CN103614486A

CN103614486A - 一种溶藻弧菌检测试剂盒

Info

Publication number: CN103614486A
Application number: CN201310673719.7A
Authority: CN
Inventors: 胡成进; 刘晓斐; 汤潜
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-12-12
Filing date: 2013-12-12
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2033-12-12
Also published as: CN103614486B

Abstract

本发明涉及一种溶藻弧菌的检测试剂盒，具体包括引物及LAMP实际反应液，本发明所述的试剂盒灵敏度高、特异性强、成本低，操作简便。

Description

一种溶藻弧菌检测试剂盒

技术领域

本发明属于病原菌诊断技术领域，具体涉及一种应用LAMP技术检测溶藻弧菌的快速检测试剂盒和检测方法。

背景技术

溶藻弧菌是一种革兰氏阴性条件致病菌，通常人类感染是因为生食海鲜或者伤口接触了带菌的海水或海产品。临床症状主要表现为伤口感染、胃肠炎、中耳炎、眼内炎、食物中毒和败血症等疾病。目前海洋病原菌检测的传统方法主要包括前增菌、选择性增菌、选择性培养、生化鉴定、血清学鉴定，需5～6天出报告，方法繁琐，费时费力。而PCR方法，虽然快速、敏感、特异，但对操作人员要求较高、且需特殊仪器，同样不适合现场检测。

环介导等温扩增( loop-mediated isothermal amplifi-cation，LAMP) 技术是 Notomi 等2000年发明的一种新颖的扩增技术，该技术在具有置换活性的DNA聚合酶( Bst DNA polymerase)作用下，利用特别设计的四段引物识别靶基因的六个区域，恒温条件下进行核酸扩增，以达到对目的基因的高效、特异复制的目的。另外通过环引物的添加，大大加快了反应的速度，整个过程只需要 1～2 h。其结果可以根据反应的副产物白色沉淀焦磷酸镁来判断是否发生扩增，也可以在反应管中加入荧光染料, 反应后观察是否变色来进行鉴别。该检测技术较常规PCR和real-time PCR来说不需要昂贵的设备、特殊的实验室环境和专业技术人员。其突出优点有：操作简便，耗时少，且特异性好、灵敏度高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用LAMP技术对溶藻弧菌进行快速检测的试剂盒。

本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

溶藻弧菌快速检测试剂盒（LAMP法），它包括：

（1）6条引物：

表1 溶藻弧菌引物

（2）2*反应缓冲液组分：

（3）Chelex-100试剂（购自美国Sigma公司）；Bst DNA 聚合酶（购自New England Biolabs公司，8u/ul）；钙黄绿素（购自美国Sigma公司）；

（4）阳性对照DNA，阴性对照DNA。

上述溶藻弧菌快速检测试剂盒（LAMP法）的检测方法包括以下步骤：

（1）取各引物干粉，加去离子水配置成100uM保存液，实验时将引物保存液稀释十倍使用。向Chelex-100中加入20ml去离子水，配成5% Chelex100溶液；

（2 取1ml样品菌液离心弃上清，取沉淀，细菌沉淀中加入1ml 5％Chelex100溶液，震荡混匀后置100℃水浴10min，然后立即冰浴1min，4℃ 12000rpm离心10min，取上清即为标本；

（3）试剂配制（在冰盒上操作）

试验反应按照下表比例进行配置（1次反应量）

阳性对照反应以阳性对照DNA代替样本DNA；

阴性对照反应以阴性对照DNA代替样本DNA；

空白对照反应以去离子水代替样本DNA；

(4) 扩增反应

将配置好的反应溶液置于恒温金属加热仪中，在63℃的条件下反应40分钟；在80℃条件下恒温5分钟或在95℃条件下恒温2分钟，使酶灭活以终止反应。

（5）结果判断

在DNA延伸合成时，从脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子结合会产生一种焦磷酸镁的反应副产物，当在反应前加入钙黄绿素混合液时，颜色会由橙黄色变为草绿色，即溶藻弧菌阳性。

（6）质量控制

阳性对照管为草绿色，阴性对照管和空白对照管为橙黄色，如图1所示，若实验结果与上述结果不符应重新检测。

（7）检验结果的解释

1）检测结果为阳性结果的报告，只能说明样本中有细菌DNA的存在；

2）虽然本试剂盒检测溶藻弧菌的灵敏性和特异性较高，但阴性结果并不能排除样本中含有细菌，只能说明样本中细菌含量低于本试剂盒检测的灵敏度。

试剂盒的评价

（1）. 特异性：选择23株致病菌菌株，其中包括2株溶藻弧菌菌株（ATCC17749T、E0666）、2株创伤弧菌菌株（MO6-24/O、ATCC27562），其他为临床标本分离株，均为临床常见菌，检测结果见图2。溶藻弧菌LAMP检测试剂盒分别特异扩增出溶藻弧菌两株，试管内颜色变为草绿色，而对其它21株细菌均无扩增。

注：第一排：1溶藻弧菌(ATCC17749T)、2溶藻弧菌(E0666) 3创伤弧菌(ATCC27562 ) 、4创伤弧菌（MO6-24/O）、5副溶血弧菌、6白色念珠菌、7金黄色葡萄球菌8铜绿假单胞菌；

第二排：9热带念珠菌10嗜麦芽窄食单胞菌11流感嗜血杆菌12产酸克雷伯杆菌13光滑念珠菌14产单核李斯特氏菌15肺炎克雷伯菌16鲍曼不动杆菌；

第三排： 17产气肠杆菌18克柔念珠菌19粘质沙雷氏菌20表皮葡萄球菌21肺炎链球菌 22化脓性链球菌23 大肠杆菌24阴性对照（水）。

（2）灵敏度：将过夜培养的溶藻弧菌标准菌株配成菌液，用生理盐水10倍倍比稀释成10⁶~10⁰CFU/ml 七个数量级梯度。提取各组细菌DNA后，分别进行LAMP和PCR扩增。结果显示，试剂盒对溶藻弧菌的检出限对应的细菌数量级为10¹CFU/ml（图3）。而PCR检出限对应的细菌数量级为10²CFU/ml （图4），结果显示， LAMP扩增灵敏度较PCR扩增灵敏度高10倍。

（3）重复性：将阳性对照、阴性对照及2份待检标本DNA各重复LAMP检测3次。结果显示，阳性对照、阴性对照及待检标本3次检测结果一致，表明该试剂盒具有良好的重复性。

（4）稳定性：将试剂盒由-20℃取出，置室温下溶解，再置-20℃冷冻，如此反复冻融 1 次、5次、10 次后，对试剂盒内阴、阳性对照进行LAMP扩增。结果显示，试剂盒经反复冻融1、5、10次后，阳性对照均得到阳性结果，阴性对照均得到阴性结果，表明该试剂盒具有良好的稳定性。

5. 保存期：试剂盒保存于-20℃条件下，每隔2个月取出，对阳性对照和阴性对照进行LAMP检测。结果显示，试剂盒保存2、4、6个月后，阳性对照均得到阳性结果，阴性对照均得到阴性结果，表明该试剂盒可在-20℃下至少保存6个月。

附图说明

图1为阴性阳性对照实验结果；

图2为溶藻弧菌LAMP检测特异性结果；

图3为溶藻弧菌LAMP检测灵敏度结果；

注：左起对应菌量浓度分别为4.47×10⁵CFU/ml; 4.47×10⁴CFU/ml; 4.47×10³CFU/ml; 4.47×10²CFU/ml; 4.47×10¹CFU/ml; 4.47×10⁰CFU/ml; 阴性对照；空白对照；

图4为溶藻弧菌PCR检测灵敏度结果，

注：M: Marker DL 5; 各道对应菌量浓度1: 4.47×10⁵CFU/ml; 2: 4.47×10⁴CFU/ml; 3: 4.47×10³CFU/ml; 4: 4.47×10²CFU/ml; 5: 4.47×10¹CFU/ml; 6: 4.47×10⁰CFU/ml; 7: 阴性对照 8: 空白对照。

具体实施方式

以下以实例对本发明做进一步说明。实例仅用于说明本发明，不限制权利要求书中详细描述的本发明。

实施例1

1、引物的设计与合成

对Genebank中的溶藻弧菌基因组的己知序列进行同源性分析比对，最终确定gyrB (EF542801.1)基因为溶藻弧菌诊断的候选基因，

表4-1溶藻弧菌LAMP扩增候选基因

菌株	基因序列号	基因名称	位置	片段长度
					溶藻弧菌	EF542801.1	gyrB	670~1019	349bp

根据候选基因设计引物，设计好的引物由上海生工生物技术有限公司进行合成；

2、试剂配制

向引物干粉中加入去离子水，配成100uM的保存液，实验时将引物保存液稀释十倍使用。向Chelex100中加入20ml去离子水，配成5% Chelex100溶液；

3、样本处理

取1ml菌液离心弃上清，取沉淀。细菌沉淀中加入1ml 5％Chelex100溶液，震荡混匀后置100℃水浴10min，然后立即冰浴1min，4℃ 12000rpm离心10min，取上清即为标本；

4、反应液配制（在冰盒上操作）

2*反应缓冲液	12.5ul
		F3溶液	1.0 ul
B3溶液	1.0 ul
		FIP溶液	1.0 ul
BIP溶液	1.0 ul
		LF溶液	1.0 ul
LB溶液	1.0 ul
		Bst DNA 聚合酶	1.0 ul
钙黄绿素(50uM)	1.0 ul
		样本 DNA	2.0 ul
去离子水	2.5 ul
		合计	25.0 ul

阳性对照反应以阳性对照DNA代替样本DNA；

阴性对照反应以阴性对照DNA代替样本DNA；

空白对照反应以去离子水代替样本DNA；

5、扩增反应

1）将配置好的反应溶液置于恒温金属加热仪中，在63℃的条件下反应40分钟；

2）在80℃条件下恒温5分钟或在95℃条件下恒温2分钟，使酶灭活以终止反应。

6、结果判断

在DNA延伸合成时，从脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子结合会产生一种焦磷酸镁的反应副产物，当在反应前加入钙黄绿素和氯化锰混合液时，颜色会由橙黄色变为草绿色，即溶藻弧菌阳性。

<110>胡成进

<120>一种溶藻弧菌检测试剂盒

<160>6

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<223>引物

<400>1

GCGGTTGAATCAGCAATGG 19

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<223>引物

<400>2

GCCGAATCACCCTCCACTA 19

<210>3

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(39)

<223>引物

<400>3

TCACGTGCACGTGCTGCATCGTCTGAGTTCCTGATTGAG 39

<210>4

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(40)

<223>引物

<400>4

ATGACGCGCCGTAAAGGTGCGCCGGATCTTTTTCCTGACA 40

<210>5

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(24)

<223>引物

<400>5

CGAACAAACCATCTTCGCTTCTTC 24

<210>6

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>6

TCGAACAAACCATCTTCGCT 20

Claims

1.一种溶藻弧菌检测试剂盒，其特征在于，包括：

引物；

2*反应缓冲液；

Chelex-100试剂；

Bst DNA 聚合酶；

钙黄绿素；

阳性对照DNA；

阴性对照DNA；

所述的引物为6条，分别为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的外侧引物F3和如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的外侧引物B3、如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的内侧引物FIP和如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的内侧引物BIP、如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的环引物LF和如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列环引物LB；

所述的2*反应的组成及含量为：

pH8.8 Tris-HCl 40 mM

KCl 20 mM

MgSO₄16 mM

（NH₄）₂SO₄20 mM

Tween20 0.2 %

Betaine 1.6 M

dNTPs 1.4 mM

MnCl₂1 mM 。

2.根据权利要求1所述的溶藻弧菌快速检测试剂盒，其特征在于，包括以下检测步骤：

1）取各引物干粉，加去离子水配置成100uM保存液，实验时将引物保存液稀释十倍使用，向Chelex-100中加入20ml去离子水，配成5% Chelex100溶液；

2）细菌基因组DNA的提取：取1ml样品菌液离心弃上清，取沉淀，细菌沉淀中加入1ml 5％Chelex100溶液，震荡混匀后置100℃水浴10min，然后立即冰浴1min，4℃ 12000rpm离心10min，取上清即为样本DNA；

3）在冰盒上配置25μl反应体系如下：

2*反应缓冲液 10uM 12.5μl

F3溶液 10uM 1.0μl

B3溶液 10uM 1.0μl

FIP溶液 10uM 1.0μl

BIP溶液 10uM 1.0μl

LF溶液 10uM 1.0μl

LB溶液 10uM 1.0μl

Bst DNA 聚合酶 8u/ul 1.0μl

钙黄绿素 50uM 1.0μl

样本 DNA 2.0μl

去离子水 2.5 μl

4）扩增：将配置好的反应溶液置于恒温金属加热仪中，在63℃的条件下反应40分钟,在80℃条件下恒温5分钟使酶灭活以终止反应；若反应管变为草绿色即可判定含有溶藻弧菌。