CN111781352A - 新型冠状病毒N-His重组蛋白芯片平台的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新型冠状病毒N‑His重组蛋白芯片平台的构建方法，通过pET28a N质粒先制备有良好抗原性的N重组蛋白，然后再利用该N重组蛋白去确定第一抗体和第二抗体的最佳稀释度，最后用构建的芯片检测梯度稀释的血清确定好芯片的检测限和线性范围，由此去完成N基因重组蛋白芯片平台的构建。相对于RT‑PCR检测方法，本芯片具有更稳定的检测性能，还具有高通量、微型化等特点，不易受病毒变异的影响，可以更精准、快速的实现对2019‑nCoV大批量的筛查。

Description

新型冠状病毒N-His重组蛋白芯片平台的构建方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒N-His重组蛋白芯片平台的构建方法。
背景技术
2019年12月下旬出现了一批不明原因的肺炎患者，后经对肺炎患者样本进行测序，发现了一种新型冠状病毒，随后命名为2019-nCoV。新型冠状病毒(2019-nCoV)患者初始症状多为发热、乏力和干咳，并逐渐出现呼吸困难等严重表现。多数患者预后良好，部分严重病例可出现急性呼吸窘迫综合征或脓毒症休克，甚至死亡。目前，该病没有特效治疗方法，潜伏期长，平均为14天，潜伏期内仍具有传染性，主要通过飞沫传播和接触传播，在密闭、不通风场所可能存在气溶胶传播风险。而部分患者无症状或起病症状不明显，极易导致漏诊并扩大感染范围。
目前关于冠状病毒检测的分子诊断方法有RT-PCR、实时逆转录PCR (rRT-PCR)、逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)以及实时RT-LAMP，同时也可通过免疫荧光技术、中和抗体、酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法等检测病毒相关蛋白。现全国检测2019-nCoV的主要手段为RT-PCR， RT-PCR技术虽有高灵敏度，高特异性等特点，但该实验对检测人员要求较高且实验操作步骤需要频繁的进行升温和降温过程，需要昂贵的仪器，且由于病毒传播过程中可能会发生变异，极易影响RT-PCR检测的敏感性。
有鉴于此，确有必要提供一种解决上述问题的技术方案。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种新型冠状病毒N-His重组蛋白芯片平台的构建方法，以实现对2019-nCoV大批量快速的筛查。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种新型冠状病毒N-His重组蛋白芯片平台的构建方法，包括以下步骤：
1)N重组蛋白抗原的制备：
1.1)应用RT-PCR方法得到新型冠状病毒N基因PCR扩增产物，回收，纯化；
1.2)酶切N基因PCR扩增产物，并使用T4连接酶连接pET28a载体，得到 pET28a N基因载体；
1.3)将pET28a N基因载体转化进入感受态大肠杆菌中培养；
1.4)取步骤1.3)中的菌液，使用质粒抽提纯化试剂盒提取和纯化重组pET28a N质粒；
1.5)通过PCR、酶切和测序的方法鉴定重组pET28a N质粒，将通过鉴定的重组pET28a N质粒转化进入感受态大肠杆菌中，并诱导表达N蛋白；
1.6)鉴定步骤1.5)得到的N蛋白的抗原免疫活性；然后纯化和复性N蛋白，得到N重组蛋白抗原；
2)芯片的制作：
2.1)将步骤1.6)中得到的N重组蛋白抗原用点样仪点击到载片上；
2.2)用疏水笔将点好的载片上的不同杂交区隔离，待其干燥后固定载片，然后滴加封闭液进行封闭；
2.3)以新型冠状病毒血清作为第一抗体，稀释后与步骤2.2)中的N重组蛋白抗原进行第一次杂交，杂交后洗涤，然后再与荧光标记的第二抗体进行第二次杂交，杂交后洗涤并干燥，收集数据，利用方阵实验确定第一抗体和第二抗体的最佳稀释度；
2.4)用构建的芯片分析检测梯度稀释的新型冠状病毒血清，确定芯片的检测限及线性范围，完成新型冠状病毒N-His重组蛋白芯片平台的构建。
优选的，所述载片为氪基或环氧基修饰的玻璃载片。
优选的，步骤2.1)中，在将N重组蛋白抗原点击到载片上前，先将N重组蛋白抗原稀释到lOμg/ml-1μg/μl之间，离心后取上清液等待点样。
优选的，所述N重组蛋白抗原及第一抗体的最佳稀释度的测定方法为：将N 重组蛋白抗原稀释至800μg/ml、700μg/ml、600μg/ml、500μg/ml、400μg/ml、 300μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml，用第一抗体稀释液分别按1：1500、 1：1000、1：800、1：600、1：400、1：200稀释第一抗体，采用梯度间的方阵交叉杂交进行确定N重组蛋白抗原及第一抗体的最佳稀释度。
优选的，步骤2.2)中，将载片放在相对湿度为50～60％、温度为4～25℃下固定5～10h。
优选的，步骤2.2)中，滴加封闭液后，在2～6℃下封闭10～14h。
优选的，步骤2.3)中，第一次杂交的时间为0.8～1.2h。
优选的，第一次杂交后洗涤工序为：将杂交后的载片轻缓放入盛满封闭液的离心管中浸润洗涤，倒掉封闭液后加入洗涤缓冲液连续洗涤2～3次。
优选的，步骤2.3)中，第二次杂交的时间为0.4～0.6h。
优选的，所述封闭液为含1.5％胎牛血清封闭液。
相比于现有技术，本发明的有益效果在于：
1)本发明提供了一种新型冠状病毒N-His重组蛋白芯片平台的构建方法，通过pET28a N质粒先制备有良好抗原性的N重组蛋白，然后再利用该N重组蛋白去确定第一抗体和第二抗体的最佳稀释度，最后用构建的芯片检测梯度稀释的血清确定好芯片的检测限和线性范围，由此去完成N基因重组蛋白芯片平台的构建。相对于RT-PCR检测方法，本芯片具有更稳定的检测性能，还具有高通量、微型化等特点，不易受病毒变异的影响，可以更精准、快速的实现对 2019-nCoV大批量的筛查。
2)本发明通过控制芯片制作的多个过程，准确把控点样的环境、N重组蛋白和第一抗体的最佳稀释度等等，使得本发明的芯片可以达到有效检测2000倍稀释的血清，大大增加了检测的限度。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施方式，对本发明及其有益效果作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
一种新型冠状病毒N-His重组蛋白芯片平台的构建方法，包括以下步骤：
1)N重组蛋白抗原的制备：
1.1)应用RT-PCR方法得到新型冠状病毒N基因PCR扩增产物，回收，纯化；
1.2)酶切N基因PCR扩增产物，并使用T4连接酶连接pET28a载体，得到 pET28a N基因载体；
1.3)将pET28a N基因载体转化进入感受态大肠杆菌中培养；
1.4)取步骤1.3)中的菌液，使用质粒抽提纯化试剂盒提取和纯化重组pET28a N质粒；
1.5)通过PCR、酶切和测序的方法鉴定重组pET28a N质粒，将通过鉴定的重组pET28a N质粒转化进入感受态大肠杆菌中，并诱导表达N蛋白；
1.6)鉴定步骤1.5)得到的N蛋白的抗原免疫活性；然后纯化和复性N蛋白，得到N重组蛋白抗原；
2)芯片的制作：
2.1)将步骤1.6)中得到的N重组蛋白抗原用点样仪点击到氪基或环氧基修饰的玻璃载片上；
2.2)用疏水笔将点好的载片上的不同杂交区隔离，待其干燥后固定载片，其中，固定的条件为50～60％的相对湿度、4～25℃的温度和5～10h的固定时间；固定完成后滴加封闭液在2～6℃下封闭10～14h，封闭液为含1.5％胎牛血清封闭液；
2.3)以新型冠状病毒血清作为第一抗体，稀释后与步骤2.2)中的N重组蛋白抗原进行第一次杂交，第一次杂交的时间为0.8～1.2h，杂交后洗涤，然后再与荧光标记的第二抗体进行第二次杂交，第二次杂交的时间为0.4～0.6h，杂交后洗涤并干燥，收集数据，利用方阵实验确定第一抗体和第二抗体的最佳稀释度；
2.4)用构建的芯片分析检测梯度稀释的新型冠状病毒血清，确定芯片的检测限及线性范围，完成新型冠状病毒N-His重组蛋白芯片平台的构建。
进一步地，步骤2.1)中，在将N重组蛋白抗原点击到载片上前，先将N重组蛋白抗原稀释到lOμg/ml-1μg/μl之间，离心后取上清液等待点样。
进一步地，N重组蛋白抗原及第一抗体的最佳稀释度的测定方法为：将N重组蛋白抗原稀释至800μg/ml、700μg/ml、600μg/ml、500μg/ml、400μg/ml、300μg/ml、 200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml，用第一抗体稀释液分别按1：1500、1：1000、1： 800、1：600、1：400、1：200稀释第一抗体，采用梯度间的方阵交叉杂交进行确定N重组蛋白抗原及第一抗体的最佳稀释度。
进一步地，第一次杂交后洗涤工序为：将杂交后的载片轻缓放入盛满封闭液的离心管中浸润洗涤，倒掉封闭液后加入洗涤缓冲液连续洗涤2～3次。
具体的，一种新型冠状病毒N-His重组蛋白芯片平台的构建方法，包括以下步骤：
1)N重组蛋白抗原的制备：
1.1)由美国国家生物信息中心基因库(NCBI GenBank)基因库中获取 2019-nCoV的N基因序列，设计引物，应用RT-PCR(逆转录和聚合酶链式反应) 方法得到新型冠状病毒N基因PCR扩增产物，回收，纯化；
设计引物的正义链为：GGACCCCAAAATCAGCGAAA；
反义链为：ATGTTGAGTGAGAGCGGTGA；
1.2)酶切N基因PCR扩增产物，并使用T4连接酶连接pET28a载体，得到 pET28a N基因载体；
1.3)先制备感受态大肠杆菌，然后将pET28a N基因载体转化进入感受态大肠杆菌中培养；
1.4)培养完成后，取步骤1.3)中的菌液，使用质粒抽提纯化试剂盒提取和纯化重组pET28a N质粒；其中，pET28a N质粒是pET28a N基因载体在细菌中称呼；
1.5)通过PCR、酶切和测序的方法鉴定重组pET28a N质粒，将通过鉴定的重组pET28a N质粒转化进入感受态大肠杆菌中，并诱导表达N蛋白；
1.6)将步骤1.5)中感受态大肠杆菌通过超声波裂解及尿素的洗涤进行初步纯化，然后通过亲和层析柱亲和层析进一步纯化，采用蛋白质印迹法(Western Blotting)鉴定步骤1.5)得到的N蛋白的抗原免疫活性；接着对N蛋白透析进一步纯化和复性，得到N重组蛋白抗原；Western Blotting表明N重组蛋白均具有良好的抗原性。
2)芯片的制作：
2.1)将步骤1.6)中得到的N重组蛋白抗原在冰上解冻，稀释N重组蛋白抗原到lOμg/ml-1μg/μl之间，然后将配制好的N重组蛋白抗原在低温下高速离心，取上清液加入点样板中，等待点样；
2.2)首先对点样仪进行调试及设置，依次接通电源，打开电脑，等待计算机启动完毕后打开点样仪，同时将湿度控制仪旋钮调节至45％～60％之间的相对湿度；检查点样针是否堵塞，真空泵是否正常工作，洗针池是否污秽等，然后按照点样仪操作规范依次设定点样的速度，点样针的回针高度，振针次数，洗针的次序，点样矩阵参数等等，接着更换弯曲的点样针，更换全新的洗针渡(双蒸水)；然后放入氪基或环氧基修饰的玻璃载片及振针片子；等待湿度上升至设定值后即可以开始点样；
可针对点样环境进行优化，针对点样相对湿度的优化：选择1×磷酸盐缓冲液(含20％二甲基亚砜)为点样缓冲液，将N重组蛋白稀释到700μg/ml，在45％、 50％、55％及60％四个不同的相对湿度条件下点样，发现在50％时，点样的形态具有较理想的表现；针对点样浓度的优化，用点样缓冲液将N重组蛋白稀释到四个不同的梯度，300μg/ml、500μg/ml、700μg/ml及900μg/ml，在相对湿度50％下点样，点样完后用疏水笔将样区围起来，接着洗涤后用含1.5％胎牛血清封闭液进行封闭，第一抗体为150倍稀释的阳性新冠病毒抗体，经分析对比显示500μl/ml的点样浓度较为合适；可将上述的点样环境优化结果应用到后续的点样中；
选择好点样环境后，用疏水笔将点好的片子上的不同杂交区隔离，隔离先要求均匀且圆滑，待其干燥后固定载片，其中，固定的条件为50～60％的相对湿度、4～25℃的温度和5～10h的固定时间；固定完成后，取出固定好的片子，放入湿盒，往样点区滴加封闭液(以盖住为适度)，然后在2～6℃下封闭10～14h，其中，封闭液为含1.5％胎牛血清封闭液；
2.3)小心倾倒片子上的封闭液，以临床分离出的新型冠状病毒血清作为第一抗体，稀释后与步骤2.2)中的N重组蛋白抗原在湿盒中室温下进行第一次杂交，第一次杂交的时间为1h，杂交后将片子轻缓放入盛满封闭液的离心管中浸润洗涤，倒掉封闭液后加入新鲜的洗涤缓冲液连续洗涤2～3次，其中，洗涤可在低速摇床中匀速地晃动；
洗涤完成后取出片子，轻轻倾倒去表面的洗涤液，边缘倾斜到一无粉滤纸上小心地吸去残留的洗涤液，将片子平放到湿盒内，待表面无明显的洗涤液残留后用微量移液器缓缓地往杂交区加入合适稀释倍数的荧光标记第二抗体，在湿盒中室温下进行第二次杂交，第二次杂交的时间为0.5h，杂交过程中应避免过度曝光；
杂交结束后先用封闭液快速润洗一次，然后加入新鲜的洗涤缓冲液洗涤5 次，最后用双蒸水洗涤两次，待全部洗涤完成后，将片子装入50ml离心管中，在室温下离心，最后将片子放入片子架内在50℃干燥箱内干燥，直至表面无任何液体残留，将处理好的片子避光保存于4℃中，离心过程中也应避免过度曝光。杂交的试验数据可利用方阵实验来确定第一抗体和第二抗体的最佳稀释度，具体的可将N重组蛋白抗原稀释至800μg/ml、700μg/ml、600μg/ml、 500μg/ml、400μg/ml、300μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml，用第一抗体稀释液分别按1：1500、1：1000、1：800、1：600、1：400、1：200稀释第一抗体，采用梯度间的方阵交叉杂交进行确定N重组蛋白抗原及第一抗体的最佳稀释度，结果显示在1：400的第一抗体稀释度和600μg/ml的N重组蛋白抗原浓度时，效果较优；同样的，第二抗体最佳稀释度的方法也是如此；
2.4)最后，用构建的芯片分析检测梯度稀释的新型冠状病毒血清，确定芯片的检测限及线性范围，完成新型冠状病毒N-His重组蛋白芯片平台的构建。通过回归分析显示，以N重组蛋白抗原为捕获抗原的蛋白芯片的检测线性区间在2000倍以内，检测灵敏度可以有效检测2000倍稀释的血清。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还能够对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上述的具体实施方式，凡是本领域技术人员在本发明的基础上所作出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
序 列 表
[0001]
SEQUENCE LISTING
<110> 广东医科大学附属医院
<120> 新型冠状病毒N-His重组蛋白芯片平台的构建方法
<130> 2020
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<400> 1
ggaccccaaaatcagcgaaa 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<400> 2
atgttgagtg agagcggtga 20

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒N-His重组蛋白芯片平台的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)N重组蛋白抗原的制备：
1.1)应用RT-PCR方法得到新型冠状病毒N基因PCR扩增产物，回收，纯化；
1.2)酶切N基因PCR扩增产物，并使用T4连接酶连接pET28a载体，得到pET28a N基因载体；
1.3)将pET28a N基因载体转化进入感受态大肠杆菌中培养；
1.4)取步骤1.3)中的菌液，使用质粒抽提纯化试剂盒提取和纯化重组pET28a N质粒；
1.5)通过PCR、酶切和测序的方法鉴定重组pET28a N质粒，将通过鉴定的重组pET28a N质粒转化进入感受态大肠杆菌中，并诱导表达N蛋白；
1.6)鉴定步骤1.5)得到的N蛋白的抗原免疫活性；然后纯化和复性N蛋白，得到N重组蛋白抗原；
2)芯片的制作：
2.1)将步骤1.6)中得到的N重组蛋白抗原用点样仪点击到载片上；
2.2)用疏水笔将点好的载片上的不同杂交区隔离，待其干燥后固定载片，然后滴加封闭液进行封闭；
2.3)以新型冠状病毒血清作为第一抗体，稀释后与步骤2.2)中的N重组蛋白抗原进行第一次杂交，杂交后洗涤，然后再与荧光标记的第二抗体进行第二次杂交，杂交后洗涤并干燥，收集数据，利用方阵实验确定第一抗体和第二抗体的最佳稀释度；
2.4)用构建的芯片分析检测梯度稀释的新型冠状病毒血清，确定芯片的检测限及线性范围，完成新型冠状病毒N-His重组蛋白芯片平台的构建。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2.1)中，所述载片为氪基或环氧基修饰的玻璃载片。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2.1)中，在将N重组蛋白抗原点击到载片上前，先将N重组蛋白抗原稀释到lOμg/ml-1μg/μl之间，离心后取上清液等待点样。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述N重组蛋白抗原及第一抗体的最佳稀释度的测定方法为：将N重组蛋白抗原稀释至800μg/ml、700μg/ml、600μg/ml、500μg/ml、400μg/ml、300μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml，用第一抗体稀释液分别按1：1500、1：1000、1：800、1：600、1：400、1：200稀释第一抗体，采用梯度间的方阵交叉杂交进行确定N重组蛋白抗原及第一抗体的最佳稀释度。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2.2)中，将载片放在相对湿度为50～60％、温度为4～25℃下固定5～10h。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2.2)中，滴加封闭液后，在2～6℃下封闭10～14h。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2.3)中，第一次杂交的时间为0.8～1.2h。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，第一次杂交后洗涤工序为：将杂交后的载片轻缓放入盛满封闭液的离心管中浸润洗涤，倒掉封闭液后加入洗涤缓冲液连续洗涤2～3次。
9.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2.3)中，第二次杂交的时间为0.4～0.6h。
10.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述封闭液为含1.5％胎牛血清封闭液。
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