CN103172752A - 牛肺炎支原体的诊断试剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物诊断医学，特别涉及牛肺炎支原体的诊断技术，具体为多表位融合抗原，含有如SEQ ID NO：1所示，或氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；其在制备牛肺炎支原体诊断试剂中的应用；该诊断试剂可作为间接ELISA试剂盒的固相载体包被抗原，与之特异性抗体结合后，并加入辣根过氧化物酶偶联的抗-牛IgG抗体进行孵育，产生显色反应，显色程度与待测样本中抗牛肺炎支原体抗体的量成正比；本方法操作简便，无需依靠复杂的仪器设备，对实验室条件、以及实验人员的技术要求不高，检测成本相对较低，适合于基层和养殖场大规模开展；本多表位融合抗原制作成本低，适合大规模应用；灵敏度和特异性高，批间差异小，采用多表位作为标靶，其检测结果一致性高。

Description

牛肺炎支原体的诊断试剂及应用

技术领域

本发明涉及动物诊断医学，特别涉及牛肺炎支原体的诊断技术。

背景技术

牛肺炎支原体(Mycoplasma bovis，MB)属于原核生物界，厚壁菌门，柔膜体纲，支原体目，支原体科，支原体属，是目前发现最小和最简单的能自主复制的原核生物。60年代首次有报道称牛肺炎支原体引起牛发生肺炎和乳腺炎，在这之后人们发现MB还可导致牛发生关节炎、角膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产等多种疾病。国外报道每年由牛呼吸道疾病引起的经济损失其中至少四分之一是由牛肺炎支原体引起，特别是在牛运输环节，全群发病率高达90％以上，持续时间长达三个月以上，严重影响牛的生长发育。目前，牛肺炎支原体疫苗并未得到推广的情况下，早诊断早隔离是控制牛肺炎支原体群体感染的有效措施。因此，对牛肺炎支原体有效的诊断方法将直接影响到养牛业的经济效益。

常见的牛肺炎支原体的临床检测方法：生物学检测、免疫学检测、以及分子生物学检测。牛肺炎支原体在机体内兼性厌氧、对营养要求极其严格，培养时须从体外摄取如胆固醇、脂肪酸、核糖前体、维生素等大分子物质，若病料保存不当则实验室常规分离鉴定十分困难，故实验室生物学检测的方法临床并不适用。分子生物学检测操作复杂繁琐，对仪器设备、实验室条件、以及实验人员的技术要求高，检测成本亦相应增加，也难以在基层和养殖场大规模开展。所以，免疫学检测抗牛肺炎支原体抗体是目前诊断牛肺炎支原体感染的主要措施。

免疫学方法检测抗体最常见的检测模式是间接酶联免疫分析(ELISA)。而决定间接ELISA是否有效的关键在于抗原的选择。间接ELISA检测病原体抗体所用的抗原按照其来源和性质可分为三类：全毒、重组表达蛋白、合成肽，合成肽的制备成本较高，所以不适合大规模生产应用，因此间接ELISA检测抗体所用的抗原主要是全毒和基因重组表达的病原体蛋白。但以全毒作为包被抗原同时也具有培养条件要求高、有散毒隐患、批间差异大、具有一定的非特异性反应的缺点，尤其是对于牛肺炎支原体，难以控制的体外培养条件限制了全毒作为捕获抗原的应用。

重组表达蛋白作为捕获抗原的优点在于目的蛋白的反应特异性高，且一旦技术路线成熟，可大量稳定的制备，成本低，适合工业化生产的应用。目前已经商品化的牛肺炎支原体抗体检测试剂盒或已经报道的牛肺炎支原体抗体检测方法均为利用基因重组技术制备的病原体蛋白，主要分为两类——膜黏附蛋白(Variable surface Lipoprotein，VSP)和膜蛋白。

传统的重组表达蛋白的技术路线都是针对某一种蛋白，其往往选择经实验验证免疫原性强、抗体应答持续时间长、且不同亚型之间相对保守的蛋白作为标靶。但即便如此，理论上仍旧只能捕获和检测针对一种病毒蛋白的抗体。所以采用不同的蛋白作为标靶，检测结果就有可能不一致，包括阳性程度(即抗体滴度)、甚至是漏检(假阴性)。对于牛肺炎支原体而言，一个更为突出的问题是由于牛肺炎支原体的基础研究相对滞后，目前尚未能明确该病原体感染后诱导机体产生抗体的优势和保守抗原——即迅速诱导产生抗体而且抗体产生的持续时间长，感染过程中抗原也不容易发生变异。例如，目前已有报道的VSP虽然具有很强的免疫原性，但却容易出现变异而影响检测的准确性。所以，采用传统的技术路线制备某一种特定的病原体蛋白作为捕获抗原，其检测结果就很有可能不能准确反映病原体真实的感染情况。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种重组表达蛋白，其为多表位抗原，其能特异性捕获牛肺炎支原体抗体。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

多表位融合抗原，所述多表位融合抗原的氨基酸序列含有如SEQ ID NO：1所示，或所述多表位融合抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明所设计的多表位融合抗原，基于已有的牛肺炎支原体全基因组研究为基础，进行了充分的生物信息学分析，寻找到了一种可用于检测牛肺炎支原体抗体的牛肺炎支原体假定膜蛋白P33，截取其特异且保守部位的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

SEQID NO：1所示氨基酸的进一步缩写如下：

“EAKSDNKMEKDIKINENTDEKNSSETMNNKQKQDKSSIDSKMEEKADNKTEKDIKINENTDEKNSSETMNNKQKQDKSSIDSKMEEKADNKTEKDIKINENTDEKNSSETMNNKQKQDKSSIESKMKEKTEKQDSKTNSEKQDSETDDSSNELTIPSESTPKDMPTEN”

在此基础上，结合已探明的牛肺炎支原体膜蛋白P30，设计了一种融合了不同牛肺炎支原体蛋白B细胞表位的抗原——即多表位融合抗原的重组蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

SEQ ID NO：2所示氨基酸的进一步缩写如下：

“EAKSDNKMEKDIKINENTDEKNSSETMNNKQKQDKSSIDSKMEEKADNKTEKDIKINENTDEKNSSETMNNKQKQDKSSIDSKMEEKADNKTEKDIKINENTDEKNSSETMNNKQKQDKSSIESKMKEKTEKQDSKTNSEKQDSETDDSSNELTIPSESTPKDMPTENGPGPGNDKKEEKKKVEEPAKQAEGAGTGDKTTSASGTANSNGASSNSTNAQKTDEKEIKETSDSPKKDGEKVSDKHKVAGPGPGKDIKDEDLIPPKTGNNKQVFFDTRDGDTKLSGKFKGKLPWGPGPGPIHKNRKGKIKASGFVNVEKEGDKLKIKFRFFKYNKGASP”。

其中，如SEQ ID NO：1所示的肽段A是如SEQ ID NO：2所示的肽段B的截短片段。经抗原特异性分析证实，如SEQ ID NO：1所示的肽段A为牛肺炎支原体抗体的特异性抗原，分析结果详见图1。

多表位融合抗原首先建立在对牛肺炎支原体全集因组序列进行充分分析的基础上，针对P33和P30基因进行与其他支原体特异性的验证；对牛肺炎支原体P33和P30进行基因优化和重组表达，并验证两个重组蛋白的免疫原性。其次根据P33和P30氨基酸序列分析结果，建立多表位融合抗原蛋白的氨基酸一级结构。

本发明的目的之二在于提供两种种多表位融合抗原蛋白的应用，该应用为诊断牛肺炎支原体技术提供了新思路。同时，根据该应用，制备了牛肺炎支原体诊断试剂，其具有较高的特异性和敏感性。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的多表位融合抗原在制备牛肺炎支原体诊断试剂中的应用。

进一步，牛肺炎支原体诊断试剂，所述牛肺炎支原体诊断试剂为牛肺炎支原体抗体的特异性抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1-2任一所示。

所述的多表位融合抗原和辣根过氧化物酶标记羊抗牛的IgG联合在检测牛肺炎支原体抗体中的应用。该联合运用被证实是最佳的抗体配对。

牛肺炎支原体诊断试剂是通过如下思路制备的：确定多表位融合抗原蛋白的氨基酸序列基础上，反向将其翻译成核苷酸序列，人工合成所需基因片段并测序验证，克隆后通过双酶切与表达载体pET-28a连接，转染至BL21(DE3)codonplus，通过卡那抗性筛选、发酵、IPTG诱导表达，获得目的抗原。该抗原为胞内表达，超声破菌后收集菌液，依次通过镍金属螯合层析、Q-HP层析、重复镍金属螯合层析得到电泳纯的抗原。以纯化的抗原作为捕获抗原进行包被酶标板，检测牛肺炎支原体抗体阳性样本，同时设置不包被该抗原的对照，以此验证该抗原蛋白的敏感性和特异性。更多信息参见分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)。

本发明的目的之三在于提供一种诊断试剂盒，其能准确的检测牛肺炎支原体抗体。

含有所述的牛肺炎支原体诊断试剂的试剂盒，所述试剂盒为ELISA试剂盒，包括包被有包被抗原的固相载体，酶标二抗和显色底物，所述包被抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。该试剂盒是基于间接ELISA法的原理设计的。

其中，所述的牛肺炎支原体诊断试剂的试剂盒中的所述酶标二抗为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶或β-半乳糖苷酶标记的标记的抗牛IgG。

其中，所述的牛肺炎支原体诊断试剂的试剂盒中所述酶标二抗优选为辣根过氧化物酶标记羊抗牛的IgG。

本发明的目的之四在于提供一种牛肺炎支原体抗体的检测方法，该方法为判断涉及畜牧牛来源的食品的安全提供了检测保障技术。

运用所述的试剂盒检测牛肺炎支原体抗体的方法，具体包括以下步骤：

A固相载体的包被

将所述包被抗原用包被抗原稀释液稀释后，包被于固定载体上，在固相载体上添加待测样品孵育，再加入所述酶标二抗孵育，加入显色底物反应充分后，用所述终止液终止反应；

B读取数据

用仪器分别读取待测样品组和标准样品组的数值，通过与已知含量的标准样品或阴性对照品比较，求得待测样品的牛肺炎支原体抗体含量或判定待测样品是否为阳性。对于结果是否属于正常或非正常的判定标准，可以采用一切可实现的定性或定量方法。

优选的所述的方法中，所述步骤A中，所述包被抗原纯度以质量计算为95％时，所述包被抗原被稀释成浓度为1-10μg/ml，酶标二抗为稀释浓度以体积计为1∶2000-3000的辣根过氧化物酶标记羊抗牛的IgG，所述显色底物为辣根过氧化物酶的显色底物。HRP标记的羊抗牛IgG干粉购自美国KPL公司(货号14-12-06)，按照附带的说明书所述的步骤重悬成贮存液后，以冲洗缓冲液稀释2000-3000倍。在上述稀释配比下，检测结果最佳。

例如，待测样品为牛奶，用酶标仪在450nm波长下读取待测样品数据，在实验有效的前提下，IRPC≥20为阳性样本，反之为阴性样本。

另外，待测样品可以为血清、尿液等体液。

本发明的有益效果：1)同生物学检测、以及分子生物学检测相比较，本方法操作简便，无需依靠复杂的仪器设备，对实验室条件、以及实验人员的技术要求不高，检测成本相对较低，适合于基层和养殖场大规模开展。2)在抗原的种类选择方面，同合成肽相比，本多表位融合抗原制作成本低，适合大规模应用；同全毒相比，在保证灵敏度的前提下特异性高，批间差异小，也不像全度一样需要要求较高的培养条件。3)本多表位融合抗原适合作为血清学的检测重组抗原。4)采用多表位作为标靶，其检测结果一致性高。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。

图1为SEQ ID NO：1氨基酸序列抗原特异性分析图。

图2为牛肺炎支原体P33蛋白氨基酸序列抗原特异性分析图。

图3为牛肺炎支原体P30蛋白氨基酸序列抗原特异性分析图。

图4为BamHI/Not I酶切质粒pMD18-T-P33。

图5为BamHI/Xho I酶切质粒pMD18-T-P30。

图6为P33蛋白在BL21(DE3)菌中28℃表达SDS-PAGE电泳图；其中，M：Protein Ruler^TM II；Lane1：未加入IPTG；Lane2：加入IPTG诱导5h。

图7为P30蛋白在BL21(DE3)菌中28℃表达SDS-PAGE电泳图；其中，M：Protein Ruler^TM II；Lane1：加入IPTG诱导5h；Lane2：未加入IPTG。

图8为MbP33蛋白Western-Blotting图；其中M：EasySee Western Marker；Lane1：未加入IPTG BL21(DE3)pET-28a-P33菌体蛋；Lane2：加入IPTG诱导5h后的BL21(DE3)菌体蛋白。

图9为MbP30蛋白Western-Blotting图，M：EasySee Western Markek；Lane1：pET-28a-P30融合蛋白质(27kDa+20kDa)；Lane2：未加IPTG诱导的TransSetta菌蛋白。

图10为多表位融合蛋白P39经Ni-Sephorse.6F.F纯化后SDS-PAGE电泳结果。

图11为多表位融合蛋白P39经Q-HP阴离子层析图谱。

图12为多表位融合蛋白P39经Q-HP阴离子层析SDS-PAGE电泳结果。

图13为多表位融合蛋白P39经凝胶层析结果。

图14为多表位融合蛋白P39经镍金属螯合层析结果。

图15为终纯化后PAGE电泳结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

氨基酸的缩写如下：

甘氨酸gly G；丝氨酸Ser S；丙氨酸ala A；苏氨酸thr T；缬氨酸valV；异亮氨酸ile I；亮氨酸leu L；酪氨酸tyr Y；苯丙氨酸phe F；组氨酸his H；脯氨酸pro P；天冬氨酸asp D；甲硫氨酸met M；谷氨酸glu E；色氨酸trp W；赖氨酸lys K；半胱氨酸cys C；精氨酸arg R

牛肺炎支原体73个膜蛋白和36个分泌蛋白中，其中，致病相关蛋白P33和特异性膜蛋白P30，其除了某些稀有密码子，两段基因还含有编码色氨酸的TGA密码子，TGA在大肠杆菌表达系统中是终止子，本设计将两个蛋白的基因组序列进行重新优化，再利用大肠杆菌表达系统对两个蛋白片段基因进行了原核表达。利用western-blotting确定了两个蛋白的抗原免疫特性，将两段蛋白基因糅合为一个能容易大量制备、质量控制可靠、无散毒风险的重组蛋白，该重组蛋白能够捕获针对MB膜蛋白和致病蛋白抗原的抗体，以检测出感染早期以及应答持续时间长的抗体，从而避免漏检，提高血清抗体和牛奶检测的准确性。

本专利中所涉及的氨基酸序列，均是以从氮端到碳端的顺序书写。

实施例1多表位融合抗原

一牛肺炎支原体致病相关蛋白P33和特异性膜蛋白P30基因载体的构建

1pMD18-T-P33和pMD18-T-P30构建

P33基因片段全长903bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3，其中有含有5个编码色氨酸的TGA密码子，P33的B细胞表位分析见图2；

SEQ ID NO.3：

“ggatccatattattgacaacactatcgccaattatctcattgccatttttatctgctagttgcatcaccgaagcaaaatcagataacaaaatggaaaaagatattaagataaacgaaaatacagatgaaaaaaattcttctgaaacaatgaataacaaacaaaaacaagataaaagcagtatagattcaaagatggaagaaaaagcagataacaaaacggaaaaagatattaagataaacgaaaatacagatgaaaaaaattcttctgaaacaatgaataacaaacaaaaacaagataaaagcagtatagattcaaagatggaagaaaaagcagataacaaaacggaaaaagatattaagataaacgaaaatacagatgaaaaaaattcttctgaaacaatgaataacaaacaaaaacaagataaaagcagtatagaatcgaaaatgaaagaaaaaacagaaaagcaagattcaaaaactaactcagaaaaacaagattcagaaactgatgacagtagtaatgaattaacaatacctagtgaaagcacaccaaaagatatgccaacagaaaattctgaaataaacgactatttagacaaagttaaggaatacggaaaagaagcatcagaattttatgaattactttctaaattatttaaaacaaagtataaagataaaataattcaaaaaattggtaagtttgagaaaataatcaaagaattttctaaattatatgagggaacaaagaacaacttagaccaaattattgaaggatttaaagaacctgattttaagaaagcattattagaacttttgaatagttacaaagaatctagagaagaaataaaaaatgcaattaaagaattaaaagaaattgaaaatgaaagtagattttaactcgag”。

P30基因片段全长738bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，其中有含有1个编码色氨酸的TGA密码子，P30的B细胞表位分析见图3；

SEQ ID NO.4：

“ggatccatgtttaagaggaatccaaaatttatgaaacacaaactattattaagtttaggaactgtattaactgctactttttcttttcctttaattgctgctaaatgtgatggcaatgacaagaaggaagaaaagaaaaaagttgaagaacctgcaaaacaagctgaaggagctggaacaggtgataaaacaacctctgcaagtggaactgctaattctaatggcgcaagttctaatagtactaatgcacaaaaaacagatgaaaaagaaataaaagaaacttccgattcacctaaaaaagatggagaaaaggtttcagataaacataaagtagcttacaaggatattgattttgatttttctaagattaaaatcgtaattagtaaaaaagacatcaaggatgaagacttaattccgcctaaaacaggcaataataagcaagttttctttgatactcgtgatggagatacaaagttaagcggaaagttcaagggaaaattaccttgaaaaggtgttgaaattggaactgttactggtctaccagacggatattcaattgctagtgttgagaatccaatccacaaaaacagaaaaggcaaaattaaagctagtggatttgtcaatgttgaaaaagaaggagacaaactaaaaattaagtttagattctttaagtacaacaaaggagcaagcccaacagtttcaacaaaggtttacgaagcaattatttcttagctcgag”。

本发明中的核苷酸序列均按照从5’端到3’端的顺序进行书写。

重组质粒及表达将P33和P30的稀有密码子进行优化，人工合成两段基因组序列分别连入pMD18-T载体，形成pMD18-T-P33和pMD18-T-P30。P33和P30密码子优化后的序列，为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

SEQ ID NO.5：

tagaactcggtacgcgcggatcttccagagattggatccatcctgctgaccaccctgtctccgatcatctctctgccgttcctgtctgcttcttgcatcaccgaagctaaatctgacaacaaaatggaaaaagacatcaaaatcaacgaaaacaccgacgaaaaaaactcttctgaaaccatgaacaacaaacagaaacaggacaaatcttctatcgactctaaaatggaagaaaaagctgacaacaaaaccgaaaaagacatcaaaatcaacgaaaacaccgacgaaaaaaactcttctgaaaccatgaacaacaaacagaaacaggacaaatcttctatcgactctaaaatggaagaaaaagctgacaacaaaaccgaaaaagacatcaaaatcaacgaaaacaccgacgaaaaaaactcttctgaaaccatgaacaacaaacagaaacaggacaaatcttctatcgaatctaaaatgaaagaaaaaaccgaaaaacaggactctaaaaccaactctgaaaaacaggactctgaaaccgacgactcttctaacgaactgaccatcccgtctgaatctaccccgaaagacatgccgaccgaaaactctgaaatcaacgactacctggacaaagttaaagaatacggtaaagaagcttctgaattctacgaactgctgtctaaactgttcaaaaccaaatacaaagacaaaatcatccagaaaatcggtaaattcgaaaaaatcatcaaagaattctctaaactgtacgaaggtaccaaaaacaacctggaccagatcatcgaaggtttcaaagaaccggacttcaaaaaagctctgctggaactgctgaactcttacaaagaatctcgtgaagaaatcaaaaacgctatcaaagaactgaaagaaatcgaaaacgaatctcgtttctaactcgagaatcgtcgaacggcaggcgtgcaaactt

SEQ ID NO.6：

tagaactcggtacgcgcggatcttccagagattggatccatgttcaaacgtaacccgaaattcatgaaacacaaactgctgctgtctctgggtaccgttctgaccgctaccttctctttcccgctgatcgctgctaaatgcgacggtaacgacaaaaaagaagaaaagaaaaaagttgaagaaccggctaaacaggctgaaggtgctggtaccggtgacaaaaccacctctgcttctggtaccgctaactctaacggtgcttcttctaactctaccaacgctcagaaaaccgacgaaaaagaaatcaaagaaacctctgactctccgaaaaaagacggtgaaaaagtttctgacaaacacaaagttgcttacaaagacatcgacttcgacttctctaaaatcaaaatcgttatctctaaaaaagacatcaaagacgaagacctgatcccgccgaaaaccggtaacaacaaacaggttttcttcgacacccgtgacggtgacaccaaactgtctggtaaattcaaaggtaaactgccgtggaaaggtgttgaaatcggtaccgttaccggtctgccggacggttactctatcgcttctgttgaaaacccgatccacaaaaaccgtaaaggtaaaatcaaagcttctggtttcgttaacgttgaaaaagaaggtgacaaactgaaaatcaaattccgtttcttcaaatacaacaaaggtgcttctccgaccgtttctaccaaagtttacgaagctatcatctcttaactcgagaatcgtcgaacggcaggcgtgcaaactt

2P33和P30基因蛋白的原核表达

利用限制性内切酶BamH I和Xho I酶切pMD18-T-P33获得目的片段(见图4)，利用限制性内切酶BamH I和Xho I酶切pMD18-T-P33获得目的片段pMD18-T-P30获得目的片段(见图5)，分别连接pET-28a质粒转化进Trans1-T1感受态细胞；挑阳性单克隆对其进行LB培养基过夜培养挑菌提取阳性质粒；取1μl质粒转化Transetta(DE3)感受态细胞。挑若干个菌落至5ml LB(Kan+)培养基，培养至OD₆₀₀＝0.5～1，加入5μl0.5M IPTG，37℃诱导5h；收集菌体，加入200μl PBS垂悬，取50垂悬液加入10μl6×protein loading Buffer混匀，煮5min14600rpm离心5min；制备质量体积分数为12.5％的SDS PAGE胶，点样品(上清5μl)跑电泳检测，检测结果见图6、图7。

3P33和P30蛋白的western-blotting

选出表达P33和P30的蛋白质样品，用12.5％SDS-PAGE胶进行分离。转膜：200mA转2小时。封闭1小时。Anti-mouse His标签一抗(按体积比1∶10000稀释后)孵育1小时。TBST洗3次。Anti-mouse二抗(按体积比为1∶10000稀释后)孵育1h。TBST洗1次，TBS洗3次。EasySee Western Blot kit孵育1min，压片，显色见图8、图9。

二、多表位融合蛋白P39的构建

1.根据P33和P30蛋白免疫分析最终确定的多表位融合抗原蛋白P39序列为SEQ ID NO.2。确定多表位融合抗原蛋白的氨基酸序列基础上，反向将其翻译成核苷酸序列，人工合成所需基因片段，片段克隆后通过双酶切与表达载体pET-28a连接，转染至BL21(DE3)codonplus，通过卡那抗性筛选、发酵、IPTG诱导表达，获得目的抗原。重组菌种在自诱导培养基中37℃发酵并诱导表达18h后。

2.重组牛肺炎支原体蛋白P39的纯化

超产破菌过滤后的上清用镍金属螯合层析柱Ni-Sephorse.6F.F上柱，HisBinding buffer(20mmol/L sodium phosphate，0.5M NaCl，PH7.4)平衡后用HisElution buffer(20mmol/L sodium phosphate，0.5M NaCl，0.5M咪唑PH7.4)15％B、20％B、30％B梯度及线性梯度洗脱，根据SDS-PAGE电泳结果收集目的蛋白洗脱峰，结果见图10。

收集含目的蛋白的洗脱峰，20mM Tris-HCl buffer(pH8.0)透析过夜，进一步做阴离子纯化，纯化结果(见图11、图12)结果显示：牛肺炎支原体融合蛋白经Q-HP阴离子层析后，其纯度到达95％(见图13)，分子量约49KD。4℃冰箱放置两天后意外发现融合蛋白标签自动脱离，其脱离片段分子量大小与目的蛋白片段大小之和正好与融合蛋白大小相符，为39kDa，凝胶层析分离(见图14)，再用镍金属螯合层析，其结果为标签蛋白与未脱离完全的融合蛋白正好被镍金属螯合，目的蛋白穿透镍金属螯合层析，结果见(图15)。

3.重组蛋白P39的定量

用Lowry法对纯化的重组蛋白P39进行蛋白定量测定，获得其蛋白量为0.4mg/ml。

实施例2多表位融合抗原P39制备用于检测牛肺炎支原体抗体的试剂盒

一间接ELISA检测试剂盒的组成

1抗原包被板：

1)包被：多表位融合抗原以50mM的碳酸盐缓冲液(pH9.3)稀释至5μg/mL，每孔加入100μL，4℃孵育过夜。

●碳酸盐缓冲液(5×，pH9.3)1L

组分     用量及终浓度

Na2CO3(MW105.99)分7.949g(75mM)

析纯

NaHCO3(MW84.01)分析14.702g(175mM)

纯

超纯水溶解，定容至1L，过滤除菌，2-8℃保存。使用前以超纯水稀释5倍。

2)封闭：1％酪蛋白，300μL/孔，37℃孵育2h，密封2-8℃保存。

2样本稀释液：0.5％酪蛋白，以PBS(1×，pH7.4)配制。PBS的配制方法见《分子克隆实验指南》(第3版)下册第1570页。

3阳性对照：原液来自于牛肺炎支原体攻毒样本，经biovet和bio-X两个公司生产的牛肺炎支原体抗体检测试剂盒检测确认牛肺炎支原体抗体阳性，检测结果为“+++”。原液以样本稀释液(见上)稀释至检测OD在0.6以上。

4阴性对照：原液来自于新生健康牛，经上述两种商品化抗体检测产品检测确认为牛肺炎志远体抗体阴性。

5冲洗缓冲液：PBS(见上)加入Tween-20至终浓度为0.05％-0.1％(体积百分比)，例如在1L PBS中加入Tween-200.5mL-1mL。

6酶标抗体工作液：HRP标记的羊抗牛IgG干粉购自美国KPL公司(货号14-12-06)，按照附带的说明书所述的步骤重悬成贮存液后，以冲洗缓冲液稀释2000-3000倍。

7终止液：2M H₂SO₄或者是1％SDS。如果用2M H₂SO₄终止显色，酶标仪以波长420-450nm检测OD值；如果用1％SDS终止显色，酶标仪以波长620-650nm检测OD值。

二间接ELISA检测步骤

试剂盒采用酶联免疫吸附测定法检测牛血清或血浆样本中的牛肺炎支原体抗体(IgG)。其基本原理是将重组多表位融合抗原包被在酶标板内的固相表面；检测时将待测样本加入酶标板孵育，样本中针对牛肺炎支原体的特异性抗体与包被在固相表面的抗原特异结合，再通过冲洗步骤去除未结合在固相表面的其他成分；之后，加入酶标抗体(辣根过氧化物酶偶联的抗-牛IgG抗体)进行孵育，使之与已经吸附在固相表面上的牛抗体相结合，再通过冲洗步骤去除未结合在固相表面的酶标抗体并加入辣根过氧化物酶的底物，底物在辣根过氧化物酶的催化下产生显色反应。显色程度与待测样本中抗牛肺炎支原体抗体的量成正比。具体操作步骤如下：

所有试剂在使用前必须放置于室温(18℃-25℃)平衡温度，并且轻柔摇匀。操作部同样品时必须更换枪头。

1抗原包被板、样本稀释液、阳性对照、阴性对照、缓冲液(10X)平衡至室温：将双抗包被板、样本稀释液、阳性对照、阴性对照、缓冲液(10X)从试剂盒中取出，于室温放置30min。冲洗缓冲液(10X)如出现沉淀，可将其置于37℃并不断振摇至溶解后再使用。

2准备待测样本：待测样本(牛血清、血浆或牛奶)以样本稀释液稀释40倍，以体积稀释倍数计算。阴性对照和阳性对照不作稀释。

3将稀释好的待测样品加入至检测管中，100ul/管。加样完毕后封膜封板，室温孵化30min。吸取样本，以冲洗液冲洗，300ul/管，重复5次。

4加入酶标抗体工作液，100ul/管。加样完毕后封膜封板，室温孵化30min。吸除酶标抗体工作液，以冲洗液冲洗，300ul/管，重复5次。

5加入底物液，100ul/管，室温孵化10min。

6加入终止液，50ul/管。

7将酶标仪的检波长设定在450nm，检测各种样本的吸光度，及A(450)值，计算及结果判定。

三间接ELISA试剂盒结果判定

每次实验设置两个阴性对照(NC1、NC2)和两个阳性对照(PC1、PC2)。实验结束后首先计算两个阴性对照的A(450)均值(NC)和两个阳性对照的A(450)均值(PC)，然后计算待测样本的IRPC值，初步确定本试验ELISA检测结果的判定方法：

1)ELISA检测过程为用波长450nm检测，计算两个阴性对照A(450)的平均值：NC＝(A(450)nc1+A(450)nc2)/2。

2)计算两个阳性对照A(450)的平均值：PC＝(A(450)pc1+A(450)pc2)/2。

3)计算待测样本的IRPC值：

IRPC＝(S-NC)/(PC-NC)*100

其中S为待测样本的A(450)检测值。阳性对照A(450)均值大于0.5(即PC＞0.5)，阳性对照A(450)均值与阴性对照A(450)均值的比值大于4(即PC/NC＞4)，判定实验有效，反之实验无效，需重复。在实验有效的前提下，待测样本的IRPC＞20为阳性样本，反之为阴性样本。

四试剂盒田间试验结果

利用试剂盒对丰都某养殖场采集的临床样本进行的田间试验，该结果与国外Biovet公司同类产品的比较，我们研制的产品临床灵敏度达到90.98％，临床特异性达到87.59％，实验数据结果见下表：

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.多表位融合抗原，其特征在于：所述多表位融合抗原的氨基酸序列含有如SEQ ID NO：1所示，或所述多表位融合抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述的多表位融合抗原在制备牛肺炎支原体诊断试剂中的应用。

3.牛肺炎支原体诊断试剂，其特征在于：所述牛肺炎支原体诊断试剂为牛肺炎支原体抗体的特异性抗原，所述特异性抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-2任一所示。

4.含有权利要求3所述的牛肺炎支原体诊断试剂的试剂盒，所述试剂盒为ELISA试剂盒，包括包被有包被抗原的固相载体，酶标二抗和显色底物，其特征在于：所述包被抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

5.根据权利要求4所述的牛肺炎支原体诊断试剂的试剂盒，其特征在于：所述酶标二抗为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶或β-半乳糖苷酶标记的标记的抗牛IgG。

6.根据权利要求4所述的牛肺炎支原体诊断试剂的试剂盒，其特征在于：所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗牛的IgG。

7.权利要求1所述的多表位融合抗原和辣根过氧化物酶标记羊抗牛的IgG联合在检测牛肺炎支原体抗体中的应用。

8.运用权利要求4所述的试剂盒检测牛肺炎支原体抗体的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

A固相载体的包被

将所述包被抗原用包被抗原稀释液稀释后，包被于固定载体上，在固相载体上添加待测样品孵育，再加入所述酶标二抗孵育，加入显色底物反应充分后，用所述终止液终止反应；

B读取数据

用仪器分别读取待测样品组和标准样品组的数值，通过与已知含量的标准样品或阴性对照品比较，求得待测样品的牛肺炎支原体抗体含量，或判定待测样品是否为阳性。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤A中，所述包被抗原纯度为95％时，所述包被抗原被稀释成浓度为1-10μg/ml，酶标二抗为稀释浓度以体积计为1∶2000-3000的辣根过氧化物酶标记羊抗牛的IgG，所述显色底物为辣根过氧化物酶的显色底物。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：待测样品为牛奶，用酶标仪在450nm波长下读取待测样品数据，在实验有效的前提下，IRPC≥20为阳性样本，反之为阴性样本。

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