CN108318684A - 一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片制备方法和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的制备方法，优化PPV VP2密码子，克隆至pColdI后，转化至大肠杆菌Rossetta 2，进行PPV VP2蛋白的表达。成功表达的VP2蛋白用镍磁珠纯化。将纯化后的PPV VP2蛋白点样到环氧基片，于37℃干燥过夜。次日将芯片表面贴上芯片围栏，每个围栏封闭、洗涤即得。检测时，将封闭后的芯片加入PPV抗体阳性猪血清，洗涤、干燥，加入兔抗猪金标二抗孵育、洗涤、干燥，每个围栏加入银染显色液显色，洗涤后干燥观察结果。本发明提供的检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片可用于实验室检测，也可满足基层养殖场，能够更快速、方便、高通量地检测猪细小病毒抗体的蛋白芯片诊断技术，及时监测猪群细小病毒抗体水平。

Description

一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片制备方法和检测 方法

技术领域

本发明涉及一种生物芯片，尤其涉及一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的制备方法和检测方法。

背景技术

猪细小病毒病(porcine parvovirus infection，PPI)是由猪细小病毒((porcineparvovirus，PPV) 感染所引起的一种猪繁殖障碍病，该病主要表现为：受感染的母猪，特别是初产母猪发生死胎、畸形胎和木乃伊胎及弱仔等，但母猪本身无明显的症状。该病广泛存在于世界各地，严重影响养猪业的发展。

猪细小病毒感染可以依据临诊症状和流行病学做出初步诊断，一般认为，如果仅妊娠母猪发生流产、死胎、木乃伊胎、胎儿发育异常等繁殖障碍症状，同时有证据表明是传染性疾病时，应考虑到猪细小病毒感染的可能，但是进一步确诊必须进行实验室诊断。自从首次报道猪细小病毒病以来，国内外学者对该病的诊断方法进行了大量研究，但是各种诊断方法各有利弊。

常用于猪细小病毒病诊断的实验室诊断方法有PCR、RT-PCR、QPCR、病毒中和试验、免疫荧光技术、乳胶凝集试验、免疫组化试验、免疫胶体金技术、DNA探针、纳米探针技术等。其中，间接ELISA检测猪细小病毒抗体，是目前临床上常用的一种方法，有市售猪细小病毒ELISA抗体检测试剂盒，也可由实验室自行纯化蛋白并包被至96孔板，建立ELISA检测技术。范朋举等报道中记载，具体为利用大肠杆菌原核表达系统表达猪细小病毒VP2蛋白，经镍柱纯化得到VP2蛋白。将纯化后的VP2蛋白以2-10μg/mL的浓度包被至96孔板，加入100μL100倍稀释的待检血清37℃孵育1h,100μLHRP标记的抗体37℃孵育1h，加100μLTMB底物37℃显色15min，立即用50μL2mol/LH2SO4终止反应。该方法的判定标准为：抗体效价若大于0.18确定为猪细小病毒抗体阳性。

但是，ELISA灵敏性相对较低；每个待检样需要200-1000ng蛋白，需要较大量的VP2蛋白；待检血清采集耗费工作量；结果判定需要特定的仪器。

蛋白芯片检测技术是近年来在生物科技领域发展起来的一项针对蛋白及多肽等高分子生物的检测技术。作为一种快速、简便、高通量生物芯片分析检测技术，近年来在食品检验、蛋白质组学、疾病诊断、药物筛选、农林畜牧业以及司法鉴定等领域应用日渐增多。蛋白芯片是将各种蛋白质(如抗原、抗体)、多肽以及受体、配体等有序固定于某一载体(如滤膜、凝胶、玻片、纳米微珠和微孔板)之上，以分析检测样品中能与之特异相互作用的成分。但是，生物芯片应用于动物疫病诊断的研究并不广泛。

因此，急需建立一种可用于实验室检测，也可满足基层养殖场，用于更快速、方便、高通量地检测猪细小病毒抗体的蛋白芯片诊断技术，及时监测猪群细小病毒抗体水平。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的制备方法和检测方法。

一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

S1：优化PPV VP2密码子，合成优化的猪细小病毒PPV VP2基因(SEQ ID No.1)；

S2：将S1制得的猪细小病毒PPV VP2基因克隆至载体pColdI，得到酶切和测序鉴定正确的阳性克隆pColdI-VP2；

S3：将S2制得的阳性克隆pColdI-VP2转化至大肠杆菌Rossetta 2，培养转化体，经IPTG 诱导，对培养物包涵体洗涤、溶解，用His标签蛋白磁珠纯化后，透析复性、纯化得到重组蛋白PPV VP2，-80℃保存备用；

S4：将S3制得的重组蛋白PPV VP2稀释，点样在芯片载体上，所述芯片载体为环氧基片，干燥，封闭，洗涤，制得检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片。过去可视化蛋白芯片的芯片载体常用NC膜、PVDF膜和醛基基片，NC膜和PVDF膜在芯片制备过程中不易固定、洗涤、干燥，并且在操作时易碎或刮花；醛基与寡核苷酸结合能力较强，与蛋白结合能力相对较弱，尽管醛基基片与蛋白质分子结合超过24h也只能结合部分蛋白质或多肽分子。环氧基片与蛋白的结合能力优异，仅需少量PPV VP2蛋白即可制得检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片，且检测灵敏。另一方面，环氧基片成本相对较低，适合产业化大规模制备和基层购买。

进一步的，所述S2中，pColdI质粒和S1合成的PPV VP2基因用限制性内切酶HindIII 和Bam H I双酶切，酶切产物胶回收纯化，将纯化的酶切产物用T4Ligase连接，于16℃连接过夜，连接产物转化至大肠杆菌DH5α，并涂布于氨苄抗性的LA平板，37℃培养过夜，提取质粒，进行双酶切切验证，得到酶切和测序鉴定正确的阳性克隆pColdI-VP2。

进一步的，S4中，所述重组蛋白PPV VP2的稀释方法为用2×蛋白芯片点样液稀释，稀释至浓度为0.05-0.4mg/ml，优选的，0.3-0.4mg/ml；所述点样方式为Personal Arrayer16接触式点样系统点制芯片；所述干燥条件为37℃干燥过夜；所述封闭方法为，将干燥的环氧基片表面贴上芯片围栏，每个芯片围栏加入100μL1％BSA，37℃封闭2h；所述洗涤方法为，用PBST 洗涤5min。

进一步的，S4中，所述制得检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片保存条件为4℃保存。

前述制备的一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

S1：将待测血清稀释后，点样至所述检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的芯片载体上， 37℃孵育30-60min，用PBST洗涤5min后干燥；

S2：在S1的点样点上点样或在S1点样所在的芯片围栏中加入100倍稀释的兔抗猪金标二抗于37℃孵育30-60min，用PBST洗涤5min后干燥；

S3：在S2的点样点上或在S2处理所在的的芯片围栏中加入1:1混合好的银染显色液A液和B液，显色8-15min，用PBST洗涤5min后干燥观察结果。若出现银色斑点则判定为抗体阳性，若无斑点则判定为抗体阴性。

进一步的，S1所述待测血清稀释倍数为10-6000倍，优选的，2000倍。

进一步的，S1所述待测血清孵育时间为30-45min，S2所述兔抗猪金标二抗孵育时间为 60min.

进一步的，S3所述显色时间为10min。

前述制备的检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片在制备猪细小病毒抗体检测试剂盒中的应用。

一种猪细小病毒抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括前述制备的检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片。

本发明技术方案所实现的有益效果为：

1、本发明建立的可视化蛋白芯片技术应用于检测猪细小病毒抗体，用建立的可视化蛋白芯片技术检测170份未知的临床血清样本，阳性检出率可达80.6％，而商品化的猪细小病毒 ELISA抗体检测试剂盒检出的阳性率为78.2％，蛋白芯片的阳性检出率比商品化的猪细小病毒 ELISA抗体检测试剂盒高出2.4％。因此，蛋白芯片的特异性与灵敏性更高、具有高通量的特点。

2、本发明采用的环氧基修饰的基片能与PPV VP2蛋白高效结合，相对于可视化蛋白芯片中过去常用NC膜、PVDF膜和醛基基片，环氧基修饰的基片只需要微量PPV VP2蛋白即可制得检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片，且检测灵敏。另一方面，环氧基片成本相对较低，适合产业化大规模制备和基层购买。相对于ELISA检测技术每个待检样需要200-1000ng蛋白，本发明的可视化蛋白芯片的每个待检样只需0.5-2ng蛋白。

3、本发明采用纯化的蛋白作为抗原，具有获取工艺相对简单、杂质少、无传染性等优点。

4、本发明的可视化蛋白芯片，采用纯化的高纯度的蛋白与环氧基片上的环氧基高效结合，能够捕捉到待检测血清的微量抗体，因此只需要微量的待检血清，一定程度上减少了临床检测时需采集大量血清的工作量。

5、结果可用肉眼观察，基层养殖场无需购买特殊仪器判读结果。

6、解决了间接ELISA灵敏性低、检测需耗费大量抗原蛋白和临床血清、结果判定需要酶标仪等问题，便于基层现场快速、简便检测猪细小病毒抗体。

附图说明

图1实施例2重组表达质粒pColdI-VP2经Hind III和Bam H I双酶切鉴定；M.核酸标准品 (DL5000)；1.pColdI-VP2质粒；

图2实施例3原核表达和纯化重组VP2蛋白的SDS-PAGE鉴定；M.蛋白分子质量标准；1.诱导表达的R2空菌；2.诱导表达的R2(pColdI)；3.诱导表达的R2(pCold I-VP2)菌液上清； 4.诱导表达的R2(pCold I-VP2)包涵体；5-8:纯化的VP2；

图3实施例4可视化蛋白芯片的制备图示；

图4实施例4不同浓度的PPV VP2蛋白点样方阵示意图及可视化蛋白芯片点样图片；

图5实施例4不同浓度的PPV VP2蛋白可视化蛋白芯片点样清晰度折线图；

图6实施例5不同浓度的PPV抗体阳性血清可视化蛋白芯片点样清晰度折线图；

图7实施例6不同孵育时间的一抗、二抗可视化蛋白芯片点样清晰度折线图，其中由左至右9个点分别为1-9组。

具体实施方式

主要材料与试剂

载体pColdI、大肠杆菌DH5α、Rossetta 2(R2)由本实验室保存。蛋白质预染Marker购自美国Thermo scientific公司；DNAMarker、胶回收试剂盒、限制性内切酶Hind III、BamH I 购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取试剂盒购自美国Omega公司；His标签蛋白磁珠购自英芮诚生化科技(上海)有限公司；蛋白芯片点样液、光学环氧基片、多样品芯片围栏、购自北京博奥生物技术有限公司；兔抗猪金标二抗购自北京博奥森生物技术有限公司；银染显色液购自美国Sigma-Aldrich公司；猪细小病毒ELISA抗体检测试剂盒购自武汉科前生物股份有限公司。

实施例1优化并合成猪细小病毒PPV VP2基因

根据猪细小病毒PPV VP2基因序列(NCBI：JQ710896.1)的高级结构及GC含量、大肠杆菌宿主密码子使用频率等，利用Rare Codon Caltor分析了VP2基因中含有的稀有密码子，截取主要抗原表位区域，优化VP2密码子，优化序列后由武汉金开瑞生物工程有限公司合成优化的PPV VP2基因(SEQ ID No.1)。

实施例2猪细小病毒PPV VP2基因克隆

Hind III和Bam H I分别对质粒pColdI和实施例1合成的PPV VP2基因进行酶切(酶切体系为：10×Q.Cut Buffer 2μL；Hind III 1μL；Bam H I 1μL；pColdI-VP2/pColdI 5μL；灭菌蒸馏水 11μL)，37℃水浴酶切30min后，配制1％核酸胶进行核酸电泳分析，酶切产物胶回收纯化。纯化的酶切产物用T4Ligase于16℃连接过夜(连接体系为pColdI 1μL；PPVVP2基因片段7μL； 10×Ligation Buffer 1μL；T4Ligase 1μL)，将连接产物加入至20μL的感受态细胞DH5α，混匀后冰浴30min。42℃热激90s,冰浴5min,加入800μL LB培养基，37℃振荡培养45min后，5200 rpm离心5min，余100μL液体重悬菌体，涂布在含有氨苄抗性的平板上，37℃培养过夜。次日分别挑取2个菌落于5mL LB中，培养过夜，提取质粒，进行双酶切切验证，将双酶切鉴定和测序鉴定正确的阳性克隆命名为pColdI-VP2(图1)。

实施例3 VP2基因在大肠杆菌中的表达与纯化

将空载体质粒pColdI、实施例2得到的重组质粒pColdI-VP2分别转化至Rossetta2(R2) 感受态细胞，转化及鉴定方法同实施例2，得到重组菌株R2(pColdI)、R2(pColdI-VP2)，鉴定正确的阳性克隆37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入IPTG(终浓度为0.1mmol/L)18℃振荡诱导过夜，同时设置诱导的R2空菌作为阴性对照。

将诱导后的R2(pColdI-VP2)菌液4℃离心收集菌体，PBS重悬菌体后使用超声波破碎仪于冰上破碎，高速离心后分离上清和包涵体，并对包涵体产物进行洗涤(20mM SodiumPhosphate,500mM NaCl,0～20mM Imidazole，4M Urea,pH7.4)和溶解(20mM SodiumPhosphate, 500mM NaCl,0～20mM Imidazole，8M Urea,pH7.4)，用His标签蛋白磁珠进行纯化。加入5×SDS 电泳上样缓冲液煮沸，以诱导的R2空菌和R2(pColdI)菌液为对照，进行SDS-PAGE并对其进行考马斯亮蓝染色和脱色，观察重组蛋白的表达情况。

SDS-PAGE结果显示，在约34kDa处可见VP2蛋白(图2)，且重组蛋白主要以包涵体形式存在，经镍磁珠纯化获得了高纯度的重组蛋白。

因此，从重组菌株R2(pColdI)培养得到的包涵体中分离重组蛋白PPV VP2，经IPTG大量诱导后，用His标签蛋白磁珠进行纯化，纯化的蛋白经透析复性、去除蛋白中咪唑等有害物质，-80℃保存备用。

实施例4抗原稀释浓度范围的确定及PPV可视化蛋白芯片的制备

为了确定最佳抗原浓度，用2×蛋白芯片点样液将实施例3得到的PPV VP2蛋白稀释至 0.002mg/mL，0.02mg/mL，0.05mg/mL，0.1mg/mL，0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL。用Personal Arrayer 16接触式点样系统点制芯片，将不同浓度的PPV VP2蛋白点样在环氧基片上，每个斑点重复三次。点样后的环氧基片于37℃干燥过夜。次日将芯片表面贴上芯片围栏，每个围栏加入100μL1％BSA于37℃封闭2h，用PBST洗涤5min后，立即使用或可保存于4℃备用。

制备好的芯片加入100倍稀释的猪细小病毒PPV抗体阳性猪血清于37℃孵育1h，用PBST 洗涤5min后干燥，加入100倍稀释的兔抗猪金标二抗(参照兔抗猪金标二抗说明书)于37℃孵育1h，用PBST洗涤5min后干燥，每个围栏加入100μL经1:1混合好的银染显色液A液和B液，显色8-15min，用PBST洗涤5min后干燥观察结果，通过对PPV VP2蛋白点样浓度对比发现，稀释浓度为0.05-0.4mg/ml可见清晰的银色斑点，当蛋白浓度达到0.3-0.4mg/mL时，银色斑点最为清晰(图4、5)。

因此，将PPV VP2蛋白以0.3mg/mL的浓度点样至环氧基片上，点样后的环氧基片于37℃干燥过夜。次日将芯片表面贴上芯片围栏，每个围栏加入100μL1％BSA于37℃封闭2h，用 PBST洗涤5min，得到检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片，4℃保存以备后续使用。(图3) 实施例5血清稀释倍数范围的确定

将以10倍、100倍、1000倍、2000倍、4000倍、5000倍、6000倍稀释后的PPV抗体阳性血清(即一抗)分别点样至实施例4制备好的蛋白芯片上，37℃孵育1h。用PBST洗涤5min 后干燥，加入100倍稀释的兔抗猪金标二抗(参照兔抗猪金标二抗说明书)于37℃孵育1h，用PBST洗涤5min后干燥，加入1:1混合好的银染显色液A液和B液，显色10min，用PBST 洗涤5min后干燥观察结果(图6)。

实验结果显示，PPV抗体阳性血清稀释至6000倍仍可见清晰银色斑点，且在2000倍稀释点样时灰度值最大，可作为最佳血清稀释倍数，用于PPV可视化蛋白芯片诊断技术。

实施例6一抗、二抗孵育时间范围的确定

为了确定检测时最适的抗体反应时间，一抗(PPV抗体阳性血清)、二抗(兔抗猪金标二抗)分别设置了30min、45min、1h的孵育时间梯度，共9组时间梯度试验，即：第1组：一抗30min,二抗30min；第2组：一抗30min,二抗45min；第3组：一抗30min,二抗60min；第4 组：一抗45min,二抗30min；第5组：一抗45min,二抗45min；第6组：一抗45min,二抗60min；第7组：一抗60min,二抗30min；第8组：一抗60min,二抗45min；第9组：一抗60min,二抗60min。各组均在37℃反应，其他反应条件不变，用PBST洗涤5min后干燥，加入1:1混合好的银染显色液A液和B液，显色10min，用PBST洗涤5min后干燥观察结果(图7)。

实验结果显示：当一抗孵育时间为30-45min，二抗孵育时间为60min时为最佳。

实施例7符合率比较

用建立的PPV可视化蛋白芯片诊断技术检测已用商品化的猪细小病毒ELISA抗体检测试剂盒检测出的9份阴性阴性猪血清和42份阳性猪血清，对两种方法进行符合性比较。

检测结果显示，51份检测血清中，利用可视化蛋白芯片检出的阳性率为86.3％，阴性率为13.7％，商品化的猪细小病毒ELISA抗体检测试剂盒检出的阳性率为82.3％，阴性率为17.6％；其中1份商品化的猪细小病毒ELISA抗体检测试剂盒检出的阳性样品被蛋白芯片检测出为阴性，3份商品化的猪细小病毒ELISA抗体检测试剂盒检出的阴性样品被蛋白芯片检测出为阳性；因此计算出阴性符合率为85.7％，阳性符合率为93.2％，总符合率为92.2％。

实施例8临床应用

利用建立的PPV可视化蛋白芯片诊断技术和商品化的猪细小病毒ELISA抗体检测试剂盒检测来自不同地区的170份未知的临床血清样本，对结果进行分析。

本发明的检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的具体检测方法为：将待测血清稀释 2000倍后，点样至检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的芯片载体环氧基片上，37℃孵育 30min，用PBST洗涤5min后干燥；在待测血清点样的芯片围栏中加入100倍稀释的兔抗猪金标二抗于37℃孵育60min，用PBST洗涤5min后干燥；在相应芯片围栏中加入1:1混合好的银染显色液A液和B液，显色10min，用PBST洗涤5min后干燥观察结果。检测结果显示，可视化蛋白芯片检出的阳性率为80.6％，阴性率为19.4％，商品化的猪细小病毒ELISA抗体检测试剂盒检出的阳性率为78.2％，阴性率为21.8％，蛋白芯片的阳性检出率比商品化的猪细小病毒ELISA抗体检测试剂盒高出2.4％。

本发明建立的可视化蛋白芯片技术应用于检测猪细小病毒抗体，特异性与灵敏性更高、具有高通量的特点。制备时，PPV VP2蛋白与环氧基修饰的基片能高效结合，因此只需要微量 PPV VP2蛋白，相对于ELISA检测技术每个待检样需要200-1000ng蛋白，本发明的可视化蛋白芯片的每个待检样只需0.5-2ng蛋白。利用本发明的可视化蛋白芯片检测技术，在检测时，只需要微量的待检血清，一定程度上减少了临床上采集血清的工作量，且检测结果可用肉眼观察，基层养殖场无需购买特殊仪器判读结果。解决了间接ELISA灵敏性低、检测需耗费大量抗原蛋白和临床血清、结果判定需要酶标仪等问题，便于基层现场快速、简便检测猪细小病毒抗体。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片制备方法和检测方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence )

<400> 1

ggatccagcg caaccagtcc gcctaccaaa atttacaata atgatctgac cgcaagcctg 60

atggtggcac tggataccaa taataccctg ccgtatacac cggcagcacc gcgtagcgaa 120

accctgggtt tttatccgtg gctgccgacc aaaccgacac agtatcgtta ttatctgagc 180

tgcattcgca atctgaatcc tccgacctat accggtcaga gccagccgaa taatcgtctg 240

aataccaatc gtctgcatag cgatatcatg ttctatacca ttgaaaatgc cgtgccgatt 300

catctgctgc gtaccggtga tgaatttagt accggtatct atcactttga taccaaaccg 360

ctgaaactga cccatagctg gcagaccaat cgtagcctgg gtctgcctcc gaaactgctg 420

accgaaccga ccaccgaagg tgatcagcat ccgggtacac tgcctgcagc aaatacccgt 480

aaaggttatc atcagaccat caacaatagc tataccgaag caaccgcaat tcgtccggca 540

caggttggtt ataatacccc gtatatgaac ttcgagtata gcaatggtgg tccgtttctg 600

accccgattg ttccgaccgc agatacccag tataatgatg atgaaccgaa tggtgcaatt 660

cgcttcacca tggattatca gcatggtcat ctgaccacca gtagccaaga actggaacgt 720

tataccttta atccgcagag caaatgtggt cgtgcaccga aacagcagtt taatcagcag 780

gcaccgctga atctggaaaa tacaaataat ggcaccctgc tgccgagcga tccgattggt 840

ggtaaaagca atatgaagct t 861

Claims (10)

1.一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

S1：优化PPV VP2密码子，合成优化的猪细小病毒PPV VP2基因(SEQ ID No.1)；

S2：将S1制得的猪细小病毒PPV VP2基因克隆至载体pColdI，得到酶切和测序鉴定正确的阳性克隆pColdI-VP2；

S3：将S2制得的阳性克隆pColdI-VP2转化至大肠杆菌Rossetta 2，培养转化体，经IPTG诱导，对培养物包涵体洗涤、溶解，用His标签蛋白磁珠纯化后，透析复性、纯化得到重组蛋白PPV VP2，-80℃保存备用；

S4：将S3制得的重组蛋白PPV VP2稀释，点样在芯片载体上，所述芯片载体为环氧基片，干燥，封闭，洗涤，制得检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S2中，pColdI质粒和S1合成的PPVVP2基因用限制性内切酶Hind III和Bam H I双酶切，酶切产物胶回收纯化，将纯化的酶切产物用T4Ligase连接，于16℃连接过夜，连接产物转化至大肠杆菌DH5α，并涂布于氨苄抗性的LA平板，37℃培养过夜，提取质粒，进行双酶切切验证，得到酶切和测序鉴定正确的阳性克隆pColdI-VP2。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S4中，所述重组蛋白PPV VP2的稀释方法为用2×蛋白芯片点样液稀释，稀释至浓度为0.05-0.4mg/ml，优选的，0.3-0.4mg/ml；所述点样方式为Personal Arrayer 16接触式点样系统点制芯片；所述干燥条件为37℃干燥过夜；所述封闭方法为，将干燥的环氧基片表面贴上芯片围栏，每个芯片围栏加入100μL1％BSA，37℃封闭2h；所述洗涤方法为，用PBST洗涤5min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S4中，所述制得检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片保存条件为4℃保存。

5.权利要求1至4任一项权利要求制备的一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

S1：将待测血清稀释后，点样至所述检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片上，37℃孵育30-60min，用PBST洗涤5min后干燥；

S2：在S1处理基础上加入100倍稀释的兔抗猪金标二抗于37℃孵育30-60min，用PBST洗涤5min后干燥；

S3：在S2处理基础上加入1:1混合好的银染显色液A液和B液，显色8-15min，用PBST洗涤5min后干燥观察结果。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，S1所述待测血清稀释倍数为10-6000倍，优选的，2000倍。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，S1所述待测血清孵育时间为30-45min，S2所述兔抗猪金标二抗孵育时间为60min。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，S3所述显色时间为10min。

9.权利要求1至4任一项权利要求制备的检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片在制备猪细小病毒抗体检测试剂盒中的应用。

10.一种猪细小病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1至4任一项权利要求制备的检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片。