CN102851385A

CN102851385A - 利用lamp检测溶藻弧菌的引物组及其快速诊断试剂盒

Info

Publication number: CN102851385A
Application number: CN2012103574210A
Authority: CN
Inventors: 徐义刚; 吴岩; 李丹丹; 刘忠梅; 刘新亮; 李苏龙
Original assignee: HEILONGJIANG CENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE TECHNICAL CENTER
Current assignee: HEILONGJIANG CENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE TECHNICAL CENTER
Priority date: 2012-09-24
Filing date: 2012-09-24
Publication date: 2013-01-02
Anticipated expiration: 2032-09-24
Also published as: CN102851385B

Abstract

本发明涉及一种利用LAMP检测溶藻弧菌的引物组和快速诊断试剂盒，所述的引物组为：F3：CCAGTGGCTTACTCGTTGG，B3：TTCGCGGCCATAAACTCAT，FIP：CGTTCCACTGCCCACCAAACAAGCCCAGCACTGGTATATGC，BIP：GGCAACCAAACGGACCTTGCCCGATTGATGACGCCCTTAG；快速诊断试剂盒，它含有如上所述的引物组、阳性对照品、LAMP反应液和BstDNAPolymerase聚合酶。本发明具有可操作性强、快速、结果判定直观、检测成本低廉、实验装置简单的优点，仅需要普通水浴锅或其他可以得到稳定热源的设备即可。

Description

利用LAMP检测溶藻弧菌的引物组及其快速诊断试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种利用LAMP检测溶藻弧菌的引物组及其快速诊断试剂盒。

背景技术

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是一种嗜盐性革兰氏阴性细菌，广泛分布于河口和海洋环境中，是引起鱼、虾、贝等多种海水养殖动物致病和死亡的主要致病性弧菌，可引起伤口感染、胃肠炎和败血症等症状，严重威胁着水产养殖业发展，造成的经济损失巨大。近年来，由于溶藻弧菌引起食物中毒事件的不断出现，使人们进一步认识到了溶藻弧菌对人类的致病性和危害，也因此将其列入食源性致病菌的范畴，成为食品卫生日常监测和检疫对象。

目前，我国针对水产养殖中溶藻弧菌等细菌性致病菌的预防缺乏有效的措施，主要依赖于抗生素的广泛使用，导致了耐药菌株的出现，同时也对人类的健康构成威胁。此外，检测手段滞后，仍以传统的分离培养、生物化学反应鉴定为主，虽然检测结果准确，但是实验操作较繁琐、费时费力，一般需要5-7d完成检测，影响检测时限。因此，发展操作简便、快速准确、灵敏度高且易推广的检测方法，对溶藻弧菌进行早诊断和早预防，提高食品卫生水平，保证食品安全具有重要意义。

LAMP技术是具有巨大发展潜力的一种高新检测技术，具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、检测成本低廉等优点，已在疾病诊断、物种鉴定等领域得到广泛应用。该方法的技术特点是依赖于能够特异性识别靶基因上6个特定区域的4条引物，利用具有链置换活性的DNA聚合酶，60-65℃恒温条件下，40-60min内即可完成检测工作，伴随目标DNA的不断扩增，产生大量的LAMP副产物-焦磷酸镁白色沉淀，使反应溶液变浑浊，并以此作为直接的结果判断依据。

溶藻弧菌主要有6个毒力相关基因，即铁调蛋白基因（fur）、鞭毛蛋白基因（flaA）、胶原酶基因（valC）、碱性丝氨酸蛋白酶基因（aspA）、外膜蛋白基因（ompK和OmpW）。根据靶基因种内高度保守、种间高度特异的选择原则，经过序列BLAST比对分析，溶藻弧菌的胶原酶基因是作为检测靶基因的理想候选者。本发明选取了溶藻弧菌胶原酶基因作为靶基因，根据其保守区设定合成了4条LAMP反应专用引物，建立了溶藻弧菌的LAMP检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有快速、准确、灵敏度高、特异性强、检测成本低的一种检测溶藻弧菌的LAMP引物组及其快速诊断试剂盒。本发明利用Genbank中已发布的溶藻弧菌基因组DNA序列，结合生物信息学手段，确定以溶藻弧菌胶原酶（collagenase）基因保守区序列作为检测靶序列，设计合成了4条特异性的LAMP引物，对溶藻弧菌进行定性检测。

本发明采用以下主要技术特征：

一种利用LAMP检测溶藻弧菌的引物组，由外引物对和内引物对组成，

所述的外引物对为：

F3： CCAGTGGCTTACTCGTTGG，

B3： TTCGCGGCCATAAACTCAT，

所述的内引物对为：

FIP： CGTTCCACTGCCCACCAAACAAGCCCAGCACTGGTATATGC，

BIP： GGCAACCAAACGGACCTTGCCCGATTGATGACGCCCTTAG。

本发明还具有如下特点：

一种利用LAMP检测溶藻弧菌的快速诊断试剂盒，它含有如上所述的引物组、阳性对照品、LAMP反应液和Bst DNA Polymerase聚合酶。

所述的引物中外引物对和内引物对的添加摩尔比为1:4。

所述的溶藻弧菌包括对溶藻弧菌标准菌株和溶藻弧菌分离菌株进行检测；

所述的LAMP反应体系为：

Figure 2012103574210100002DEST_PATH_IMAGE002

LAMP反应条件：65℃水浴作用45min。采用琼脂糖凝胶电泳法或浊度观察法进行检测结果的判定。

利用试剂盒法提取溶藻弧菌基因组DNA，以提取的溶藻弧菌基因组DNA作为LAMP反应阳性模板。采用单因子浓度梯度实验法逐一改变LAMP反应体系中各组分浓度，以优化LAMP反应体系，并调节反应温度和作用时间，建立了LAMP检测方法（见图1）。

本发明分别以霍乱弧菌（ATCC 14035、ATCC 16112）、拟态弧菌（ATCC 33655）、副溶血性弧菌（ATCC 27968）、创伤弧菌（ATCC 27562、ATCC 33149）、溶藻弧菌（ATCC 33839、ATCC 51160）大肠埃希菌（ATCC 25922、ATCC 8739）、肠出血性大肠埃希菌O₁₅₇: H₇（ATCC 35150）、产肠毒素大肠埃希菌（ATCC 35401）、阪崎肠杆菌（ATCC 51329）、福氏志贺氏菌（ATCC 12022）、金黄色葡萄球菌（ATCC 49444）、空肠弯曲菌（ATCC 33560）、单核细胞增生李斯特菌（ATCC 19111）、绵羊李斯特菌（ATCC 19119）、鼠伤寒沙门氏菌（CMCC 50115）、猪霍乱沙门氏菌（ATCC 10708）、嗜水气单胞菌（ATCC 7966）、小肠结肠炎耶尔森氏菌（ATCC 9610）、沙门氏菌分离株、副溶血性弧菌分离株、创伤弧菌分离株、溶藻弧菌分离株、肠出血性大肠埃希菌O₁₅₇: H₇分离株、绿脓杆菌分离株基因组DNA进行实验，以验证该方法检测的特异性。实验结果显示，本发明方法能够特异性的对溶藻弧菌标准菌株和溶藻弧菌分离菌株进行检测，引物与其他细菌无交叉反应，证明本发明方法具有高度的检测特异性。

本发明将已知菌体浓度的溶藻弧菌进行10倍梯度稀释，同时制备溶藻弧菌污染食品样本，利用试剂盒法提取每个稀释梯度的基因组DNA，以此作为模板进行LAMP扩增，以确定该方法的检测灵敏度。实验结果显示，本发明方法对纯培养的溶藻弧菌的最低检出限约为9CFU/mL (见图2)，对污染食品中溶藻弧菌的最低检出限为15CFU/mL (见图3)。

利用本发明方法重复20次检测同一个阳性标准品，检测结果均相同；两次（时间间隔30天）检测同一批次阳性标准品，检测结果均相同，可见本发明方法具有良好的重复性和稳定性。

应用建立的溶藻弧菌LAMP检测方法对采集的实际样本进行了检测，共检测了192份牡蛎样本、125份生蚝样本、43份象牙蚌样本、97份螃蟹样本、172份虾样本、85份海产鱼类样本，结果共检出13份溶藻弧菌阳性样本，经检验检疫行业标准SN/T 2564-2010法验证，符合率为100%，显示本发明方法具有良好的可靠性和实用性。

本发明方法与实时荧光PCR技术相比，两者具有相同的检测灵敏度（图4），但本发明方法不需要投入昂贵的仪器设备和配备专业的检测人员，而且该方法可操作性强、快速、结果判定直观、检测成本低廉、实验装置简单，仅需要普通水浴锅或其他可以得到稳定热源的设备即可，具有广泛推广性。作为一种经济适用的检测方法，既要保证检测的时效性，又要保证检测的准确性。LAMP技术针对靶基因序列设计的两对内外引物，可严格地识别靶序列的6个独立区域，所以LAMP 反应不会受到反应物中非靶序列DNA存在的影响，增强了检测的特异性。

附图说明

图1为溶藻弧菌LAMP检测方法的建立（A：浑浊度观察. 1：LAMP阴性结果；2： LAMP阳性结果. B：琼脂糖凝胶电泳检测结果. M：DNA marker 2000；1：LAMP阳性结果；2：LAMP阴性结果）；

图2为纯培养溶藻弧菌LAMP方法检测灵敏度结果（A：琼脂糖凝胶电泳检测结果. M：DNA Marker 2000；1~8依次是：9.2×10⁶，9.2×10⁵，9.2×10⁴，9.2×10³，9.2×10²， 9.2×10¹，9.2×10⁰，9.2×10^-1CFU/mL；B：浑浊度观察结果. 1~8依次是：9.2×10⁶，9.2×10⁵， 9.2×10⁴，9.2×10³，9.2×10²，9.2×10¹，9.2×10⁰，9.2×10^-1CFU/mL）；

图3为污染食品样本中溶藻弧菌LAMP方法检测灵敏度结果（A：琼脂糖凝胶电泳检测结果. M：DNA Marker 2000；1~5依次是：1.5×10⁴，1.5×10³，1.5×10²，1.5×10¹，1.5×10⁰ CFU/mL；B: 浑浊度观察结果. 1~6依次是：1.5×10⁴，1.5×10³，1.5×10²，1.5×10¹，1.5×10⁰ CFU/mL，阴性对照样本）；

图4为实时荧光PCR方法检测溶藻弧菌灵敏度对照图（初始菌体浓度为9.2×10⁷CFU/mL）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明：

1. LAMP模板的制备

参照天根TIANamp Bacteria DNA Kit 说明书进行细菌基因组DNA的提取和纯化，按比例加入相应试剂：

1.1 取1.5mL 待检细菌增菌液，10000r/min 离心1min，弃上清，加入200μL缓冲液GA，彻底悬浮菌体；

1.2 加入20μL蛋白酶K (20mg/mL)，并加入220μL 缓冲液GB，充分混匀，70℃水浴作用10min；

1.3 加入220μL无水乙醇，充分混匀15s，离心5-10秒后将所得溶液（包括絮状沉淀）转移吸附柱CB3中，12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体；

1.4 向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（含无水乙醇），12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体；

1.5 向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW（含无水乙醇），12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体；

1.6 重复步骤1.5（向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW（含无水乙醇），12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体）；

1.7 将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min空载离心2min，室温放置2-5min，晾干残留的漂洗液；

1.8 将吸附柱CB3转入新的收集管中，在加入100μL缓冲液TE，室温放置2-5min，12000r/min离心2min，收集洗脱液。

2. LAMP阳性质控标准品的制备

分析比较Genbank中公布的溶藻弧菌基因组序列，选取溶藻弧菌胶原酶（collagenase）基因作为检测靶基因，设定合成了引物VA-F（上游）：5′-CTGAAGATTTTGAGTGTCGCG-3′和VA-R（下游）：5′-CTCGCGTTACCCGTATACTTG-3′，以提取的溶藻弧菌基因组DNA为模板，采用常规PCR法扩增靶基因序列，PCR反应体系（25μL）如下：

10×PCR Buffer	2.5μL
		dNTP (2.5mmol/L)	4μL
引物VA-F (20mmol/L)	1μL
		引物VA-R (20mmol/L)	1μL
rTaqDNA Polymerase (5U/μL)	0.5μL
		基因组DNA模板	1μL
无菌去离子水	15μL

PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 45s，56℃ 45s，72℃ 45s，进行30个循环；72℃延伸10min。将PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的基因片段，回收的目的PCR产物与克隆载体pMD-19-T vector连接，转化感受态大肠杆菌JM109，37℃过夜培养，鉴定阳性重组菌，参照华舜小量质粒DNA提取试剂盒说明书制备阳性质粒。

2.1 挑取阳性克隆单菌落，接种于5mL含100 μg/mL Amp^r的LB培养基中，37℃培养过夜；

2.2 取3mL过夜培养菌液，12000r/min离心5min，弃上清，加入250μL 的Buffer P1（含RNase）充分振荡菌体沉淀至其彻底悬浮；

2.3 加入250μL 的Buffer P2，立即温和地上下颠倒离心管6-10次，混合均匀，室温静置2-4min；

2.4 加入350μL 的Buffer P3，温和反复颠倒离心管6-10次，混合均匀，12000r/min离心10min；

2.5 将上清移入吸附柱中，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；

2.6 加入500μL B1液，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；

2.7 加入500μL W1液（含无水乙醇），12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；

2.8 加入500μL W1液（含无水乙醇），室温静置1min，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中，12000r/min空载离心1min；

2.9 将吸附柱置于一个洁净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入150μL去离子水，室温静置2min，12000r/min离心1min，洗脱收集质粒DNA，作为阳性质控保存备用。

3. LAMP引物

通过基因序列的BLAST比对分析，选取溶藻弧菌胶原酶（collagenase）基因序列保守区，利用LAMP引物设计软件PrimerExplorerV3设定合成4条LAMP引物，即外引物F3和B3与内引物FIP和BIP，引物序列如下：

F3：5′-CCAGTGGCTTACTCGTTGG-3′，

B3：5′-TTCGCGGCCATAAACTCAT-3′，

FIP：5′-CGTTCCACTGCCCACCAAACAAGCCCAGCACTGGTATATGC-3′，

BIP：5′-GGCAACCAAACGGACCTTGCCCGATTGATGACGCCCTTAG-3′。

1. LAMP反应体系（50μL）的建立与优化

4.1 10×ThermoPoL Buffer 单因子浓度优化

在反应体系中其他条件相同的情况下，经过对不同浓度的10×ThermoPoL Buffer实验结果比较，选定1×ThermoPoL Buffer作为试剂盒中每个反应的缓冲液终浓度。

4.2 dNTP单因子浓度优化

在反应体系中其他条件相同的情况下，将2.5mmol/L 的dNTP用量范围设在每个反应1～15μL，以每1μL递增，经过试验结果的比较分析，确定试剂盒中每个反应的dNTP (2.5mmol/L) 用量为8μL。

4.3 MgSO₄单因子浓度优化

在反应体系中其他条件相同的情况下，将100mmol/L的MgSO₄用量范围设在每个反应0.5～5μL，以每0.5μL递增，经过试验结果的比较分析，确定试剂盒中每个反应的MgSO₄ (100mmol/L) 用量为4μL。

4.4 内引物FIP/BIP单因子浓度优化

在反应体系中其他条件相同的情况下，将40mmol/L的FIP/BIP用量范围分别设在每个反应0.1～1.5μL，以每0.1μL递增，经过试验结果的比较分析，确定试剂盒中每个反应的内引物FIP/BIP (40mmol/L) 用量分别为1μL。

4.5 外引物F3/B3单因子浓度优化

在反应体系中其他条件相同的情况下，将10mmol/L的F3/B3用量范围分别设在每个反应0.1～1.5μL，以每0.1μL递增，经过试验结果的比较分析，确定试剂盒中每个反应的外引物F3/B3 (10mmol/L) 用量分别为1μL。

4.6 甜菜碱单因子浓度优化

在反应体系中其他条件相同的情况下，将10mmol/L的甜菜碱用量范围设在每个反应0.5～8μL，以每0.5μL递增，经过试验结果的比较分析，确定试剂盒中每个反应的甜菜碱 (10mmol/L) 用量为4μL。

4.7 Bst DNA Polymerase单因子浓度优化

在反应体系中其他条件相同的情况下，将8U/μL的Bst DNA Polymerase用量范围设在每个反应0.1～2μL，以每0.2μL递增，经过试验结果的比较分析，确定试剂盒中每个反应的Bst DNA Polymerase (8U/μL) 用量为1μL。

4.8 LAMP反应条件的确定

通过对不同水浴温度和作用时间的试验结果比较，确定最佳的LAMP反应条件为水浴温度65℃，作用时间为45min。

采用的检测体系总体积为50μL，利用上述设计的LAMP引物进行反应体系条件的建立与优化，最终确定的LAMP反应体系中各组分用量如下：

10×ThermoPoL Buffer	5μL
		dNTP (2.5mmol/L)	8μL
MgSO₄ (100mmol/L)	4μL
		引物FIP(40mmol/L)	1μL
引物BIP(40mmol/L)	1μL
		引物F3(10mmol/L)	1μL
引物B3(10mmol/L)	1μL
		甜菜碱(10mmol/L)	4μL
Bst DNA Polymerase (8U/μL)	1μL
		DNA模板	1～5μL
无菌去离子水	19～23μL

LAMP反应条件为：水浴温度65℃，作用时间45min。采用琼脂糖凝胶电泳法或浊度观察法进行检测结果的判定。

5. 灵敏度试验

5.1 纯培养溶藻弧菌LAMP检测灵敏度试验

将菌体浓度约9.2×10⁷CFU/mL的溶藻弧菌进行10倍梯度稀释，利用试剂盒法提取每个稀释梯度溶藻弧菌基因组DNA，以此作为模板进行实验，经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，以确定其检测灵敏度，并目测反应液浊度情况。结果显示，初始浓度为9.2×10⁷CFU/mL的溶藻弧菌经10⁷倍稀释后，本发明方法仍能进行有效检测，说明该方法对纯培养溶藻弧菌的检出限约为9CFU/mL。

5.2 模拟污染食品中溶藻弧菌LAMP检测灵敏度试验

取10g溶藻弧菌阴性的虾肉样本，加入90mL碱性蛋白胨水，制成匀浆；加入1mL菌体浓度约为1.5×10⁷CFU/mL的溶藻弧菌，充分混匀；取1mL匀浆液（约含1.5×10⁵CFU/mL的溶藻弧菌）进行10倍梯度稀释，利用试剂盒法提取每个稀释梯度总基因组DNA进行实验，经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，以确定其灵敏度，并目测反应液浊度情况。结果显示，制备的含有1.5×10⁵CFU/mL溶藻弧菌的食品样本经10⁴倍稀释后，本发明方法仍能进行有效检测，说明该方法对污染食品中溶藻弧菌的检出限为15CFU/mL。

6. LAMP方法与实时荧光PCR方法检测的灵敏度比较试验

利用实时荧光PCR方法检测溶藻弧菌，以比较LAMP与实时荧光PCR两种方法检测的灵敏度。针对溶藻弧菌胶原酶基因保守区设计合成了实时荧光PCR引物与探针，其序列如下：上游引物(F)5'-GAGCTTTCTGTTGAATGTAACGACAC-3'；下游引物(R)5'-ACCCACACGCTCCATTGC-3'；探针(Probe)5'-FAM-TCTCTGCAAACTCAGA- CGCAAGCGTAGG-TAMRA-3'。实时荧光PCR方法反应体系(25μL)如下：10×PCRbuffer 2.5μL、引物F 和R(20μmol/L)各1μL、dNTP 2μL、Taq DNA Polymerase 0.5μL、probe (10μmol/L) 1μL、DNA模板1μL，加ddH₂O至25μL。反应条件：95℃ 预变性3min；94℃ 10s，60℃ 40s，此步收集FAM荧光，进行40个循环。结果显示，实时荧光PCR方法对溶藻弧菌的检出限也为9CFU/mL，说明本发明方法与实时荧光PCR方法具有相同的检测灵敏度。

7. 特异性试验

利用建立的溶藻弧菌LAMP检测方法对表1中的细菌进行检测，以探究该方法检测的特异性。结果显示，本发明方法能够特异性地检测溶藻弧菌标准菌株和溶藻弧菌分离菌株，且与其他菌株无交叉反应，说明本发明方法具有高度的特异性（见表1）。

表1 LAMP方法检测的特异性结果

菌株	来源	LAMP结果
			霍乱弧菌 Vibrio cholerae	ATCC 14035	－
霍乱弧菌 Vibrio cholerae	ATCC 16112	－
			拟态弧菌 Vibrio mimicus	ATCC 33655	－
副溶血性弧菌 Vibrio parahaemolyticus	ATCC 27968	－
			副溶血性弧菌 Vibrio parahaemolyticus	分离株	－
创伤弧菌 Vibrio vulnificus	ATCC 27562	－
			创伤弧菌 Vibrio vulnificus	ATCC 33149	－
创伤弧菌 Vibrio vulnificus	分离株	－
			溶藻弧菌 Vibrio alginolyticus	ATCC 33839	+
溶藻弧菌 Vibrio alginolyticus	ATCC 51160	+
			溶藻弧菌Vibrio alginolyticus	分离株	+
大肠埃希菌 Escherichia coli	ATCC 25922	－
			大肠埃希菌 Escherichia coli	ATCC 8739	－
肠出血性大肠埃希菌 Enterohemorrhagic E.coli O₁₅₇: H₇	ATCC 35150	－
			肠出血性大肠埃希菌 Enterohemorrhagic E.coli O₁₅₇: H₇	分离株	－
产肠毒素大肠埃希菌Enterotoxigenic E. coli	ATCC 35401	－
			绿脓杆菌 Pseudomonas aeruginosa	分离株	－
阪崎肠杆菌 Enterobacter.sakazakii	ATCC 51329	－
			福氏志贺氏菌 Shigella flexneri	ATCC 12022	－
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus	ATCC 49444	－
			空肠弯曲菌 Campylobacter jejuni	ATCC 33560	－
单核细胞增生李斯特菌Listeria monocytogenes	ATCC 19111	－
			绵羊李斯特菌Listeria ivanovii	ATCC 19119	－
鼠伤寒沙门氏菌Salmonella. typhimurium	CMCC 50115	－
			猪霍乱沙门氏菌Salmonella enterica	ATCC 10708	－
沙门氏菌 Salmonella	分离株	－
			嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila	ATCC 7966	－
小肠结肠炎耶尔森氏菌Yersinia enteroxolitica	ATCC 9610	－

8. 重复性试验

8.1 利用本发明方法重复20次检测同一个阳性标准品，考察该方法检测的重复性和稳定性。

8.2 利用本发明方法间隔30天检测同一批次阳性标准品，考察该方法检测的重复性和稳定性。

9. 实践应用

将建立的溶藻弧菌LAMP检测方法应用于检验检疫实践工作中，对采集的牡蛎、象牙蚌、生蚝、螃蟹、虾和海产鱼类样本进行检测，其检测结果与溶藻弧菌检验检疫行业标准（SN/T 2564-2010）检测结果进行比较，考察该方法的可靠性与实用性。结果显示，利用建立的溶藻弧菌LAMP检测方法对采集的192份牡蛎样本、125份生蚝样本、43份象牙蚌样本、97份螃蟹样本、172份虾样本、85份海产鱼类样本进行检测，共检出13份溶藻弧菌阳性样本，经检验检疫行业标准SN/T 2564-2010法验证，符合率为100%，未发生漏检、错检，显示该方法具有良好的可靠性和实用性（见表2）。

表2 实践应用结果

Figure 2012103574210100002DEST_PATH_IMAGE004

<110> 黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 利用LAMP检测溶藻弧菌的引物组及其快速诊断试剂盒

<140>

<141>

<160> 4

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

CCAGTGGCTT ACTCGTTGG 19

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

TTCGCGGCCA TAAACTCAT 19

<210>3

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

CGTTCCACTG CCCACCAAAC AAGCCCAGCA CTGGTATATG C 41

<210>4

<211>40

212>DNA

<213>人工序列

<400>40

GGCAACCAAA CGGACCTTGC CCGATTGATG ACGCCCTTAG 40

Claims

1.一种利用LAMP检测溶藻弧菌的引物组，其特征在于，所述的引物组由下列外引物对和内引物对组成：

所述的外引物对为：

F3： CCAGTGGCTTACTCGTTGG，

B3： TTCGCGGCCATAAACTCAT，

所述的内引物对为：

FIP： CGTTCCACTGCCCACCAAACAAGCCCAGCACTGGTATATGC，

BIP： GGCAACCAAACGGACCTTGCCCGATTGATGACGCCCTTAG。

2.一种利用LAMP检测溶藻弧菌的快速诊断试剂盒，其特征在于：它含有权利要求1所述的引物组、阳性对照品、LAMP反应液和Bst DNA Polymerase聚合酶。

3.根据权利要求2所述的一种利用LAMP检测溶藻弧菌的快速诊断试剂盒，其特征在于：所述的引物中外引物对和内引物对的添加摩尔比为1:4。