CN105349447A - 弧菌菌株及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种保藏编号为CCTCC-M2015093的弧菌菌株，该菌为溶藻弧菌。其发酵液具有极强的溶藻活性，而且，利用其发酵液对斑马鱼、丰年虾等进行急性毒理实验显示其没有明显的生物毒性，可大规模用于赤潮防治。

Description

弧菌菌株及其用途

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体的，本发明涉及一种弧菌菌株、弧菌菌株的用途、弧菌菌株分泌物的用途、组合物、组合物的用途，试剂盒、试剂盒的用途、获得溶藻物质的方法以及溶藻物质的用途。

背景技术

赤潮是在全球范围内造成严重的海洋生态环境问题的灾害，已经引起社会各界的广泛关注，由于近年来，沿海污染加剧，导致近海海域发生富营养化，导致赤潮频繁爆发当赤潮藻类大量繁殖时，藻的光合作用消耗了大量的CO₂，导致水体的酸碱度发生改变，影响了海洋生物的正常生命活动，同时，由于赤潮生物覆盖在水上层，使阳光很难到达水体深处，降低水体的透明度，导致底层的水草、珊瑚礁及以水草为主食的海洋动物死亡，生物多样性锐减。因此，海域一旦发生富营养化，海洋生态系统的生物种群会发生大变化，生态平衡便被打乱。特别是某些有毒赤潮藻种的爆发，不仅仅会毒害海洋生物，还会对人类健康造成危害，并造成巨大的经济损失。因此，急需研究出一种区别于传统的物理法和化学法的新型而高效的控制赤潮的方法，才能解决当前的赤潮问题。

与传统的物理方法和化学方法相比较，利用生物特别是某些具有杀藻作用的微生物控制赤潮的方法具有高效、安全等优点，得到学术界越来越多的关注和研究。利用海洋中具有杀藻作用的微生物可使海洋生态环境保持动态平衡，并能实现对赤潮的预防和控制的目的。其中溶藻细菌作为一类能够通过直接或间接方式来实现对藻类的灭活或溶解被越来越多的学者所关注，许多研究表明有害藻类的生长和消亡与自然水体中存在的某些溶藻细菌有关。溶藻细菌是海洋生态系统中的重要组成部分，能有效维持藻华的生物量平衡【ImaiI，SunaharaT，NishikawaT，etal.FluctuationsoftheredtideflagellatesChattonellaspp.(Raphidophyceae)andthealgicidalbacteriumCytophagasp.intheSetoInlandSea，Japan[J].MarineBiology，2001(138):1043-1049.】。

溶藻细菌(Algae-lysingbacteria)是专指那些能通过直接或者间接的方式，使藻类生长受到抑制或者杀灭藻细胞、裂解藻细胞的细菌统称。国内外学者十几年前就开展了溶藻细菌的研究工作。溶藻细菌的相关报道主要集中在：粘细菌【FukamiK，YuzawaT，NishijimaT，etal.IsolationandpropertiesofabacteriuinhibitingthegrowthofGymnodiniumnagasakiense[J].NibonSuisanGakkai-shi，1992(58):1073-1077】、噬胞菌属(Cytophaga)【ShiloM，.LysisofBlue-GreenAlgaebyMyxobacter[J].Journalofbacteriology，1970(9):453-461.ShiloM，.LysisofBlue-GreenAlgaebyMyxobacter[J].Journalofbacteriology，1970(9):453-461.】、纤维弧菌属(Cellvibrio)、节杆菌(Arthrobacter)、蛭弧菌(Bdellovibriobacterious)、腐生螺旋体属(Saprospira)、杆菌(Bacillus)、弧菌(Vibrio)【OshikawaK，KAachi，MNishijima，etal.13-Cyanoaianeneproductionbymarinebacteriaoncyanide-freemediumanditsspecificinhibitoryactivitytowardcyanobacteria[J].ApplEnvironMicrobiol，2000，66(2):718-722.】、黄杆菌属(Flavobacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)【HayashidaA，TanakaS，TeramotoY，etal.Isolationofanti-algalPseudomonasstutzeristrainsandtheirlethalactivityofChattonellaantiaua[J].AgricBiolChem，1991.55(3):787-790.】、交替单胞菌(Alteromonas)、屈挠细菌属(Flexibacter)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、交替假单胞菌(Pseudoalteromonas)等。这些细菌大部分属于革兰氏阴性菌，它们的作用对象比较广泛，对许多微型藻类都具有杀灭作用。

溶藻细菌的作用方式分两种：一种是通过直接与宿主藻接触或者进入宿主藻细胞体内杀灭藻细胞，另一种是通过分泌某些胞外活性物质或者活性酶等使藻细胞死亡的间接溶藻方式【周瑞.高效溶藻细菌混合溶藻特性的初步研究[D].湖北省武汉市:华中师范大学，2006:7-10.】。最早被报道具有溶藻细菌是粘细菌，李勤生和黎尚豪【李勤生，黎尚豪.溶解固氮蓝藻的细菌[J].水生生物学集刊，1981，7(3):377-384】报道了粘细菌与蓝藻细胞发生直接接触而导致蓝藻细胞死亡，并发现该溶藻现象只发生在藻的营养细胞，对孢子和异形胞等菌不会产生影响。Takenaka【TakenakaS，WatanabeMF.MicrocystinLRdegradationbyPseudomonasaeruginosaalkalineprotease[J].Chemosphere，1997，34(4):749-757】从铜绿微囊藻水华中分离出一株与蛭弧菌相似度很高的细菌，该细菌能进入宿主铜绿微囊藻细胞内使藻细胞溶解。

发明内容

依据本发明的第一方面，本发明提供一种分离的弧菌菌株，其在中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，CCTCC)的保藏编号为M2015093，命名为Vibriosp.H115，保藏日期为2015年3月8日，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学。

H115是发明人从赤潮海水样本中首次分离出来的一种新型溶藻细菌，鉴定属于弧菌属，该菌的16SrRNA序列如SEQIDNO：1所示。该菌具有形态特征如下：菌落直径2-3mm，圆形，表面光滑，湿润，灰白色。

依据本发明的第二方面，本发明提供弧菌菌株H115在抑制藻类生长、杀灭藻细胞和/或裂解藻细胞中的用途。

依据本发明的第三方面，本发明提供弧菌菌株H115的分泌物在抑制藻类生长、杀灭藻细胞和/或裂解藻细胞中的用途。该溶藻细菌通过分泌胞外活性物质对藻类进行溶解。筛选溶藻细菌所分泌的高效溶藻物质为有效控制赤潮提供了的一个新的思路。该溶藻细菌通过分泌特异性或非特异性的胞外物质，包括但不限于分泌氨基酸、多肽、蛋白质、羟胺和/或抗生等物质来溶解藻细胞。

依据本发明的第四方面，本发明提供弧菌菌株H115在制备溶藻物质中的用途。

依据本发明的第五方面，本发明提供一种组合物，该组合物包括弧菌菌株H115。

依据本发明的第六方面，本发明提供上述组合物在抑制藻类生长、杀灭藻细胞和/或裂解藻细胞中的用途。

依据本发明的第七方面，本发明提供一种组合物，其包括弧菌H115的分泌物。

依据本发明的第八方面，本发明提供上述组合物在抑制藻类生长、杀灭藻细胞和/或裂解藻细胞中的用途。

依据本发明的第九方面，本发明提供一种试剂盒，其包括弧菌菌株H115和/或该弧菌菌株的分泌物。

依据本发明的第十方面，本发明提供上述试剂盒在抑制藻类生长、杀灭藻细胞、裂解藻细胞和/或制备溶藻物质中的用途。

依据本发明的第十一方面，本发明提供一种用于检测弧菌H115的试剂盒，其包括一对引物，所述引具有如SEQIDNO：2-3所示的序列；任选的，所述试剂盒包括如SEQIDNO：1所示的参考序列。

依据本发明的第十二方面，本发明提供一种检测弧菌H115的方法，该方法包括：利用上述任一检测试剂盒获得待检样本的核酸序列，检测所述核酸序列是否来自弧菌H115。在本发明的一个实施例中，该方法包括：提取待测样本的核酸，任选的电泳检测所述核酸；利用检测试剂盒中的引物对所述核酸进行扩增，获得扩增产物，任选的电泳检测所述扩增产物；对所述扩增产物进行序列测定，获得测定序列；将所述测定序列与SEQIDNO：1比对，完全匹配则确定待测样本包含该弧菌菌株。

依据本发明的第十三方面，本发明提供一种获得溶藻物质的方法，该方法包括获取弧菌菌株H115的发酵液。在本发明的一个实施例中，该方法还包括：去除该细菌发酵液中的菌体，包括离心获得上清液，以及利用滤膜过滤上清液。任选的，对过滤后的上清液进行灭菌，和/或去除过滤后的上清液中的多糖，和/或对过滤后的上清液中进行脱盐，和/或蒸干过滤后的上清液，以获得该菌株分泌的起溶藻作用的物质。

依据本发明的第十四方面，本发明提供通过上述任一实施例获得的溶藻物质在赤潮防治中的用途。

本发明分离鉴定出的新型溶藻弧菌，其能够分泌强极性溶藻活性物质，具有强力溶藻活性，能够抑制藻类生长、杀灭藻细胞和/或裂解藻细胞，而且没有明显的生物毒性，具有生物安全性，可大规模用于赤潮防治。本发明基于分离的新型溶藻弧菌，利用溶藻细菌控制赤潮藻类原理去研究赤潮的生消机理，为防治赤潮提供了新的方向，对海洋环境保护和监测具有重要意义。本发明的弧菌H115还能用于其它的需要抑制、溶解或消除藻类的领域。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是本发明的一个实施例中的溶藻菌H115的基因组DNA的电泳图，标记为3的泳道为H115基因组DNA所在泳道；

图2是本发明的一个实施例中的溶藻菌H115的16SrDNA的电泳图，标记为3的泳道为H11516SrDNA所在泳道；

图3是本发明的一个实施例中的溶藻菌H115对血红哈卡藻细胞数的影响；

图4是本发明的一个实施例中的溶藻菌H115对血红哈卡藻细胞产量值的影响。

具体实施方式

根据本发明的一个实施例，提供一种分离的弧菌菌株，其在中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，CCTCC)的保藏编号为M2015093，命名为H115。H115是发明人从赤潮海水样本中首次分离出来的一种新型溶藻细菌，鉴定属于弧菌。在本发明的一些实施例中，对该菌种进行筛选、培养和保存：用无菌的1000mL蓝口瓶从赤潮爆发的深圳大梅沙海域采得海水样品，取回实验室后立刻使用天津津腾GM-0.20型隔膜真空泵将海水滤过孔径分别为0.45um和0.22um的水系醋酸纤维滤膜，将所得的0.22um水系醋酸纤维滤膜放入30mL无菌的2216E液体培养基中，25℃，180rpm恒温培养摇床培养箱培养24h，放入预培养一周的50mL血红哈卡藻(Akashiwosanguinea，暨南大学海洋藻种室提供)藻液中，按藻培养条件，培养一周以上——22℃，光照强度为2000lx，光照周期12h：12h。将变浑浊藻液按梯度稀释，涂布2216E平板，25℃培养24h，经三次划线分离，获得纯培养的菌株，将获得的纯培养菌株进行2216E液体培养，甘油保种后放置-80℃低温冷冻保存。以上，采得赤潮水样后，以赤潮藻类血红哈卡藻(Akashiwosanguine)为对象，利用液体感染法筛得一株具有极强溶藻效果的细菌H115，通过生理生化特性以及16SrRNA核苷酸序列分析，发现未曾有人报道过一样的菌株，鉴定该菌为巴西弧菌菌株(Vibriobrasiliensisstrain)，为溶藻弧菌，发明人命名为H115。该菌的16SrDNA序列显示如下：

agtggtagagcgtccccccgaaggttaaactacccacttcttttgcagcccactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgtggcattctgatccacgattactagcgattccgacttcacggagtcgagttgcagactccgatccggactacgacgcactttttgggattcgctcactctcgcaagttggccgccctctgtatgcgccattgtagcacgtgtgtagccctactcgtaagggccatgatgacttgacgtcgtccccaccttcctccggtttatcaccggcagtctccctggagttcccacccgaagtgctggcaaacaaggataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatttcacaacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtctcagagttcccgaaggcaccaatccatctctggaaagttctctggatgtcaagagtaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgagttttaatcttgcgaccgtactccccaggcggtctacttaacgcgttagctccgaaagccacggctcaaggccacaacctccaagtagacatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcatctgagtgtcagtatctgtccagggggccgccttcgccaccggtattccttcagatctctacgcatttcaccgctacacctgaaattctacccccctctacagtactctagtctgccagtttcaaatgcaattccgaggttgagccccgggctttcacatctgacttaacaaaccacctgcatgcgctttacgcccagtaattccgattaacgctcgcaccctccgtattaccgcggctgctggcacggagttagccggtgcttcttctgcagctaacgtcaaatacagcagctattaactacgataccttcctcactgctgaaagtactttacaacccgaaggccttcttcatacacgcggcatggctgcatcaggcttgcgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctggaccgtgtctcagttccagtgtggctgatcatcctctcagaccagctagggatcgtcgccttggtgagccattacctcaccaactagctaatcccacctgggcatatcctgacgcgagaggcccgaaggtccccctctttgagccgaagctattatgcggtattagccatcgtttccaatggttatcccccacatcagggcaatttcccaggcattactcacccgtccgccgctcgacgccgttaacgttccccgaaggttcagttaactcgttccgctcgactgcat(SEQIDNO：1)，其基因组DNA和16SrDNA的电泳结果分别如图1和图2所示。该菌具有形态特征如下：菌落直径2-3mm，圆形，表面光滑，湿润，灰白色。该菌具有极强的溶藻活性，在本发明的一个实施例中，培养该菌株24h，获得包含其分泌物的发酵液，较佳的对发酵液进行离心和去除菌体以获得上清液，利用血红哈卡藻藻液按上清液与藻液体积比为1：2000测试该上清液仍具溶藻活性。在本发明的另一个实施例中，培养该菌株24h，获得包含其分泌物的发酵液，较佳的对发酵液进行离心、去除菌体、脱盐蒸干等处理以获得沉淀物，用100mL去离子水溶解沉淀物后按溶解液与藻液体积比为1：100加入血红哈卡藻藻液中仍具溶藻活性。

根据本发明的一个实施例，提供弧菌菌株H115在减少藻类的用途，包括但不限于抑制藻类生长、杀灭藻细胞和/或裂解藻细胞。该溶藻细菌通过分泌胞外活性物质对藻类进行溶解，筛选溶藻细菌所分泌的高效溶藻物质为有效控制赤潮提供了的一个新的思路。本发明的溶藻物质或者包含溶藻物质的组合物可以以固态或液态的形式使用或储藏。

根据本发明的一个实施例，供弧菌菌株H115的分泌物在抑制藻类生长、杀灭藻细胞和/或裂解藻细胞中的用途。该溶藻细菌通过分泌胞外活性物质对藻类进行溶解。筛选溶藻细菌所分泌的高效溶藻物质为有效控制赤潮提供了的一个新的思路。该溶藻细菌通过分泌特异性或非特异性的胞外物质，溶藻物质的组分可能包括但不限于氨基酸、多肽、蛋白质、羟胺和/或抗生。

根据本发明的一个实施例，提供弧菌菌株H115在制备溶藻物质中的用途。制备溶藻物质包括培养获得H115的发酵液。

根据本发明的一个实施例，提供一种组合物，该组合物包括弧菌菌株H115。根据本发明的一些实施例，该组合物具有抑制藻类生长、杀灭藻细胞和/或裂解藻细胞的用途。

根据本发明的一个实施例，提供一种组合物，其包括弧菌H115的分泌物。根据本发明的一些实施例，该组合物具有减少藻类细胞，包括但不限于抑制藻类生长、杀灭藻细胞和/或裂解藻细胞的用途。

根据本发明的一个实施例，提供一种试剂盒，其包括弧菌菌株H115和/或该弧菌菌株的分泌物。该试剂盒具有减少藻类细胞，包括但不限于抑制藻类生长、杀灭藻细胞和/或裂解藻细胞的用途。

根据本发明的一个实施例，提供上述试剂盒在抑制藻类生长、杀灭藻细胞、裂解藻细胞和/或制备溶藻物质中的用途。

根据本发明的一个实施例，提供一种用于检测弧菌H115的试剂盒，其包括一对引物，所述引具有如SEQIDNO：2-3所示的序列，SEQIDNO：2和3分别为5’‐AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‐3’和5’‐GGCTACCTTGTTACGACTT‐3’；任选的，所述试剂盒包括如SEQIDNO：1所示的序列。

根据本发明的一个实施例，提供一种检测弧菌H115的方法，该方法包括：利用上述任一弧菌H115检测试剂盒获得待检样本的核酸序列，检测所述核酸序列是否包含来自弧菌H115的核酸序列。在本发明的一个实施例中，该方法包括：提取待测样本的核酸，任选的电泳检测所述核酸；利用检测试剂盒中的引物SEQIDNO：2和3对所述核酸进行扩增，获得扩增产物，任选的电泳检测所述扩增产物；对所述扩增产物进行序列测定，获得测定序列；将所述测定序列与SEQIDNO：1比对，完全匹配则确定待测样本包含该弧菌菌株。

根据本发明的一个实施例，提供一种获得溶藻物质的方法，该方法包括获取弧菌菌株H115的发酵液。在本发明的一个实施例中，提供一种对溶藻细菌弧菌属分泌的溶藻活性物质的普适性的进一步的纯化方法，该方法还包括：去除该细菌发酵液中的菌体，包括离心获得上清液，以及利用滤膜过滤上清液。任选的，对过滤后的上清液进行灭菌，和/或去除过滤后的上清液中的多糖，和/或对过滤后的上清液中进行脱盐，和/或蒸干过滤后的上清液，以获得该菌株分泌的起溶藻作用的物质。具体的，例如，先对H115菌株进行扩大培养，例如，将保存于-80℃冰箱的菌种按照1％的体积比接种到100mL无菌的液体2216E培养基中25℃，180rpm恒温培养摇床培养箱培养24h。接着，对发酵液进行预处理，例如收集细菌发酵液，利用高速离心机将菌液以10000×g，2min离心，将上清液收集后用0.22um水系醋酸纤维滤膜过滤除去菌体，再用高温高压灭菌锅121℃，20min处理发酵液。再者，为进一步确定溶藻活性物质，去掉培养基组分等中的多糖，例如进行多糖沉淀——将上一步处理得的发酵液与无水乙醇(-20℃预冷5h)以体积比为1：3迅速剧烈混匀，于4℃冰箱静置过夜(8～14h)，利用高速离心机将菌液以10000×g，2min离心，收集上清液，弃去沉淀部分，将收集的上清液通过旋转蒸发仪将无水乙醇和水分蒸干，称重3.05g，再用100mL的去离子水重新溶解沉淀。进一步可选的，进行脱盐，例如将上步所得的100mL溶液装到截留相对分子量为100的透析袋中，放置在盛有去离子水的4L玻璃烧杯中用磁力搅拌器边搅拌边加热，每1h换一次去离子水，连续换7次，将透析袋内的上清液收集，用1M的盐酸和1M的氢氧化钠溶液调节上清液的pH至7.0。再进一步确定溶藻活性物质组分，可选的利用阳离子交换树脂进行分离，将阳离子交换树脂(AmberliteGC-50-type1)按照说明书进行预处理，预处理完毕再用5.6％的氨水处理树脂，将样品缓慢加入阳离子交换柱内，按3个柱体积加入去离子水洗脱一次，再加3个柱体积的5.6％氨水洗脱，用干净的试管接取氨水洗脱相，将收集的氨水洗脱相通过旋转蒸发仪将氨水和水分蒸干，称重2.85g。使用0.22um滤膜过滤溶藻细菌的培养液和高温高压处理过的溶藻细菌菌液均具有溶藻效果，表明该溶藻菌很可能是通过分泌具有热稳定性的非蛋白类代谢物进行间接溶藻作用，而且，该菌分泌的溶藻物质具有超强亲水性，因能够被阳离子交换树脂(AmberliteGC-50-type1，ion-exchangeresin)吸附，能利用5.6％氨水洗脱分离。而将所得发酵液通过多糖沉淀法弃去下层沉淀，取上清，再将所得上清再利用阳离子交换方法分离和回收包含纯溶藻活性物质的氨水洗脱相，去除了包括大分子蛋白、核酸以及多糖等大量杂质，能够实现强极性溶藻物质的纯化。溶藻物质或者包含溶藻物质的组合物可以以固态或液态的形式使用或储藏。

根据本发明的一个实施例，提供通过上述任一实施例获得的溶藻物质在溶解藻类中的用途，例如在赤潮防治中的应用。在本发明的一些实施例中，利用发酵液离心以及菌体过滤后的上清液，对斑马鱼以及丰年虾的急性毒理学实验，24h后斑马鱼或丰年虾没有出现致死现象。的溶藻活性物质的应用，其特征在于当赤潮爆发时，投放到海域进行溶藻。说明当将溶藻物质或者包含溶解物质的组合物投放到相应海域时，不会对其他海洋生物造成毒害作用，具有生物安全性。

以下对分离得的新型菌株及其溶藻活性、生物毒性等方面进行详细的描述。下面示例，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待的试剂、试验动物及仪器，都是常规市售产品或者公开的。

实施例一

溶藻菌的筛选培养和鉴定

1.筛选培养

选用的藻株为血红哈卡藻(Akashiwosanguine)(由暨南大学海洋藻种室提供)，该藻株为海洋赤潮藻常见藻类。

血红哈卡藻培养时使用的培养基为改良f/2培养基，1L培养基的配方如下：

5mgNaH₂PO₄.H₂O,75mgNaNO₃，微量元素混合液(0.22mgZnSO₄.7H₂O,0.01mgCoCl₂.6H₂O,0.18mgMnCl₂.4H₂O,0.006mgNaMoO₄.2H₂O,4.36mgNa₂EDTA.2H₂O,3.15mgFeCl₂.6H₂O,0.01mgCuSO₄.5H₂O)0.1mg维生素B₁,0.5ug维生素B₁₂，0.1ugBiotin(H)，陈海水定容至1L。

血红哈卡藻培养条件如下：在温度为22℃，光照为3000Lux条件下连续光照培养，其生长周期为30天左右，最大藻细胞浓度为2×10⁴cells/mL。

从赤潮爆发的深圳大梅沙海域为实验水样来源。用经高温灭菌的蓝盖玻璃瓶采集水样，采样后的2h内立即转移到4℃冰箱保存。水样先使用孔径0.45μm的滤膜过滤，去除杂质和其它比细菌体积较大的生物；滤液再用0.22μm的滤膜过滤，将滤液中的细菌收集至滤膜上；将0.22μm滤膜放入预培养一周的50mL藻液中，按藻培养条件培养一周以上；将变浑浊藻液梯度稀释，涂布2216E平板，25℃培养24h，经三次划线分离，获得纯培养的菌株，将获得的纯培养菌株进行2216E液体培养，甘油保种后放置-80℃低温冷冻保存。

海洋细菌培养时使用的培养基为2216E培养基配方如下：

5g蛋白胨(Peptone)，1g酵母提取物(YeastExtract)，0.1g磷酸高铁，10-12g琼脂粉(固体培养基)，用1M盐酸调PH7.6-7.8，陈海水定容到1L。

2.鉴定

(1)提取获得的纯培养菌株的基因组DNA，电泳检测结果如图1所示，其中从左边起，第一泳道是Marker，第四泳道(标记为3)为该基因组DNA。

(2)设计合成获得引物对SEQIDNO：2和SEQIDNO：3，以(1)中的基因组DNA为模板，进行PCR，获得PCR产物。PCR产物的电泳检测结果如图2所示，其中的标记为3的泳道为该PCR产物。

(3)对(2)中的PCR产物进行测序，获得该菌株的16SrDNA序列，如SEQIDNO：1所示。

以上，未特别交待的核酸提取过程、电泳检测和PCR反应等涉及的步骤可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可通过市售获得。

实施例二

纯化溶藻活性物质

(1)扩大培养

将保存于-80℃冰箱的菌种按照1％的体积比接种到100mL无菌的液体2216E培养基中25℃，180rpm恒温培养摇床培养箱培养24h。

(2)发酵液预处理

收集细菌发酵液，利用高速离心机将菌液以10000×g，2min离心，将上清液收集后用0.22um水系醋酸纤维滤膜过滤除去菌体，再用高温高压灭菌锅121℃，20min处理发酵液。

(3)多糖沉淀步骤

将步骤(2)得到的发酵液按发酵液与无水乙醇(-20℃预冷5h，)的体积比为1：3迅速剧烈混匀。于4℃冰箱静置过夜(8～14h)，利用高速离心机将菌液以10000×g，2min离心，收集上清液，弃去沉淀部分。将收集的上清液通过旋转蒸发仪将无水乙醇和水分蒸干，称重3.05g，再用100mL的去离子水重新溶解沉淀。

(4)脱盐步骤

将步骤(3)所得的100mL溶液装到截留相对分子量为100的透析袋中，放置在盛有去离子水的4L玻璃烧杯中用磁力搅拌器边搅拌边加热，每1h换一次去离子水，连续换7次，将透析袋内的上清液收集，用1M的盐酸和1M的氢氧化钠溶液调节上清液的pH至7.0。

(5)阳离子交换树脂分离步骤

将阳离子交换树脂按照说明书进行预处理，预处理完毕再用5.6％的氨水处理树脂，将样品缓慢加入阳离子交换柱内，按3个柱体积加入去离子水洗脱一次，再加3个柱体积的5.6％氨水洗脱，用干净的试管接取氨水洗脱相。将收集的氨水洗脱相通过旋转蒸发仪将氨水和水分蒸干，称重2.85g。

实施例三

溶藻活性测试

通过设置不同的菌藻比例(体积比)进行溶藻实验，确定其溶藻细菌的最低溶藻浓度；通过浮游生物框对血红哈卡藻液进行计数，测得藻浓度，摇匀并分装藻液；将溶藻细菌培养到稳定期，菌液经过5000rpm离心10min，弃上清，用f/2重悬菌体2-3次，收集菌体；设置不同的菌藻比例(体积比)，添加适量的菌悬液至藻培养液中。将菌藻混合液放至光照培养箱中培养；使用细胞计数法定期检测藻浓度变化，图3显示溶藻菌H115对血红哈卡藻细胞数的影响。使用Water-Pam水体荧光仪定期测其光合系统的影响，如图4，图4显示溶藻菌H115对血红哈卡藻细胞产量值的影响。

取实施例二步骤(3)所得的上清液，利用血红哈卡藻藻液按上清液与藻液体积比为1:100测试上清液仍具溶藻活性。

取实施例二步骤(5)所得的沉淀，用100mL去离子水溶解后按上清液与藻液体积比为1:100加入血红哈卡藻藻液中仍具溶藻活性。

实施例四

急性毒理学实验

利用实施例步骤(2)所得的上清液，对斑马鱼以及丰年虾的急性毒理学实验。

1、随机挑选5条斑马鱼设为一组，分别置于200mL静置过夜的自来水中，将实施例二步骤(2)所得的上清液分别加入100uL、400uL、1000uL，连续24h观察斑马鱼的状况并记录数据。每个浓度设置3个平行实验，每个系列设置1个空白对照组，实验重复3次，24h后斑马鱼并没有出现致死现象。

2、随机挑选20条丰年虾设为一组，分别置于用一半海水和一半自来水配制的1mL半咸水中，将实施例二步骤(2)所得的上清液分别加入5uL、10uL、20uL、40uL。实验开始连续24h观察丰年虾的状况并记录数据。每个浓度设置3个平行实验，每个系列设置1个空白对照组，实验重复3次，24h后丰年虾并没有出现致死现象。

Claims (11)

1.一种弧菌菌株，其在CCTCC的保藏编号为M2015093。

2.权利要求1的弧菌菌株，其特征在于，所述弧菌菌株具有如SEQIDNO：1所示的16SrDNA序列，所述弧菌菌株为溶藻弧菌。

3.权利要求1或2的弧菌菌株和/或其分泌物在抑制藻类生长、杀灭藻细胞、裂解藻细胞和/或制备溶藻物质中的用途。

4.一种组合物，其包括权利要求1或2的弧菌菌株和/或权利要求1或2的弧菌菌株的分泌物。

5.权利要求4的组合物在抑制藻类生长、杀灭藻细胞、裂解藻细胞和/或制备溶藻物质中的用途。

6.一种试剂盒，其包括权利要求1或2的弧菌菌株和/或权利要求1或2的弧菌菌株的分泌物。

7.权利要求6的试剂盒在抑制藻类生长、杀灭藻细胞、裂解藻细胞和/或制备溶藻物质中的用途。

8.一种用于检测权利要求1或2的弧菌菌株的试剂盒，其包括一对引物，所述引具有如SEQIDNO：2-3所示的序列；

任选的，所述试剂盒包括如SEQIDNO：1所示的参考序列。

9.一种检测权利要求1或2的弧菌菌株的方法，其特征在于，包括：

利用权利要求8的试剂盒获得待检样本的核酸序列，

检测所述核酸序列是否来自所述弧菌菌株。

10.一种获得溶藻物质的方法，其特征在于，包括获取权利要求1或2的弧菌菌株的发酵液；

任选的，

所述方法还包括，

去除所述发酵液中的菌体，其中包括，离心获得上清液，以及过滤所述上清液；

任选的，

对过滤后的上清液进行灭菌，和/或去除过滤后的上清液中的多糖，和/或对过滤后的上清液进行脱盐，和/或蒸干过滤后的上清液。

11.利用权利要求10的方法获得的溶藻物质在赤潮防治中的用途。