CN101955904A

CN101955904A - 一种自然水环境中的溶藻菌分离方法

Info

Publication number: CN101955904A
Application number: CN 201010518153
Authority: CN
Inventors: 吴为中; 李超; 吴伟龙
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2010-10-25
Filing date: 2010-10-25
Publication date: 2011-01-26
Anticipated expiration: 2030-10-25
Also published as: CN101955904B

Abstract

本发明提供了一种自然水环境中的溶藻菌分离方法，属于自然水环境的生物控藻技术。本发明采用自然水环境挂膜的方法，通过在富营养化水体中放置惰性载体，在短时间内形成物种丰富的微生物群落，然后采用添加了藻类细胞内含物的固体SM培养基进行高效溶藻细菌的筛选分离。本发明能够快速、便捷、有效地分离高效的溶藻菌。

Description

一种自然水环境中的溶藻菌分离方法

技术领域

本发明属于自然水环境的生物控藻技术，具体涉及一种自然水环境中的溶藻菌分离方法。

背景技术

20 世纪60 年代，国外科学家发现有多种微生物着生在水华藻类上并能分解藻类，揭开了微生物与水华之间的关系，并开始了有关病毒（Curtis A.Suttle, A.M.C, Matthew T.Cottrell．Infection of phytoplankton by viruses and reduction of primary productivity[J]． Nature ,1990,347: 467-469．）、真菌（Ellen Van Donk, J.R．The effect of fungal parasitism on the succession of diatoms in Lake Maarsseveen I (The Netherlands) [J]．Freshwater Biology,1983,13(3): 241-251．）以及细菌溶藻的研究。后来越来越多的研究发现溶藻细菌对水华的控制有非常重要的作用。然而，溶藻细菌控藻研究首先就是要从自然水体中分离高效溶藻细菌。针对目前溶藻细菌的分离方法，通常分为两种思路：一种是利用液体感染的方法进行分离；另一种是利用固体感染的方法进行分离。具体分离方法为：

（1）利用液体感染筛选分离方法

利用液体感染方法筛选溶藻细菌，一般先确定水样中是否含有溶藻细菌，再进行分离筛选。(Imai I, Kim Mu-Chan, et al．Relationships between dynamics of red tide-causing raphidophycean flagellates and algicidal micro-organisms in the coastal sea of Japan [J]．Phycological Research,1998,46(2):139-146．)展了一种利用液体培养基分离海洋溶藻细菌的方法。程序如下：采集水样，经0.8??m滤膜过滤，去除比细菌大的颗粒，然后用藻类培养基对水样进行10倍递增梯度稀释，取1mL各个稀释度的水样分别加入4mL预培养藻类培养物中，设置5个平行进行培养。培养一段时间后，取黄化的培养物涂布平板分离细菌，然后从优势菌株筛选溶藻细菌。

（2）固体感染筛选方法（即软琼脂顶层平板法(SAOTL)）

在固体培养基上分离溶藻细菌主要利用空斑形成(Plaque formation)的方法进行。1964年Safferman（Safferman R.S,Camion R.E,Desjardins P.R,et al．Classification and nomenclature of viruses of cyanobaeteria[J]．Intevrirology,1983,19:61-66．）首先采用SAOTL法分离和检测蓝藻病毒， 1970年Shilo (Shilo M．Lysis of Blue-Green Algae by Myxobacter．Journal of bacteriology,1970,104(1): 453-461．)将其用于分离溶藻细菌，后经过许多研究者的不断发展和完善，目前以成为一种分离溶藻微生物，尤其是淡水生态系统中溶藻细菌的常用方法（Kurhmaro A ,Loya Y, et al．Bacterial infection and coral bleaching[J]．Nature,1996,380:396.）其基本操作如下：制备两种藻类固体培养基——琼脂培养基和软琼脂培养基(soft-agar medium)，以琼脂培养基作底层平板，水样、预培养的藻和融化并冷却到47℃的软琼脂培养基混合均匀迅速倾注到底层平板，琼脂固化后进行培养，至扩散的溶藻斑出现后，通过单斑纯化获得溶藻菌株（席宇，一株欧文氏菌的分离及其溶藻特性的研究．2003,华中师范大学．硕士毕业论文）。

由于水样的预处理、微生物间相互依赖关系以及分离使用的培养基缺乏微生物所需的特殊的营养需求等，种种这些原因都会使大部分的细菌被遗漏，无论在液体还是在固体培养基中，有些细菌是不能被分离培养的。Suzuki（Suzuki M T, M S Rappe, Z W Haimberger．Bacterial diversity among small-subunit rRNA gene clones and cellular isolates from the same seawater sample[J]．Appl. Environ. Microbiol., 1997, 63 (3):983-989．）的研究发现：在海洋环境中，通过培养获得细菌的16SrRNA序列远远少于直接从环境中获得的序列。这给分离高效溶藻微生物带来了困难，这些矛盾的解决都需要技术和方法上的突破。

发明内容

本发明的目的在于提供一种自然水环境中的溶藻菌分离方法，可直观、快速、便捷地分离具有高效抑藻效果的溶藻细菌。

本发明的技术方案如下：一种自然水环境中的溶藻菌分离方法，包括如下步骤：

1）在富营养化水体中放置惰性载体，在惰性载体上形成富集多种微生物的生物膜；

2）制备藻类细胞内含液，将其与BG11培育基混合后制成半固体培养基，铺在BG11 固体培养基上，获得SM培养基；

3）清洗步骤1）形成的生物膜材料，去除原生动物和水中杂质，然后加入藻类培养液中培养；

4）取步骤3）中发生溶藻现象的培养液进一步在固体培养基上进行溶藻空斑实验；

5）挑取步骤4）形成的溶藻空斑再进行多次溶藻空斑实验，从而纯化空斑；

6）取纯化后的空斑在步骤2）制备的SM培养基上划线培养，获得单菌落并检测其溶藻效果，得到溶藻菌。

上述步骤1）中所述惰性载体是惰性挂膜材料，可选用惰性玻璃片、FPUFS载体（含有羟基、环氧基和酰胺基等反应性基团，孔径0.3～0.7mm）等。惰性挂膜材料通常垂挂在富营养化水体水面下1~1.5m处，15-30天后即可得到富集多种微生物的生物膜。

通过在不同地域如云南滇池、北京的富营养化湖泊、富营养化景观水体中放置多个惰性挂膜材料，定期采收形成生物膜的材料开展后续的溶藻试验初步筛选，再从有明显控藻效果生物膜中分离溶藻微生物。

上述步骤2）中所述藻类根据待治理区域的水华特点进行选择。针对我国水华特点主要为微囊藻、水华鱼腥藻（Anabaena flos-aquae），可建立以这两种藻类细胞内含液与BG11培养基混合制作的SM培养基，直接用于溶藻菌的分离，能快速完成针对微囊藻、水华鱼腥藻等水华藻的溶藻菌的筛选。可以通过将藻类细胞反复冻溶后离心，取上清过滤除菌得到无菌的藻类细胞内含液。

上述步骤3）通常是将生物膜材料用灭菌高纯水清洗后，将清洗得到的混合液通过滤纸过滤，以消除原生动物的影响以及去除水中的杂质；然后将滤液加入预培养的藻类培养液中，光照静置培养，出现溶藻现象的培养液用于下一步骤。

上述步骤4）的溶藻空斑实验所用的培养基为BG11固体培养基，将步骤3）出现溶藻现象的培养液用BG11培养液稀释后与浓缩的藻液混匀，涂布在BG11固体培养基上，光照培养，观察是否有空斑出现。

上述步骤5）取溶藻空斑重悬于BG11培养液中后重复进行溶藻空斑实验，进行空斑纯化。

上述步骤6）取一个最后形成的典型空斑，转移到SM 培养基上黑暗培养。形成菌落后挑取部分菌落加入藻类培养液中培养以检测其溶藻效果，将出现溶藻现象的菌落再次转移到新的SM 培养基上划线分离，直至获得具有溶藻作用的单菌落。

本发明采用自然水环境挂膜的方法，通过在富营养化水体中放置惰性载体，在短时间内形成物种丰富的微生物群落，并直接采用自主建立的固体SM培养基进行高效溶藻细菌的分离筛选。本发明创新性提出惰性材料富集微生物、模拟富营养化藻类细胞效果初筛、SM培养基划线分离菌株的过程，可直观、快速、便捷地分离具有高效抑藻效果的溶藻细菌。

附图说明

图1为本发明具体实施例的处理流程图；

图2为本发明实施例中测得的溶藻菌DC1的叶绿素a去除效果图。

具体实施方式

下面通过实例对本发明做进一步说明。需要注意的是，公布实施例的目的在于帮助进一步理解本发明，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于实施例所公开的内容，本发明要求保护的范围以权利要求书界定的范围为准。

一、溶藻菌的分离

具体步骤如下：

1）溶藻材料的获取

以滇池富营养化水体中溶藻菌的分离为例，在滇池采样点水面下1.5m处，悬挂多个惰性挂膜材料FPUFS载体。20d后取出，在惰性挂膜材料上形成生物膜。

2）SM培养基的制备

收集培养至对数期的水华鱼腥藻（OD₆₈₀≈1），于常温以3000~4500r/min 离心8~15 min，去上清后用新鲜的BG11 液体培养基来悬浮藻细胞沉淀，分装1.5 ml 的Eppendorf 管中，每管1~2ml，用液氮反复冻融8~12次，于4℃以10000~12000×g 离心10~15 min，取上清用0.22mm 孔径的滤膜过滤除菌，滤液保存于-20℃。取100~200 ml 冻融鱼腥藻滤液，用无菌的BG11液体培养基稀释到0.5~1 ml。用微波炉化开1％的低熔点琼脂糖的BG11 半固体培养基，将它保温在47~55℃水浴锅中足够长时间使其温度降到47~55℃，取1~2 ml 保温的无菌BG11 半固体培养基加到无菌小试管中，于47~55℃温浴，再取0.5~1 ml 稀释的冻融鱼腥藻滤液加到小试管中，混匀后立即均匀铺在BG11 固体培养基上，在超净台上吹干后置于4℃保存。SM 培养基含有具有生物活性成分的鱼腥藻提取物。

3）细菌培养

将步骤1）获得的生物膜样品进行如下预处理：用灭菌高纯水清洗，将混合液通过滤纸过滤，以消除原生动物的影响以及去除水中的杂质；然后进行细菌培养：

实验组：将过滤所得的10~20mL水样经无菌操作注入到100~150mL预培养5-7天的各种藻中。

对照组：在100~150mL预培养5-7天的各种藻种中注入20mL经滤纸过滤后高压灭菌的水样。

将上述两组试样分别混合均匀，在光照下静置培养。每天观察是否发生溶藻现象，连续观察5到7天。将对照正常，实验组出现溶藻现象的藻液用于下一步实验。由于分离到的溶藻细菌对鱼腥藻的溶藻效果最好，我们选择水华鱼腥藻作为主要的受试蓝藻藻种。取水华鱼腥藻中出现溶藻现象的黄化藻液用于下一步实验。

4）菌种分离溶藻空斑实验

收集培养至对数期的水华鱼腥藻（OD₆₈₀≈1），于常温下3000~4500r/min离心10~15min，然后再用新鲜的BG11培养基来悬浮藻细胞沉淀，最终浓度控制在30~40倍原浓度。将出现溶藻现象的黄化藻液用无菌BG11培养液稀释100和1000倍。取稀释液0.2~0.3 ml与1~1.5 ml浓缩水华鱼腥藻液混合，在小试管中混匀后均匀涂布在BG11固体培养基上，并且设置一个滴加对应量无菌水和浓缩水华鱼腥藻液的空白对照。将这些藻板在植物室内继续光照培养，几天后观察平板上是否有空斑出现。

5）空斑纯化

待藻板上出现空斑后，用无菌接种环切取典型的空斑（每板取2-3个)，重悬于2~3ml 的无菌BG11 液体培养基中，用步骤4）所述的铺藻板的方法对空斑纯化三次。以上操作均在超净室中进行。

6）划线分离

从最后一次形成空斑的藻板上切取一个典型的空斑，转移到SM 培养基上，于25~35℃黑暗培养。所有操作均需无菌操作。使用无菌接种环挑取菌落周围部分到新的SM 培养基上划线分离。同时在50 ml小锥形瓶中加入20 ~30ml水华鱼腥藻液，用无菌接种环挑取单菌落的一部分放入藻液，混合后将它们在光照下继续培养，观察并记录这些液体在5~7天内是否黄化。若检测到抑藻效果，对该单菌落再次转移到新的SM 培养基上进行划线生长，反复纯化多次。分离出五株溶藻菌，对这五株溶藻菌进行进一步的抑藻效果检测。

二、细菌抑藻效果

无菌操作条件下，将溶藻菌接种在高温灭菌的基本培养基中，35℃、170rpm条件下摇床培养2d。取2mL、5mL、10mL、20mL菌悬液，依次加入到初始叶绿素a（Chl-a）浓度为0.612 mg·L^-1的水华鱼腥藻液中，用BG11培养基定容至40 mL。设平行组和对照组，实验条件下培养1周（藻种接种于150mL锥形瓶中，用封口膜封口保存，放置在光合植物培养室内培养，光合培养周期(光照和黑暗的时间比)为14h:10h、温度25±1°C、光照2000lux），测定初始藻液和6d后黄化藻液的Chl-a浓度。

基本培养基：每1000ml蒸馏水含1g磷酸二氢铵(NH₄H₂PO₄)，0.2g MgSO₄·7H₂O，5g葡萄糖，5g NaCl，1g K₂HPO₄·3H₂O。

BG11培养基和其中的微量元素A5的成分分别如表1和表2所示：

表1 BG11培养基各营养物质成分

营养成分	浓度 (g/L)	营养成分	浓度(g/L)
				硝酸钠(NaNO₃)	1.500	乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA·Na₂)	0.001

磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)	0.040	柠檬酸铁铵(FeC₆H₅O₇·NH₄OH)	0.006
				硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)	0.075	碳酸钠(Na₂CO₃)	0.020
氯化钙(CaCl₂·2H₂O)	0.036	A5	1.0mL
				柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)	0.006	蒸馏水(Distilled water)	991mL

表2 微量元素A5营养物质成分

营养成分	浓度(g/L)	营养成分	浓度(g/L)
				硼酸(H₃BO₃)	2.860	硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)	0.079
氯化锰(MnCl₂·4H₂O)	1.810	氯化钴(CoCl₂·6H₂O)	0.494
				硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)	0.222	硫酸锰(MnSO₄·H₂O)	2.50
钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)	0.390

向0.612mg·L^-1的藻液中加入不同量的溶藻菌菌体，其中溶藻效果最佳的溶藻菌DC1的叶绿素a去除效果变化如图2所示。

实验结果表明，菌株DC1对水华鱼腥藻对有明显的溶藻效果，溶藻细菌的菌体浓度对溶藻效果具有很大影响。在初始Chl-a浓度相同的情况下，菌体浓度越大，对鱼腥藻的去除效率越大。初始Chl-a浓度为0.612mg·L^-1藻液中加入1.45×10⁷cells·mL^-1、3.63×10⁷cells·mL^-1、7.26×10⁷cells·mL^-1、14.5×10⁷cells·mL^-1溶藻菌DC1，光照培养6d后对鱼腥藻的平均去除率分别为35.50%、59.47%、71.60%、94.93%；加入14.5×10⁷cells·mL^-1菌量，光照培养6d后，Chl-a浓度可降低至0.18mg·L^-1。实验结果表明，DC1菌株不仅对鱼腥藻具有显著的去除效果，而且可控制藻液Chl-a浓度在较低范围，可有效控制鱼腥藻生长，具有高效的抑藻效果。经鉴定，DC1为解淀粉芽孢杆菌。

Claims

1.一种自然水环境中的溶藻菌分离方法，包括如下步骤：

2）制备藻类细胞内含液，将其与BG11培养基混合后制成半固体培养基，铺在BG11 固体培养基上，获得SM培养基；

5）挑取步骤4）形成的溶藻空斑再进行多次溶藻空斑实验以纯化空斑；

2.如权利要求1所述的自然水环境中的溶藻菌分离方法，其特征在于，步骤1）中所述惰性载体为惰性玻璃片或FPUFS载体。

3.如权利要求1所述的自然水环境中的溶藻菌分离方法，其特征在于，步骤1）将所述惰性载体垂挂在富营养化水体水面下1~1.5m处15-30天。

4.如权利要求1所述的自然水环境中的溶藻菌分离方法，其特征在于，步骤2）中所述藻类为微囊藻和/或水华鱼腥藻。

5.如权利要求1所述的自然水环境中的溶藻菌分离方法，其特征在于，步骤2）中所述藻类细胞内含液是通过将藻类细胞反复冻溶后离心，再取上清过滤除菌得到。

6.如权利要求1所述的自然水环境中的溶藻菌分离方法，其特征在于，步骤3）用灭菌水清洗生物膜材料，将清洗得到的混合液用滤纸过滤，然后将滤液加入预培养的藻类培养液中，光照静置培养。

7.如权利要求1所述的自然水环境中的溶藻菌分离方法，其特征在于，步骤4）溶藻空斑实验所用的培养基为BG11固体培养基，将步骤3）出现溶藻现象的培养液用BG11培养液稀释后与浓缩的藻液混匀，涂布在BG11固体培养基上，光照培养，观察是否有空斑出现。

8.如权利要求7所述的自然水环境中的溶藻菌分离方法，其特征在于，步骤5）取溶藻空斑重悬于BG11培养液中后重复进行溶藻空斑实验以纯化空斑。

9.如权利要求1所述的自然水环境中的溶藻菌分离方法，其特征在于，步骤6）划线培养在黑暗中进行，然后挑取菌落加入藻类培养液中培养以检测其溶藻效果，将出现溶藻现象的菌落再次转移到新的SM 培养基上划线分离，直至获得具有溶藻作用的单菌落。