CN102936619A - 定量检测大肠杆菌rna的方法及其专用标准品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量检测大肠杆菌RNA的方法及其专用标准品和应用。本发明提供的方法包括如下步骤:(1)按照如下方法制作标准曲线;将RNA标准品配制成各个浓度的标准品稀释液,然后将各个标准品稀释液反转录为cDNA,以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR,以实时荧光定量PCR体系中的cDNA对应的RNA拷贝数(也可对拷贝数进行数据处理,如拷贝数以10为底的对数)和Ct值制作标准曲线方程;(2)提取大肠杆菌的总RNA并反转录为cDNA,以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR,将Ct值代入所述标准曲线方程,得到大肠杆菌的RNA含量。本发明的方法可用于快速检测环境中少量的大肠杆菌,为快速检测活性大肠杆菌提供技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种定量检测大肠杆菌RNA的方法及其专用标准品和应用。
背景技术
大肠杆菌(Escherichia coli)是一种食源性致病菌,会引起腹泻、恶心、出血性结肠炎等症状。近年来,由大肠杆菌引发的感染性疾病在许多国家都相继报道,已经成为世界性的环境安全性问题。
目前,大肠杆菌的传统检测方法是培养法。然而,近年的研究发现,细菌在环境压力(如高温)下可以进入“具有活性但不可培养(viable but nonculturable,VBNC)”的状态,无法用常规培养法检出,但仍然保持代谢活性和致病性,能够在环境压力解除的条件下恢复其可培养性,引发严重的微生物安全风险。已经有研究表明,大多数革兰氏阴性菌(包括大肠杆菌)也可以进入这样的状态。因此,传统培养法无法检测到处于VBNC状态的大肠杆菌而得到假阴性的结果。
PCR技术可以快速、灵敏的检测到目标菌。然而有研究表明,经过热处理后,尽管细菌已经丧失细胞活性,但作为PCR扩增模板的DNA仍可以存在数天,因此常规PCR技术无法区分活性菌与非活性菌。
与DNA相比,大多数mRNA较不稳定,其半衰期较短(仅几分钟),可以更好的作为活性菌存在的分子信标。已有大量研究证实,细菌体内mRNA的存在与其细胞活性之间存在显著关系。又有研究表明,处于VBNC状态的细菌仍具有转录活性,其体内仍可以检测到一定量的mRNA。
实时荧光定量PCR和反转录(又称逆转录)为定量检测样品中的RNA提供了技术手段。有研究者使用基因组DNA或者质粒DNA片段作为反转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测实际样品中RNA的标准品。可是,使用DNA作为标准品并没有考虑到反转录中的效率问题,从而导致检测到的RNA与实际相比减少了84%-98.6%。因此,以DNA作为检测RNA的标准品会大大低估样品中实际的RNA的含量。
发明内容
本发明的目的是提供一种定量检测大肠杆菌RNA的方法及其专用标准品和应用。
本发明提供了一种定量检测大肠杆菌RNA的方法,包括如下步骤:
(1)按照如下方法制作标准曲线;将RNA标准品配制成各个浓度的标准品稀释液,然后将各个标准品稀释液反转录为cDNA,以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR,以实时荧光定量PCR体系中的cDNA对应的RNA拷贝数(也可对拷贝数进行数据处理,如拷贝数以10为底的对数)和Ct值制作标准曲线方程;
(2)提取大肠杆菌的总RNA并反转录为cDNA,以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR,将Ct值代入所述标准曲线方程,得到大肠杆菌的RNA含量。
所述RNA标准品可为所述大肠杆菌的部分核酸片段。
所述步骤(1)的所述实时荧光PCR和所述步骤(2)中的所述实时荧光PCR的反应体系和反应条件均可相同。
所述RNA标准品具体可为序列表的序列6所示的单链RNA分子。
所述实时荧光PCR采用的引物对具体可为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对。
所述标准曲线具体为一元线性回归曲线。
所述实时荧光定量PCR的退火温度具体可为55.5°C。
以上任意所述方法均可应用于检测大肠杆菌活菌数(一个拷贝数的RNA可以代表一个活菌)。
所述检测大肠杆菌活菌数具体可为检测水样中的大肠杆菌活菌数。
本发明还保护序列表的序列6所示的单链RNA分子。
本发明还保护序列表的序列1所示的双链DNA分子。
本发明还保护定量检测大肠杆菌RNA的特异引物对,由序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成。
本发明还保护一种定量检测大肠杆菌RNA(或检测大肠杆菌活菌数)的试剂盒,包括标准品和特异引物对;所述标准品为序列表的序列6所示的单链RNA分子;所述特异引物对为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对。
本发明还保护标准品和/或特异引物对在制备定量检测大肠杆菌RNA的试剂盒(或制备检测大肠杆菌活菌数的试剂盒)中的应用;所述标准品为序列表的序列6所示的单链RNA分子;所述特异引物对为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对。
本发明还保护序列表的序列6所示的单链RNA分子和/或特异引物对在检测大肠杆菌活菌数中的应用;所述特异引物对为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对。
由于细菌的RNA较不稳定,半衰期短,因此可以作为活性菌的分子信标。本发明提供的方法中,将RNA用作定量RNA拷贝数的标准品(标准品和待测RNA一样进行了反转录,从而扣除了反转录效率的影响),可以更准确的定量大肠杆菌RNA,从而更准确的检测待测样本中的大肠杆菌数量。
本发明采用的标准品具有广谱识别和特异性相结合的特点,敏感性高,制备方法简便,可以长期保存,纯度好,线性检测范围宽,可以用于环境样品中大肠杆菌的快速定量检测。定量PCR具有快速、灵敏的优点。因此,本发明的方法可用于快速检测环境中少量的大肠杆菌,为快速检测活性大肠杆菌提供技术支持。
附图说明
图1为采用各个退火温度得到的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为采用引物对乙进行特异性验证中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为采用各个稀释液反转录的cDNA为模板的PCR扩增曲线图。
图4为标准曲线图。
图5为采用各个稀释液反转录的cDNA为模板的溶解曲线图。
图6为采用各个稀释液反转录的cDNA为模板的琼脂糖凝胶电泳图。
图7为实施例5中的溶解曲线图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli),又称大肠杆菌:中国普通微生物菌种保存管理中心(网址为http://www.cgmcc.net/),CGMCC编号为1.2385。
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium):美国模式培养物集存库(ATCC,网址为www.atcc.org/),ATCC编号为14028。
耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis):中国普通微生物菌种保存管理中心(网址为http://www.cgmcc.net/),CGMCC编号为CGMCC 1.562。
实施例1、引物的合成与标准品的制备
一、引物的设计与合成
对大肠杆菌的基因组DNA进行分析,选取uidA基因的部分序列,根据该序列设计两对引物(引物对甲和引物对乙)。
引物对甲由uidA-T7-F和uidA-T7-R组成,靶序列为序列表的序列1所示的双链DNA分子,为921bp。
uidA-T7-F(序列2):5'-taatacgactcactataggggcgttacaagaaagcc-3';
uidA-T7-R(序列3):5-gcatctcttcagcgtaagggtaatgcga-3'。
引物对乙由uidA-F和uidA-R组成,靶序列为序列表的序列1自5’末端第257至443位核苷酸所示的双链DNA分子,为187bp。
uidA-F(序列4):5'-cgatgtcacgccgtatgttatt-3';
uidA-R(序列5):5'-ggtgtagagcattacgctgcg-3'。
分别合成以上各条引物。
二、标准品的制备
1、提取大肠杆菌的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板,采用引物对甲进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
3、将步骤2的PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,利用TaKaRa切胶回收试剂盒(TaKaRa Code:DV805A)回收约921bp的DNA片段。
4、采用promega体外转录试剂盒(promega Code:P1320)将步骤3回收的DNA片段进行体外转录,获得与所述DNA片段对应的RNA片段(标准品)。
三、标准品的测序
1、将步骤二获得的标准品进行反转录,获得与其对应的cDNA。
2、采用天根DNA纯化回收试剂盒(Code:DP214)回收纯化步骤1得到的cDNA。
3、将步骤2得到的cDNA进行测序,测序结果如序列表的序列1所示(序列1中,自5’末端第1至20位核苷酸为T7启动子)。测序结果表明,步骤二得到的标准品为序列表的序列6所示的单链RNA。
实施例2、标准品的梯度稀释
检测RNA拷贝数的方法:利用超微量核酸蛋白测定仪(NanoDrop ND-2000C,美国)测定RNA浓度,然后按照如下公式计算RNA拷贝数:
6.02×1023为阿伏伽德罗常数;340(Da)为RNA的一个碱基的相对分子质量。
将实施例1制备得到的标准品用无菌水依次稀释,得到稀释液1至稀释液8,其中RNA的浓度依次为:9.6186×108拷贝数/μL、9.6186×107拷贝数/μL、9.6186×106拷贝数/μL、9.6186×105拷贝数/μL、9.6186×104拷贝数/μL、9.6186×103拷贝数/μL、9.6186×102拷贝数/μL和9.6186×101拷贝数/μL。
实施例3、定量检测大肠杆菌活菌RNA的方法的建立
一、引物退火温度的优化
1、以实施例1得到的标准品反转录后的cDNA为模板,采用采用实施例1合成的引物对乙进行PCR扩增。
PCR反应体系为(20μL):10×PCR Buffer 2μL,25mM MgCl21.6μL,10mM dNTP1.6μL,上游引物(20μM)1μL,下游引物(20μM)1μL,模板2μL(约100ng),Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL,去离子水10.4μL。
PCR反应程序95°C 10min;95°C 30s、退火20s、72°C 20s,40个循环;72°C,5min;反应结束后4°C保存。分别采用51°C、52°C、53.7°C、54.4°C和55.5°C作为退火温度。
2、将步骤1的PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,结果见图1(图1中,泳道1至5依次为采用51°C、52°C、53.7°C、54.4°C、55.5°C作为退火温度得到的PCR扩增产物)。退火温度为55.5°C时,扩增效果最好。
二、引物的特异性验证
分别将大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和耻垢分枝杆菌进行如下步骤:
1、提取菌株的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板,采用实施例1合成的引物对乙进行PCR扩增。
PCR反应体系同步骤一。
PCR反应程序:采用55.5°C的退火温度,其它同步骤一。
3、将步骤2的PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,结果见图2。
图2中,M为DNA Marker(DL 2000),1为阴性对照(以水为模板),2为阳性对照(以实施例1得到的标准品反转录后的cDNA为模板),3为大肠杆菌,4为鼠伤寒沙门氏菌,5为耻垢分枝杆菌。5个泳道中,只有阳性对照和大肠杆菌具有187bp的目标条带。结果表明,引物对乙特异性针对大肠杆菌,与鼠伤寒沙门氏菌和耻垢分枝杆菌无交叉反应。
三、qPCR检测限、定量区间及标准曲线的制定
将实施例2制备的稀释液1至稀释液8(各2μL)分别进行反转录实时荧光定量PCR,具体步骤如下:将稀释液作为模板进行反转录,得到cDNA;采用天根DNA纯化回收试剂盒(Code:DP214)回收各个cDNA并作模板,进行实时荧光定量PCR(qPCR)。
qPCR反应体系为20μL,溶剂为水,其中含有模板(将2μL稀释液反转录得到的cDNA)、10μL 2×Premix Ex TaqTM、0.5μmol/L uidA-F、0.5μmol/L uidA-R。采用将2μL稀释液(依次为稀释液1至稀释液8)反转录得到的cDNA作为模板,qPCR反应体系中的cDNA反转录前的RNA量分别为:1.92×109、1.92×108、1.92×107、1.92×106、1.92×105、1.92×104、1.92×103、1.92×102拷贝。
qPCR反应程序:1个循环:95°C 10min;
40个循环:95°C 30s、55.5°C 20s、72°C 20s,在退火过程中收集荧光;
熔解曲线过程:95°C 1min,从60°C开始每30s温度升高0.5°C,结束温度为95°C。
PCR扩增曲线见图3。图3中,自左至右的8条扩增曲线分别为采用2μL稀释液(依次为稀释液1至稀释液8)反转录得到的cDNA作为模板。从图中可以看出,扩增曲线平滑,扩增效果较好。
标准曲线见图4。标准曲线方程为:y=-3.1502x+32.757,R2=0.99933,y代表临界循环数,x代表qPCR反应体系中的cDNA对应的RNA量(log10拷贝数)。最低检测限为1.92×102copies/反应,定量检测区间为1.92×102-1.92×109copies/ul,扩增效率E=101/3.1502-1=1.077,即107.7%。
溶解曲线见图5。可以看出,8条曲线一致,均曲线平稳,峰尖且窄,熔解温度为83.5±0.5°C,证明该PCR扩增产物极为特异。
将qPCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,结果见图6。图5中,M为DNA Marker(DL2000),2-9依次为采用稀释液8至稀释液1反转录得到的cDNA作为模板的qPCR体系,10为阳性对照(以实施例1得到的标准品反转录后的cDNA为模板),N为阴性对照(以水为模板)。
四、qPCR检测方法的重复性
分别进行6次实施例1,得到6个批次的标准品。将每个批次的标准品分别反转录为cDNA并反复冻融6次,然后进行qPCR(qPCR反应体系和反应程序同步骤三),根据循环数的变异系数(CV)对重复性进行评价。
结果见表1,循环数变异系数分别为0.58%-7.48%,结果表明,标准品甲的标准曲线重复性良好。
表1标准品不同批次间重复性分析
实施例4、检测大肠杆菌活菌数量
一、待测样本的制备
1、将大肠杆菌菌液(大肠杆菌浓度为109CFU/mL)作为菌液甲;将菌液甲95℃处理10min(热灭活),得到菌液乙。
2、将菌液甲和菌液乙分别以不同的体积比混合,得到待检样本;菌液甲和菌液乙分别采用以下体积比:1:999、10:990、100:900、500:500;将菌液甲作为待检样本的阳性对照。
二、定量检测待测样本中的大肠杆菌RNA
将步骤一得到的各个待测样本分别进行如下操作:
1、提取1ml待检样本的总RNA。
2、将步骤1得到的全部总RNA反转录为cDNA。
3、将步骤2得到的全部cDNA作为模板,进行qPCR(qPCR反应体系和反应程序同实施例3的步骤三);将荧光信号7设为阈值,得到临界循环数(Ct值);将临界循环数代入实施例3的步骤三得到的标准曲线方程,得到待测样本中的大肠杆菌RNA浓度(一个拷贝数的RNA可以代表一个细胞响应值,也就是代表一个活菌;细胞相应值的单位为CE,即copies equivalence)。
三、采用培养法定量检测待测样本中的大肠杆菌活菌数量
将步骤一得到的各个待测样本分别进行如下操作:取1ml待测样本,采用培养法定量检测待测样本中的大肠杆菌活菌浓度(以CFU计)。
培养法中采用营养肉汤培养基(BG11培养基)进行大肠杆菌培养。每升LB培养基由去离子水和如下溶质组成:牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl5g和琼脂15g;121℃,20分钟灭菌。
步骤二和步骤三的结果见表2(四次重复试验的结果)。
表2步骤二和步骤三检测到的大肠杆菌RNA浓度
当活性菌比例为100%时,步骤二的方法与步骤三的方法检测到的大肠杆菌活菌浓度相近(平均值分别为1.25×108CFU/100μL和1.22×108CE/100μL)。当活性菌比例下降到0.1%时,步骤三的方法检测到的大肠杆菌活菌浓度平均值为6.18×106CFU/100μL,步骤二的方法检测到的大肠杆菌活菌浓度平均值为3.18×107CE/100μL,这是由于当细菌处于不利温度条件时部分进入VBNC状态,无法用培养法检测而其RNA仍然存在造成的,所以步骤二的方法检测到的大肠杆菌活菌浓度比培养法高。综上所述,步骤二的方法能够较为有效地区分活菌与非活菌。
实施例5、检测实际水环境样品中的大肠杆菌活菌数
实际水样取自再生水厂二沉池、混凝池、砂滤池三处。样品放入冰盒运回实验室,4°C保存。
一、水样浓缩(无菌操作)
1、将水样用0.45μm滤膜,然后将滤膜剪成条状置于4mL离心管中,向离心管中加入4mL PBS缓冲液。
2、将离心管置于漩涡震荡仪上剧烈震荡,然后将离心管内的液体转移至10mL离心管中,再加入4mL PBS缓冲液,然后转移至一个新的10mL离心管内。
3、将离心管4℃、12000rpm离心5min,弃去上清夜,将余下的近2mL包括沉淀在内的混合液转移至2mL离心管,4℃、12000rpm离心2min,收集沉淀(菌体)。
二、提取步骤一得到的菌体的总RNA并反转录为cDNA。
三、将步骤二得到的cDNA作为模板,进行qPCR(qPCR反应体系和反应程序同实施例3的步骤三);将荧光信号7设为阈值,得到临界循环数(Ct值);将临界循环数代入实施例3的步骤三得到的标准曲线方程,得到待测样本中的大肠杆菌RNA浓度(一个拷贝数的RNA可以代表一个活菌)。
熔解曲线见图7。曲线平稳,熔点曲线的熔点峰窄且尖,熔解温度为83.5±0.5°C。
检测结果见表3。
表3水环境样品中的大肠杆菌活菌数
Claims (10)
1.一种定量检测大肠杆菌RNA的方法,包括如下步骤:
(1)按照如下方法制作标准曲线;将RNA标准品配制成各个浓度的标准品稀释液,然后将各个标准品稀释液反转录为cDNA,以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR,以实时荧光定量PCR体系中的cDNA对应的RNA拷贝数和Ct值制作标准曲线方程;
(2)提取大肠杆菌的总RNA并反转录为cDNA,以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR,将Ct值代入所述标准曲线方程,得到大肠杆菌的RNA含量。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述RNA标准品为所述大肠杆菌的部分核酸片段;所述步骤(1)的所述实时荧光PCR和所述步骤(2)中的所述实时荧光PCR的反应体系和反应条件相同。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于:所述RNA标准品为序列表的序列6所示的单链RNA分子。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于:所述实时荧光PCR采用的引物对为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对。
5.权利要求1所述方法在检测大肠杆菌活菌数中的应用。
6.序列表的序列6所示的单链RNA分子或序列表的序列1所示的双链DNA分子。
7.定量检测大肠杆菌RNA的特异引物对,由序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成。
8.一种试剂盒,包括标准品和特异引物对;所述标准品为序列表的序列6所示的单链RNA分子;所述特异引物对为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对;所述试剂盒的功能为定量检测大肠杆菌RNA或检测大肠杆菌活菌数。
9.标准品和/或特异引物对在制备试剂盒中的应用;所述标准品为序列表的序列6所示的单链RNA分子;所述特异引物对为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对;所述试剂盒的功能为定量检测大肠杆菌RNA或检测大肠杆菌活菌数。
10.序列表的序列6所示的单链RNA分子和/或权利要求7所述特异引物对在检测大肠杆菌活菌数中的应用。
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