CN102337234A

CN102337234A - 粘质沙雷氏菌lth-2及其筛选方法和应用

Info

Publication number: CN102337234A
Application number: CN 201110215312
Authority: CN
Inventors: 浦跃朴; 杨飞; 尹立红; 吴巍
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2011-07-29
Filing date: 2011-07-29
Publication date: 2012-02-01

Abstract

本发明公开了一种粘质沙雷氏菌（ Sarratia marcesens ） LTH-2 ，该菌株的保藏编号为 CCTCCM2011209 ，其具有溶解微囊藻并产生灵菌红素的能力。该菌生产溶藻代谢产物灵菌红素，可以消除微囊藻水华及其水华带来的环境污染。

Description

粘质沙雷氏菌LTH-2及其筛选方法和应用

技术领域

本发明属于粘质沙雷氏菌筛选技术领域，具体涉及一种粘质沙雷氏菌LTH-2及其筛选方法和应用。

背景技术

随着社会经济的迅猛发展，社会工业化进程的加快，人们不合理的生活、生产方式等原因导致了水域中氮、磷等营养盐类大量富集，致使全球性水域富营养化日益严重。水体富营养化带来的直接危害就是水华的产生。在温暖的季节，藻类大量繁殖，往往漂浮在水面或分散在水中呈浮动状态形成一片片蓝绿色的藻块或藻的薄层即“水华”。最近十几年来，在滇池、太湖等水域，“水华”频现。“水华”出现时，由于密集的藻类，导致水体透明度降低，影响水中植物的光合作用；当大量藻类死亡后，其迅速分解，消耗水中的溶解氧，使得溶解氧急剧减少，造成水体缺氧。缺氧引起水生生物窒息死亡，水体的正常生态平衡被打乱，生物种群会显示剧烈的波动，这种生物种类演替导致水生生物的稳定性和多样性降低，使水体失去以前的功能，出现湖泊老化。

另外自来水厂的过滤装置易会由于藻类“水华”而被填塞，影响混凝沉淀效果，影响出水浊度，从而影响自来水厂的生产和自来水的质量。而有些藻类在代谢过程中或藻体破裂后会释放藻毒素，微囊藻毒素就是一种很强的肝致癌物，长期饮用则可能引发肝癌。综上水体富营养化所引起“水华”影响水体景观，使水质恶化，生态系统平衡遭破坏，影响自来水厂的生产和自来水的质量，产生藻毒素，给水生态系统、公共卫生安全带来严重威胁。

研究净水除藻技术，从而解决藻类泛滥、水华暴发，已经成为的一个非常重要而紧迫的任务。目前，除藻技术主要有捞藻、挖泥、换水除藻、黏土絮凝和遮光技术等物理技术；投加氧化型杀菌除藻剂以及无机金属化合物及重金属制剂等非氧化型杀菌除藻剂等化学技术；除此之外，还有水生植物控制、水生动物控制和微生物除藻等生物除藻技术。物理除藻技术往往需要昂贵的经济成本，耗资大，因此该技术的运用只局限于局部水域。化学除藻技术显效速度快、效果显著，但杀菌灭藻剂往往对其他生物有副作用，加速藻毒素释放，产生副产物，从而会不可避免地将造成环境的二次污染或破坏生态平衡，所以化学除藻技术只能作为权宜之计。生物除藻技术利用生态系统食物链摄取的原理及生物的相生相克关系来控制或抑制藻的泛滥生长，将能够有效地控制蓝藻生长的生物调动起来。这种方法充分利用了生态系统中各生物的相互作用，可有效地控制藻类生长。

有关研究表明溶藻菌在水华消退过程中扮演重要的角色。因此，从自然界中分离纯化土著溶藻菌以及其相关活性物质，从而安全、高效地治理水华具有非常重要的实际意义。目前对土著溶藻菌的报道较少，尤其淡水中的土著溶藻菌以及其代谢产物的报道更少。本发明因此而来。

发明内容

本发明目的在于提供一种粘质沙雷氏菌(Sarratia marcesens)LTH-2，解决了现有技术中缺乏进行水华处理的溶藻菌研究以及淡水水华污染净化处理等技术难题。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：

一种粘质沙雷氏菌(Sarratia marcesens)LTH-2，该菌株的保藏编号为CCTCC M 2011209，其具有溶解微囊藻并产生灵菌红素的能力。

本发明的另一目的在于提供一种粘质沙雷氏菌LTH-2的培养筛选方法，其特征在于所述方法包括将富营养化的太湖水样品进行稀释后在固体分离培养基平皿上进行需氧培养形成菌落，然后挑单菌落分离纯化得到纯化的粘质沙雷氏菌LTH-2菌株。

优选的，所述方法中需氧培养在温度控制在28～30℃范围内、pH值控制在6.8～7.2下进行。

优选的，所述方法中采用的固体分离培养基以其组分的配比计包括：

牛肉膏 5重量份数；

蛋白胨 10重量份数；

NaCl 5重量份数；

琼脂粉 2重量份数；

蒸馏水 100重量份数；

固体分离培养基的pH值控制在6.8～7.2范围内。

优选的，所述方法中还包括将所述纯化的粘质沙雷氏菌LTH-2菌株按照3～5％的接种量接入液体培养基，液体培养基的pH值控制在6.8～7.2范围内，培养温度为28～30℃，培养时间为24h～48h，得到扩大培养的粘质沙雷氏菌LTH-2菌株。

优选的，所述方法中所述的液体培养基以其组分的配比计包括：

牛肉膏 5重量份数；

蛋白胨 10重量份数；

NaCl 5重量份数；

蒸馏水 100重量份数；

且液体培养基的pH值控制在6.8～7.2。

本发明的又一目的在于提供一种粘质沙雷氏菌LTH-2在净化含铜绿微囊藻液污水中的应用。

本发明属于环保技术领域，具体涉及一种从富营养化湖泊细菌中筛选出来可以高效率溶解微囊藻的淡水土著菌菌株以及制备其产生的灵菌红素的方法。本发明揭示了一种从富营养化湖泊细菌中筛选出来可以高效率溶解微囊藻的淡水土著细菌菌株以及该菌生产溶藻代谢产物灵菌红素，从而消除微囊藻水华及其水华带来的环境污染。

使用的微生物

使用的微生物为粘质沙雷氏菌，根据其生物类别情况命名为粘质沙雷氏菌(Sarratia marcesens)LTH-2，来自中华人民共和国江苏省无锡市太湖湖水中分离获得，现在已经保藏于中国典型培养物保藏中心，该保藏中心的地址位于湖北省武汉市武汉大学生命科学学院武汉市武昌珞珈山；粘质沙雷氏菌(Sarratia marcesens)LTH-2的保藏日期为2011年6月23日，保藏期限为30年，保藏编号为CCTCC M 2011209。

本发明提供的溶藻菌是从江苏省无锡市富营养化程度严重且微囊藻水华频发的太湖中筛选的得到的菌株。该菌株为太湖中土著的异养细菌，命名为LTH-2，此菌经过Biolog微生物鉴定系统鉴定以及此菌16S rDNA序列分析，其属于粘质沙雷氏菌(Sarratia marcesens)中的成员。菌LTH-2的16SrDNA全基因序列已向美国国家生物技术信息中心(NCBI)的Genebank基因序列数据库递交，登录号为HM640277。

粘质沙雷氏菌LTH-2的微生物学特性

1、形态学方面的特性

微生物本身形态学特性：菌体为革兰氏阴性短杆状，大小为(0.7～0.9)μm×(1.0～1.3)μm，周身鞭毛，有动力，无芽孢，无荚膜。

2、培养学方面的特性

培养基用的是牛肉膏蛋白胨培养基。其在牛肉膏蛋白胨固体培养基上的微生物学特性：菌落呈圆形，光滑，湿润，表面凸起，中心不透明，边缘不规则，大小为1-3mm，均产生红色色素，有轻微异味。该菌为为兼性好氧菌。

3、生理生化特征：

(1)细胞产生红色色素；

(2)杆状；

(3)革兰氏阴性；

(4)氧化/发酵(O/F)：F发酵型；

(5)氧化酶：阴性；

(6)鸟氨酸：阳性；

(7)赖氨酸：阳性；

(8)乳糖：阴性；

(9)蔗糖：阳性；

(10)苯丙氨酸：阴性；

(11)葡萄糖酸盐：阳性；

(12)甘露醇：阳性；

(13)尿素：阴性；

(14)丙二酸眼：阴性；

(15)明胶液化：弱阳性(22度)；

(16)七叶苷：阳性；

(17)水杨苷：阴性；

(18)麦芽糖：阴性；

(19)半乳糖：阳性；

(20)硝酸盐还原：阳性；

(21)木糖：阴性；

(22)密二糖：弱阳性；

(23)肌醇：阳性；

(24)海藻糖：阳性；

(25)棉籽糖：阴性；

(26)吲哚：阴性；

(27)鼠李糖：阴性；

(28)动力学检查：阳性(悬滴检查)，半固体为动力弱阳性。

通过生理生化检测、Biolog微生物鉴定系统鉴定以及此菌16S rDNA序列分析均表明此菌为粘质沙雷氏菌中的成员，因此可以精确地将本发明的LTH-2分类为粘质沙雷氏菌，从而建立了分类鉴定微生物的一种快速(利用Biolog微生物鉴定系统，16h内即可得到鉴定结果)、可靠、准确的途径。

该菌株能够高效溶解微囊藻，24h溶藻率78.6％。产生溶解微囊藻的红色代谢产物灵菌红素，代谢产物产量高。

本发明所提供制备灵菌红素的方法，是用LTH-2为生产菌株，经母种发酵培养，提取红色代谢产物和纯化代谢产物的过程。

经理化特性、分子量、¹H-NMR、FT-IR、GC-MS检测，代谢产物的数据与灵菌红素一致，即经过理化性质及结构的鉴定试验可知此制备方法所得的产品是较纯的灵菌红素。将代谢产物溶于微量甲醇中，然后加入藻密度为3×10⁶个/mL处于对数生长期的微囊藻液中，然后在显微镜下计数藻细胞浓度。在24内，其对铜绿微囊藻的半数抑制浓度IC₅₀为1.9(±0.1)×10-1μgml^-1。通过形态学、一系列生化试验等生理生化特性以及16S rDNA序列分析，将此溶藻菌最终确定为粘质沙雷氏菌。

经过对该产物理化性质、分子量、结构和溶藻效果分析，可证明由菌株LTH-2发酵提取的深红色代谢物为灵菌红素，且具有较强的溶藻效果，具有很好地开发成一种见效快、用量少、对环境友好的除藻剂的巨大潜力。该菌株的获得为消除微囊藻水华及其水华带来的环境污染增添了一种生物途径，也为开发出廉价但高效的生物活性物质以及天然色素奠定了菌种基础，有很好的研究前景。

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：

本发明提供了一种能够从淡水细菌筛选出来可以高效率溶解微囊藻的淡水细菌菌株。该菌株遗传稳定，繁殖快，溶解微囊藻效率高，可进行大批量发酵生产，以消除微囊藻水华。另外，本发明提供一种制备该菌株产生的溶藻代谢产物灵菌红素方法。利用此制备方法，不必用到昂贵的实验仪器，所以不仅可以快速、简单易行地得到较纯的高效溶藻活性物质-灵菌红素，而且将发酵液中的上清液和菌体分别进行提取红色代谢产物，大大节约了有机溶剂的用量。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为本发明实施例获得的溶藻菌LTH-2溶藻效果；

图2为本发明实施例获得的溶藻菌LTH-2系统进化树；

图3为本发明实施例制备的较纯代谢产物灵菌红素甲醇溶液的紫外可见吸收光谱；

图4为本发明实施例制备的较纯的灵菌红素的¹H-NMR图谱；

图5为本发明实施例制备的灵菌红素的GC-MS图谱；

图6为本发明实施例制备灵菌红素高效溶藻过程。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1粘质沙雷氏菌(Sarratia marcesens)LTH-2的筛选和形态学观察

粘质沙雷氏菌(Sarratia marcesens)LTH-2自中华人民共和国江苏省无锡市太湖湖水中分离获得，现在已经保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2011209。

筛选粘质沙雷氏菌(Sarratia marcesens)LTH-2采用的原料为太湖湖水。

具体筛选步骤如下：

(1)配制溶藻菌固体分离培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂粉2g，蒸馏水100mL，pH7.2；

(2)将太湖水样品进行梯度稀释，10倍稀释形成浓度梯度，分别取每一浓度的样品0.1mL涂布于固体培养基平皿上，培养24小时形成菌落，然后挑单菌落分离纯化得到纯化菌株；

(3)配制液体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水100mL；

(4)扩大培养：将纯化的菌株按照4％的接种量接入液体培养基，液体pH7.2，培养温度为30℃，培养时间为48h；

(5)溶藻效果的实验：取1mL培养48h的菌液接种于19mL处于对数生长期的铜绿微囊藻液中作为实验组，微囊藻浓度为3×10⁶个/mL。以未加入菌液而加入等体积的菌培养基的藻液组为对照组。两天后观察实验组和对照组的藻液黄化和藻体凝结情况。

结果发现：加入菌LTH-2菌的实验组藻液明显黄化，藻体凝结出现沉淀，对照组藻液未黄化和凝结沉淀。

依据经典形态学方法，对分离获得的菌进行肉眼和显微镜形态学观察，合并表型相同的菌株，筛选分离表型不同的菌株，并结合溶藻效果实验的结果，最后获得一株土著高效溶藻且产灵菌红素的菌株LTH-2。溶藻菌LTH-2溶藻效果参见附图1。

实施例2粘质沙雷氏菌(Sarratia marcesens)LTH-2的鉴定

本实施例对培养得到的粘质沙雷氏菌(Sarratia marcesens)LTH-2建立了分类鉴定微生物的一种快速(利用Biolog微生物鉴定系统，16小时内即可得到鉴定结果)、可靠、准确的途径。具体鉴定步骤如下：

A.Biolog微生物鉴定系统鉴定

Biolog微生物鉴定系统测试的是微生物在鉴定板中利用或氧化化和物的能力。测试会产生特征性的紫色孔模式，组成代谢指纹，系统软件自动和数据库对比，如果能找到合适的匹配，就可以得出一个鉴定结果。具体方法参加Biolog公司的MicroLogTM System，Release 4.2指导手册。

(1)平板选择：针对溶藻菌LTH-2选择Biolog GN板

(2)样品制备：将菌接LTH-2种于Biolog接种液中，并控制到适宜浓度，使浊度为61％T。

(3)加样：取一定体积菌液(150μL/孔)，平行加入Biolog GN板中各孔，共加96孔。

(4)培育与读数：生化培养箱中37℃恒温培育16-24h，放入读数仪，A-1孔位于左上方。即可点击“Read This”进行读数。本发明实施例获得的Biolog微生物鉴定系统鉴定溶藻菌LTH-2的鉴定结果自动显示在屏幕下方，将所得数据进行保存即可。鉴定结果参见下表。

B.生理生化检测

生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，可用于鉴别一些在形态等方面不易区别的微生物，因此微生物生理生化检测结果是微生物分类鉴定重要的依据。根据第八版《伯杰氏细菌分类鉴定手册》中的方法进行发酵类型、代谢底物、营养依赖型等方面的检测。

该菌株的生理生化特性是：细胞产生红色色素，杆状，革兰氏阴性，氧化/发酵(O/F)：F发酵型，氧化酶：阴性，鸟氨酸：阳性，赖氨酸：阳性，乳糖：阴性，蔗糖：阳性，苯丙氨酸：阴性，葡萄糖酸盐：阳性，甘露醇：阳性，尿素：阴性，丙二酸眼：阴性，明胶液化：弱阳性(22度)，七叶苷：阳性，水杨苷：阴性，麦芽糖：阴性，半乳糖：阳性，硝酸盐还原：阳性，木糖：阴性，密二糖：弱阳性，肌醇：阳性，海藻糖：阳性，棉籽糖：阴性，吲哚：阴性，鼠李糖：阴性。动力学检查：阳性(悬滴检查)，半固体为动力弱阳性。

C.16S rDNA序列分析

引物：16S rDNA的PCR引物为：

27F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；

1492R：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’。

用blast比较菌株LTH-2的16S rDNA序列与Genbank中其它菌已登录的16S rDNA序列。经比对，此菌株与Genebank中的Serratia marcescensstrain MH6同源性为99％。从系统进化树中可以发现该菌株与核糖体数据库计划(RDP)数据库中的标准株Serratia marcescens AB061685的相关性为55％。系统进化树参见附图2。

具有高效率溶藻且产灵菌红素的菌株LTH-2，培养16h后，经过Biolog微生物鉴定系统鉴定快速鉴定，此菌为粘质沙雷氏菌的可能性为98％，Biolog鉴定系统结果栏目显示粘质沙雷氏菌(Specie ID：Serratiamarcescens)，因此可以判断其为粘质沙雷氏菌。

实施例3菌株红色色素的制备和结构鉴定

利用粘质沙雷氏菌LTH-2为生产菌株，制备其产生的红色代谢产物灵菌红素，具体的灵菌红素制备步骤如下：

(1)母种制备：在牛肉膏蛋白胨培养生产发酵母种，将颜色深红的菌株LTH-2接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，并将此菌株作为发酵母种菌株使用。

(2)发酵培养生产：接种生产发酵母种于发酵培养基中发酵生产，发酵条件是：通气培养，生产温度为30℃。所述的发酵培养基为液体培养基，培养基配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水100mL，控制pH7.2。

发酵过程分三个阶段，逐步扩大培养。首先将发酵母种菌株接种于含有新鲜培养基的平皿中(一级培养，18-24小时)，然后接种到装有250mL液体培养基的三角烧瓶中进行摇床培养(二级培养，约24小时)，再将三角烧瓶中的发酵液作为母液加到装有1.6L的液体培养基中，进行通气发酵培养(生产性发酵培养，约2天及以上)。二级培养与生产型发酵培养之间母液和液体培养基之间的比例为1∶10(体积比)。

(3)提取红色代谢产物：8000r/min，15min离心发酵液，上清液用乙酸乙酯萃取，沉淀物溶解于甲醇，合并上清液中的乙酸乙酯红色萃取物和沉淀物中的甲醇红色提取物。

(4)纯化红色代谢产物：将红色代谢产物经硅胶柱层析，用石油醚、乙酸乙酯混合物对硅胶柱进行梯度洗脱(石油醚∶乙酸乙酯起始比例为50∶1，接着为15∶1，最终配比例为5∶1，均为体积比)，收集红色组分(石油醚∶乙酸乙酯比例为5∶1时的组分)，重复一次柱层析，即通过梯度洗脱硅胶柱，观察洗脱液的颜色来分段收集得到红色洗脱液，可得到红色产品。

对制备的产品进行纯度、结构鉴定以及溶藻效果测定，结果表明：

如图3～5所示，由高效液相验证纯度和¹H-NMR图谱显示，产品纯度可高达90％。

经结构的鉴定试验可以证明其结构为：

分子式为：C₂₀H₂₅N₃O。

产品数据：

λmax：540nm；¹H-NMR(CDCl₃，500MHz，ppm)σ0.89(t，3H，H-19)，1.29(m，2H，H-18)，1.32(m，2H，H-17)，1.54(m，2H，H-16)，2.38(t，2H，H-15)，2.55(s，3H，H-14)，4.01(s，3H，H-20)，6.08(s，1H，H-6)，6.35(m，1H，H-2)，6.68(d，1H，H-11)，6.92(d，1H，H-3)，7.05(brs，1H，H-9)，7.26(m，1H，H-1)，12.57(brs，1H，H-21)，12.74(brs，1H，H-22)。FT-IR(KBr)：3445，2924，1625，1461，1134，1060cm^-1。GC-MS：m/z 323.2，HPLC-TOF MS-ES+：m/z 324.2078。

此产品的理化特性、分子量、¹H-NMR、FT-IR、GC-MS等数据与灵菌红素一致，即经过理化性质及结构的鉴定试验可知此制备方法所得的产品是较纯的灵菌红素。

如图6，将此产品溶于微量甲醇中，然后加入藻密度为3×10⁶个/mL处于对数生长期的微囊藻液中，然后在显微镜下计数藻细胞浓度。在24内，其对铜绿微囊藻的半数抑制浓度IC₅₀为1.9(±0.1)×10^-1μg ml^-1。

经过对该产物理化性质、分子量、结构和溶藻效果分析，可证明由菌株LTH-2发酵提取的红色代谢物为灵菌红素，灵菌红素作为一种新研究的抗肿瘤活性物质，具有开发成抗癌新药的潜力，且本发明的灵菌红素具有较强的溶藻效果，具有很好的开发成一种见效快、用量少、对环境友好的除藻剂。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种粘质沙雷氏菌（Sarratia marcesens）LTH-2，该菌株的保藏编号为 CCTCC M 2011209，其具有溶解微囊藻并产生灵菌红素的能力。

2.一种权利要求1所述的粘质沙雷氏菌LTH-2的培养筛选方法，其特征在于所述方法包括将富营养化的太湖水样品进行稀释后在固体分离培养基平皿上进行需氧培养形成菌落，然后挑单菌落分离纯化得到纯化的粘质沙雷氏菌LTH-2菌株。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法中需氧培养在温度控制在28～30℃范围内、pH值控制在6.8～7.2下进行。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法中采用的固体分离培养基以其组分的配比计包括：牛肉膏 5重量份数；蛋白胨 10重量份数；NaCl 5重量份数；琼脂粉 2重量份数；蒸馏水 100重量份数；固体分离培养基的pH值控制在6.8～7.2范围内。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法中还包括将所述纯化的粘质沙雷氏菌LTH-2菌株按照3～5%的接种量接入液体培养基，液体培养基的pH值控制在6.8～7.2范围内，培养温度为28～30℃，培养时间为24h～48h，得到扩大培养的粘质沙雷氏菌LTH-2菌株。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中所述的液体培养基以其组分的配比计包括：牛肉膏 5重量份数；蛋白胨 10重量份数；NaCl 5重量份数；蒸馏水 100重量份数；且液体培养基的pH值控制在6.8～7.2。

7.一种权利要求1所述的粘质沙雷氏菌LTH-2在净化含铜绿微囊藻液污水中的应用。