CN109295242B

CN109295242B - 用于检测三甲胺产生基因的引物对及试剂盒

Info

Publication number: CN109295242B
Application number: CN201811203027.5A
Authority: CN
Inventors: 李菁; 蔡元源; 周星辰
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2018-10-16
Filing date: 2018-10-16
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2038-10-16
Also published as: CN109295242A

Abstract

本发明公开了一种用于检测三甲胺产生基因的引物对及试剂盒。基于筛选到的一种来自于肠道细菌Clostridium saccharolyticum的三甲胺产生基因在人体内高表达，命名为cutC基因。其基因序列如SEQ ID NO.1所示，找到了具有特异性且定量效果理想的引物对组合，并设计了检测试剂盒。本发明有效克服了现有技术中对肠道细菌中动脉粥样硬化风险基因检测的不足，能提高动脉粥样硬化疾病的预测率。本发明的试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景，且具有高度产业化利用价值。

Description

用于检测三甲胺产生基因的引物对及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测来自于肠道细菌Clostridiumsaccharolyticum的三甲胺产生基因的引物对及试剂盒。

背景技术

心血管疾病是目前全球高发疾病，每年约有1500万人死于心血管疾病，其中以冠心病和脑卒中风为主。其中，动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心血管代谢性疾病发生的重要诱因之一。动脉粥样硬化是由脂质在血管壁积累而引起的一种复杂疾病，受多种遗传以及环境因素影响。由于在动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样，因此称为动脉粥样硬化。

肠道菌群代谢红肉、贝类、蛋类中常见的胆碱、左旋肉毒碱、γ丁酰甜菜碱是会产生一种小分子物质—三甲胺(Trimethylamine，TMA)。TMA又会在肝脏黄素单氧酶(Flavin-containing monooxygenase，FMO3)的作用下变成氧化三甲胺(TMAO)。TMAO会通过增敏血小板，促进血栓形成，抑制胆固醇的逆转运等机制导致动脉粥样硬化。

肠道细菌Clostridium saccharolyticum的三甲胺产生基因，能发挥其特有的生物学功能，即通过裂解食物中的胆碱类物质产生小分子的三甲胺，从而参与血小板的聚集、血栓形成、胆固醇的逆转运等生物学过程，目前正在成为动脉粥样硬化等心血管疾病研究的新热点。当前，已有较多的研究证实三甲胺和氧化三甲胺在动脉粥样硬化类心血管疾病中执行重要的调控功能，但利用肠道细菌中产生三甲胺的基因对动脉粥样硬化进行预测目前还未见文献报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中对肠道细菌中动脉粥样硬化风险基因检测的不足，提供一种用于肠道细菌Clostridium saccharolyticum的三甲胺产生基因的引物对及试剂盒，有效克服了对肠道细菌中动脉粥样硬化风险相关菌属基因检测的不足，能提高动脉粥样硬化的预测率。

本发明系统性地在人类微生物组计划中发现了一系列胆碱三甲胺产生基因后，筛选到一种来自于肠道细菌Clostridium saccharolyticum的三甲胺产生基因在人体内高表达，命名为cutC基因。其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

一种用于检测三甲胺产生基因的引物对，所述引物对是用于扩增来自于肠道细菌Clostridium saccharolyticum的三甲胺产生基因的引物对，包括如下至少一组引物对：

第一组：如SEQ ID NO.2所示的上游引物，如SEQ ID NO.3所示的下游引物；

第二组：如SEQ ID NO.4所示的上游引物，如SEQ ID NO.5所示的下游引物；

第三组：如SEQ ID NO.6所示的上游引物，如SEQ ID NO.7所示的下游引物；

第四组：如SEQ ID NO.8所示的上游引物，如SEQ ID NO.9所示的下游引物；

第五组：如SEQ ID NO.10所示的上游引物，如SEQ ID NO.11所示的下游引物；

第六组：如SEQ ID NO.12所示的上游引物，如SEQ ID NO.13所示的下游引物；

第七组：如SEQ ID NO.14所示的上游引物，如SEQ ID NO.15所示的下游引物；

第八组：如SEQ ID NO.16所示的上游引物，如SEQ ID NO.17所示的下游引物；

第九组：如SEQ ID NO.18所示的上游引物，如SEQ ID NO.19所示的下游引物；

第十组：如SEQ ID NO.20所示的上游引物，如SEQ ID NO.21所示的下游引物。

进一步地，所述来自于肠道细菌Clostridium saccharolyticum的三甲胺产生基因，其序列如SEQ ID NO.1所示。

一种用于检测三甲胺产生基因的试剂盒，包括至少一组上述引物对。

进一步地，所述试剂盒还包括DNA模板、荧光染料和qRT-PCR反应液。

进一步地，所述qRT-PCR反应液包括buffer缓冲液、Taq酶、Mg²⁺和dNTP。

一种用于检测三甲胺产生基因的方法，包括以下步骤：

步骤1，提取待测对象粪便样本的基因组DNA；

步骤2，以步骤1的基因组DNA为模板，以上述引物对为引物进行qRT-PCR扩增；

步骤3，根据qRT-PCR扩增结果计算三甲胺产生基因的表达水平。

进一步地，qRT-PCR扩增体系为：10μL的2×qRT-PCR反应液、10μM的引物各0.8μL、加ddH₂O至20μL，30μg/μL的DNA模板。

进一步地，qRT-PCR扩增反应程序为：95℃30s预变性；接40个循环：95℃5s、60℃45s。

本发明的有益效果是：本发明基于cutC基因，设计并获得其检测引物和试剂盒，有效克服了现有技术中对肠道细菌中动脉粥样硬化风险基因检测的不足，能提高动脉粥样硬化疾病的预测率。该qRT-PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景，且具有高度产业化利用价值。

附图说明

图1为实施例1中用RT-qPCR的方法检测cutC在小鼠模型中的相对表达量。

图2为实施例2中用受试者工作曲线比较cutC对动脉粥样硬化患者的诊断效果。

图3为实施例3中用第一组引物进行PCR扩增获得的cutC的条带。

图4为实施例3中底物含量对cutC产生三甲胺能力的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本实施例仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。本领域的普通技术员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

针对cutC基因，在前期大量的研究、分析后，包括序列特异性比较、扩增效率比较、定量准确性比较等。经过比对和实验验证，找到了具有特异性且定量效果理想的引物对组合，所述的引物序列如下：

第一组

如SEQ ID NO.2所示的上游引物(5’-CCATCCATCACGACCTACCG-3’)，

如SEQ ID NO.3所示的下游引物(5’-CTCACGGTACTGATCCTCGC-3’)；

第二组

如SEQ ID NO.4所示的上游引物(5’-CAGACCGGTATGTCCATCGG-3’)，

如SEQ ID NO.5所示的下游引物(5’-CCGGACTCAATGTCTGCCTT-3’)；

第三组

如SEQ ID NO.6所示的上游引物(5’-AGCAAAGTGCTTCCGCTACT-3’)，

如SEQ ID NO.7所示的下游引物(5’-CCGGATAACTCCCATACGCC-3’)；

第四组

如SEQ ID NO.8所示的上游引物(5’-CCATCGAGTCCCTGCTTGTT-3’)，

如SEQ ID NO.9所示的下游引物(5’-TCACCCATATCCGGGCAAAC-3’)；

第五组

如SEQ ID NO.10所示的上游引物(5’-GGGAACTCAGATTCCGGACG-3’)，

如SEQ ID NO.11所示的下游引物(5’-CGGTAGGTCGTGATGGATGG-3’)；

第六组

如SEQ ID NO.12所示的上游引物(5’-TGTTGCCGGATACAGTGCTT-3’)，

如SEQ ID NO.13所示的下游引物(5’-GTCAGCATGGTACGGCTGAT-3’)；

第七组

如SEQ ID NO.14所示的上游引物(5’-TGGTCCGGACTTGCTACCTA-3’)，

如SEQ ID NO.15所示的下游引物(5’-TCCTCGCCCTCAGGAGTATC-3’)；

第八组

如SEQ ID NO.16所示的上游引物(5’-CTCCGAAGCCTCTGATGTCC-3’)，

如SEQ ID NO.17所示的下游引物(5’-GTCTGTGCTCATGCTCGGTA-3’)；

第九组

如SEQ ID NO.18所示的上游引物(5’-GTTTGCCCGGATATGGGTGA-3’)，

如SEQ ID NO.19所示的下游引物(5’-CAGCATGGTACGGCTGATGA-3’)；

第十组

如SEQ ID NO.20所示的上游引物(5’-TGATGTGGATCACCAGCGAG-3’)，

如SEQ ID NO.21所示的下游引物(5’-TCTCTTGTAACGCCGCCTAC-3’)。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测cutC基因的试剂盒，包括至少一组上述引物对。还包括：DNA模板(如SEQ ID NO.1所示)、荧光染料SYBR Green II、qRT-PCR反应液。

其中，所述qRT-PCR反应液包括buffer缓冲液、热启动Taq酶、Mg²⁺及dNTP。

本试剂盒应保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

实施例1

实时荧光定量qRT-PCR初步验证cutC在动脉粥样硬化模型小鼠和正常小鼠中的差异表达

一、实验材料

选取动脉粥样硬化小鼠和正常对照小鼠的粪便样本提取样本的细菌基因组对cutC的表达差异进行qRT-PCR的第一次实例验证。

二、试验方法

粪便细菌的基因组提取：采用MinkaGene Stool DNA kit试剂盒(货号DX1050-02)对粪便样本进行基因组的提取，获取终浓度在500-2000μg/μL的DNA样本。

目的cutC基因的扩增：使用Vazyme公司的ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒(货号Q331-02/03)进行实时荧光定量PCR。

采用第一组引物对进行扩增，上游引物(Primer1)5’-CCATCCATCACGACCTACCG-3’，下游引物(Primer2)5’-CTCACGGTACTGATCCTCGC-3’。

反应体系及条件如下：

qRT-PCR反应程序：95℃30s预变性；接40个循环：95℃5s、60℃45s。

三、实验结果

根据qRT-PCR的相对运量公式：2^-△△Ct，分别计算出cutC在动脉粥样硬化模型组(AS)和配对正常组(CON)的粪便样本中的表达水平，比较结果如图1所示：cutC在CON中的表达水平主要集中在0.000-1.890之间，而AS中的cutC的表达量主要集中在3.22-5.89之间，显著高于CON组，以上结果说明该指标在动脉粥样硬化患者的肠道细菌中普遍高表达。

实施例2

构建ROC曲线验证cutC基因序列SEQ ID NO.1用于辅助诊断区分动脉粥样硬化病人和健康志愿者的能力。

采用受试者工作曲线(ROC)法进行验证，动脉粥样硬化患者和健康志愿者粪便中标志性基因cutC的表达水平判断其用于预测区分动脉粥样硬化疾病风险的能力。如图2所示，结果表明单独基本指标区分动脉粥样硬化病人的ROC曲线下面积(AUC)仅0.53，加入了cutC的表达指标后，AUC提高到0.76，具有临床预诊意义。

实施例4

用于检测细菌样本中cutC基因的存在和其产生三甲胺的能力。

对Clostridium saccharolyticum WM1的细菌培养液用第一组引物进行PCR扩增，扩增后的产物过核酸电泳，获得cutC的条带(如图3所示)与真实序列一致(约2.1kb)。再通过在特定的培养基(ATCC Medium 1118)中添加含量递增的胆碱作为底物，检测三甲胺的产生量，从而判断cutC的酶活性。如图4所示，发现随着底物含量的增加，cutC产生三甲胺的能力也显著性增加。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 用于检测三甲胺产生基因的引物对及试剂盒

<130> 20181016

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2556

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttggatatta gagaattttc aaataagctt gcagaagcga caaaaaatat gtctcctgaa 60

gagaaagctt ctctgatgaa gatgtttgaa tctgtttcac aggaaattgg aaaagaagat 120

acaaaaaaag agaccgcaaa ggatctgtgc gagtatcctt ctgagggaac tcagattccg 180

gacggcatga caagacgttt aaagctgtta aaggagaatt acttaaagca gaagccatcc 240

atcacgacct accgtgcaag agcgatcaca aagattgctg ctgaaaatcc cggtatgcca 300

aagatcgaat taagagcaaa gtgcttccgc tactgctgtg agacagctcc tctggttatt 360

caggataacg agctgatcgt aggcgcaccc tgcggcgcac ccagagccgg cgcattctca 420

ccagatatcg catggagatg gatggtagat gagattgata ccatcggaac aagacctcag 480

gatccattct acatttccga ggaagacaag aagatcatgc gtgaggagct gttcccattc 540

tggaagggca aatccgtaga tgagtactgc gaggatcagt accgtgaggc aggcgtatgg 600

gagttatccg gcgagtcctt cgtatccgac tgctcctacc atgcattaaa cggcggcggc 660

gactccaacc ccggctatga tgtaatcctg atgaagaagg gtatgctgga tatccagaat 720

gaagcaagag agcatttaac aaagcttcac tacgagaatc cagatgatat tgagaagata 780

tacttctaca agtccattat cgagacaact gaaggtgtaa tgatctatgc cagaagaatg 840

tccgaatatg caaaggaact ggctgacaaa gagaccgatc caaagagaaa ggcagagctt 900

tacaagatct ccgagattaa tgcaaaggtt cctgctcaca agcctgagac cttctgggag 960

gcaatccagg cagtatggac catcgagtcc ctgcttgttg tggaagagaa tcagaccggt 1020

atgtccatcg gccgtgtaga ccagtatatg tacccgttct acaaggcaga cattgagtcc 1080

ggcagaatga atgacttcca ggcatttgag cttgcaggct gtatgctgat caagatgtct 1140

gagatgatgt ggatcaccag cgagggcggt tccaagttct ttgcaggata ccagccattc 1200

gtaaatatgt gcgtaggcgg cgttacaaga gagggccgtg atgcaaccaa tgacctgacc 1260

tatctgttaa tggatgcagt ccgtcatgta aagatttacc agccgtctct ggcctgccgt 1320

attcacaaca agtccccgag aaagtactta aagaagatcg tagatgtagt acgttccgga 1380

atgggcttcc ctgcctgcca ctttgatgat acacatatca agatgatgct ggcaaagggc 1440

gtttccatcg aggatgcaag agattactgt ctgatgggct gtgtagagcc tcagaaggcc 1500

ggccgtctct atcagtggac ctctaccgct tatacacagt ggcccatttg tatcgagctt 1560

gtattaaatc acggtgttcc gctgtggtac ggcaagcagg tttgcccgga tatgggtgac 1620

ttaaacagct ttaagacata tgaagagttt gaagctgccg ttaaggaaga gatcaaatac 1680

atcacaaagt ggaccagcgt tgctacggtt atttcccaga gagttcacag agagctggct 1740

ccgaagcctc tgatgtccat tatgtacgag ggctgtatgg aaaagggaaa ggacgtatcc 1800

tccggcggcg ctatgtataa ctttggacca ggcgttgtat ggtccggact tgctacctat 1860

gcagactcca tggcagccat caagaagctg gtatttgacg ataagaaata tacgctggag 1920

cagttaaatg aagcattaaa agcagacttt aatggatatg agcagatccg caccgactgt 1980

ctgaacgctc ctaagtacgg aaatgatgac gattacgcag atgatattgc ggcagatctg 2040

atcaacttta ccgagcatga gcacagacag tacaagactc tttactctat cctgagccat 2100

ggtactctgt ccatttccaa taatacccca ttcggccaga tgaccggtgc gtctgcaaac 2160

ggacgccatg catggctgcc tctgtctgac ggaatcagcc caagccaggg cgctgacttc 2220

aagggcccga ccgctattat caagtctgta tccaagatgt ccaatgataa tatgaacatc 2280

ggtatggtac ataacttcaa gatcatggca ggccttcttg atactcctga gggcgaggaa 2340

agcctgatca ccctgctgcg tacagcctgc atgtttggaa acggcgagat gcagtttaac 2400

tatctggata acaagaccct gatcgaggct cagaagcatc cagagcagta ccgcgacctg 2460

atcgtgcgtg ttgccggata cagtgctttc ttcgtagagc tgtgcaagga tgtacaggat 2520

gagatcatca gccgtaccat gctgactcat ttttaa 2556

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccatccatca cgacctaccg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcacggtac tgatcctcgc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagaccggta tgtccatcgg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccggactcaa tgtctgcctt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agcaaagtgc ttccgctact 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccggataact cccatacgcc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccatcgagtc cctgcttgtt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcacccatat ccgggcaaac 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gggaactcag attccggacg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cggtaggtcg tgatggatgg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgttgccgga tacagtgctt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtcagcatgg tacggctgat 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tggtccggac ttgctaccta 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcctcgccct caggagtatc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctccgaagcc tctgatgtcc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gtctgtgctc atgctcggta 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gtttgcccgg atatgggtga 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cagcatggta cggctgatga 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgatgtggat caccagcgag 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tctcttgtaa cgccgcctac 20

Claims

1.一种用于检测三甲胺产生基因的引物对，所述引物对是用于扩增如SEQ ID NO.1所示的cutC基因，包括如SEQ ID NO.2所示的上游引物和如SEQ ID NO.3所示的下游引物。

2.一种用于检测三甲胺产生基因的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物对。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括DNA模板、荧光染料和qRT-PCR反应液。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述qRT-PCR反应液包括buffer缓冲液、Taq酶、Mg²⁺和dNTP。

5.一种用于检测三甲胺产生基因的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，提取待测对象粪便样本的基因组DNA；

步骤2，以步骤1的基因组DNA为模板，以权利要求1所述的引物对为引物进行qRT-PCR扩增；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：qRT-PCR扩增体系为：10 μL 的2×qRT-PCR反应液、10μM的引物各0.8 μL、加ddH₂O至20μL，30 μg/μL 的DNA模板。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：qRT-PCR扩增反应程序为：95℃ 30s预变性；接40个循环：95℃ 5s、60℃ 45s。