CN112725484A

CN112725484A - 结核分枝杆菌sRNA实时荧光定量PCR标准品及其应用

Info

Publication number: CN112725484A
Application number: CN202110084221.1A
Authority: CN
Inventors: 付英梅; 张凤民; 李婷; 顾伟; 宋武琦; 范云帆
Original assignee: Harbin Medical University
Current assignee: Harbin Engineering University; Harbin Medical University
Priority date: 2021-01-21
Filing date: 2021-01-21
Publication date: 2021-04-30

Abstract

本发明公开了一种结核分枝杆菌sRNA实时荧光定量PCR标准品及其应用。为了更准确的检测样本中的结核分枝杆菌sRNAMTS2823的表达水平，本发明设计了RNA标准品序列，并建立了相应的定量检测体系。本发明中的RNA标准品绘制的RT‑qPCR标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系，可对生物样本中的sRNAMTS2823序列进行绝对值定量，可用于检测样本中的结核分枝杆菌sRNAMTS2823的表达水平。

Description

结核分枝杆菌sRNA实时荧光定量PCR标准品及其应用

技术领域

本发明涉及结核分枝杆菌一种sRNA标准品的设计、制备和在实时定量检测中的应用。属于微生物学领域，

背景技术

细菌的小RNA(small RNA，sRNA)是在菌体中表达量较高、能形成二级结构、具有稳定性的一类小分子非编码RNA。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)是结核病的病原体。2019年，全球估计有1000万人患结核病，140万人因结核病死亡[Globaltuberculosis report 2020.Geneva:World Health Organization.Licence:CC BY-NC-SA3.0IGO,2020.]。MTB是细胞内寄生菌，在宿主体内生长缓慢，其致病机制仍不甚清晰。受机体免疫水平和抗痨药物的影响，不同的MTB感染者细菌增殖状态和排菌量有很大差异，导致结核病的病原学分离阳性率很低。在感染组织中，受机体免疫作用或抗结核药物的影响，结核分枝杆菌的sRNA出现差异表达，参与感染与免疫的进程。所以，对MTB sRNA表达量的准确测定，有利于进一步深入研究sRNA在MTB致病中的作用、探索MTB sRNA作为特异性诊断标志物的价值。MTS2823为体外培养的MTB指数增长期时含量最丰富的一种sRNA，在小鼠感染的肺组织中，MTS2823也是表达水平较高的一类sRNA[KB,A.,et al.,Sequence-basedanalysis uncovers an abundance of non-coding RNA in the total transcriptomeof Mycobacterium tuberculosis.PLoS pathogens,2011.7(11):p.e1002342.DV,I.,etal.,Expression ofMycobacterium tuberculosis small RNAs in mice models oftuberculosis.Bioorganicheskaiakhimiia,2014.40(2):p.253-6.]。

近年来，在病原微生物核酸的检测中，实时荧光定量PCR技术应用广泛。逆转录(reverse transcription，RT)和实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)为定量检测样品中的RNA提供了技术手段。定量PCR中常用的标准品来自基因组DNA或者质粒DNA片段，经制定工作标准曲线后，可实现对样本中DNA的准确定量。目前，研究者定量检测样品中的RNA表达水平时，也使用这类标准品。但是，样本中RNA的定量检测，采用的方法为逆转录-定量PCR法(RT-qPCR)，即先经过逆转录过程将RNA转化为cDNA后，方可进一步通过qPCR的方法对其中的靶cDNA进行检测。逆转录的效率通常在30-40％左右，并且具有很高的可变性，不同RNA拷贝被逆转录成cDNA的效率不同[

A.,et al.,Properties ofthe reverse transcription reaction in mRNA quantification.Clinical chemistry,2004.50(3):p.509-15.Miranda,J.A.and G.F.Steward,Variables influencing theefficiency and interpretation of reverse transcription quantitative PCR(RT-qPCR):An empirical study using Bacteriophage MS2.JVirol Methods,2017.241:p.1-10.]。基于DNA标准品所制定的工作标准曲线，定量的为逆转录后靶cDNA的拷贝数，而受逆转录效率的影响，用于反映样本中的RNA拷贝数时会发生很大偏差，常导致测定值远低于样品中的实际RNA拷贝数。

MTB的sRNA通常具有较高的GC含量和复杂的二级结构，目前，MTB sRNA的定量检测的明显掣肘，就是市场上缺少一种质量稳定、定量准确的标准对照样品。因此，本发明以MTB菌体中表达量较高、且能形成稳定发夹结构的sRNAMTS2823为检测靶标，设计并合成了相应的sRNA标准品，经实验验证最终得到了一段可用于定量检测MTB sRNA MTS2823表达水平的sRNA标准品，可用于细菌、细菌培养上清以及人体样本中结核分枝杆菌sRNA MTS2823的定量检测。

发明内容

本发明目的是提供一种在逆转录实时荧光定量PCR中能准确地定量样本中sRNA表达水平的标准品和检测方法，可对样本中的sRNA进行准确定量，克服了现有核酸定量PCR检测技术中，DNA标准品对样品中实际RNA含量定量不足的问题，提高了逆转录实时荧光定量PCR检测sRNA含量的准确性。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明根据结核分枝杆菌sRNAMTS2823的基因序列，根据其GC含量和二级结构特征，选取其中一段长96nt的核苷酸序列，经人工合成相应的RNA，作为sRNA标准品。所述的标准品为一段RNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，本发明还提出了一对用于检测所述的结核分枝杆菌sRNA实时荧光定量PCR标准品的引物。

其中，优选的，所述的引物由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

其中，优选的，所述的引物用于实时荧光定量PCR检测时，其qPCR体系如下所示：

qPCR反应条件如下所示：

更进一步的，本发明还提出了所述的结核分枝杆菌sRNA实时荧光定量PCR标准品在制备检测结核分枝杆菌sRNA表达水平试剂中应用。

其中，优选的，所述的结核分枝杆菌sRNA为sRNAMTS2823。

更进一步的，本发明还提出了所述的引物在制备检测结核分枝杆菌sRNA表达水平试剂中应用。

其中，优选的，所述的结核分枝杆菌sRNA为sRNAMTS2823。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1.本发明设计的sRNA标准品具有较大的检测范围，在3.6×10⁹～3.6×10²copies/μl范围内，qPCR的扩增效率为90.06％，R2＝0.99，具有较高的灵敏度。可用于细菌、细菌培养上清以及人体样本中的sRNA拷贝的定量。

2.本发明作为检测样本中sRNA拷贝数的RNA标准品，在逆转录之前加入检测体系，定量结果消除了逆转录效率带来的偏差，更精确的反映样本中sRNA的拷贝数，提高检测结果的准确性。

3.结核分枝杆菌sRNA丰度较高，但通常具有较高GC含量和复杂二级结构。本发明的sRNA标准品可以作为定量PCR核酸检测试剂的标准品，用于定量检测结核分枝杆菌复杂结构sRNA的拷贝数。

4.使用本发明的sRNA标准品制作的标准曲线具有较高的相关性和扩增效率，可作为sRNA检测试剂盒的标准品组件使用。

5.使用本发明的sRNA标准品，可灵敏定量结核分枝杆菌的低拷贝sRNA，对研发和使用低丰度结核病RNA诊断标志物，提高结核病检出率，有重要意义。

附图说明

图1为不同浓度的RNA标准品在荧光定量PCR时的扩增曲线；

图2为RNA标准品的熔解曲线；

图3为RNA标准品进行荧光定量PCR扩增建立的标准曲线。

图4为BCG菌体sRNAMTS2823的CT值检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神及范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1RNA标准品序列及引物设计

1.采用生物信息学分析方法，根据sRNAMTS2823的序列和结构特征，设计RNA标准品序列见表1，引物序列见表2。

表1RNA标准品序列信息

表2检测标准品片段的引物序列

RNA标准品序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

实施例2建立sRNA标准品实时定量PCR检测体系并绘制标准曲线

1、sRNA标准品逆转录

(1)取sRNA标准品#2823-WT(SEQ ID No.1)干粉一管(0.6nmol)，以100μl DEPC处理水溶解。1mol RNA为6.02×10²³个拷贝数(copies)，0.6nmol的RNA干粉标准品为3.6×10¹⁴copies，100μl DEPC处理水溶解后为3.6×10¹²copies/μl。

(2)将sRNA标准品进行10的倍比稀释(10¹²-100copies/μl，10μl的RNA标准品和90μl的DEPC处理水)。

(3)取各浓度的1μl RNA标准品用于逆转录。

逆转录体系如表3所示。

表3逆转录体系

sRNA标准品#2823-WT体积	1μl
		逆转录试剂ALLINONE	4μl
Nuclease-FreeWater	15μl
		合计	20μl

逆转录程序为：25℃10min，42℃15min，85℃5min。

2、每个稀释倍数的cDNA取2μl做qPCR实验。

(1)qPCR体系(含引物，DEPC处理水，qPCRmix，cDNA)如表4所示。

表4 qPCR体系

2823-F(10μM)	0.6μl
		2823-R(10μM)	0.6μl
2XEvagreenqPCRmix	10μl
		DEPC处理水	6.8μl
cDNA	2μl
		合计	20μl

(2)qPCR反应条件如表5所示：

表5 qPCR反应条件

步骤	循环
		95℃300S	1
95℃10S；60℃20S；72℃20S	45
		98℃10s；65℃60s；97℃1s	1
37℃30s	1

3、结果判定：

(1)10倍差梯度稀释的RNA标准品样本(3.6×10⁹～3.6×10²copies/μl)经荧光定量PCR方法扩增后，分别得到不同稀释度标准品的扩增曲线(图1)。扩增曲线呈光滑的“S”型曲线，并且各梯度的样本在指数期的扩增曲线呈明显的平行关系，表明RNA标准品具有较好的扩增效率以及较高的扩增稳定性。

(2)RNA标准品的熔解曲线如图2所示，显示峰型唯一无杂峰，提示PCR产物为MTS28223序列的特异性产物。

(3)在RNA标准品稀释为3.6×10⁹-10²copies/μl时，进行荧光定量PCR扩增后，用对应的Ct值与拷贝数制作标准曲线，结果如图3所示。标准曲线方程为：Y＝-3.5857x+44.418，R2＝0.99，扩增效率为90.06％。

该实验表明，用本发明的RNA标准品建立的qRT-PCR标准曲线，可以用于建立MTS2823核酸绝对值定量qRT-PCR检测法，构建的RNA标准品制备的标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系(斜率为-3.5857，R2＝0.99)。

该标准品具有较大的检测范围3.6×10⁹～3.6×10²copies/μl。并且，扩增效率为90.06％，R2＝0.99，具有较高的灵敏度。

实施例3sRNA标准品的稳定性和重复性测试

将实施例2中的sRNA标准品的标准曲线制作过程重复三次。三次结果的CT值如表6。实验结果显示，sRNA标准品具有较高的稳定性和重复性。

表6 sRNA标准品的稳定性和重复性

实施例4细菌样本中结核杆菌sRNAMTS2823的定量

方法：

1、将一支卡介苗粉末(0.25mg/支)溶于200μl注射用生理盐水，接种于5mL含10％ADC的7H9培养基中，37℃，210r/min震荡培养16-30天。

2、将培养20天和30天的BCG菌体和上清通过离心法分离，并用0.22μm的滤膜过滤上清，以防存在细菌残留样本，从而获得在指数生长期和稳定生长期的BCG菌体和培养上清样本。

3、从临床检验科获得对数生长期的结核分枝杆菌临床菌株。

4、在菌体中加入终浓度为4mg/ml的溶菌酶，静置5min后，5s/3s超声30个循环。加入500μl Trizol，按说明书的操作常规提取细菌总RNA。在300μl培养上清中将入1ml的Trizol LS试剂，按说明书的操作常规提取BCG培养上清总RNA。

5、将1μg的总RNA参照实施例2的方法逆转录并进行qPCR测定。

6、用实施例2的sRNA标准品建立qRT-PCR标准曲线。

结果判定：

结核分枝杆菌sRNAMTS2823在细菌及细菌培养上清中表达并检出。对BCG及结核分枝杆菌临床株菌体中sRNAMTS2823进行定量检测，使用标准品及其标准曲线计算出样本中相应RNA拷贝数。结果如表7所示。

表7结核分枝杆菌临床株菌体和BCG菌体及培养上清中MTS2823的含量

检测BCG菌液吸光度得到OD值为0.13，计算菌落形成单位为0.81×10⁶cfu/ml，提取1ml该菌液总RNA浓度为391.7ng/μl，检测CT值所对应3.6×10⁹copies/μl，计算得到单位cfu的BCG菌体中sRNAMTS2823的拷贝数约为8.9×10⁴copies。

实施例5BCG样本中结核杆菌sRNAMTS2823检测

本实验首先对提取BCG菌体总RNA 10倍差稀释若干梯度，使用20μl的体系，将梯度稀释的总RNA分别逆转，体系为1～1×10^-6μg/20μl，参照实施例2的方法逆转后进行实时荧光定量PCR，结果如图4。

测定结果表明，本方法检测BCG菌体中MTS2823的CT值范围在12.9～28.9之间，根据方法中建立的标准曲线，计算得到，BCG菌体中MTS2823约在3.6×10⁴～3.6×10⁹copies/μl之间，随着稀释倍数增加，CT值也随之增大。

序列表

<110> 哈尔滨医科大学

<120> 结核分枝杆菌sRNA实时荧光定量PCR标准品及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 96

<212> RNA

<213> artificial sequence

<400> 1

aggccaaggc ucgauccaga agagaagguu cggucucccg agggccccgc ccagcauggu 60

ugggggcacc cacgcggagu cauagccacg auaacg 96

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

ccaaggctcg atccagaaga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

tatcgtggat atgactccgc 20

Claims

1.结核分枝杆菌sRNA实时荧光定量PCR标准品，其特征在于，所述的标准品为一段RNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一对用于检测权利要求1所述的结核分枝杆菌sRNA实时荧光定量PCR标准品的引物。

3.如权利要求2所述的引物，其特征在于，所述的引物由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

4.如权利要求2或3所述的引物，其特征在于，所述的引物用于实时荧光定量PCR检测时，其qPCR体系如下所示：

qPCR反应条件如下所示：

5.权利要求1所述的结核分枝杆菌sRNA实时荧光定量PCR标准品在制备检测结核分枝杆菌sRNA表达水平试剂中应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的结核分枝杆菌sRNA为sRNAMTS2823。

7.权利要求2或3所述的引物在制备检测结核分枝杆菌sRNA表达水平试剂中应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的结核分枝杆菌sRNA为sRNAMTS2823。