuscular cuando se administra la
vacuna por vía parenteral.
El fin principal de la respuesta inmunitaria en
un mamífero infectado por Bordetella es inactivar
Bordetella y eliminar las células infectadas por
Bordetella. La rama de células B de la respuesta inmunitaria
tiene la responsabilidad principal para la inactivación de
Bordetella. La manera principal en la que se logra esto es
mediante neutralización de la infectividad. Otro mecanismo principal
para la destrucción de las células infectadas por Bordetella
se proporciona mediante linfocitos T citotóxicos (CTL) que reconocen
antígenos de pertactina expresados en combinación con antígenos de
histocompatibilidad de clase I en la superficie celular. Los CTL
reconocen polipéptidos de pertactina procesados dentro de las
células de una proteína pertactina que se produce, por ejemplo, por
la célula infectada o que se internaliza por una célula fagocítica.
Por tanto, pueden emplearse las composiciones inmunogénicas de la
invención para estimular una respuesta de células B frente a
polipéptidos de pertactina, así como inmunidad mediada por una
respuesta de CTL tras la infección. La respuesta de CTL puede
desempeñar un papel importante en mediar la recuperación de
infección primaria por Bordetella y en acelerar la
recuperación durante infecciones posteriores.
La capacidad de los polipéptidos de pertactina
tal como se definieron en las composiciones de la invención y
vacunas de la invención para inducir niveles protectores de
anticuerpos neutralizantes en un huésped puede potenciarse mediante
emulsionamiento con un adyuvante, incorporación en un liposoma,
acoplamiento con un portador adecuado, o mediante combinaciones de
estas técnicas. Por ejemplo, pueden administrarse los polipéptidos
de pertactina tal como se definieron en las composiciones de la
invención con un adyuvante convencional, tal como gel de hidróxido
de aluminio y fosfato de aluminio, en una cantidad suficiente para
potenciar la respuesta inmunitaria humoral o mediada por célula en
el huésped. De manera similar, los polipéptidos de pertactina
pueden unirse a membranas lipídicas o incorporarse en membranas
lipídicas para formar liposomas. El uso de lípidos no pirogénicos
libres de ácidos nucleicos y otras materias extrañas puede emplearse
para este fin.
El programa de inmunización dependerá de varios
factores, tales como la propensión del huésped a la infección y la
edad del huésped. Puede administrarse una dosis única de la vacuna
de la invención al huésped o puede seguirse un ciclo primario de
inmunización en el que se administran varias dosis a intervalos de
tiempo. Pueden administrarse dosis posteriores usadas como
refuerzos cuando sea necesario tras el ciclo primario.
Pueden administrarse las proteínas, polipéptidos
y vacunas de pertactina al huésped en una cantidad suficiente para
prevenir o inhibir la infección por Bordetella o la
replicación in vivo. En cualquier caso, la cantidad
administrada debe ser al menos suficiente para proteger al huésped
frente a una inmunosupresión sustancial, aunque la infección por
Bordetella pueda no prevenirse totalmente. Puede obtenerse
una respuesta inmunogénica administrando las proteínas o
polipéptidos de la invención al huésped en una cantidad de, por
ejemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 50 microgramos de
antígeno por kilogramo de peso corporal, preferiblemente de
aproximadamente 5 a aproximadamente 10 microgramos de antígeno por
kilogramo de peso corporal. Pueden administrarse las proteínas,
polipéptidos y vacunas de la invención junto con un vehículo
fisiológicamente aceptable. Puede emplearse por ejemplo, un
diluyente, tal como agua o una solución salina.
Otro aspecto dado a conocer en la solicitud
incluye administrar cualquier combinación de los ácidos nucleicos
que codifican para polipéptidos de pertactina, las proteínas y
polipéptidos per se, con o sin moléculas portadoras, a un
individuo. El individuo puede ser un animal. Tal como se usa en el
presente documento, el término "animal" significa un mamífero,
y preferiblemente, el mamífero se selecciona del grupo que consiste
en un ser humano, un conejo, un ratón, un perro, un gato, un bovino,
un cerdo y un caballo. En una realización especialmente preferida,
el mamífero es un ser humano.
Los métodos de tratamiento incluyen administrar
composiciones inmunogénicas que comprenden polipéptidos o proteínas
pertactina, y composiciones que comprenden ácidos nucleicos que
codifican también para polipéptidos o proteínas pertactina. Los
expertos en la técnica tienen conocimiento del concepto, de la
aplicación y de la eficacia de las vacunas de ácido nucleico (por
ejemplo, vacunas de ADN) y la tecnología de vacunas de ácido
nucleico así como tecnologías basadas en proteínas y polipéptidos.
La tecnología basada en ácidos nucleicos permite la administración
de ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos de pertactina,
desnudos o encapsulados, directamente a tejidos y células sin la
necesidad de producción de las proteínas codificadas antes de la
administración. La tecnología se basa en la capacidad de estos
ácidos nucleicos para que los capten las células del organismo
receptor y se expresen para producir un determinante inmunogénico
frente al que responde el sistema inmunitario del receptor.
Normalmente, los antígenos expresados se presentan en la superficie
de las células que los han captado y expresan los ácidos nucleicos,
pero la expresión y exportación, de los antígenos codificados hacia
el sistema circulatorio del individuo receptor están también dentro
del alcance de la presente invención. Tal tecnología de vacunas de
ácido nucleico incluye, pero no se limita a, inserción de ADN y ARN
desnudos e inserción de vectores expresión que codifican para
polipéptidos de pertactina. Aunque la tecnología se denomina
"vacuna", es igualmente aplicable a composiciones inmunogénicas
que no dan como resultado una respuesta protectora. Tales
composiciones inductoras no de protección se dan a conocer en la
presente solicitud y métodos.
Aunque la presente solicitud da a conocer la
inserción de ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos de
pertactina y moléculas portadoras como ácido nucleico desnudo, la
presente solicitud también da a conocer la inserción de ácidos
nucleicos como parte de composiciones mayores o más complejas. Están
incluidos entre estos sistemas de inserción virus, partículas
similares a virus, o bacterias que contienen el ácido nucleico que
codifica para polipéptidos de pertactina. También, los complejos de
los ácidos nucleicos de la invención y moléculas portadoras con
compuestos de permeabilización celular, tales como liposomas, están
incluidos dentro del alcance de la invención. Otros compuestos,
tales como vectores moleculares (documento EP 696.191, Samain et
al.) y sistemas de inserción para vacunas de ácido nucleico se
conocen por el experto en la técnica y se ejemplifican, por
ejemplo, en los documentos WO 93 06223 y WO 90 11092, U.S. 5.580.859
y U.S. 5.589.466 (patentes de Vical), que se incorporan como
referencia al presente documento, y pueden prepararse o usarse sin
demasiada o excesiva experimentación.
Para lograr además los objetos y según los fines
de la presente invención, se describe un kit que puede diagnosticar
una infección por Bordetella. Este kit, en una realización,
contiene las secuencias de ADN tal como se definieron anteriormente
que pueden hibridar con secuencias de ARN bacteriano o ADN análogo
para indicar la presencia de una infección por Bordetella.
Pueden usarse diferentes técnicas de diagnóstico que incluyen, pero
no se limitan a: (1) procedimientos de transferencia de tipo
Southern para identificar ADN celular que puede digerirse o no con
enzimas de restricción; (2) técnicas de transferencia de tipo
Northern para identificar ARN extraído de células; y (3) técnicas
de transferencia puntual, es decir, filtración directa de la muestra
a través de una membrana, tal como de nitrocelulosa o nailon, sin
separación previa en gel de agarosa. Podría obtenerse un material
adecuado para la técnica de transferencia puntual de líquidos
corporales incluyendo, pero sin limitarse a, suero y plasma,
sobrenadantes de células en cultivo, o extractos citoplasmáticos
obtenidos tras la lisis celular y eliminación de las membranas y los
núcleos de las células mediante centrifugación.
A continuación, se encuentran las referencias de
las cepas usadas en la búsqueda con respecto a la presente
invención:
- 9.73H+5, DEL, SEI: Infect Immun.-(1993)
61''4072-4078. Gueirard, P. y Guiso, N., presentada
con CNCM el 12 de mayo de 1989, nº 858.
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Microbiol. (1997) 143:1433-1441. Le Blay, K. et
al.
- 63.2: CIP - Lab. Ident., Inst. Pasteur, París,
Francia - J. Clin. Microbiol., 1993, 31, 2745
- TI: CIP81.32 - Lab. Ident., Inst. Pasteur,
París, Francia - J. Clin. Microbiol., 1993, 31, 2746
- Fr287: Vaccine (1999) 17:2651:2660.
Boursaux-Eude, C. et al.
- 18232: ref. OMS: ATCC97.97 (CIP63.1).
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\vskip1.000000\baselineskip
Se han citado las referencias siguientes en esta
solicitud. La descripción completa de cada una de estas referencias
se basa en y se incorpora al presente documento como referencia.
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POLIMORFISMOS DE LAS REGIONES REPETIDAS DE PERTACTINA EN
BORDETELLA PERTUSSIS, BORDETELLA PARAPERTUSSIS Y
BORDETELLA BRONCHISEPTICA, SU USO EN DIAGNÓSTICO Y EN
COMPOSICIONES INMUNOGÉNICAS
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<130> B4888 - AD/VMA/CAL
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<140> documento PCT/EP 01/06457
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23-05-2001
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<150> documento US 60/206.969
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<151>
25-01-2002
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<160> 25
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 3000
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<212> ADN
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<213> Bordetella bronchiseptica
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<210> 2
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<211> 2733
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<212> ADN
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<213> Bordetella pertussis
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<210> 3
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<211> 3116
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<212> ADN
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<213> Bordetella parapertussis
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<213> Bordetella bronchiseptica
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 56
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<213> Bordetella bronchiseptica
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<213> Bordetella bronchiseptica
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<213> Bordetella bronchiseptica
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<213> Bordetella bronchiseptica
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<213> Bordetella bronchiseptica
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<400> 25
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\sa{Gly Gly Xaa Xaa Pro}
Claims (19)
1. Composición inmunogénica que comprende una
mezcla de al menos dos pertactinas o fragmentos de pertactina de
Bordetella bronchiseptica, en la que dichas pertactinas o
fragmentos contienen al menos la región II, o tanto la región I como
la región II y en la que dichas pertactinas o fragmentos difieren
entre sí, en sus respectivas secuencias de aminoácidos, en al menos
la región II o las regiones I y II.
2. Composición inmunogénica según la
reivindicación 1, en la que al menos dos de las pertactinas o
fragmentos de pertactina de Bordetella bronchiseptica
difieren al menos en el número de secuencias de aminoácidos PQP de
repetición en su región II.
3. Composición inmunogénica según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 2, en la que cada pertactina o fragmento
de pertactina de Bordetella bronchiseptica comprende 6, 7, 8
ó 9 secuencias de aminoácidos PQP de repetición en la región II de
los mismos.
4. Composición inmunogénica según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, en la que los fragmentos de
pertactina contienen desde aproximadamente 48 hasta aproximadamente
60 aminoácidos.
5. Composición inmunogénica según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, en la que al menos una pertactina o
fragmento de pertactina de Bordetella bronchiseptica
comprende la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID
NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ
ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:22.
6. Composición inmunogénica según la
reivindicación 1, en la que cada pertactina o fragmento de
pertactina de Bordetella bronchiseptica comprende la región
I.
7. Composición inmunogénica según la
reivindicación 6, en la que al menos dos de las variantes de
pertactina de Bordetella bronchiseptica difieren al menos en
el número de secuencias de aminoácidos GGXXP de repetición en su
región I.
8. Composición inmunogénica según una cualquiera
de las reivindicaciones 6 a 7, en la que cada variante de pertactina
de Bordetella bronchiseptica comprende 1, 2 ó 3 secuencias de
aminoácidos GGXXP de repetición en la región I de las mismas.
9. Composición inmunogénica según una cualquiera
de las reivindicaciones 6 a 8, en la que XX del motivo GGXXP se
selecciona de FD, FG o AV.
10. Composición inmunogénica según una
cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en la que los fragmentos
de pertactina contienen desde aproximadamente 46 hasta
aproximadamente 56 aminoácidos.
11. Composición inmunogénica según una
cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en la que al menos una
pertactina o fragmento de pertactina de Bordetella
bronchiseptica comprende la secuencia seleccionada del grupo que
consiste en SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9.
12. Composición inmunogénica según la
reivindicación 1, que comprende una mezcla de pertactinas o
fragmentos de pertactina de Bordetella bronchiseptica, en la
que al menos uno de dicha pertactina o fragmento de Bordetella
bronchiseptica comprende la región II de pertactina de
Bordetella bronchiseptica que tiene 6, 7, 8 ó 9 secuencias de
aminoácidos PQP de repetición en la región II de los mismos, y al
menos otro de dicha pertactina o fragmento de Bordetella
bronchiseptica comprende la región I de pertactina de
Bordetella bronchiseptica que tiene 1, 2 ó 3 secuencias de
aminoácidos GGXXP de repetición en la región I del mismo.
13. Composición inmunogénica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicha composición comprende
al menos un polipéptido que comprende una secuencia o un fragmento
de dicha secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID
NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ
ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:22.
14. Composición inmunogénica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12, que consiste esencialmente en:
- a)
- un polipéptido que comprende la región I y la región II, o un polipéptido que comprende la región I y un polipéptido que comprende la región II de una pertactina de Bordetella bronchiseptica cepa 9.73, consistiendo dichas región I y región II respectivamente en SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO: 16.
- b)
- un polipéptido que comprende la región I y la región II, o un polipéptido que comprende la región I y un polipéptido que comprende la región II, de una pertactina de Bordetella bronchiseptica de la cepa SEI, consistiendo dichas región I y región II respectivamente en SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:22.
\newpage
15. Composición inmunogénica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12, que consiste esencialmente en:
- a)
- un polipéptido que comprende la región I y la región II, o un polipéptido que comprende la región I y un polipéptido que comprende la región II de una pertactina de Bordetella bronchiseptica cepa 9.73 depositada en la Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos (CNCM, Collection Nationale de Culture de Microorganismes) el 12 de mayo de 1989 con el número I-858, y
- b)
- un polipéptido que comprende la región I y la región II, o un polipéptido que comprende la región I y un polipéptido que comprende la región II, de una pertactina de Bordetella bronchiseptica de la cepa SEI, consistiendo dichas región I y región II respectivamente en SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:22.
16. Composición inmunogénica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 13, que comprende también pertactinas de
Bordetella parapertussis o un fragmento de las mismas que
pueden inducir una respuesta inmunitaria celular o humoral frente a
infecciones por Bordetella, o de Bordetella pertussis
o un fragmento de las mismas que pueden inducir una respuesta
inmunitaria celular o humoral frente a infecciones por
Bordetella, o mezclas de las mismas.
17. Vacuna que comprende una composición
inmunogénica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16,
junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
18. Kit de vacunación que comprende al menos una
composición inmunogénica según las reivindicaciones 1 a 16, y medios
para administrar la composición a un animal.
19. Composición inmunogénica según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la que la composición
comprende además al menos una adhesina de Bordetella
seleccionada del grupo que consiste en FHA, AGG2, AGG3 y/o al menos
una toxina de Bordetella seleccionada del grupo que consiste
en PTX, DNT, TCT, Ac-Hly.
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