CN105445473B - 一种牛布鲁氏菌elisa检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种牛布鲁氏菌ELISA检测试剂盒，属于蛋白质工程技术领域。本发明的试剂盒以牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28混合抗原作为ELISA试剂盒的包被抗原，各抗原浓度分别为1μg/ml，按照体积比1:1:1进行混合得到混合抗原，血清稀释度为1:200，酶标二抗稀释度为1:20000，通过间接ELISA方法检测牛布鲁氏菌，本发明试剂盒具有特异性强，灵敏度高，准确率高，操作简便，重现性好的特点，具有良好的市场应用前景。

Description

一种牛布鲁氏菌ELISA检测试剂盒
技术领域
本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体地，涉及一种以牛布鲁氏菌外膜蛋白为检测抗原的牛布鲁氏菌ELISA检测试剂盒。
背景技术
布鲁氏菌病是一种在世界范围内影响严重的人畜共患病。布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的，主要侵害动物的生殖系统，引起流产和不孕不育，带来严重的经济损失。确诊布病的诊断方法是对致病微生物的分离培养鉴定。
目前在血清学诊断方法上，大部分都是基于检测抗布鲁菌脂蛋白(脂多糖，LPS)的抗体，虽然虎红平板凝集和补体结合实验在世界范围内最认可和接受的测试，但是由于实验结果有交叉性，实验操作步骤繁琐、费时等诟病，在实际操作中应用较少。ELISA检测方法易于操作，特异性、灵敏性高，在布鲁菌血清学诊断中很有前景，但是基于布鲁菌全菌作为诊断抗原，不可避免出现假阳性、假阴性，造成误判，并且基于检测布鲁氏菌LPS的ELISA方法不能区分自然感染和疫苗感染的缺陷。因此很有必要研发一种既不使用全菌也不使用脂蛋白LPS的诊断抗原。
外膜蛋白OMP，不仅是布鲁氏菌结构蛋白和功能蛋白，而且也是布鲁氏菌重要的抗原和毒力因子，对维持布鲁氏菌细胞膜的完整性和选择性至关重要。然而遗憾的是在布鲁氏菌如何生存和致病力感染中，外膜蛋白OMP起到的作用尚未被人知晓。外膜蛋白OMP28已经被全面的研究了，在作为ELISA诊断抗原上具有较好的反应原性和特异性，也可以作为候选疫苗。但将OMP19、OMP22、OMP28多种蛋白混合后用于布鲁氏菌的诊断还未有研究报道。
pCold-TF载体在His-tag序列和多克隆位点之间插入了Trigger Factor(TF)基因。Trigger Factor是一种原核细胞的核糖体结合伴侣蛋白，能够促进新生肽链的共翻译蛋白的可溶性。通过TF的可溶性标记功能和分子伴侣作用，可以使一些难以表达的基因获得更高概率的可溶性表达；pCold TF载体的启动子为冷激蛋白CspA(Cold shockproteins)，决定着目的基因表达过程中要采取15℃左右的低温培养。低温培养能降低蛋白质合成的速率，改变多肽折叠的动力学，从而导致正确折叠的蛋白增加，这是pCold TF载体的优点之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牛布鲁氏菌ELISA检测试剂盒。
本发明通过以下技术方案实现：构建包含牛布鲁氏菌外膜蛋白基因OMP19、OMP22、OMP28的表达载体，通过将三种基因的表达载体分别转化入感受态细胞，得到牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28表达工程菌；经IPTG诱导表达；将表达产物过镍-NTA琼脂糖树脂层析柱，洗脱得到纯化的牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28。然后将纯化的三种蛋白按比例以混合后用于包被ELISA酶标板，作为检测抗原，用于检测牛布鲁氏菌。
本发明提供一种牛布鲁氏菌ELISA检测试剂盒，以牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28混合抗原作为ELISA酶标板的包被抗原。
进一步地，本发明的试剂盒中，所述包被抗原是将浓度均为1μg/ml的OMP19、OMP22、OMP28三种蛋白按照体积比1:1:1混合得到。
本发明的试剂盒还含有马血清，牛布鲁氏菌阴性、阳性血清，酶标二抗，洗涤液，酶标抗体稀释液，底物显色液，终止液。
本发明试剂盒所使用的牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19通过以下方法制备得到：合成OMP19基因，序列如SEQ ID NO.1所示；将OMP19基因与pCold-TF载体分别用BamHI和XhoI双酶切，将酶切后的OMP19基因与pCold-TF载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到重组表达载体pCold-TF/OMP19；将重组表达载体pCold-TF/OMP19转化入感受态细胞，制得牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19表达工程菌；经IPTG诱导表达；将表达产物过镍-NTA琼脂糖树脂层析柱，洗脱得到纯化的牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19。
所述OMP19基因是以布鲁氏菌DNA为模板，SEQ ID NO.7-8所示的引物进行PCR扩增得到的。
Fomp19 5’-cgcggatccATGGGAATTTCAAAAGCAAG-3’(SEQ ID NO.7)
Romp19 5’-ccgctcgagTCAGCGCGACAGCGTCAC-3’(SEQ ID NO.8)
PCR反应条件为：95℃，5min；95℃，30s，57℃，45s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min，4℃保存。1.5％琼脂糖凝胶回收目的基因片段。
本发明试剂盒所使用的牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP22通过以下方法制备得到：合成OMP22基因，序列如SEQ ID NO.2所示；将OMP22基因与pCold-TF载体分别用BamHI和XhoI双酶切，将酶切后的OMP22基因与pCold-TF载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到重组表达载体pCold-TF/OMP22；将重组表达载体pCold-TF/OMP22转化入感受态细胞，制得牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP22表达工程菌；经IPTG诱导表达；将表达产物过镍-NTA琼脂糖树脂层析柱，洗脱得到纯化的牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP22。
所述OMP22基因是以布鲁氏菌DNA为模板，SEQ ID NO.9-10所示的引物进行PCR扩增得到的。
Fomp22 5’-cgcggatccATGTTCAAGCGTTCTATC-3’(SEQ ID NO.9),
Romp22 5’-ccgctcgagCTAGAATTTGTAGTTCAG-3’(SEQ ID NO.10)；
PCR反应条件为：95℃，5min；95℃，30s，57℃，45s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min，4℃保存。1.5％琼脂糖凝胶回收目的基因片段。
本发明试剂盒所使用的牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP28通过以下方法制备得到：合成OMP28基因，序列如SEQ ID NO.3所示；将OMP28基因与pCold-TF载体分别用BamHI和XhoI双酶切，将酶切后的OMP28基因与pCold-TF载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到重组表达载体pCold-TF/OMP28；将重组表达载体pCold-TF/OMP28转化入感受态细胞，制得牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP28表达工程菌；经IPTG诱导表达；将表达产物过镍-NTA琼脂糖树脂层析柱，洗脱得到纯化的牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP28。
所述OMP28基因是以布鲁氏菌DNA为模板，SEQ ID NO.11-12所示的引物进行PCR扩增得到的。
Fomp28 5’-cgcggatccATGAACACTCGTGCTAGC-3’(SEQ ID NO.11),
Romp28 5’-ccgctcgagTTACTTGATTTCAAAAACG-3’(SEQ ID NO.12)。
下划线出分别为BamH I、Xho I酶切位点。
PCR反应条件为：95℃，5min；95℃，30s，57℃，45s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min，4℃保存。1.5％琼脂糖凝胶回收目的基因片段。
本发明提供了牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28的混合抗原在制备检测牛布鲁氏菌试剂盒中的应用。
本发明的ELISA检测试剂盒可以弥补国内牛布鲁氏菌检定方法的不足。仅需要2个小时就能测得结果(IDEXX试剂盒需要4小时左右才能测得结果)，且检测灵敏度、准确度高，运用本发明检测试剂盒检测牛布鲁氏菌最低检测限为血清1:1600。在建立混合抗原ELISA检测方法过程中，为降低背景值，本发明使用了无关血清，即10％的马血清作为封闭液，较常用的封闭液5％脱脂乳、1％BSA，能够大大降低背景值。本发明试剂盒便于操作、使用成本低(本试剂盒耗材不超过500元，而购买IDEXX试剂盒的花费为3000元)、稳定性和重复性好，适合大规模推广应用。
附图说明
图1为三种牛布鲁氏菌外膜蛋白基因的PCR扩增结果图，其中M为DL2000 Marker，泳道1、2、3分别为OMP28、OMP22、OMP19基因的PCR扩增电泳结果。
图2重组载体酶切鉴定图，其中M为DL2000 Marker，泳道1、2、3分别为pCold-TF/OMP19、pCold-TF/OMP22、pCold-TF/OMP28载体的双酶切产物。
图3纯化的牛布鲁氏菌外膜蛋白SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白分子质量标准，泳道1、2、3分别为重组蛋白OMP19、OMP22、OMP28。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
以下实施例的材料和试剂情况如下：牛布鲁氏菌A544株和牛布病标准阴阳性血清由中国兽医药品监察所提供，被检牛血清来自天津某养殖场96份，大肠埃希氏菌DH5α和BL21(DE3)感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，pCold-TF载体由中国检验检疫科学研究院动检所保存。
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶BamH I、Xhol I、T4DNA连接酶、诱导剂IPTG购自TaKaRa公司；封闭用马血清购自Gibico公司，酶标二抗HRP标记的羊抗牛IgG购自美国Rockland公司；PageRulerPrestained Protein Ladder经典蛋白marker(10-170kDa)、BCA蛋白浓度检测试剂盒购自美国Thermo Scientific公司；NI-NTA Agrose购自德国Qiagen公司；IDEXX牛布鲁菌抗体检测(血清)试剂盒购自美国爱德士生物科技公司；TMD单组份显色试剂盒(可溶型)购自北京索莱宝生物科技有限公司。其他试剂均为分析纯。
实施例1牛布鲁氏菌外膜蛋白重组表达载体构建
1、引物设计与合成
根据GenBank上的发布的牛布鲁氏菌外膜蛋白基因序列OMP19(登录号为L27997)、OMP22(登录号为AY484562)、OMP28(登录号为JQ865997)，利用primer5.0软件分别设计上下游引物，将设计好的引物送至上海生工生物工程技术有限公司合成。引物序列如下：
Fomp19 5’-cgcggatccATGGGAATTTCAAAAGCAAG-3’,
Romp19 5’-ccgctcgagTCAGCGCGACAGCGTCAC-3’；
Fomp22 5’-cgcggatccATGTTCAAGCGTTCTATC-3’,
Romp22 5’-ccgctcgagCTAGAATTTGTAGTTCAG-3’；
Fomp28 5’-cgcggatccATGAACACTCGTGCTAGC-3’,
Romp28 5’-ccgctcgagTTACTTGATTTCAAAAACG-3’。
下划线出分别为BamH I、Xho I酶切位点。
2、目的基因片段的扩增
以布鲁氏菌A544株DNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段，PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃复性45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃结束反应。反应结束后用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并观察结果，用胶回收试剂盒并按说明书步骤，切胶回收目的基因片段。
PCR扩增产物，经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小分别约为534bp、639bp、753bp，与预期目的片段大小相符(见图1)。
3、pCold-TF/OMP19、pCold-TF/OMP22、pCold-TF/OMP28重组表达载体的构建
将经胶回收试剂盒纯化回收的OMP19、OMP22、OMP28基因片段与pCold-TF载体基因片段分别用BamH I、Xho I双酶切。酶切产物在T4DNA连接酶的作用下16℃连接过夜，然后转化至E.coli DH5α感受态细胞中，涂至带有氨苄青霉素抗性的LB培养基中，37℃恒温箱培养过夜；随机挑取5个单克隆菌落接种于氨苄青霉素抗性的LB培养基中，200r/min，37℃震荡培养过夜，试剂盒提取菌液质粒并用30％甘油保菌，PCR鉴定，鉴定为阳性质粒再经酶切鉴定，酶切鉴定为阳性的质粒送至北京华大基因公司测序。
经酶切鉴定，凝胶电泳检测得分别到3对大小分别为5769bp、534bp(碱基序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)；5769bp、639bp(碱基序列如SEQ IDNO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)；5769bp、753bp(碱基序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)的预期条带(见图2)。对应的阳性克隆菌，公司反馈的测序结果在Genbank上BLAST，基因序列分别与登录的OMP19、OMP22、OMP28基因符合率达到100％。
实施例2牛布鲁氏菌外膜重组蛋白的诱导表达与纯化
1、重组蛋白的诱导与表达
将实施例1的测序基因和读码框正确的的重组子质粒pCold-TF/OMP19、pCold-TF/OMP22、pCold-TF/OMP28分别转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上培养。将含重组质粒的菌液按1％的量接种在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养2h左右，至OD600值为0.6-0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol/L，16℃培养24h后收菌。菌液在4℃条件下10000g离心15min，然后以PBS缓冲液重悬沉淀；在冰浴条件下超声处理15min至液体澄清，再在4℃条件下10000g离心15min，收集上清液和沉淀，12％SDS-PAGE鉴定蛋白是否可溶性表达。
2、重组蛋白的亲和层析纯化
按照QIAGEN公司的NI-NTA agrose试剂说明书操作，每1ml的NI-NTA agrose填料结合蛋白的载量为5-10mg，使用前先将其在4℃条件下2000*g离心20min，以去除NI-NTAagrose填料中的酒精，再用Tris-Hcl buffer(pH8.0)将其平衡，将粗蛋白液与之在4℃充分结合。可在Tris-Hcl buffer(pH8.0)中添加低浓度咪唑和0.01％Triton 114以降低蛋白非特异性结合。蛋白与NI-NTA agrose填料结合充分后，先以10mmol/L浓度咪唑洗脱至考马斯亮蛋白定量检测液检测不变蓝色，再以250mmol/L浓度咪唑洗脱蛋白，同样洗至蛋白定量检测液检测几乎不变色，收集洗脱液。洗脱液以30kD蛋白分子量截留的超滤离心管浓缩，同时至少更换4次Tris-Hcl buffer(pH8.0)液混匀后离心以降低浓缩蛋白液中咪唑的浓度。纯化后的重组蛋白用BCA试剂盒测浓度后，分装保存于-80℃。
在诱导纯化重组蛋白的过程中分别取相对应的样品，加入4X蛋白质上样缓冲液，煮沸7-8min各取10μl上样，在上层胶中以120V电压电泳10min至样品压成一条直线，在下层胶中增压至220V电泳40min。将SDS-PAGE胶在考马斯亮蓝染色夜中染色过夜，在洗脱液中洗脱至背景颜色变浅后拍照分析。结果表明，诱导表达的重组蛋白rOMP19、rOMP22、rOMP28均为可溶性表达，经NI-NIA agrose亲和层析纯化后获得纯度较高的重组蛋白。pCold-TF载体标签大小为48KD，rOMP19、rOMP22、rOMP28的大小分别为17kD、22kD、26kD，见图3，SDS-PAGE图中蛋白条带大小与预期的相符合。BCA试剂盒检测重组蛋白rOMP19、rOMP22、rOMP28浓度分别为0.15mg/ml、0.3mg/ml、0.6mg/ml。
实施例3牛布鲁氏菌ELISA检测方法的建立
1、间接ELISA方法程序的建立
用NaHCO3(pH＝9.6)缓冲液稀释上述纯化的重组蛋白rOMP19、rOMP22、rOMP28，分别将浓度稀释成1μg/ml，再将各重组抗原按1:1:1体积比混合作为包被抗原，每孔加样100μl，37℃包被96孔ELISA板2h。每孔200μl体积10％马血清封闭45min，PBST洗涤五次。阴性、阳性血清(中国药监所)分别按1:50、1:100、1:200、1:400进行稀释，每孔加样100μl，37℃孵育30min，PBST洗涤五次。酶标二抗(2mg/ml)以PBST 1：10 000、1：20 000、1：40 000稀释稀，每孔加入100μl，37℃孵育30min，PBST洗涤五次。底物TMB 100μl/孔避光显色10min，2M硫酸50μl/孔终止反应后，酶标检测仪测定OD450nm值，分析比较P/N值(P/N＝阳性血清450nm值/阴性血清450nm值)。实验结果显示三种重组抗原混合rOMPs建立ELISA检测牛布鲁氏菌ELISA方法中，混合前各单一抗原的浓度分别为1μg/ml，三种蛋白等体积进行混合，待检血清和阳性血清稀释度为1:200，酶标二抗的稀释度为1:20 000。以下表1-表9是本发明间接ELISA检测方法中各参数的优化过程与最佳参数选择结果。
表1抗原包被浓度与酶标二抗最适反应浓度的确定
表2一抗稀释倍数的选择结果
表3包被条件的选择结果
表4封闭液的选择结果
表5封闭时间的选择结果
表6一抗作用时间的选择结果
表7酶标二抗反应时间的选择结果
表8显色液和显色时间的选择结果
表9终止条件的选择结果
2、重复性试验
按上述确定的最佳检测条件对阳性及阴性血清各一份重复检测10次，计算变异系数(CV值)，CV值等于10次检测OD450nm值的标准差除以均值。结果显示，同一份牛布鲁氏菌阳性血清重复检测10次，变异系数(CV)值为9.8％；同一份牛布鲁氏菌阴性血清重复检测10次，变异系数(CV)值为10.2％。
3、灵敏度试验
按上述试验确定的最佳检测条件对阳性及阴性血清各一份作1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200倍比稀释，进行检测，分析比较P/N值。
牛布鲁氏菌阳性血清的稀释度为：1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200之间。血清稀释度不能太低，在实验中发现血清稀释度为1:50的时候，阳性血清OD值已接近2，现有技术认为OD值控制在1左右为佳。本实施例结果发现血清稀释到1:1600时仍能检出阳性。
表10 rOMPs-ELISA灵敏度试验结果
4、临界值(cut off value)的确定
按上述试验确定的最佳检测条件检测30份由IDEXX试剂盒反复检测确定为阴性的血清样本，计算出平均OD450nm值(X)和标准差OD450nm值(SD)，参照吴保成等科学推导ELISA实验临界值的方法，将阴阳性临界值定为(X+2.2SD)，即当血清OD450nm值≧(X+2.2SD)时判为阳性，否则为阴性。
30份IDEXX试剂盒检测为阴性的牛血清OD450nm平均值(X)为0.25，标准差(SD)为0.10，所以临界值为0.47。当检测的血清OD450nm值≧0.47时，判定为阳性；当检测血清OD450nm值≦0.47时，判定为阴性。
5、混合抗原ELISA法检测血清样本
按上述试验确定的最佳检测条件分别检测经IDEXX试剂盒筛选的60份阳性牛血清和30份阴性牛血清，同时设置阳性对照和阴性对照各两孔。
比较ELISA检测血清OD值和P/N值结果(见表11)，三种重组蛋白中，OMP28的抗原性相对较好，OMP19的抗原性相对较次。三种重组蛋白混合按比例定量包被时，抗原性明显强于单一蛋白。rOMPs-ELISA与IDEXX-ELISA试剂盒检测结果比较：60份阳性血清，中54份阳性，6份假阳性。30份阴性血清中，28份阴性，2份假阳性。结果见表12。
表11三种蛋白包被结果比较
表12 rOMPs-ELISA与IDEXX-ELISA试剂盒检测结果比较
6、特异性和总符合率
对小肠结肠耶尔森菌、大肠杆菌、沙门氏菌等交叉反应强烈的诊断血清与布鲁氏菌阴、阳性血清按优化好的稀释度稀释做检测以验证本实施例方法的特异性，结果见13。
表13 rOMPs-ELISA特异性试验结果
根据IDEXX-ELISA试剂盒检测结果为标准，本发明建立的混合抗原rOMPs-ELISA法检测60份阳性血清、30份阴性血清结果为：60份阳性血清中出现了4份假阴性，敏感性为90％；30份阴性血清中出现了2份假阳性，特异性为93.3％，总符合率为91.1％。结果见表14。
表14 rOMPs-ELISA检测96份血清结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种牛布鲁氏菌ELISA检测试剂盒，其特征在于，以牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28混合抗原作为ELISA酶标板的包被抗原；
所述包被抗原是将浓度均为1μg/ml的OMP19、OMP22、OMP28三种蛋白按照体积比1:1:1混合得到；
所述牛布鲁氏菌ELISA检测试剂盒还含有10％马血清作为封闭液，另外含有牛布鲁氏菌阴性、阳性血清，酶标二抗，洗涤液，酶标抗体稀释液，底物显色液，终止液；
牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19通过以下方法制备得到：合成OMP19基因，序列如SEQ IDNO.1所示；将OMP19基因与pCold-TF载体分别用BamHI和XhoI双酶切，将酶切后的OMP19基因与pCold-TF载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到重组表达载体pCold-TF/OMP19；将重组表达载体pCold-TF/OMP19转化入感受态细胞，制得牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19表达工程菌；经IPTG诱导表达；将表达产物过镍-NTA琼脂糖树脂层析柱，洗脱得到纯化的牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19；
所述OMP19基因是以布鲁氏菌DNA为模板，SEQ ID NO.7-8所示的引物进行PCR扩增得到的；
牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP22通过以下方法制备得到：合成OMP22基因，序列如SEQ IDNO.2所示；将OMP22基因与pCold-TF载体分别用BamHI和XhoI双酶切，将酶切后的OMP22基因与pCold-TF载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到重组表达载体pCold-TF/OMP22；将重组表达载体pCold-TF/OMP22转化入感受态细胞，制得牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP22表达工程菌；经IPTG诱导表达；将表达产物过镍-NTA琼脂糖树脂层析柱，洗脱得到纯化的牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP22；
所述OMP22基因是以布鲁氏菌DNA为模板，SEQ ID NO.9-10所示的引物进行PCR扩增得到的；
牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP28通过以下方法制备得到：合成OMP28基因，序列如SEQ IDNO.3所示；将OMP28基因与pCold-TF载体分别用BamHI和XhoI双酶切，将酶切后的OMP28基因与pCold-TF载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到重组表达载体pCold-TF/OMP28；将重组表达载体pCold-TF/OMP28转化入感受态细胞，制得牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP28表达工程菌；经IPTG诱导表达；将表达产物过镍-NTA琼脂糖树脂层析柱，洗脱得到纯化的牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP28；
所述OMP28基因是以布鲁氏菌DNA为模板，SEQ ID NO.11-12所示的引物进行PCR扩增得到的。
2.牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28的混合抗原在制备检测牛布鲁氏菌试剂盒中的应用；
在所述检测牛布鲁氏菌试剂盒中，以所述牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28的混合抗原作为ELISA酶标板的包被抗原；
所述包被抗原是将浓度均为1μg/ml的OMP19、OMP22、OMP28三种蛋白按照体积比1:1:1混合得到；
所述牛布鲁氏菌ELISA检测试剂盒还含有10％的马血清，以及牛布鲁氏菌阴性、阳性血清，酶标二抗，洗涤液，酶标抗体稀释液，底物显色液，终止液。
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