CN103884847B - 一种结核分枝杆菌全蛋白质芯片及应用 - Google Patents

一种结核分枝杆菌全蛋白质芯片及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种结核分枝杆菌全蛋白质芯片及应用。本发明提供的一种有如下1）-7）中至少一种功能的蛋白芯片，所述蛋白芯片上连有如下4168种蛋白，且每种蛋白单独成立一个检测点；本发明的实验证明，本发明提供了一种结核分枝杆菌全蛋白质芯片，由基片和包含95%以上的结核分枝杆菌基因组编码的蛋白质组成。该全蛋白质芯片在寻找血清生物标识物、与小分子化合物c-di-GMP相互作用底物，与蛋白质激酶的相互作用的激酶底物，与巨噬细胞相互作用的底物都有明显的意义。本发明相对现有的研究手段具备全局性、高通量的筛选特点，简化了研究设计及操作过程，显著提高研究效率。

Description

一种结核分枝杆菌全蛋白质芯片及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种结核分枝杆菌全蛋白质芯片及应用。
背景技术
结核病是由结核杆菌感染所致，侵扰了人类有7000年的历史。卡介苗和抗生素的出现使结核病一度得到控制。但耐药的产生及与HIV共感染等问题使结核病在世界范围内又死灰复燃。WHO于1993年史无前例地宣布“全球结核病紧急状态”，1998年又重申了“遏制结核病刻不容缓”。目前全球60亿人约有20亿感染了结核杆菌，现有结核病患者2000万，每年死亡300万，结核病已成为传染病中的头号杀手。我国为全球22个结核病疫情严重的国家之一，年发病人数约为130万，占17%，位居全球第2位。然而，耐药的出现使得结核病问题雪上加霜。目前全球感染了结核杆菌的20亿人有5000万是耐药的。全球已有50多个国家报告发生了广泛耐药结核病例。中国是耐多药和广泛耐药结核病疫情最严重的国家之一，耐多药结核病人14万，占全球1/3～1/4的耐多药结核病人在中国。再加上全球的城市化进程加快、交通日益发达以及人口老龄化等又为结核病的流行创造了有利条件，其结果导致结核病的流行正在全球复活。
结核病疫情严重，但临床防治存在困难：1）因无特异的结核病生物标识物及其灵敏、快速的检测方法等导致结核病发现率低；2）目前无有效疫苗进行结核病预防。尽管卡介苗的普及大大降低了新生儿和青少年结核病的发病率和死亡率，但其存在保护时效较短、不同人群差异很大、对成人无效等问题。3）60年来无抗结核新药导致耐药性、不良反应和疗效不足等问题产生。目前，结核病治疗世界范围内推广使用DOTS策略。这是一种标准化疗程，即前期4种药物联用（异烟肼+利福平+吡嗪酰胺+乙胺丁醇）加后期的两种药物联用（异烟肼+利福平）。这种策略虽然在结核病治疗方面起着非常重要的作用，但结核病治疗时间长达6-9个月，导致耐药性及不同人群差异很大，导致死亡率的升高。因此迫切需要发展新的结核病诊断试剂、新型疫苗和药物。
造成目前结核病防控方面被动的最根本原因之一在于结核病和导致结核病的肺结核分枝杆菌基础研究方面的薄弱。结核病是结核杆菌与宿主免疫系统复杂斗争的结果。结核杆菌不分泌毒素，也不像病毒是有限的几个基因致病，它由4000多个蛋白组成，而且除蛋白质之外还有糖类和脂类等功能分子对于其致病性至关重要，但目前结核杆菌哪些蛋白质引起致病？哪些蛋白质可以作为新药研发的靶标？哪些蛋白质引起宿主的免疫反应还不清楚。这些基本的科学问题不清楚导致结核病诊断，疫苗和药物相关的研发无从下手。传统的结核病研究主要集中在单一因素或单一水平。需要认识到结核杆菌致病的关键问题是病原与宿主的互作，需要采用多因素、多水平的分析思路和高通量的筛选方法来理解多个因子协同作用导致结核病的发生。要想在结核病的防控方面取得突破，必需站在全局性的高度从基础的新生物标识物、新免疫原发现以及药物作用机制的揭示方面甚至更基础的结核菌的分子调控网络入手。但由于结核菌研究的一些特殊性，如生长极其缓慢、难以破碎、基因组GC含量高、蛋白质难以重组表达以及致病菌必需在P3实验室中操作等，结核病及肺结核分枝杆菌的基础研究方面长期滞后。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种蛋白芯片。
本发明提供的蛋白芯片，包括基片和与其连接的结核分枝杆菌基因组编码的85%的蛋白质；且每种蛋白单独成立一个检测点。
上述蛋白芯片中，所述结核分枝杆菌基因组编码的85%的蛋白质为表1所示的4168种蛋白；
所述基片为载体玻片。
上述蛋白芯片中，所述蛋白芯片是分别将所述4168种蛋白点样于载体玻片上制成的。
上述蛋白芯片中，所述结核分枝杆菌为结核分枝杆菌（MycobacteriumM.tuberculosis）H37Rv和结核分枝杆菌（Mycobacterium M.tuberculosis）CDC1551。
含有上述的蛋白芯片的试剂盒。
上述的蛋白芯片或试剂盒在如下1）-5）中的应用：
1）筛选与结核病患者血清特异结合的蛋白或构建与结核病患者血清特异结合的蛋白库；
2）筛选与环二鸟苷酸相互作用的结合分枝杆菌蛋白或构建与环二鸟苷酸相互作用的结合分枝杆菌蛋白数据库；
3）筛选与蛋白激酶相互作用的结合分枝杆菌蛋白或构建与蛋白激酶相互作用的结合分枝杆菌蛋白数据库；
4）筛选与非编码RNA相互作用的结合分枝杆菌蛋白或构建与非编码RNA相互作用的结合分枝杆菌蛋白数据库；
5）筛选与巨噬细胞蛋白相互作用的结合分枝杆菌蛋白或构建与巨噬细胞蛋白相互作用的结合分枝杆菌蛋白数据库。
上述应用中，所述蛋白激酶为PknB或PknE；
所述非编码RNA为MTS2823，其核苷酸序列为序列表中序列1；
所述巨噬细胞蛋白按照如下方法制备：裂解所述巨噬细胞，收集上清液得到巨噬细胞蛋白。
上述结核病患者为由结核分枝杆菌感染的患者。
上述应用中，所述巨噬细胞为单核巨噬细胞THP-1。
本发明的实验证明，本发明提供了一种结核分枝杆菌全蛋白质芯片，由基片和包含85%以上的结核分枝杆菌基因组编码的蛋白质组成。该全蛋白质芯片在寻找血清生物标识物、与小分子化合物c-di-GMP相互作用底物，与蛋白质激酶的相互作用的激酶底物，与巨噬细胞裂解物相互作用的底物都有明显的意义。本发明相对现有的研究手段具备全局性、高通量的筛选特点，简化了研究设计及操作过程，显著提高研究效率。
附图说明
图1为所制备的结核分枝杆菌蛋白的银染定量检测
图2为所制备的结核分枝杆菌蛋白的免疫印迹检测
图3为所制备的全蛋白质芯片的质控结果图
图4为全蛋白质芯片的血清分析结果图
图5为全蛋白质芯片与小分子化合物的作用结果图
图6为全蛋白质芯片与蛋白质相互作用的结果图
图7为全蛋白质芯片上进行蛋白质激酶反应的结果图
图8为全蛋白质芯片与RNA相互作用的结果图
图9为全蛋白质芯片与细胞裂解物相互作用的结果图
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、全蛋白质芯片的制备
（一）结核分枝杆菌蛋白的高通量的制备
1、表达
由基因工程改造过的酿酒酵母利用半乳糖诱导过量表达，具体过程为：
首先从分枝杆菌属结核分枝杆菌（Mycobacterium M.tuberculosis）H37Rv菌株（北京株）（Nature1998Nov12;396(6707):190；公众可从中国科学院生物物理研究所，上海交通大学，中国科学院武汉病毒研究所，广东体必康生物科技有限公司获得.）和CDC1551菌株（J Bacteriol.2002October;184(19):5479–5490；公众可从广东体必康生物科技有限公司获得..）中，分别通过PCR克隆获得H37Rv菌株3749个蛋白和CDC1551菌株419个蛋白基因编码片段，共4168个蛋白，通过Invitrogen公司的BP酶将基因编码片段连接到pDONR221载体（购自Invitrogen）上，转化到大肠杆菌DH5-Alpha中扩增，提取载体再通过LR酶（Invitrogen）换至经过改造的能够表达GST标签的pEGH-A载体（该载体在“Jian Zhu，Heng Zhu，et al：J.Virol.May2009vol.83no.105219-5231”中公开过，公众可从中国科学院生物物理研究所，上海交通大学，中国科学院武汉病毒研究所，广东体必康生物科技有限公司获得）上，再次转化到大肠杆菌DH5-Alpha中扩增，提取质粒转化到Pep4酿酒酵母菌株（该菌株在文献“Heng Zhu，Michael Snyder，et al：Nature Genetics26,283–289(2000)doi:10.1038/81576”中公开过，公众可从中国科学院生物物理研究所，上海交通大学，中国科学院武汉病毒研究所，广东体必康生物科技有限公司获得）中。诱导培养基中培养，待其OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为2g/L的半乳糖，诱导6h，4000rpm离心收集菌，-80℃保存。
每1L诱导培养基（溶剂为水）中含有的组分如表1所示：
表1
2、纯化
1)、准备裂解液：
50ml裂解液中加50μl巯基乙醇，125μlPMSF及两片Roche蛋白抑制剂；
2)、于-80℃冰箱里取出上述步骤1收集的菌（从120ml诱导培养基培养收集到的菌体），加400μl氧化锆珠和400μl裂解液，4℃环境中震荡30s，后置冰上2min，重复四次；
3)、取出后11,000rpm离心2min，取上清于一新的15ml离心管中；
4)、重复2）和3）步四次，将上清收集于同一离心管中；
5)、添加裂解液至12ml即原始诱导培养基体积的1/10，同时用没加抑制剂的裂解液将谷胱甘肽beads清洗3次。12ml裂解液中加入300μl的beads；
6)、加入beads后的裂解液于4℃孵育2h；
7)、11,000rpm离心2min后取上清保存于4℃。Beads用清洗液Ι和清洗液II各洗3次；
8)、加300μl洗脱缓冲液孵育15min后，离心取上清收集于一新的离心管中，重复一次。
得到的洗脱液即溶有该蛋白。
上述纯化过程中所用到的缓冲液（溶剂均为水）的组成见表2-表5.
表2裂解液（1L）
表3清洗液I(1L)
表4清洗液II(1L)
表5洗脱缓冲液(1L)
3、鉴定
下述实验过程中，所述的溶剂或液体的百分数为体积百分数。
1）、材料制备
配置两块12%的SDS-PAGE胶，1.0mm，15孔。一块银染，一块Western Blotting。取上述纯化好的蛋白各20μl，加入4μl6X Loading buffer，同时制备规格浓度梯度的BSA样品作为银染定量对照，煮样5min。
2)、跑胶
依次每孔加入12μl上述制备好的样品，BSA梯度样品，2.5μMarker（Takara）记录次序。80V30min，140V1h。
3）银染操作步骤：
固定：30min或者更长时间40%乙醇10%冰醋酸加水到250ml
致敏：30min75ml乙醇30%乙醇17g乙酸钠28.2g三水乙酸钠0.5g硫代硫酸钠（大苏打）加水到终体积250ml
水洗：3x10min
银染：20min0.625g AgNO3100μl37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml
水洗：2x1min
显色：时间视情况而定6.25g Na2CO350μl37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml
终止：10min1g甘氨酸加水到终体积250ml
保存：1%冰醋酸，4℃
4）Western-Blotting步骤：
转膜：15V40min（半干转，Bio-Rad）。转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml
封闭：5%脱脂牛奶（Bio-Rad）1h。
第一抗体孵育：Anti-GST鼠抗（NovaGen）终浓度1μg/ml1h
第二抗体孵育：羊鼠抗荧光800通道（Odyssey）终浓度1μg/ml1h
Odyssey扫描仪扫描，保存图片。
进行银染定量和Western-Blotting鉴定。
部分结果分别如图1和图2所示。图1结果表明所制备的Rv0174Rv2823c Rv1860cRv1984c Rv2220Rv2874Rv0002Rv0040c Rv0583c Rv1899c Rv3803c Rv1166Rv3835蛋白的量均为50μg/ml；图2结果证明，所制备的Rv0174Rv2823c Rv1860c Rv1984cRv2220Rv2874Rv0002Rv0040c Rv0583c Rv1899c Rv3803c Rv1166Rv3835蛋白正确。
其余蛋白也均验证正确。
经测序，所制备的4168种蛋白的氨基酸序列对应的UniProtKB号为如下表6所示。
表6为4168种蛋白名称及其对应的UniProtKB号
（二）全蛋白质芯片的制备
在上述制备的4168种蛋白对应的各自洗脱液中，分别加入终浓度为25%（体积百分比）的甘油、0.02%（体积百分比）的Tween20、终浓度为0.05mg/ml的BSA和终浓度为0.1g/L的NaN3混匀，分别得到4168种用于芯片点制的蛋白溶液。将上述用于芯片点制的蛋白溶液分装于384孔版中，每孔8μl作为样品板，不点样时该板置于-80℃低温保存。
采用生物芯片点样仪将上述用于芯片点制的蛋白溶液分别点于载体玻片（载体玻片为商品化的三维H载体玻片，购自北京博奥生物芯片有限责任公司）上，每点点样约1nL、2个平行点，且每种蛋白单独成立一个检测点。
点样结束后保持在35%RH湿度4℃环境中16h后，将玻片放置于塑料盒中封口-80℃低温保存，得到全蛋白质芯片即为蛋白芯片。
该芯片上还点有IgG标准品或Cy5标记抗人抗体二抗的混合液。
（三）全蛋白质芯片的质控
1、芯片质控具体操作步骤：
1)将上述（二）点制好密封的全蛋白质芯片从-80℃取出，室温复温10分钟。
2)封闭：将芯片放入洗涤盒，加入约50ml芯片封闭液（见表3），摇床50rpm，室温1h。
3)快速甩掉芯片上多余的液体，置于湿盒内。
4)单张芯片加入1ml已经稀释至终浓度1μg/ml的GST标签鼠抗（Novagen）于芯片上，反应1h。
5)将芯片从湿盒中取出，置于洗涤盒，加入约50ml上述配制的洗涤液，摇床50rpm，室温5min，重复3次。再用约50ml超纯水洗一次，5min。
6)快速甩掉芯片上多余的液体，置于湿盒内。
7)单张芯片加入1ml已经稀释至终浓度1μg/ml的Cy3荧光抗鼠第二抗体于芯片上，避光反应1h。
8)将芯片从湿盒中取出，置于洗涤盒，加入约50ml上述配制的洗涤液，摇床50rpm，室温5min，重复3次。再用约50ml超纯水洗一次，5min。
9)离心干燥，用Genepix扫描仪在532nm通道下读取数据。
2、质控过程中所涉及的各种缓冲液及试剂的配制
（1）洗涤液：（见表7）pH7.4的PBST溶液
表7
（2）芯片封闭液（见表8）：含BSA的pH7.4PBS溶液
表8
（3）Cy3标记抗鼠第二抗体的浓缩液：使用市售的抗人IgM-Cy5荧光标记二抗，稀释至浓度为1mg/ml，分装于避光小管。
结果如图3所示，质控显示所点制每株蛋白荧光强度信噪比显著，可用于下游蛋白质组学芯片应用。
实施例2、应用全蛋白质芯片检测血清
（一）待测血清样品的准备
结核病患者（感染结核分歧杆菌）血清和健康人群血清（广东省结核病控制中心）本于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟左右，取上清即可立即检测；或进行分装，并将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。4℃解冻后的样品应再次离心，然后检测。
（二）诊断过程中所涉及的各种缓冲液及试剂的配制
（1）样品稀释液（见表9）：pH7.4PBS溶液
表9
（2）洗涤液（见表10）：pH7.4的PBST溶液
表10
（3）芯片封闭液（见表11）：含BSA的pH7.4PBS溶液
表11
（4）Cy5标记抗人第二抗体的浓缩液：使用市售的抗人IgM-Cy5荧光标记二抗，稀释至浓度为1mg/ml，分装于避光小管。
（三）应用全蛋白质芯片进行血清分析
使用实施例1制备的全蛋白质芯片可用于血清分析。
1、具体操作步骤
1)将实施例1制备的全蛋白质芯片从-80℃取出，室温复温10分钟。
2)封闭：将芯片放入洗涤盒，加入约50ml芯片封闭液（见表3），摇床50rpm，室温1h。
3)快速甩掉芯片上多余的液体，置于湿盒内。
4)待测样品的稀释与加样：将待测血清样品按体积比1:100用上述配制的样品稀释液（见表1）稀释，取30μL稀释后的含待测血清的溶液加入到封闭的围栏封闭空间中。反应1h，室温。待检测样品临用前15分钟内配制。
5)将芯片从湿盒中取出，置于洗涤盒，加入约50ml上述配制的洗涤液，摇床50rpm，室温5min，重复3次。
6)快速甩掉芯片上多余的液体，置于湿盒内。
7)每个封闭空间加入30μL已经稀释至终浓度1μg/ml的Cy5荧光抗人二抗于芯片上，避光反应1h。
8)将芯片从湿盒中取出，置于洗涤盒，加入约50ml上述配制的洗涤液，摇床50rpm，室温5min，重复3次。再用约50ml超纯水洗一次，5min。
9)离心干燥，用Genepix扫描仪在635nm通道下读取数据。
部分结果如图4所示，
Rv2693c、Rv1984c、Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287、Rv3835和Rv0174这些蛋白与结核病患者血清均特异结合，而与健康人群血清无特异结合，因此表明蛋白质组芯片可用于筛选与结核病患者血清特异结合的蛋白或构建与结核病患者血清特异结合的蛋白库。
实施例3、全蛋白质芯片与小分子化合物c-di-GMP相互作用
c-di-GMP（环二鸟苷酸）是一个在细菌中普遍存在的第二信使分子，调控生物被膜形成、毒力、运动和细胞分化等多样性的细胞活动。近来有研究发现Mycobacterium Tuberculosis和Mycobacterium smegmatis有合成c-di-GMP和调节c-di-GMP变化的酶，但是对于c-di-GMP在Mycobacterium Tuberculosis体内是如何调节的一直都不清楚。利用TB全蛋白质芯片，可以全局性发现c-di-GMP相互作用蛋白，对其进行功能研究，进而更清楚和更准确的认识到c-di-GMP在MycobacteriumTuberculosis的作用。
1、封闭芯片
用1×TBST配制20mL的3%BSA封闭液，倒入封闭盒中，从-80℃冰箱中取两张由实施例1制备的全蛋白质芯片放入其中，将封闭盒放在平摇摇床上，50-60rmp/min，室温1h。
2、样品准备
用PBS配制1mM biotin，取1μL加入3mL PBS中，作为阴性对照；用PBS配制2mM biotin-c-di-GMP(购于BioLog，B098-001)，取0.5μL加入3mL PBS中，待下一步反应。
3、蛋白与芯片反应
将封闭好的两张芯片放在自制四孔板中，加入准备好的样品，放在摇床上缓慢摇动，4℃，过夜。
4、清洗
将芯片取出放在清洗盒中，用20mL1×TBST清洗5min，重复3次。
5、检测探针
将清洗好的两张芯片放在自制四孔板中，按1：1000加cy3-strepadvin（购于sigma）到其中，放在摇床上缓慢摇动，室温，1h。
6、清洗
将芯片放在清洗盒中，用20mL1×TBST清洗5min，重复3次；用20mL ddH2O清洗5min。
7、甩干
取出芯片，用甩干仪进行甩干。
8、扫描
Genepix扫描仪在532nm通道下读取数据。
部分结果如图5所示，Rv3420c、Rv1525、Rv0523c、Rv3756c、Rv0191、Rv2656c、Rv2937、Rv0379芯片结果信噪比均大于3，差异显著，说明这些蛋白与小分子化合物c-di-GMP作用。
因此该蛋白芯片可以筛选与环二鸟苷酸相互作用的结合分枝杆菌蛋白或构建与环二鸟苷酸相互作用的结合分枝杆菌蛋白数据库。
实施例4、全蛋白质芯片与蛋白质激酶PknB的相互作用
已知结核分枝杆菌编码11种丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶。这些蛋白激酶在结核菌的生长、分裂、浸染宿主和致病的一系列过程中扮演重要角色。通过将蛋白激酶与全蛋白质芯片反应，可以找到与之相互作用的蛋白质，从而可揭示这些激酶的整体调控网络。
1、活化菌株
1）、从TB蛋白库中挑选出需要的2种蛋白激酶菌种PknB,PknE(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶E)（PknB：UniprotKB P0A5S4PknE:UniprotKBP72001）于固体活化培养基（表12）上，放于30℃培养箱中培养2天。
2）、挑去单菌落于96孔板中，其中加入液体活化培养基1mL，培养两天，待OD值达到2.0以上，方可进行诱导。
2、诱导蛋白表达
1）、将活化好的菌液以1:1500的比例加入到300mL诱导培养基（表13）中，30℃，220rpm，培养14-17h,待OD值在0.6-0.8时加入2%半乳糖（生工）诱导培养6个小时，之后进行收菌。
3、收菌
1）、提前将离心机设置成4℃。
2）、将菌液各自倒入50mL离心管中，3900rpm,4℃,5min,倒掉上清。
重复上述步骤直到所有的菌体都已离心完全。
3）、将收集好的菌体放于-80℃冰箱进行保存，方便后续提取蛋白。
4、纯化蛋白
1)、准备裂解液：
50ml裂解液（表14）中加50μl巯基乙醇(sigma)，125μlPMSF（sigma）及两片Roche蛋白抑制剂(Roche)；
2)、于-80℃冰箱里取出上述步骤3收集的菌体，加600μl氧化锆珠和1mL裂解液，4℃环境中震荡1min，后置冰上1min，重复四次；
3)、取出后12,000rpm离心3min，取上清于一新的50mL离心管中；
4)、重复2和3步四次，将上清收集于同一离心管中；
5)、添加裂解液至30ml，同时用没加抑制剂的裂解液将谷胱甘肽beads(国家生物化学研发中心)清洗3次。30ml裂解液中加入800μl的beads；
6)、加入beads后的裂解液于4℃孵育2h；
7)、12,000rpm离心3min后取上清保存于4℃，Beads用wash bufferΙ（表15）和wash buffer II（表16）各洗3次；
8)、加800μl洗脱液孵育15min后，离心取上清收集于一新的离心管中，重复一次。得到的洗脱液(表17)即溶有目的蛋白（目的蛋白为蛋白质激酶PknB，其氨基酸序列为序列2）。
5、鉴定
1）、材料制备
配置两块8%的SDS-PAGE胶，1.0mm，15孔。一块用于银染确定蛋白含量，一块用于做Western Blotting鉴定蛋白质是否是目的蛋白。取上述纯化好的蛋白各20μl，加入4μl6X Loading buffer（碧云天生物有限公司），同时制备规格浓度梯度的BSA样品作为银染定量对照，煮样5min。
2)、跑胶
依次每孔加入12μl上述制备好的样品，BSA梯度样品，2.5μLMarker（Takara）记录次序。60V30min，120V1h。
3）、银染操作步骤：
固定：30min或者更长时间40%乙醇10%冰醋酸加水到250ml
致敏：30min75ml乙醇30%乙醇17g乙酸钠28.2g三水乙酸钠0.5g硫代硫酸钠（大苏打）加水到终体积250ml
水洗：3x10min
银染：20min0.625g AgNO3100μl37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml
水洗：2x1min
显色：时间视情况而定6.25g Na2CO350μl37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml
终止：10min1g甘氨酸加水到终体积250ml
保存：1%冰醋酸，4℃
4）、Western-Blotting步骤：
转膜：160mA,80min（半干转，Bio-Rad）。转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml
封闭：将NC膜放入5%脱脂牛奶（Bio-Rad）中封闭1h。
第一抗体孵育：Anti-V5鼠抗（sigma）终浓度1μg/ml孵育1h。
用TBST缓冲液洗膜3次，每次5min。
第二抗体孵育：羊鼠抗荧光800通道（Odyssey）终浓度1μg/ml1h。
用TBST缓冲液洗膜3次，每次5min。
Odyssey扫描仪扫描，保存图片。
6、蛋白与芯片相互作用
1）、封闭芯片
用3%BSA封闭液（表19）封闭由实施例1制备的全蛋白质芯片，60rpm平摇1h。
2）、蛋白与芯片反应
将蛋白质激酶PknB浓缩到50ng/uL，取200uL加与芯片上，用盖玻片均匀涂布，室温，放于湿盒中静置1h。
用PBST缓冲液（表18）洗芯片3次，每次5min。
3）、一抗孵育
每张芯片加入1:1000稀释的V5鼠抗（Sigma）1mL,室温，湿盒静置1h。
用PBST缓冲液洗芯片3次，每次5min。
4）、荧光标记
用cy5荧光标记物(jackson)进行标记，室温，湿盒静置1h。
用PBST缓冲液洗芯片3次，每次5min。
5）、Genepix检测
将芯片与甩干机上甩干，放于Genepix扫描仪进行检测。
试剂配方：
表13活化培养基
表14诱导培养基
表15裂解液
表16Wash I(1L)
表17Wash II(1L)
表18洗脱液
表19PBST洗脱液
表20封闭液
表21PBS缓冲液
表21激酶缓冲液
部分结果如图6所示，Rv0334、Rv2861c、Rv1984c、Rv1496、Rv2263、Rv0475、Rv3183、Rv1525芯片结果信噪比均大于3，差异显著，说明这些蛋白与蛋白质激酶PknB作用。
因此该蛋白芯片可以筛选与蛋白激酶PknB相互作用的结合分枝杆菌蛋白或构建与蛋白激酶PknB相互作用的结合分枝杆菌蛋白数据库。
实施例5、在全蛋白质芯片上进行PknE激酶反应
已知结核分枝杆菌编码11种丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶。这些蛋白激酶在结核菌的生长、分裂、浸染宿主和致病的一系列过程中扮演重要角色。通过将蛋白激酶与全蛋白质芯片反应，可以寻找到可被激酶磷酸化的底物蛋白质，阐明结核分枝杆菌的磷酸化信号通路及相应的功能。
1)、用3%BSA封闭缓冲液（表19）封闭由实施例1制备的全蛋白质芯片1h。
2）、用激酶缓冲液（表11）将激酶蛋白PknE稀释到50ng/uL。
3）、封闭后，将芯片转移到湿盒中，向其表面的一端加入稀释的激酶200uL,用盖玻片覆盖，放入30℃培养箱中1h。
4）、用PBST缓冲液（表18）洗涤芯片三次，每次5min。
5）、配制好的phos-tag（wako）试剂点到芯片上，1mL/片，1h。
6）、用PBST缓冲液洗涤芯片三次，每次5min。
7）、按1:1000的比例稀释荧光染料streptavidin-cy3(odessy)加入到芯片上，反应1h。
8）、用PBST缓冲液洗涤芯片三次，每次5min。
9）、用芯片甩干机甩干，然后用Genepix扫描仪进行扫描芯片，数据读取与分析。
部分结果如图7所示，Rv1223、Rv1525、MT0177、Rv1563、Rv1267c、Rv3183、Rv0327c、Rv2578c芯片结果信噪比均大于2.5，差异显著，说明这些蛋白与蛋白质激酶PknE作用。
因此该蛋白芯片可以筛选与蛋白激酶PknE相互作用的结合分枝杆菌蛋白或构建与蛋白激酶PknE相互作用的结合分枝杆菌蛋白数据库。
实施例6、全蛋白质芯片与非编码RNA MTS2823的相互作用研究
近年来，随着越来越多的非编码RNA分子的功能发现，人们越来越意识到ncRNA对细胞体内调节有着巨大的潜力。目前有研究发现有一些的ncRNAs，特别是sRNA，在Mycobacteria Tuberculosis中对其适应环境以及产生毒力有很重要的调节作用。但是，这些ncRNA在Mycobacteria Tuberculosis是如何进行调控而发挥其起作用并不清楚。利用TB全蛋白质芯片可以进行全局性的发现这些ncRNA是和哪些蛋白相互作用，进而研究其功能以及调节机理。已知，MTS2823的过表达对Mycobacterium smegmatis（MTB的模式生物）有致死性。
1、准备模板：质粒（pUC157,上海生工，A3159）线性化:
1）线性化（50μL体系）(限制性内切酶购于NEB)
50μL/管，10管，37℃过夜，2h。
2）酶灭活：65℃20min。
3）胶回收：配制1%DNA胶，120V，35min。然后，使用胶回收试剂盒（购于天根生物科技有限公司）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。步骤如下：
①柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）
②将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。
③向胶块中加入等倍体积溶液PC（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μl PC溶液），50℃水浴放置10min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块）。
④将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
⑤向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
⑥重复操作步骤5
⑦将吸附柱CB2放入收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。
⑧将吸附柱CB2放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的灭菌水离心2min，收集MTS2823的DNA溶液。
4）浓度测定：Nanodrop2000测定，MTS2823的DNA浓度为：360.2ng/μL，50μL。
2、体外转录
使用in vitro transcription kit(购于Promega)进行体外转录，步骤如下：
1)转录体系配制：
2)反应条件:37℃，1h。
3)模板消除：加Rnase-free Dnase(1U/μg DNA),37℃，15min。
4）DNA胶验证：1%DNA胶，120V，35min。
3、RNA纯化：
1)加7.5M LiCl，总浓度为2.5M，-20℃，30min。
2)最高转速离心15min,弃上清，用70%预冷乙醇洗pellet来去除残留盐。
3)用binding buffer重悬。
4)二级结构：将bio-HOTAIR用binding buffer稀释成一定浓度；
90℃，2min;冰上，2min;RT,20min,得到二级结构。
将得到的RNA送去测序，该RNA的核苷酸序列为序列表中的序列1。
4、芯片反应
1)封闭：用1×TBST配制20mL的3%BSA封闭液，倒入封闭盒中，从-80℃冰箱中取两张由实施例1制备的全蛋白质芯片放入其中，将封闭盒放在平摇摇床上，50-60rmp/min，室温1h。
2)芯片反应：将封闭好的两张芯片放在湿盒中，加入准备好的样品，室温静置1h。
4)清洗：将芯片放在清洗盒中，用20mL1×TBST清洗5min，重复3次；用20mL ddH2O清洗5min。
5）甩干：取出芯片，用甩干仪进行甩干。
6）扫描：Genepix扫描仪在635nm通道下读取数据。
部分结果如图8所示，Rv0813c、Rv1321、Rv3208、Rv3246c、Rv3674c、Rv2788、Rv0491、Rv2957芯片结果信噪比均大于2.5，差异显著，说明这些蛋白与非编码RNAMTS2823作用。
因此该蛋白芯片可以筛选与非编码RNA相互作用的结合分枝杆菌蛋白或用于构建与非编码RNA相互作用的结合分枝杆菌蛋白数据库。
实施例7、全蛋白质芯片与巨噬细胞裂解物
结核分枝杆菌是一种兼性细胞内寄生菌，巨噬细胞是其在感染人体后主要的宿主细胞，在感染过程中与巨噬细胞发生了一系列的复杂的相互作用。利用实施例1制作的结核分枝杆菌全蛋白质芯片，可以全局性高通量的研究结核分枝杆菌蛋白与宿主巨噬细胞蛋白的相互作用，从中筛选出可以作为新药研发的靶标蛋白。
具体步骤：
一、蛋白制备
1.将25cm2培养瓶中的单核巨噬细胞THP-1（中国科学院细胞库目录号：TCHu57）（细胞的数量为106/mL）置于15mL离心管中，800rpm/min，离心5min；
2.去掉上清液，沉淀用预冷的DPBS洗三次；
3.将离心管中的液体完全吸除干净后，加入175ul的细胞裂解液，将离心管置于冰上20分钟，用移液枪反复吹打裂解液；
4.将离心管于4℃中，20，000g,20min，之后吸取上清于新的1.5mL离心管；
5.用BCA法（Pierce）测定蛋白含量，确保蛋白浓度在1.0mg/mL，蛋白按照60KD计算摩尔量；
6.用生物素-NHS（Thermo-Pierce）标记蛋白，生物素-NHS与蛋白的摩尔比例为1:7；
7.用2M甘氨酸溶液进行终止反应；
8.加入1x蛋白酶抑制剂（Roche（罗氏）目录号14653600）后即为制备好的巨噬细胞总蛋白。
二、芯片处理
1.将由实施例1制备的全蛋白质芯片置于培养皿中，用Washing Buffer A洗三次，每次10min
2.将全蛋白质芯片置于封闭液中室温3h
3.用Washing Buffer A洗4次，每次5min
4.用Washing Buffer B洗2次，每次5min
5.将全蛋白质芯片置于孵育缓冲液中（封闭液中加入终浓度为1%的Tween-20），加入巨噬细胞总蛋白，总蛋白与孵育缓冲液的体积比例为1:100
6.用Washing Buffer A洗4次，每次5min
7.用Washing Buffer B洗2次，每次5min
8.将链霉亲和素-Cy3（NEB）(1%BSA+1xPBST，按1:2000稀释)1mL铺满芯片，RT，静置45min-60min,避光
9.用1xPBST洗4次，每次5min
10.用ddH2O洗2次，每次5min
11.使用甩干机的配方5甩干芯片，并扫描全蛋白质芯片
三、各裂解液配方：
1.细胞裂解液：
表22为细胞裂解液配方
补H2O至10mL，置于冰上直至使用，PMSF在使用前添加
2.Washing buffer A:0.01%叠氮钠（w/v），0.05%Tween-20（w/v），0.05%TritonX-100(w/v)融入1x PBS
3.Washing buffer B:0.5x PBS
部分结果如图9所示，Rv3804c、Rv0475、Rv3048c、Rv0498、Rv0579、Rv3197、Rv0548c、Rv0334芯片结果信噪比均大于2.5，差异显著，说明这些蛋白与巨噬细胞全蛋白作用。
因此该蛋白芯片可以筛选与巨噬细胞蛋白相互作用的结合分枝杆菌蛋白或用于构建与巨噬细胞蛋白相互作用的结合分枝杆菌蛋白数据库。

Claims (7)

1.一种蛋白芯片，包括基片和与其连接的表6所示的4168种蛋白；且每种蛋白单独成立一个检测点；所述基片为载体玻片。
2.根据权利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于：
所述蛋白芯片是分别将所述4168种蛋白点样于载体玻片上制成的。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白芯片，其特征在于：所述结核分枝杆菌为结核分枝杆菌(Mycobacterium M.tuberculosis)H37Rv和结核分枝杆菌(MycobacteriumM.tuberculosis)CDC1551。
4.含有权利要求1-3中任一所述的蛋白芯片的试剂盒。
5.权利要求1-3中任一所述的蛋白芯片或权利要求4所述的试剂盒在如下1)-5)中的应用：
1)筛选与结核病患者血清特异结合的蛋白或构建与结核病患者血清特异结合的蛋白库；
2)筛选与环二鸟苷酸相互作用的结合分枝杆菌蛋白或构建与环二鸟苷酸相互作用的结合分枝杆菌蛋白数据库；
3)筛选与蛋白激酶相互作用的结合分枝杆菌蛋白或构建与蛋白激酶相互作用的结合分枝杆菌蛋白数据库；
4)筛选与非编码RNA相互作用的结合分枝杆菌蛋白或构建与非编码RNA相互作用的结合分枝杆菌蛋白数据库；
5)筛选与巨噬细胞蛋白相互作用的结合分枝杆菌蛋白或构建与巨噬细胞蛋白相互作用的结合分枝杆菌蛋白数据库。
6.根据权利要求5的应用，其特征在于：
所述蛋白激酶为PknB或PknE；
所述非编码RNA为MTS2823，其核苷酸序列为序列表中序列1；
所述巨噬细胞蛋白按照如下方法制备：裂解所述巨噬细胞，收集上清液得到巨噬细胞蛋白。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述巨噬细胞为单核巨噬细胞THP-1。
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