CN109879942A

CN109879942A - 一种兔波氏杆菌外膜蛋白及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN109879942A
Application number: CN201910157274.4A
Authority: CN
Inventors: 刘燕; 鲍国连; 韦强; 肖琛闻; 季权安; 黄叶娥; 李科
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-03-01
Filing date: 2019-03-01
Publication date: 2019-06-14

Abstract

本发明公开了一种兔波氏杆菌外膜蛋白及其制备方法和用途，该外膜蛋白为外膜蛋白PPP或外膜蛋白PL，所述外膜蛋白PPP包含：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述外膜蛋白PL包含：如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本发明的兔波氏杆菌外膜蛋白能够用于包被ELISA酶标板，作为检测抗原，用于检测兔波氏杆菌抗体，仅需要2个小时就能测得结果，且检测灵敏度、准确度高，本发明试剂盒便于操作、使用成本低、稳定性和重复性好，适合大规模推广应用。

Description

一种兔波氏杆菌外膜蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种外膜蛋白，具体涉及一种兔波氏杆菌外膜蛋白及其制备方法和用途。

背景技术

兔波氏杆菌病是由兔支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)引起的一种多发性呼吸道疾病，主要引起哺乳仔兔和断乳仔兔的急性死亡，成年兔的鼻炎、支气管炎和脓疱性肺炎等，部分兔场波氏杆菌感染率高达70％。

近年来，在我国各养兔地区波氏杆菌发病日趋严重，是引起家兔呼吸系统疾病的最主要病原，该病病程长，反复发生，难治愈，易造成患兔生长障碍，饲料利用率低，给养兔业带来了很大的经济损失。此外，机体感染该菌后，往往容易继发或并发感染其他细菌和病毒，导致更严重的呼吸道疾病，带来更加严重的损失。而且，兔支气管败血波氏杆菌也可感染人，尤其是免疫力低下的人群。

目前，兔波氏杆菌病的诊断主要还是依靠普通细菌学检测方法，繁琐费时，检出率低，且检测工作量大，效率不大。而血清学诊断方法主要集中在乳胶凝集试验、微量凝集试验。

郭明璋、董亚芳等于1994年进行了兔波氏杆菌抗体ELISA(enzyme-linkedimmunosorbent assay，酶联免疫吸附测定法)检测方法的研究(ELISA检测兔支气管败血波氏杆菌抗体的研究，江苏农业学报，1994年03期)操作相对简单，但存在空窗期、交叉反应等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种兔波氏杆菌外膜蛋白及其制备方法和用途，解决了现有兔波氏杆菌病检测方法工作效率低的问题，能够提高检测灵敏度、准确度，便于操作，稳定性和重复性好，适合大规模推广应用。

为了达到上述目的，本发明提供了一种兔波氏杆菌外膜蛋白，该外膜蛋白为外膜蛋白PPP或外膜蛋白PL，所述外膜蛋白PPP包含：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述外膜蛋白PL包含：如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明还提供了用于制备所述的兔波氏杆菌外膜蛋白的引物序列，所述外膜蛋白PPP的引物序列包含：如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述外膜蛋白PL的引物序列包含：如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种所述的兔波氏杆菌外膜蛋白的制备方法，该方法包含：

(1)以提取的兔波氏杆菌HB菌株的基因组DNA为模板，以所述的外膜蛋白PPP的引物序列或外膜蛋白PL的引物序列作为引物，采用PCR分别扩增靶蛋白PPP或PL的基因；

(2)将扩增的目的基因与PMD-18T连接，并转化感受态细胞，检验阳性克隆，提取阳性细胞的重组质粒；

(3)将提取的重组质粒和pET-28a(+)质粒用Nco I和Xho I限制性内切酶双酶切，以连接酶连接，将连接产物转化入感受态细胞中，提取质粒，获得构建的pET-28a(+)/PL或pET-28a(+)/PPP重组质粒；

(4)鉴定步骤(3)获得的重组质粒，将阳性重组质粒转化至Rosetta感受态细胞，诱导剂IPTG诱导重组蛋白PPP或PL的表达。

所述重组蛋白PPP为所述的外膜蛋白PPP；所述重组蛋白PL为所述的外膜蛋白PL。

其中，兔波氏杆菌HB菌株(兔波氏杆菌RB50)的ATCC保藏编号为：ATCC BAA-588。

优选地，在步骤(2)和(3)中，所述感受态细胞为top10感受态细胞。

优选地，在步骤(2)中，所述检验阳性克隆采用菌液PCR方法。

优选地，在步骤(3)中，以T4连接酶连接，将连接产物转化入Top10感受态细胞中，将菌液转移至无抗性的LB液体培养基中，37℃，180～200r/min培养，使细胞恢复抗性，取菌液涂于含相应抗生素抗性LB琼脂平板上，于37℃培养12～16h，用试剂盒法提取菌液质粒。

优选地，在步骤(4)中，将阳性重组质粒转化至Rosetta感受态细胞，转移菌液至无抗生素的LB液体培养基，37℃，180～200r/min培养，使细胞恢复抗性，将菌液涂于含卡那抗性的平板，倒置平皿于37℃培养12～16h；接种于含卡那霉素的LB液体培养基中培养，直至对数生长期，加入IPTG诱导培养。

本发明还提供了一种兔波氏杆菌抗体检测试剂盒，该试剂盒含有所述的外膜蛋白PPP，和/或所述外膜蛋白PL。外膜蛋白PPP和外膜蛋白PL作为包被抗原，试剂盒还含有兔波氏杆菌阴性、阳性血清、酶标二抗、洗涤液、酶标抗体稀释液、底物显色液和终止液。

优选地，该试剂盒含有：外膜蛋白PPP和外膜蛋白PL，外膜蛋白PPP和外膜蛋白PL比例为1：1。

本发明还提供了一种兔波氏杆菌抗体间接ELISA检测方法，该方法采用所述的兔波氏杆菌抗体检测试剂盒，1μg/mL的外膜蛋白PPP和1μg/mL的外膜蛋白PL，37℃包被2h；血清稀释度为1：400，作用条件为37℃，1h；5％脱脂乳为封闭液于37℃静置2h；二抗的最佳稀释度为1：5000，作用条件为37℃。

本发明的兔波氏杆菌外膜蛋白及其制备方法和用途，解决了现有兔波氏杆菌病检测方法工作效率低的问题，具有以下优点：

(1)本发明的兔波氏杆菌外膜蛋白，能够用于包被ELISA酶标板，作为检测抗原，用于检测兔波氏杆菌抗体；

(2)本发明的引物，用于PCR扩增，以提取的兔波氏杆菌的DNA为模板，合成兔波氏杆菌外膜蛋白；

(3)本发明的兔波氏杆菌抗体检测试剂盒可以弥补国内兔波氏杆菌抗体检测的不足，仅需要2个小时就能测得结果，且检测灵敏度、准确度高，本发明试剂盒便于操作、使用成本低、稳定性和重复性好，适合大规模推广应用；

(4)本发明的兔波氏杆菌抗体检测试剂盒与感染兔的常见的细菌病之间无交叉反应，具有特异性；

(5)本发明的兔波氏杆菌抗体检测试剂盒板内变异系数的范围在0.52％～2.45％之间，板间变异系数的范围2.82％～6.56％之间，结果均在规定10％范围内，表明重复性良好；

(6)本发明的兔波氏杆菌抗体检测试剂盒含1:1的兔波氏杆菌外膜蛋白PL和兔波氏杆菌外膜蛋白PPP，检测效果明显高于单一蛋白。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明通过构建包含兔波氏杆菌外膜蛋白PL(putative lipoprotein，可能的脂蛋白)和PPP(outermembrance porinproteinprecursor，外膜孔蛋白前体)的表达载体，通过将表达载体转化入感受态细胞，分别得到兔波氏杆菌外膜蛋白PL和PPP表达工程菌；经IPTG(Isopropylβ-D-Thiogalactoside，异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达；将表达产物过镍-NTA琼脂糖树脂层析柱，洗脱得到纯化的兔波氏杆菌外膜蛋白PL和PPP。本发明将纯化的两种蛋白按比例以混合后用于包被ELISA酶标板，作为检测抗原，用于检测兔波氏杆菌抗体。

实验例1兔波氏杆菌外膜蛋白重组表达载体构建

(1)引物设计

针对PL基因序列合成，设计的引物序列：

PL196-F(上游序列)：

5’-GCGCCATGGGTAACGAAGAATCTGTTGAC-3’(SEQ ID NO.5)；

PL196-R(下游序列)：

5’-GCGCTCGAGTCAAGCAGCGTTCAGACCCGGGTCT-3’(SEQ ID NO.6)。

针对PPP基因序列合成，设计的引物序列：

PPP138-F(上游序列)：

5’-GCGCCATGGGTATCGGCTACAACGATGT-3’(SEQ ID NO.3)

PPP138-R(下游序列)：

5’-GCGCTCGAGTCAGTACATAACCATGTTGTCGTA-3’(SEQ ID NO.4)。

上述，下划线处序列“CCATGG”和“CTCGAG”分别是Nco I和Xho I酶切位点。

(2)目的基因片段的扩增与克隆

采用煮沸法提取兔波氏杆菌HB菌株的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，采用PCR扩增靶蛋白基因，PCR反应程序如下表1：

表1合成靶蛋白基因的PCR反应程序

反应完成后，取5μL PCR产物，经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，用UVP凝胶成像系统观察拍照，与标准的DL2000DNAMarker比较大小。

目的基因切胶回收后，与PMD-18T载体(购自TAKARA)连接，并转化top10感受态细胞，采用碱裂解法提取重组质粒，菌液PCR方法验证阳性克隆，经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测(与标准的DL10000DNAMarker比较大小)，PL产物的大小1125bp，PPP产物的大小1164bp。

(3)pET-28a(+)/PL、pET-28a(+)/PPP重组表达载体的构建

将提取的重组质粒和pET-28a(+)质粒分别用Nco I和Xho I限制性内切酶双酶切，25μL双酶切反应体系(5μL，10×KBuffer；1μL，Nco I；1μL，Xho I；5μL，BSA；30μL，质粒；8μL，灭菌水)，双酶切结束后纯化回收目的片段。

混匀后，37℃金属浴双酶切过夜，经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，观察酶切结果，然后用DNA胶回收试剂盒回收目的片段。

经双酶切处理回收后，以T4连接酶(购自TAKARA公司)连接回收的pET-28a(+)载体和目的基因(2μL，酶切处理后的载体pET-28a(+)；6μL，酶切处理后的重组质粒；0.5μL，4DNALigase；1μL，10×Ligation Buffer；0.5μL，灭菌水)，在16℃连接过夜，将连接产物转化入Top10感受态细胞中，将菌液转移至无抗性的LB液体培养基中，在37℃温度下180～200r/min培养1h，使细胞恢复抗性。

取100μL菌液涂于含相应抗生素抗性LB琼脂平板上，于37℃培养箱倒置平板培养12～16h。用碱裂解法提取质粒试剂盒法提取菌液质粒并用30％甘油保存，PCR鉴定为阳性再经酶切鉴定，酶切鉴定为阳性，测序鉴定。

重组质粒和pET-28a(+)载体双酶切后将目的片段插入到pET-28a(+)载体中，得到的重组质粒经双酶切鉴定得到的片段大小分别为5369bp和目的基因大小，与GeneBank上所发表的参考基因序列进行同源性比对，PL达到97％，PPP高达99％。

实验例2重组的兔波氏杆菌外膜蛋白诱导表达

(1)重组蛋白诱导表达

将鉴定为阳性的重组质粒转化至Rosetta感受态细胞，转移菌液至无抗生素的LB液体培养基，在37℃温度下180～200r/min培养1h，使细胞恢复抗性。

将培养液离心、重悬菌体，涂于含卡那抗性的平板，倒置平皿于37℃培养12～16h。

挑取单个菌落，接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，在200r/min，37℃下培养过夜后，以1:100比例接种于含有卡那霉素的LB大量液体培养基中，37℃培养，直至对数生长期(OD₆₀₀为0.6～0.8)，取出部分菌液作对照，其余菌液加入IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导培养3h。

取出100μL诱导菌液，将诱导前后的菌液10000r/min离心1min，取出上清，将用适量的PBS重悬沉淀两次，加入等体积的2×SDS上样缓冲液煮沸10min。经SDS-PAGE电泳检测目的蛋白是否表达。

(2)重组蛋白的亲和层析纯化

高压500mL LB培养基，以1:100加入含有阳性重组质粒的种子液，37℃，200r/min摇菌4h，加入IPTG诱导剂，诱导表达3h，之后离心去掉上清，用38mL的bingding buffer(20mM咪唑；10mM Tris-HCl(pH7.9)；0.5M NaCl)重悬沉淀，之后超声裂解菌体，直至菌液澄清，将超声后的菌液4℃，8000r/min离心10min。

将超声澄清的菌液进行亲和层析，具体如下：

1)首先用0.2M EDTA/0.5MNaCl(pH8.0)洗管(A管)，之后洗柱子，洗20～30分钟，柱子由蓝变白，离子曲线上升平稳后，水洗20～30分钟至离子浓度降为0；

2)挂Ni：用0.2M的NiCl₂，离子曲线平稳后水洗至离子浓度为零；

3)平衡柱子：用binding buffer洗柱子，至离子曲线平稳；

4)上样：先UV置0，上样30min后，用binding buffer洗至UV50以下，之后分别用10mM、20mM、50mM、100mM、125mM的咪唑洗镍柱，当UV值升到100以上，接样；

5)完毕后，用SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化的效果。

切胶纯化重组蛋白，具体如下：

1)将亲和层析后蛋白样品用1.5mm的梳子制孔，进行SDS-PAGE，电压为恒压80V；

2)电泳结束后用去离子水冲洗凝胶，于微波炉中加热30s；

3)室温摇床轻摇5min；

4)重复步骤(2)和步骤(3)两次；

5)弃掉去离子水，将凝胶加入预冷的0.25M的KCl溶液中，染色30～60s可见无色透明的蛋白条带；

6)用一干净的手术刀片将目的条带切割下来放入离心管4℃保存备用。

将4℃保存的目的蛋白凝胶，用电洗脱仪将目的蛋白从凝胶中洗脱下来，之后测定蛋白浓度，-70℃保存。将电洗脱回收的目的蛋白进行适当倍数的稀释，采用改良型BCA法蛋白质浓度测定试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)测定目的蛋白浓度。

成功表达出了兔波氏杆菌rPL蛋白大小为41.3Da、rPPP蛋白大小为41.5Da，表达蛋白的大小与预期相符。BCA法蛋白质浓度测定试剂盒测定rPL蛋白浓度为1.1mg/mL、rPPP蛋白浓度为0.93mg/mL。

实验例3兔波氏杆菌抗体间接ELISA检测方法

(1)确定最佳反应条件

采用方阵滴定法确定抗原抗体最佳稀释度，用碳酸盐缓冲液将两种重组蛋白PL、PPP(1：1)梯度稀释为2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL，100μL/孔，4℃过夜。

然后，进行封闭，采用5％脱脂乳封闭，300μL/孔，37℃，2h。弃去封闭液，洗涤酶标板，波氏杆菌阴阳性血清依次做1：50，1：100，1：200，1：400，1：800，1：1600倍比稀释后，100μL/孔，37℃孵育。

在孵育结束后，加稀释好的二抗于37℃孵育一定的时间，每次作用完成后PBST洗涤3次，3min/次。而后，加入TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)底物溶液显色，然后用0.5MH₂SO₄，100μL/孔，以终止反应。于酶标仪上测定OD₄₅₀值。

洗涤酶标板，每孔加100μL工作浓度的酶标二抗IgG，37℃孵育。弃去二抗，洗涤酶标板，每孔加100μL底物缓冲液，37℃避光显色。而后，用0.5M H₂SO₄，100μL/孔终止反应。于酶标仪上测定OD₄₅₀。

比较各对应的阴阳性血清的OD₄₅₀值与P/N值，从而确定最佳反应条件为：

1μg/mL两种重组蛋白PL、PPP抗原(1：1)，37℃包被2h；血清稀释度为1：400，作用条件为37℃，1h；5％脱脂乳为封闭液于37℃静置2h；二抗的最佳稀释度为1：5000，作用条件为37℃，60min；显色条件为37℃避光作用10min；阴阳性临界值为0.26。

该方法特异性强，敏感性高，重复性好，可为临床检测兔波氏杆菌提供有效准确的技术手段。

表2抗原和血清最佳稀释度的测定结果

表3血清不同反应时间的检测结果

表4酶标二抗最佳作用时间的选择结果

表5阴性血清临界值的检测结果

上述21份阴性血清，在1：400稀释时平均OD₄₅₀值为0.24，标准差为0.01，阴性血清的临界值＝平均数+2*标准差，临界值为0.26。

实验例4敏感性试验

将血清从1：2开始倍比稀释至1：216，测定OD₄₅₀值，如下表6所示，随着稀释的不断增加，OD₄₅₀值越来越小，并且呈一个趋势变化，本实验结果显示，与阴性血清临界值比较，敏感性试验重复三次，该方法的最低检测稀释度为1:3200。

表6不同稀释度下的OD₄₅₀值表

实验例5交叉反应试验

用建立间接ELISA方法对不同的阳性血清进行检测，其结果见表7。结果显示，含兔支气管败血波氏杆菌重组蛋白抗原的阳性血清OD₄₅₀值大于规定的吸收值，而巴氏杆菌阳性血清和兔瘟阳性血清均呈阴性，从而说明用兔支气管败血波氏杆菌纯化的两种重组蛋白PL、PPP抗原抗原包被后，与感染兔的常见的细菌病之间无交叉反应，说明所建立的方法具有特异性。

表7不同血清检测结果

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。

实验例6两种重组蛋白单独或混合包被比较试验

分别重组蛋白PL、PPP抗原单独包被或二者1:1混合包被，用建立间接ELISA方法对标准阳性血清进行检测，结果表明rPPP的P/N值好于rPL，两种蛋白1:1比例混合包被时，抗原性明显高于单一蛋白。

表8兔支气败血波氏杆菌血清阻断试验结果

实验例7重复性试验

用间接ELISA方法测定10份兔支气管败血波氏杆菌阳性血清，血清作1：400稀释后，在同一板上和不同板上分别进行ELISA测定，根据测得的OD₄₅₀值计算标准差、平均OD₄₅₀值，计算板内、板间变异系数(CV)，变异系数为检测结果的标准差与平均值的百分比。结果表明，板内变异系数的范围在0.52％～2.45％之间，板间变异系数的范围2.82％～6.56％之间，本试验的结果均在规定10％范围内，说明所建立的方法其重复性良好。

实验例8符合性试验

本试验用建立的ELISA方法检测某鼻炎发病兔场分离到的50份兔的血清，比较50份血清的数据，发现有38份血清样品检测为阳性，传统波氏杆菌凝集试验检测35份阳性，凝集试验检测的35份阳性血清样本用建立的ELISA方法检测均为阳性。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 一种兔波氏杆菌外膜蛋白及其制备方法和用途

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 417

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atgggtatcg gctacaacga tgtcgatttc aaggtgaaag gcgctaacgc cgacggcagc 60

gacttcaagt acaaccacag ccgcttcggc atgatcaacg gcgtgcagaa cggttcgcgc 120

tggggtctgc gtggtacgga agatctgggt gacggcctgc aagctgtgtt ccaactggaa 180

tcgggcttca actcgggcaa cggtaactcg gcccaagacg gccgcctgtt cggtcgccaa 240

gccaccatcg gtctgcaaag cgaaagctgg ggccgtctgg acttcggtcg ccaaaccaac 300

atcgcctcga agtacttcgg ctcgatcgat ccgttcggcg ctggcttcgg tcaagccaac 360

atcggcatgg gcatgagcgc gatgaacacc gttcgctacg acaacatggt catgtac 417

<210> 2

<211> 591

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgggtaacg aagaatctgt tgactacaaa tctacccgtc gtggtgaccc gctgtctatc 60

ccgccggacc tgacccaggc taacaacgac ccgcgttaca aagctccggc ttctggtacc 120

gctacctact ctcagttcca gcagcagggt ctgcagcagc aggcttctgc tggtcagaac 180

accaacgttc tgccggaacg tgctgacatg cgtgttgaac gtgacggtga cctgcgttgg 240

ctggttatcg aacgtccgcc ggaacagctg ttcccgaaag ttgttgactt ctggaccgac 300

acaggtttta ccgtaagcgt taacaacccg caggctggta tcatcgaaac cgactgggct 360

gaaaaccgtg ctaaaatccc ggaatcttgg ctgcgtcagg ttctgggttc tgttctggaa 420

accgcttggg actctggtga acgtgaaaaa ttccgtaccc gtgttgaacg tgttaacggt 480

cacaccgaaa tctacatcac ccacaaccag atgctggaaa aacgtgttgg ttctgacggt 540

ggtcaggttc agtggaccca cggtaaagaa gacccgggtc tgaacgctgc t 591

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gcgccatggg tatcggctac aacgatgt 28

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gcgctcgagt cagtacataa ccatgttgtc gta 33

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gcgccatggg taacgaagaa tctgttgac 29

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gcgctcgagt caagcagcgt tcagacccgg gtct 34

Claims

1.一种兔波氏杆菌外膜蛋白，其特征在于，该外膜蛋白为外膜蛋白PPP或外膜蛋白PL，所述外膜蛋白PPP包含：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述外膜蛋白PL包含：如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。

2.用于制备如权利要求1所述的兔波氏杆菌外膜蛋白的引物序列，其特征在于，所述外膜蛋白PPP的引物序列包含：如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述外膜蛋白PL的引物序列包含：如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

3.一种如权利要求1所述的兔波氏杆菌外膜蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(1)以提取的兔波氏杆菌HB菌株的基因组DNA为模板，以权利要求2中所述的外膜蛋白PPP的引物序列或外膜蛋白PL的引物序列作为引物，采用PCR分别扩增靶蛋白PPP或PL的基因；

(4)鉴定步骤(3)获得的重组质粒，将阳性重组质粒转化至Rosetta感受态细胞，诱导剂IPTG诱导重组蛋白PPP或PL的表达；

所述重组蛋白PPP为如权利要求1中所述的外膜蛋白PPP；所述重组蛋白PL为如权利要求1中所述的外膜蛋白PL。

4.根据权利要求3所述的兔波氏杆菌外膜蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(2)和(3)中，所述感受态细胞为top10感受态细胞。

5.根据权利要求3所述的兔波氏杆菌外膜蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述检验阳性克隆采用菌液PCR方法。

6.根据权利要求3所述的兔波氏杆菌外膜蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，以T4连接酶连接，将连接产物转化入Top10感受态细胞中，将菌液转移至无抗性的LB液体培养基中，37℃，180～200r/min培养，使细胞恢复抗性，取菌液涂于含相应抗生素抗性LB琼脂平板上，于37℃培养12～16h，用试剂盒法提取菌液质粒。

7.根据权利要求3所述的兔波氏杆菌外膜蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，将阳性重组质粒转化至Rosetta感受态细胞，转移菌液至无抗生素的LB液体培养基，37℃，180～200r/min培养，使细胞恢复抗性，将菌液涂于含卡那抗性的平板，倒置平皿于37℃培养12～16h；接种于含卡那霉素的LB液体培养基中培养，直至对数生长期，加入IPTG诱导培养。

8.一种兔波氏杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有如权利要求1中所述的外膜蛋白PPP，和/或所述外膜蛋白PL。

9.根据权利要求8所述的兔波氏杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有：外膜蛋白PPP和外膜蛋白PL，外膜蛋白PPP和外膜蛋白PL比例为1：1。

10.一种兔波氏杆菌抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，该方法采用如权利要求8或9所述的兔波氏杆菌抗体检测试剂盒，1μg/mL的外膜蛋白PPP和1μg/mL的外膜蛋白PL，37℃包被2h；血清稀释度为1：400，作用条件为37℃，1h；5％脱脂乳为封闭液于37℃静置2h；二抗的最佳稀释度为1：5000，作用条件为37℃。