CN102337344A - 一种定量检测土壤中大肠杆菌的方法及其检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定量检测土壤中大肠杆菌的方法及其检测试剂盒，该方法是在参考相关研究的基础上，采用MPN结合PCR的方法来定量检测土壤中的病原微生物。利用了PCR方法快速准确的优势，取代了传统MPN方法中阳性结果的生化鉴定和血清学鉴定等步骤，从而减少了国标方法中的繁琐步骤，提高了检测效率，同时也采用了国标法中的前增菌步骤，来提高检测目的病原菌的准确性，由于土壤自身的复杂性，土壤中存在着大量微生物，其中还包括不同名目的各种病原微生物，为了更好更准确地定量检测目的病原菌，采用了选择性培养目的病原菌来提高检测效率。经过发明人的创造性的努力以及科学实验验证，最终在土壤中添加纯菌实验中可以得到大肠杆菌定量检测方法的灵敏度为25个/g土壤。

Description

一种定量检测土壤中大肠杆菌的方法及其检测试剂盒

技术领域

本发明属于微生物定量检测技术领域，具体涉及一种定量检测土壤中大肠杆菌方法及其检测试剂盒。

背景技术

随着我国城镇化速度的加快，城市向边缘迁移与扩张，城乡结合部处在城市发展和乡村建设区的连接部位，是城市和农村的一个过渡地带，更是我国城市中粮食和蔬菜等农产品的主要供应区域，因此，城乡结合部的土壤健康与质量问题事关重大，不容忽视。目前专家学者对土壤质量的研究主要集中于农药残留，重金属污染和有机污染等指标方面，对于土壤中病原微生物这一生物指标关注不多。来自于禽畜粪便和污水灌溉土壤病原微生物可以潜伏在土壤中存在很长一段时间，并能进入蔬菜体内，最终影响人类的身体健康。尤其是目前经常发生的因蔬菜被污染病原菌而导致的食物中毒越来越受到人们的关注，人们才逐渐认识到这一问题的严重性。

目前在病原微生物定量检测方面主要有平板菌落计数法、MPN计数法，免疫学上的方法和以PCR等分子手段为基础的分子生物学上的方法。其中传统检测方法具有很高的权威性，但是在操作上具有耗时耗力麻烦等缺点，而且用于土壤中病原微生物的定量检测具有一定的复杂性和操作上的难度；随着现代分子生物学方法的发展，PCR技术因其快速准确而被广泛应用于食品中病原微生物的定性检测中，但是PCR方法不能够很好地区分死菌和活菌，而且在定量检测中也显得不足，这就造成结果上的不准确。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种定量检测土壤中大肠杆菌的方法，以实现提供方便、高效、快速的检测出土壤中的大肠杆菌，并有效提高检测的灵敏度。本发明的另一目的是提供一种上述方法使用的检测试剂盒。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种定量检测土壤中大肠杆菌的方法，包括以下步骤：

（1）取土壤，用无菌水稀释成5个稀释度，分别取5个稀释度的稀释样品1ml，控温30℃，用乳糖胆盐发酵培养基，摇床震荡培养24h，得增菌液；

（2）取少量增菌液，隔水煮沸10min，常温静置30~40min使其充分复性，12000r/min离心1min，得上清液；

（3）取2.5μL上清液作为PCR扩增模板，进行PCR反应，引物序列为：

phoA-1：5’-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3’，

phoA-2：5’-CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3’；

（4）同时扩增PCR产物、阳性对照和阴性对照，然后进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后染色成像，与阳性对照比较，在684bp处出现特异性扩增条带者为阳性结果，不出现条带者为阴性结果。

（5）统计阳性和阴性结果个数，查MPN表计算大肠杆菌个数；计算公式：活菌数/每克土=菌数近似值×数量指标第一位数的稀释度。

步骤（1）中，稀释成5个稀释度的具体操作为：取10g土壤加至90ml水中，震荡摇匀30min，之后取1ml土壤悬液加至9ml生理盐水，作为10^-2g/mL，再依次进行系列稀释至10^-3 g/mL、10^-4 g/mL和10^-5 g/mL。

步骤（2）中，取少量增菌液的具体操作为：取增菌液1ml加入到1.5ml离心管中，6000r/min离心5min，去除上清，沉淀溶解于200μL无菌双蒸水中，取其中的50μL进行隔水煮沸。

步骤（3）中，PCR反应体系：在25μL反应体系中，10×PCR缓冲液2.5μL，20mmol /L Mg²⁺ 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2.0μL，2.0μmol/L引物1.0μL，2U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL，补水至25μL。

步骤（3）中，PCR反应条件为：94℃预变性7min，94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸5min。

步骤（4）中，电泳条件为：先以60V电压出孔，再以100V电压电泳30min。

一种定量检测土壤中大肠杆菌的试剂盒，包括试剂供量为1次反应及以上的试剂I和试剂II，

试剂I：用于选择性增菌培养大肠杆菌的培养基，成分为乳糖胆盐发酵培养基，配方为：蛋白胨20.0g/L，胆盐3.0g/L，乳糖5.0g/L，溴甲酚紫0.01g/L，pH7.4±0.1；

试剂II：用于MPN计数法中阳性管数确认的大肠杆菌PCR反应体系，试剂供量为1次反应及以上，试剂包括：10×PCR缓冲液、20mmol /L Mg²⁺、2.5mmol/L dNTP 、2.0μmol/L上游引物、2.0μmol/L下游引物、2U/μL Taq DNA聚合酶和双蒸水；其中，上游引物为phoA-1引物，序列为：5’-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3’，下游引物为phoA-2引物，序列为：5’-CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3’。

本发明的定量检测土壤中大肠杆菌的方法，是在参考相关研究的基础上，采用MPN结合PCR的方法来定量检测土壤中的病原微生物。是一种MPN-PCR定量检测病原微生物方法。在建立MPN-PCR定量检测病原微生物方法之前，首先进行了一个实验来探索MPN计数法和平板菌落计数法之间是否存在一个相关性。众所周知，MPN计数法是一种利用数学统计的方法对样品中的活菌数量进行估计，得到的是一个近似值或者估计值；平板菌落计数法是一种最常规的活菌定量计数法，它具有一定的准确性和权威性。对同一样品进行了MPN计数方法与平板菌落计数法进行了回归分析，建立了两者之间的定量关系，使MPN计数法具有与平板菌落计数法一样的准确性，从而为病原微生物，甚至功能微生物的定量计数提供更为准确的结果。

本方法所建立的MPN-PCR方法的关键思路在于利用了PCR方法快速准确的优势，取代了传统MPN方法中阳性结果的生化鉴定和血清学鉴定等步骤，从而减少了国标方法中的繁琐步骤，提高了检测效率，同时也采用了国标法中的前增菌步骤，来提高检测目的病原菌的准确性，由于土壤自身的复杂性，土壤中存在着大量微生物，其中还包括不同名目的各种病原微生物，为了更好更准确地定量检测目的病原菌，采用了选择性培养目的病原菌来提高检测效率。经过发明人的创造性的努力以及科学实验验证，最终在土壤中添加纯菌实验中可以得到大肠杆菌定量检测方法的灵敏度为25个/g土壤。

有益效果：与现有的病原微生物定量检测方法相比，本发明的定量检测土壤中大肠杆菌法具有的突出优点包括：该方法利用了PCR方法快速准确的优势，取代了传统MPN方法中阳性结果的生化鉴定和血清学鉴定等步骤，从而减少了国标方法中的繁琐步骤，提高了检测效率，同时也采用了国标法中的前增菌步骤，来提高检测目的病原菌的准确性，并采用了选择性培养目的病原菌来提高检测效率，可以实现大肠杆菌定量检测方法的灵敏度为25个/g土壤，具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1是MPN计数法与平板菌落计数法计数结果对数值的相关性曲线图；

图2是增菌液直接扩增法扩增大肠杆菌phoA基因电泳图；图中，泳道1为10^-1浓度梯度土壤稀释液样品，泳道2为10^-2浓度梯度土壤稀释液样品，泳道3是10^-3浓度梯度土壤稀释液样品，泳道4是10^-4浓度梯度土壤稀释液样品，每个样品5个重复；CK为阴性对照，M为DL-2000 DNA Marker；

图3是增菌液沉淀洗涤后扩增法扩增大肠杆菌phoA基因电泳图；图中，泳道1为10^-1浓度梯度土壤稀释液样品，泳道2为10^-2浓度梯度土壤稀释液样品，泳道3是10^-3浓度梯度土壤稀释液样品，泳道4是10^-4浓度梯度土壤稀释液样品，每个样品5个重复；CK为阴性对照，M为DL-2000 DNA Marker；

图4是热裂解法扩增大肠杆菌phoA基因电泳图；图中，泳道1为10^-1浓度梯度土壤稀释液样品，泳道2为10^-2浓度梯度土壤稀释液样品，泳道3是10^-3浓度梯度土壤稀释液样品，泳道4是10^-4浓度梯度土壤稀释液样品，每个样品5个重复；CK为阴性对照，M为DL-2000 DNA Marker；

图5是大肠杆菌phoA引物扩增结果的电泳图；图中，泳道1为枯草芽孢杆菌168，泳道2为恶臭假单胞菌KT2440，泳道3为土壤杆菌，泳道4为短杆菌，泳道5为纤维微杆菌，泳道6为微杆菌，泳道7为假单胞菌，泳道8为红球菌，泳道9为沙门氏菌，泳道10为大肠杆菌DH5α，M为DL-2000 DNA Marker；

图6是土壤添加纯大肠杆菌25个/g土壤后扩增图谱；泳道1为10^-1浓度梯度土壤稀释液样品，泳道2为10^-2浓度梯度土壤稀释液样品，泳道3是10^-3浓度梯度土壤稀释液样品，每个样品5个重复；CK为阴性对照，M为DL-2000 DNA Marker。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

以代表性大肠杆菌DH5α菌株作为实验菌株，制备系列浓度梯度的大肠杆菌添加至灭菌土壤中进行平板菌落计数法和MPN计数法计数结果相关性分析，首先从LB平板上刮取纯培养的大肠埃希菌菌落，接种至100ml LB液体培养基中，30℃，200r/min震荡培养8h。再通过十倍稀释制备成不同浓度的系列稀释液添加至灭菌土壤中，分别采用平板菌落计数法和MPN计数法计数大肠埃希菌个数。

平板菌落计数法参照文献【沈萍，范秀荣，李广武。微生物学实验[M]。北京：高等教育出版社，1999，92-94。】进行，首先对上述制备的土壤菌悬液分别进行梯度稀释，取合适稀释度的菌悬液0.1ml涂布于LB培养基平板上，37℃条件倒置培养，平板培养1-2天后计数。

MPN计数，首先对上述制备的土壤菌悬液分别进行梯度稀释，取合适稀释度的菌悬液1ml加至5ml乳糖胆盐发酵液体培养基试管，每个稀释度做5管重复，37℃摇床震荡培养24h后统计每组样品的阳性管数，据此通过MPN表得出待测样品的微生物数目。

为了建立MPN计数法在微生物计数方面与平板菌落计数法的回归方程，首先采用向灭菌土壤中添加不同浓度的大肠杆菌纯培养物制备不同梯度的土壤菌悬液，然后采用稀释涂布平板计数法和MPN计数法分别对同一样品进行计数，从而建立起两者之间的回归方程，并对回归方程进行方差分析以及对回归系数进行了t检验。

采用了8个系列浓度的大肠杆菌菌悬液添加至灭菌土壤中进行回归方程的建立，表1列出了平板菌落计数法和MPN计数法计数结果。

表1 平板菌落计数法和MPN计数法计数结果

系列浓度编号	稀释涂布平板计数法	MPN计数法
			1	4.50×103	5.00×103
2	2.60×104	3.00×104
			3	3.30×105	3.50×105
4	2.50×106	9.50×106
			5	2.50×107	5.00×107
6	2.10×108	5.00×108
			7	3.10×109	9.50×109

以MPN计数法计数结果的对数值为横坐标，以平板菌落计数法计数结果的对数值为纵坐标作相关性曲线，以进行回归分析。曲线见图1。

在图1的基础上进行回归方程的方差分析，表2是回归方程的方差分析结果，F=1185.704，P=4.00×10^-8<0.01，表明LOG(MPN)---LOG(DISH)之间存在极显著的线性回归关系。

表2 回归方程的方差分析

方差分析	df	SS	MS	F	Significance F
						回归分析	1	34.58147	34.58147	1185.704	3.99595E-08
残差	6	0.174992	0.029165
						总计	7	34.75646

在图1的基础上进行回归系数的分析，由表3可见，建立以下回归方程：y=0.9566x。R²=0.9941，t=34.43405，P=4×10^-8，即线性回归系数是极显著的，表明LOG(MPN)---LOG(DISH)之间存在极显著的线性回归关系，可用所建立的回归方程来进行计算。

表3回归系数及回归系数的t检验

	Coefficients	Standard error	t Stat	P-value
					Intercept	0.259758	0.244377	1.06294	0.328706
X Variable 1	0.937005	0.027212	34.43405	4E-08

实施例2

PCR检测方法中特异性的高低主要取决于引物特异性的高低，因此靶基因的选择应具有种或者属特异性，才能避免假阳性的出现。根据大肠杆菌phoA基因序列，参考文献【Kong R Y，DungW F，Vrijmoed L L，et al。Marine Pollution Bulletin，1995，31(4)：317-3241。】采用引物设计软件Primer 5.0进行设计引物，引物扩增片段为684bp，上述两对引物均由上海英骏公司合成。具体序列如下：phoA-1：5’-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3’，phoA-2：5’-CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3’。

利用大肠杆菌的phoA特异性引物对枯草芽孢杆菌168，恶臭假单胞菌KT2440，土壤杆菌，短杆菌，纤维微杆菌，微杆菌，假单胞菌，红球菌，沙门氏菌，大肠杆菌DH5α等10个菌株进行常规菌液PCR，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测见图5。从图5中可以看出利用大肠杆菌的phoA特异性引物可以扩增出并且只能扩增出大肠杆菌DH5α的684bp特异性条带。PCR电泳图谱表明该两对引物具有很好的特异性。

实施例3

土壤中存在着大量的腐植酸和金属离子，他们的存在将会严重影响着PCR反应中Taq酶的活性，从而可能导致PCR反应的失败。为了提高PCR检测的效率，获得能够扩增出目的条带的干净DNA模板，通常情况下是采用酚/氯仿抽提的方法获得DNA模板，但是由于该方法的繁琐性和酚、氯仿等有机试剂的有毒性，不适宜应用于大量样品的DNA制备，而且根据以往经验，即使可以抽提出DNA，但是由于土壤中含有大量的杂质，必须经过DNA样品的回收纯化才能扩增出目的条带。为了简化模板制取的程序，将本方法于其他常用的简易方法进行了比较。

大肠杆菌增殖方法、PCR体系、条件以及电泳方法均同实施例4。

方法1：增菌液直接扩增法：取增菌液3μL加入反应体系中，直接扩增。

方法2：增菌液沉淀洗涤后扩增法：取增菌液1ml加入到1.5ml离心管中，6000r/min离心5min，去除上清，沉淀溶解于200μL无菌双蒸水中，从中取2.5μL作为PCR扩增模板。

方法3为热裂解法：按照方法2从200μL菌悬液中取出50微升置于PCR管中，隔水煮沸10min，常温静置30-40min使其充分复性，12000r/min离心1min，取2.5μL作为PCR扩增模板。

比较了三种模板制备的效果，PCR电泳图如图2、3和4所示，从PCR电泳图谱中可以看出，方法3制备的PCR反应模板明显比方法1和方法2扩增效果好，而方法1与方法2之间并无明显差异，虽然方法1和2也能扩增出目的条带，但是只能扩增出梯度为10^-3以上的稀释度，这降低了该方法的灵敏度，而方法3，可以扩增出10^-1梯度的目的条带，可以保证样品中阳性模板的准确扩增。由于土壤样品存在着大量的固体颗粒，即使进行梯度系列稀释至10^-2仍可见少量固体颗粒，严重影响了PCR的扩增效率，因此利用方法3的处理方式，可以尽可能地去掉土壤颗粒而保留菌体，经煮沸和适当时间的复性可以有效地提取大量的DNA模板，完全可以满足后续PCR反应的要求。同样对于稀释度高于10^-3的稀释液也可以采用方法1和2的方法进行模板的制备，但是在试验的过程中发现，这两种方法在扩增10^-3稀释度时存在着扩不出来的可能性，其中的原因可能是跟样品中杂质的多少有关，即使稀释到10^-3梯度，稀释液中还是存在着大量的肉眼不可见的杂物影响着PCR的扩增，所以并不提倡。另外该方法与酚/氯仿，试剂盒提取等方法相比，具有操作简单，无毒无污染以及成本低等优势，而且在PCR扩增时具有良好的效果，鉴于此，采用方法3为优选方案。

实施例4

采用MPN-PCR的方法对土壤中病原菌进行了定量检测，检测方法如下：

取10g土加至90ml水中，震荡摇匀30min，之后取1ml土壤悬液加至9ml生理盐水，作为10^-2，依次进行系列稀释至10^-3，10^-4，…… 分别取稀释度为10^-2，10^-3，10^-4，10^-5的稀释样品1ml加至5ml乳糖胆盐发酵试管中，置于摇床，30℃，震荡24h，得增菌液，每个稀释度做5管重复。

取增菌液1ml加入到1.5ml离心管中，6000r/min离心5min，去除上清，沉淀溶解于200μL无菌双蒸水中，取其中的50μL进行隔水煮沸10min，常温静置30~40min使其充分复性，12000r/min离心1min，得上清液；

取2.5μL上清液作为PCR扩增模板，进行PCR反应，PCR反应体系：在25μL反应体系中，10×PCR缓冲液2.5μL，20mmol /L Mg²⁺ 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2.0μL，2.0μmol/L phoA-1 1.0μL，2.0μmol/L phoA-2 1.0μL，2U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL，补水至25μL。

PCR反应条件为：94℃预变性7min，94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸5min。

配置1%的琼脂糖凝胶，吸取5μLPCR产物与上样缓冲液1μL混匀后点样，DNA marker 上样量为2μL。先以60V电压出孔，再以100V电压电泳30min完毕。电泳结束后置于EB中染色5min，在凝胶成像系统下观察，与阳性对照比较，在684bp处出现特异性扩增条带者为阳性结果，不出现条带者为阴性结果。

统计阳性和阴性结果个数，查MPN表计算大肠杆菌个数，即可；计算公式：活菌数/每克土=菌数近似值×数量指标第一位数的稀释度。

采用上述方法，分别对来自张家港的1、2、3和4号样品进行实际定量检测，结果如表4所示。

表4 MPN-PCR定量检测结果

样品号	指标数	菌液近似值	5管最低稀释度	大肠杆菌个数/g土
					1	510	3.5	10-1	350
2	520	5.0	10-1	500
					3	522	9.5	10-1	950
4	521	7.0	10-1	700

实施例5

首先利用MPN计数方法对土壤中添加的菌进行计数，之后利用MPN-PCR的方法（同实施例4）对土壤菌悬液进行定量检测，来确定MPN-PCR方法的灵敏度和检测限。计数结果如表5，PCR电泳图谱见图6。

表5 大肠杆菌灵敏度检测结果

MPN计数结果	MPN-PCR计数结果
		25个/g土壤	25个/g土壤

从数据中可以看出大肠杆菌的灵敏度达100%，检出限可以达到25个/g土壤。

实施例6

定量检测土壤中大肠杆菌的试剂盒，包括试剂供量为1次反应及以上的试剂I和试剂II。

试剂I：用于选择性增菌培养大肠杆菌的培养基，成分为乳糖胆盐发酵培养基，配方为：蛋白胨20.0g/L，胆盐3.0g/L，乳糖5.0g/L，溴甲酚紫0.01g/L，pH7.4±0.1；

试剂II：用于MPN计数法中阳性管数确认的大肠杆菌PCR反应体系，试剂供量为50次反应，试剂包括：10×PCR缓冲液、20mmol /L Mg²⁺、2.5mmol/L dNTP 、2.0μmol/L上游引物、2.0μmol/L下游引物、2U/μL Taq DNA聚合酶和双蒸水；其中，上游引物为phoA-1引物，序列为：5’-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3’，下游引物为phoA-2引物，序列为：5’-CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3’。

称取试剂盒I中选择性培养基，分别分装于3ml试管中，115℃高压灭菌20min。

称取10g土壤样品加至100ml带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，200r/min震荡混匀30min，按照1ml加至9ml生理盐水中进行10倍梯度稀释，选择合适的5个稀释度，每个稀释度取1ml加至已灭菌的选择性增菌培养液试管中，每个稀释度5管重复，37℃ 200r/min震荡培养16-24h。

吸取上述1ml增菌液置于1.5ml离心管中，6000r/min 离心3min，弃上清，用200微升无菌水轻轻洗涤沉淀表面的菌体，制成菌悬液。

对于10^-1和10^-2稀释度的增菌液由于存在着大量的土壤颗粒，所以洗涤的时候尽量轻柔操作只要将沉淀表面的菌体沉淀层重悬开来即可，尽量避免将土壤颗粒重悬起来

取上述菌悬液50μL置于PCR反应管中隔水煮沸10min，室温静置20-30min。12000r/min，离心1min，上清即为PCR反应模板。

取上述PCR反应模板2.5μL加至试剂II中的PCR反应管中（管中装有PCR扩增液），混匀。同时也扩增PCR试剂II中自带的阳性对照和阴性对照。

PCR扩增程序：95℃预变性7min，94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。

配置1%的琼脂糖凝胶，吸取5μLPCR产物与试剂盒中上样缓冲液1μL混匀后点样，DNA marker 上样量为2μL。先以60V电压出孔，再以100V电压电泳30min完毕。电泳结束后置于EB中染色5min，在凝胶成像系统下观察，与阳性对照比较，在684bp处出现特异性扩增条带者为阳性结果，不出现条带者为阴性结果。

统计阳性和阴性结果个数，查MPN表计算病原微生物个数。计算公式：活菌数/每克土=菌数近似值×数量指标第一位数的稀释度。

采用上述方法，分别对来自北京的1和2号样品进行实际定量检测，结果如表6所示。

表6 MPN-PCR定量检测结果

样品号	指标数	菌液近似值	5管最低稀释度	大肠杆菌个数/g土
					1	530	8.0	10-1	800
2	533	17.0	10-1	1700

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  南京农业大学

 

<120>  一种定量检测土壤中大肠杆菌的方法及其检测试剂盒

 

<130>  001

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  phoA-1

 

<400>  1

tacaggtgac tgcgggctta tc                                                22

 

 

<210>  2

<211>  23

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  phoA-2

 

<400>  2

cttaccgggc aatacactca cta                                               23

 

 

Claims (7)

1.一种定量检测土壤中大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取土壤，用无菌水稀释成5个稀释度，分别取5个稀释度的稀释样品1ml，控温30℃，用乳糖胆盐发酵培养基，摇床震荡培养24h，得增菌液；

（2）取少量增菌液，隔水煮沸10min，常温静置30~40min使其充分复性，12000r/min离心1min，得上清液；

（3）取2.5μL上清液作为PCR扩增模板，进行PCR扩增反应，引物序列为：

phoA-1：5’-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3’，

phoA-2：5’-CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3’；

（4）同时扩增PCR产物、阳性对照和阴性对照，然后进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后染色成像，与阳性对照比较，在684bp处出现特异性扩增条带者为阳性结果，不出现条带者为阴性结果；

（5）统计阳性和阴性结果个数，查MPN表计算大肠杆菌个数；计算公式：活菌数/每克土=菌数近似值×数量指标第一位数的稀释度。

2.根据权利要求1所述的定量检测土壤中大肠杆菌的方法，其特征在于：步骤（1）中，稀释成5个稀释度的具体操作为：取10g土壤加至90ml水中，震荡摇匀30min，之后取1ml土壤悬液加至9ml生理盐水，作为10^-2g/mL，再依次进行系列稀释至10^-3 g/mL、10^-4 g/mL和10^-5 g/mL。

3.根据权利要求1所述的定量检测土壤中大肠杆菌的方法，其特征在于：步骤（2）中，取少量增菌液的具体操作为：取增菌液1ml加入到1.5ml离心管中，6000r/min离心5min，去除上清，沉淀溶解于200μL无菌双蒸水中，取其中的50μL进行隔水煮沸。

4.根据权利要求1所述的定量检测土壤中大肠杆菌的方法，其特征在于：步骤（3）中，PCR反应体系：在25μL反应体系中，10×PCR缓冲液2.5μL，20mmol /L Mg²⁺ 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2.0μL，2.0μmol/L引物1.0μL，2U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL，补水至25μL。

5.根据权利要求1所述的定量检测土壤中大肠杆菌的方法，其特征在于：步骤（3）中，PCR反应条件为：94℃预变性7min，94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸5min。

6.根据权利要求1所述的定量检测土壤中大肠杆菌的方法，其特征在于：步骤（4）中，电泳条件为：先以60V电压出孔，再以100V电压电泳30min。

7.一种定量检测土壤中大肠杆菌的试剂盒，其特征在于：包括试剂供量为1次反应及以上的试剂I和试剂II，

试剂I：用于选择性增菌培养大肠杆菌的培养基，成分为乳糖胆盐发酵培养基，配方为：蛋白胨20.0g/L，胆盐3.0g/L，乳糖5.0g/L，溴甲酚紫0.01g/L，pH7.4±0.1；

试剂II：用于MPN计数法中阳性管数确认的大肠杆菌PCR反应体系，试剂供量为1次反应及以上，试剂包括：10×PCR缓冲液、20mmol /L Mg²⁺、2.5mmol/L dNTP 、2.0μmol/L上游引物、2.0μmol/L下游引物、2U/μL Taq DNA聚合酶和双蒸水；其中，上游引物为phoA-1引物，序列为：5’-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3’，下游引物为phoA-2引物，序列为：5’-CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3’。

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